EA027502B1 - Антитела против flt3 и способы их применения - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к антителам против FLT3 с модифицированной Fc-областью, содержащей аминокислотные замены S239D и I332E для увеличения антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) этих антител. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим эти антитела, нуклеиновым кислотам, кодирующим эти антитела, к клеточной линии, продуцирующей эти антитела, а также к применению таких антител в лечении лимфомы или лейкоза.

Description

Настоящее изобретение посвящено антителам и относится к специфическим антителам против РЬТ3 с модифицированной Рс-областью для создания или повышения антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (АНСС), а также к способам применения таких антител.

Предшествующий уровень техники

Тирозинкиназный рецептор РЬТ3, экспрессирующийся на клеточной поверхности гемопоэтических клеток-предшественников, играет важную роль в раннем гемопоэзе. Благодаря своей ключевой роли в регулировании выживания, пролиферации и дифференцировки гемопоэтических клеток (В- и Т-клетки), аберрантная активность РЬТ3 вовлечена в развитие и развитие раковых заболеваний гемопоэтической системы. Например, внутренние тандемные дупликации РЬТ3 являются наиболее распространенными мутациями, ассоциированными с острым миелобластным лейкозом (АМЬ). Таким образом, существует потребность в антителах, которые могут специфически нацеливаться на РЬТ3-экспрессирующие клетки и уничтожать их.

Таким образом, одна задача авторов настоящего изобретения состояла в том, чтобы предложить антитела против РЬТ3, которые могут связывать и уничтожать РЬТ3-экспрессирующие клетки ίη νίνο.

Краткое изложение сущности изобретения

В данном описании предложено антитело, которое связывает человеческую рецепторную тирозинкиназу РЬТ3, содержащее тяжелую цепь и/или легкую цепь и по меньшей мере одну аминокислотную замену в константной области по сравнению с родительским антителом против РЬТ3, где указанная по меньшей мере одна аминокислотная замена включает аминокислотные замены 8239Ό и Ι332Ε, где нумерация положений соответствует Ευ индексу и где У_ъ СНК1 имеет аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ ΙΌ N0: 1; У_ъ СНК2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ ΙΌ N0: 2; У_ь СНК3 имеет аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ ΙΌ N0: 3; Ун СНК1 имеет аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ ΙΌ N0: 4; У_н СНК2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ ΙΌ N0: 5; и У_н СНК3 имеет аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ ΙΌ N0: 6.

В данном описании также предложено антитело, которое связывает человеческую рецепторную тирозинкиназу РЬТ3, содержащее тяжелую цепь и/или легкую цепь и по меньшей мере одну аминокислотную замену в константной области по сравнению с родительским антителом против РЬТ3, где указанная по меньшей мере одна аминокислотная замена включает аминокислотные замены δ239Ό и Ι332Ε, где нумерация положений соответствует Ευ индексу, и где У_ъ СНК1 имеет аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ ΙΌ N0: 7; У_ъ СНК2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ ΙΌ N0: 8; У_ъ СНК3 имеет аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ ΙΌ N0: 9; У_н СНК1 имеет аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ ΙΌ N0: 10; У_н СНК2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ ΙΌ N0:11; и У_н СНК3 имеет аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ ΙΌ N0: 12.

В конкретном воплощении предложено антитело, в котором тяжелая цепь содержит Ун-домен, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ ΙΌ N0: 14, и легкая цепь содержит У_ъ-домен, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ ΙΌ N0: 13.

В более конкретном воплощении тяжелая цепь содержит У_н-домен, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ ΙΌ N0: 30, и легкая цепь содержит У_ъ-домен, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ ΙΌ N0: 29.

В еще одном конкретном воплощении предложено антитело, которое представляет собой химерное антитело и содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ ΙΌ N0: 27, и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ ΙΌ N0:23.

В более конкретном воплощении такое химерное антитело содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ ΙΌ N0: 43, и/или легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ ΙΌ N0: 39.

Предложенное в данном изобретении антитело связывается с повышенной аффинностью с рецептором РсуКШа или имеет повышенную эффекторную функцию АЭСС (антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности) по сравнению с родительским антителом.

В изобретении также предложена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая тяжелую или легкую цепь антитела по настоящему изобретению.

В изобретении также предложено применение антитела по изобретению в лечении лимфомы или лейкоза у млекопитающего.

В конкретном воплощении изобретения лимфома или лейкоз находится на стадии минимального остаточного заболевания (ΜΚΌ).

В изобретении также предложено применение антитела по изобретению, где лимфома или лейкоз выбраны из группы, состоящей из неходжкинских лимфом (НнЬ), хронического лимфоцитарного лейкоза (СЬЬ), В-клеточного острого лимфобластного лейкоза/лимфомы (В-АЕЬ), мантийно-клеточной лимфомы (МСЬ), волосатоклеточного лейкоза (ИСЬ), хронического миелоидного лейкоза (СМЬ), острого

- 1 027502 миелоидного лейкоза (АМЬ) и множественной миеломы (ММ).

В изобретении также предложено применение антитела по изобретению в комбинации по меньшей мере с одним агентом, выбранным из группы, состоящей из цитотоксического агента, химиотерапевтического агента, цитокина, ингибирующего рост агента, антигормонального агента, ингибитора киназы, антиангиогенного агента, кардиопротектора, иммуностимулирующего агента, иммунодепрессанта, ингибитора ангиогенеза, ингибитора протеинтирозинкиназы и второго антитела.

В еще одном аспекте изобретения предложена фармацевтическая композиция для лечения РЬТЗсвязанного заболевания или расстройства, содержащая антитело по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

В еще одном аспекте изобретения предложена клеточная линия, трансфицированная молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело по изобретению и продуцирующая таким образом антитело по настоящему изобретению.

Краткое описание графических материалов

Изобретение будет лучше понято со ссылкой на подробное описание, рассматриваемое в сочетании с неограничивающими примерами и прилагаемыми чертежами.

На фиг. 1 показано схематическое представление процедуры клонирования для химеризации моноклональных антител. Прямоугольники представляют экзоны, кружки указывают на энхансерные элементы и тонкие линии - ИТ (нетранслируемые) участки и интронные последовательности. Р -промотор; Ь₁ и Ь₂ - лидерные последовательности, кодируемые двумя различными экзонами; Е - энхансер; V - вариабельная область; Ό - область разнообразия; 1 - соединительная область; С(_1-3) - экзоны константной области; Н - шарнирная область.

На фиг. 2 показан родительский вектор, содержащий νί-область мышиной легкой цепи и С-область человеческого гена к. Область, относящаяся к фрагменту обмена, показана в увеличенном виде на фиг. 2А. Окружение последовательности, полученное в результате вставки νί-области моноклональных антител Βνΐ0 или 408 в экспрессирующий вектор сЫтРЬТЗ-НдЫ, показано на фиг. 2В. Сайт расщепления для секреторных сигнальных пептидов обозначается |; и границы экзон-интрона [,].

На фиг. 3 показан исходный вектор, содержащий тяжелую цепь γΐ изотипа 1д человека. Область, важная для клонирования νΌΙ-фрагмента, показана в увеличенном виде (а). М1и1-8ре1 фрагмент, подлежащий обмену (показан в увеличенном виде как Ь) содержит всю константную область γΐ тяжелой цепи человека и две аминокислотные модификации в СН2-домене, как указано (8ег_2З9-А§р; Но₃₃₂-О1и). На фиг. ЗВ показано окружение последовательности, полученное в результате вставки νΌΙ-области тяжелой цепи моноклонального антитела Βνΐ0 или 408 в тяжелую цепь экспрессирующего вектора сЫтРЬТЗйеауу. Сайт расщепления для секреторных сигнальных пептидов обозначается |; и границы экзонинтрона [,].

На фиг. 4 показаны эффекты цитолиза клеток для Рс-оптимизированного химерного антитела с1ит408-801Е (А) и ΟιίιηΒνΐ0-8ΟΙΕ (В) соответственно, и нестимулированных человеческих РВМСк (мононуклеарные клетки периферической крови) против культивируемых РЬТЗ-экспрессирующих лейкозных клеток человека ΝΑΣΜΐό по сравнению с немодифицированными химерными антителами сЫт408 и ΟιίιηΒνΚ). На фиг. 4С показаны эффекты цитолиза клеток для химерных антител, направленных на Ν02, которые были Рс-оптимизированы в тех же положениях, что и вышеупомянутые антитела с1шп4О8-8О1Е и ΟιίιηΒνΐ0-δΟΙΕ. на человеческих клетках меланомы 8КМе16З. Цитотоксичность определяли с использованием анализа высвобождения хрома, с указанием продолжительности анализа и соотношений мишень:эффектор.

На фиг. 5 показан эффект цитолиза клеток с помощью оптимизированного антитела против РЬТЗ 408-8ΌΙΕ и нестимулированных человеческих РВМСк на АМЬ-бластах (бластные клетки острого миелоидного лейкоза) по сравнению с немодифицированным родительским мышиным антителом.

На фиг. 6 показано выравнивание аминокислотной последовательности вариабельных областей легкой (А) и тяжелой (В) цепи антитела против РЬТЗ клонов 408 и Βνΐ0.

На фиг. 7 показано связывание мышиного, химерного и оптимизированного 408 и Βνΐ0 с РЬТЗ. РЬТЗ- и ложно-трансфицированные клетки 8р2/0 (А) или клетки ΝΑΣΜΐ6 (В,С) инкубировали с указанными антителами и анализировали с помощью непрямой иммунофлуоресценции и проточной цитометрии. Светлые и затушеванные гистограммы на (А) представляют окрашивание контрольного изотипа и указанных РЬТЗ антител (ΐ0 мкг/мл) соответственно. МР1=средняя интенсивность флуоресценции.

На фиг. 8 показан эффект 4088ΌΙΕΜ на связывание РЬТЗ-лиганда (РЬТЗЬ) и пролиферацию лейкозных клеток. (А) клетки ΝΑΕΜΐ6 инкубировали с 4088ΌΙΕΜ или Βνΐ08ΌΙΕΜ при ΐ мкг/мл в присутствии указанных концентраций рекомбинантного РЬТЗ-лиганда и количество связанного антитела определяли с помощью непрямой иммунофлуоресценции и проточной цитометрии. (В) АМЬ бласты, выделенные из периферической крови трех разных пациентов с помощью центрифугирования в градиенте плотности, инкубировали с указанными концентрациями 4О88И1ЕМ в течение 24 ч и пролиферацию оценивали с использованием анализа захвата З[Н]-тимидина. Столбики справа представляют пролиферацию в отсутствие антитела.

- 2 027502

На фиг. 9 показана ЛЭСС активность немодифицированных и δΌΙΕΜ-модифицированных вариантов РЬТ3 антител 408 и ВУ10. ⁵¹[Сг]-меченые клетки ΝΑΌΜ16 инкубировали в течение 4 ч с РВМСк здорового донора (#4) в присутствии указанных концентраций немодифицированных химерных (χ) или δΌΙΕΜ-модифицированных вариантов 408 и ВУ10 при соотношении РВМС и клеток-мишеней 50:1. Гибель клеток-мишеней определяли с использованием стандартного анализа высвобождения ⁵¹[Сг]. Представлен один типичный результат 6 независимых экспериментов с РВМСк от различных здоровых доноров.

На фиг. 10 показана ЛЭСС активность 4088ΌΙΕΜ против лейкозных клеток. Цитолитическая активность РВМСк от трех различных здоровых доноров (РВМС #1, #2, #3) против клеток ΝΛΓΜ16 (А) и РВΜСк донора #2 против лейкозных бластов от трех различных пациентов (ΑΜΓ #1, #2, #7) (В) определяли в 4- и 8-часовом анализе высвобождения ⁵¹[Сг] соответственно. В (С) цитолитическая активность через 8 ч против ΑΜΓ бластов #1 и #15 показана с использованием аутологичных РВΜСк от соответствующих пациентов в качестве эффекторных клеток. Закрашенные и незакрашенные символы указывают на АЭСС, опосредованную 4088ΌΙΕΜ, и несвязывающего контрольного антитела 9.2.278ΌΙΕ соответственно. Заполненные столбики справа (ΝΚ) указывают на ΝΚ-активность в отсутствие антитела. Следует отметить, что РВМС #1-3 относятся к РВΜСк здоровых доноров и не относятся к ΑΜΓ бластам #1-3.

На фиг. 11 показаны антигенный сдвиг и экспрессия РЬТ3 на лейкозных клетках различного происхождения (А) клетки ΝΑΣΜ16 и бласты от двух различных ΑΜΕ пациентов инкубировали с указанными концентрациями 4088ΌΙΕΜ. Через 48 ч клетки промывали, повторно инкубировали с 2 мкг/мл 4088ΌΙΕΜ и анализировали с помощью непрямой иммунофлуоресценции и проточной цитометрии. Экспрессию РЬТ3, определяемую на клетках, предварительно инкубированных без антител, принимали за 100%. (В) ΑΜΕ бласты от 15 пациентов инкубировали с мышиным 408 (10 мкг/мл), промывали и анализировали с помощью непрямой иммунофлуоресценции и проточной цитометрии. Количество связанных молекул антитела определяли путем сравнения с калиброванными шариками (ЦГИКГТ). (С) ΑΜΡ бласт, используемый в (В), инкубировали с РЕ-конъюгированным 4088ΌΙΕΜ или не связывающим РЕконъюгированным антителом 9.2.278ΌΙΕ (10 мкг/мл) и анализировали с помощью прямой иммунофлуоресценции и проточной цитометрии. δΡI=специфический индекс флуоресценции. δΡΙ четырех образцов не определяли (и.б.) из-за высокого связывания контрольного антитела 9.2.27δΌΙΕ.

На фиг. 12 показана экспрессия РЬТ3 на нормальных ЭСк (дендритные клетки) и клетках костного мозга. (Α) ЭСк. выделенные из периферической крови здоровых доноров с помощью магнитной сепарации клеток, инкубировали с мышиным 408, промывали, окрашивали меченым вторым антителом, снова промывали и инкубировали со смесью по-разному меченых СЭ11с- и СЭ303-антител. Затем клетки анализировали с помощью проточной цитометрии. Показано связывание 408 с СЭ303+ рЭС и СЭ11с+ тЭС субпопуляцией в (В) и (С) соответственно. (Ό,Ε) Аналогично (А-С), нормальные клетки костного мозга, выделенные с помощью центрифугирования в градиенте плотности, инкубировали с мышиным 408, промывали, окрашивали меченым вторым антителом и смесью по-разному меченых СЭ34- и СЭ45антител. Показано связывание 408 с субпопуляцией ί'.'Ό34+ί'.'Ό451ο\ν в (Е). Затушеванные гистограммы представляют первичное окрашивание контролем на изотип, светлые гистограммы - мышиным 408. Показаны типичные результаты одного из трех экспериментов с ОСк и клетками костного мозга от различных здоровых доноров.

На фиг. 13 показана цитотоксическая активность 408δΌΙΕΜ против нормальных клеток. (А) Человеческие клетки костного мозга от двух разных здоровых доноров (черные и затушеванные столбики) инкубировали с 5 мкг/мл 408 δΌΙΕΜ и колониеобразующие единицы определяли через 12 суток инкубации в полутвердой среде. Значения ΚΟΕс сравнивали с необработанными контролями. (В) ЭСк выделяли из РВΜСк здоровых доноров с помощью магнитной сепарации клеток и клетки ΝΑΌΜ16 использовали в качестве мишеней для 408 δΌΙΕΜ в 4-часовом анализе высвобождения 51[Сг] (соотношение РВМС:мишень 100:1). Показан один типичный эксперимент из трех с ОСк и аутологичными РВΜСк от разных доноров.

На фиг. 14 показаны эффекты ίη νίΐτο антитела 408 на мишень пациента и эффекторные клетки. (А) РВМС пациента анализировали с помощью ΡΑСδ (клеточный сортер с возбуждением флуоресценции) в отношении экспрессии РЬТ3, используя родительское мышиное антитело 408 и изотипический контроль с последующим антимышиным-РЕ конъюгатом и двойным окрашиванием СО34. (В, С) РВМС пациента инкубировали вместе с РЕТ3-положительными клетками ΝΑΕΜ16, меченными хромом (В) или бластами пациента, выделенными путем селекции в отношении СО34+ (С). Клетки-мишени предварительно обрабатывали указанными концентрациями 408-δΌΙΕΜ или немодифицированным, химерным антителом 408 (408-сй). Индукцию ΑΌί','ί'.' определяли с помощью анализов высвобождения хрома при соотношении РВМС:мишени 50:1. Следует отметить, что использовали РВМС и неочищенные ΝΚ (натуральные киллеры) клетки.

На фиг. 15 показаны период полувыведения и характеристики связывания 408-δΌΙΕΜ ίη νίνο. (А) Период полувыведения из сыворотки 408-δΌΙΕΜ определяли посредством инкубации РЬТ3экспрессирующих клеток ΝΑΌΜ16 с образцами сыворотки, полученными в различные моменты времени клинического применения. Количество специфически связанного антитела определяли с помощью ΡΑСδ

- 3 027502 и сравнивали со связывающей активностью образцов сыворотки, содержащих определенные уровни 408-δΌΙΕΜ. N0. не определяли. (В) Для определения связывания 408-δΌΙΕΜ ίη νίνο, ВМ бласты, полученные перед терапией (ά0) и через 1 ч после применения дозы 10 мг (ά5) инкубировали с родительским мышиным антителом 408, вторичным неперекрестно-реагирующим мышиным антителом против РЬТ3 (ВУ10), как указано, или изотипическим контролем (светлые пики) при 10 мкг/мл, затем с человекадсорбированным антимышиным-РЕ-конъюгатом. Полное ингибирование связывания мышиного 408, но не ВУ10, как определено с помощью РЛС8, указывает на насыщающее связывание 408-δΌΙΕΜ.

На фиг. 16 показаны клинические эффекты 408-δΌΙΕΜ. (А, В) Процентные соотношения СО34+ бластов (светлые кружки) и активированных (СО69+) СО56+СО3- ΝΚ-клеток (ромбы) среди мононуклеарных клеток в периферической крови (РВ) (А) или костном мозгу (ВМ) (В) определяли с помощью ΡΑСδ в указанные временные точки во время лечения манифестного лейкоза. (С) Уровни ΤΝΕ в сыворотке в указанные временные точки во время лечения манифестного лейкоза определяли с помощью измерения ΙΜΜΌΕΙΤΕ®. (Ό) Процентное соотношение активированных ΝΚ-клеток среди мононуклеарных клеток в РВ (ромбы) и уровни ΤΝΕ в сыворотке (кружки) определяли, как описано выше в указанных временных точках во время применения 408-δΌΙΕΜ при полной ремиссии (СК).

Подробное описание изобретения

Термины, используемые здесь, имеют, если явно не указано иное, следующее значение.

Под АОСС или антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью, как использовано в данной заявке, подразумевают клеточно-опосредованную реакцию, где цитотоксические клетки, которые экспрессируют РсуКк, распознают связанное антитело на клетке-мишени и затем вызывают лизис данной клетки-мишени.

Под АОСР или антитело-зависимым клеточно-опосредованным фагоцитозом, как использовано в данной заявке, подразумевают клеточно-опосредованную реакцию, где неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют РсуКк, распознают связанное антитело на клетке-мишени и вызывают фагоцитоз данной клетки-мишени.

Под аминокислотой и аминокислотной идентичностью, как использовано в данной заявке, подразумевают одну из 20 встречающихся в природе аминокислот или любые неприродные аналоги, которые могут присутствовать в специфическом определенном положении. Таким образом, аминокислота, используемая в данной заявке, представляет собой как встречающиеся в природе, так и синтетические аминокислоты. Например, гомофенилаланин, цитруллин и норлейцин рассматриваются как аминокислоты для целей изобретения. Аминокислота также включает иминокислотные остатки, такие как пролин и гидроксипролин. Боковая цепь может быть либо в (К)-, либо в ^-конфигурации. В одном воплощении аминокислоты находятся в (δ)- или Ь-конфигурации. Если используют не встречающиеся в природе боковые цепи, то могут быть использованы не аминокислотные заместители, например, для предотвращения или замедления деградации ίη νίνο.

Под антителом в данной заявке подразумевают белок, состоящий из одного или более полипептидов, по существу кодируемых всеми или частью признанных иммуноглобулиновых генов. Признанные иммуноглобулиновые гены, например у людей, включают каппа (к), лямбда (λ) и генетические локусы тяжелой цепи, которые вместе содержат огромное количество генов вариабельной области и генов константной области мю (μ), дельта (δ), гамма (γ), эпсилон (ε) и альфа (α), которые кодируют изотипы Ι§Μ, Ι§Ό, Ιμ0 (Ι§01, Ι§02, Ι§03 и Ι§04), Ι§Ε и Ι§Α (Ι§Α1 и Ι§Α2) соответственно. Считается, что антитело в данной заявке включает полноразмерные антитела и фрагменты антител и может относиться к природному антителу из любого организма, сконструированному антителу или антителу, полученному рекомбинантным путем для экспериментальных, терапевтических или других целей.

Под В-клеткой или В-лимфоцитом, как использовано в данной заявке, подразумевают тип лимфоцита, развивающегося в костном мозге, который циркулирует в крови и лимфе и обеспечивает гуморальный иммунитет. В-клетки распознают свободные молекулы антигена и дифференцируются или созревают в плазматические клетки, которые секретируют иммуноглобулины (антитела), которые инактивируют антигены. Также создаются клетки памяти, которые продуцируют специфический иммуноглобулин (антитело) при последующих встречах с таким антигеном. В-клетки известны также как Бетаклетки в островках Лангерганса.

Под Т-клеткой или Т-лимфоцитом, как использовано в данной заявке, подразумевают тип лимфоцита, развивающегося в костном мозге, который циркулирует в крови и лимфе и обеспечивает клеточный иммунитет. Т-клетки содержат Т-клеточный рецептор, который распознает связанный с клеткой антигенные молекулы. Т-клетки могут созревать в хелперные Т-клетки, которые секретируют цитокины и активируют другие типы клеток или цитотоксические Т-клетки, которые связываются с другими клетками и разрушают их.

Под РЬТ3 (£ш8-подобный тирозинкиназный рецептор-3), РЬК2 (киназа-2 эмбриональной печени) и СО135, используемыми взаимозаменяемо в данной заявке, подразумевают цитокиновый рецептор, экспрессирующийся на поверхности гемопоэтических клеток-предшественников. РЬТ3 представляет собой маркер клеточной поверхности для идентификации определенных типов гемопоэтических (клеток

- 4 027502 крови) предшественников в костном мозге. Конкретно, полипотентные предшественники (МРР) и общие лимфоидные предшественники (СЬР) экспрессируют высокие поверхностные уровни РЬТЗ. РЬТЗрецептор связывается с цитокиновым ЕЬЗ лигандом (РЕЗЬ). РЬТЗ представляет собой рецепторную тирозинкиназу типа III. Когда этот рецептор связывается с РЕЗЬ, он образует димер (гомодимер), который активирует передачу сигнала через вторичный мессенджер. РЬТЗ-сигнальный путь играет важную роль в клеточном выживании, пролиферации и дифференцировке развивающихся лимфоцитов (В-клетки и Тклетки). Поскольку разрегулирование РЬТЗ-сигнальной системы может вызывать пролиферативные заболевания, такие как рак и, в частности, лейкоз, РЬТЗ классифицируют как протоонкоген. Действительно, внутренние тандемные дупликации РЬТЗ представляют собой наиболее распространенные мутации, ассоциированные с острым миелобластным лейкозом (АМЬ). Применение РЬТЗ в данной заявке призвано охватить все известные или еще не открытые аллели и полиморфные формы РЬТЗ. Последовательность человеческого РЬТЗ антигена представлена в 8ЕО ГО N0:65.

Под СГОС или комплемент-зависимой цитотоксичностью, как использовано в данной заявке, подразумевают реакцию, где один или более белковых компонентов комплемента распознают связанное антитело на клетке-мишени и впоследствии вызывают лизис данной клетки-мишени.

Под константной областью антитела, как определено в данной заявке, подразумевают область антитела, которая кодируется одним из генов константной области легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина.

Под константной легкой цепью или константной областью легкой цепи, как использовано в данной заявке, подразумевают область антитела, кодируемую (генами) каппа (Ск) или лямбда (Ολ) легких цепей. Константная легкая цепь, как правило, содержит единичный домен и, как определено в данной заявке, относится к положениям 108-214 Ск или лямбда Ολ, где нумерация соответствует ЕЙ индексу.

Под константной тяжелой цепью или константной областью тяжелой цепи, как использовано в данной заявке, подразумевают область антитела, кодируемую генами мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон, для определения изотипа антитела, такого как 1дМ, Ι§Ό, 1дС. 1дА или 1дЕ соответственно. Для полноразмерных Ι§0 антител константная тяжелая цепь, как определено в данной заявке, относится к области от Ν-конца СН1-домена до С-конца СНЗ-домена, таким образом, включая положения 118-447, где нумерация соответствует ЕЙ индексу.

Под эффекторной функцией, как использовано в данной заявке, подразумевают биохимическое событие, которое является результатом взаимодействия Рс-области антитела с Рс-рецептором или лигандом. Эффекторные функции включают РсуК-опосредованные эффекторные функции, такие как АЭСС и АЭСР, и комплемент-опосредованные эффекторные функции, такие как СЭС.

Под эффекторной клеткой, как использовано в данной заявке, подразумевают клетку иммунной системы, которая экспрессирует один или более Рс-рецепторов и опосредует одну или более эффекторных функций. Эффекторные клетки включают, но не ограничиваются этим, моноциты, макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки, эозинофилы, тучные клетки, тромбоциты, В-клетки, большие гранулярные лимфоциты, клетки Лангерганса, натуральные килеры (ΝΚ) и Т-клетки и могут быть из любого организма, включая, но не ограничиваясь этим, людей, мышей, крыс, кроликов и обезьян.

Под РаЬ или РаЬ-областью, как использовано в данной заявке, подразумевают полипептиды, которые содержат УН, СН1, УН и СЬ-домены иммуноглобулина. РаЬ может относиться к этой области в отдельности или этой области в контексте полноразмерного антитела или фрагмента антитела.

Под Рс или Рс-областью, как использовано в данной заявке, подразумевают полипептид, содержащий константную область антитела, за исключением первой домена константной области иммуноглобулина. Таким образом, Рс относится к последним двум доменам константной области иммуноглобулина 1дА, Ι§ϋ и Ι§0, и последним трем доменам константной области иммуноглобулина 1дЕ и 1дМ, и гибкой шарнирной области на Ν-конце этих доменов. Для 1дА и 1дМ, Рс может включать 1-цепь. Для Ι§0, Рс содержит иммуноглобулиновые домены С,₂ и С,_З и шарнир между С_у1 и С,₂. Хотя границы Рс-области могут варьироваться, обычно считается, что Рс-область тяжелой цепи Ι§0 человека содержит остатки С226 или Р2З0 на своем карбоксильном конце, где нумерация соответствует ЕЙ индексу по Кабату. Рс может относиться к этой области в отдельности или этой области в контексте Рс-полипептида, например, антитела.

Под Рс-полипептидом, как использовано в данной заявке, подразумевают полипептид, который содержит всю или часть Рс-области Рс-полипептидов, включая Рс слияния антител, выделенные Рс8 и Рсфрагменты.

Под Рс-гамма-рецептором или РсуК, как использовано в данной заявке, подразумевают любой член семейства белков, которые связывают Рс-область Ι§0 антитела и которые по существу кодируются РсуК генами. У людей это семейство включает, но не ограничивается этим, РсуК! (СЭ64), включая изоформы РсуЫа, РсуЫЬ и РсуЫс; РсуКП (СЭЗ2), включая изоформы РсуКПа (включающие аллотипы Н1З1 и К1З1), РсуКПЬ (включающие РсуКПЬ-1 и РсуКПЬ-2) и РсуКПс; и РсуКШ (СЭ16), включая изоформы РсуКШа (включающие аллотипы У158 и Р158) и РсуКШЬ (включающие аллотипы ЕсуЫПЬЪА! и

- 5 027502

ΡοΥΚΙΙΙό-ΝΑ2) (ЛсГГсг18 с1 а1., 2002, 1ттипо1 БсИ 82:57-65), а также любые нераскрытые человеческие РсуР.5 или изоформы или аллотипы РсуК. Мышиные РсуКк включают, но не ограничиваются этим, РсуК1 (СЭ64). РсуКП (СЭ32), РсуКШ (СИ16) и РсуКШ-2 (СЭ16-2), а также любые нераскрытые мышиные РсуК или изоформы или аллотипы РсуК. РсуК может быть из любого организма, включая, но не ограничиваясь этим, людей, мышей, крыс, кроликов и обезьян.

Под Рс-лигандом или Рс-рецептором, как использовано в данной заявке, подразумевают молекулу, например, полипептид из любого организма, который связывается с Рс-областью антитела с образованием Рс-лигандного комплекса. Рс-лиганды включают, но не ограничиваются этим, РсуК, РсКп, СП], С3, маннан-связывающий лектин, рецептор маннозы, стафилококковый белок А, стафилококковый белок С и вирусный РсуК. Рс-лиганды также включают гомологи Рс-рецептора (РсКН), которые представляют собой семейство Рс-рецепторов, которые гомологичны РсуК (Όανίδ с1 а1., 2002, 1ттипо1одюа1 Ксую\у5 190:123-136). Рс-лиганды могут включать нераскрытые молекулы, которые связывают Рс.

Под 1дС, как использовано в данной заявке, подразумевают полипептид, относящийся к классу антител, которые, по существу, кодируются признанным геном гамма иммуноглобулина. У людей этот класс содержит 1дС1, 1дС2, 1дС3 и 1дС4. У мышей этот класс содержит 1дС1, 1дС2а, 1дС2Ь, 1дС3.

Под иммуноглобулином (1д) в данной заявке подразумевают белок, состоящий из одного или более полипептидов, по существу кодируемых иммуноглобулиновыми генами. Иммуноглобулины включают, но не ограничиваются этим, антитела. Иммуноглобулины могут иметь ряд структурных форм, включая, но не ограничиваясь этим, полноразмерные антитела, фрагменты антитела и отдельные иммуноглобулиновые домены.

Под иммуноглобулиновым (1д) доменом в данной заявке подразумевают область иммуноглобулина, которая существует в виде отдельной структурной единицы, как установлено специалистом в области белковой структуры. 1д домены, как правило, имеют характерную топологию β-сэндвич складывания. Известные 1д домены в классе 1дС антител представляют собой УН, Су1, Су2, Су3, УЪ и СЪ.

Под аминокислотной модификацией в данной заявке подразумевают аминокислотную замену, вставку и/или делецию в полипептидной последовательности.

Под аминокислотной заменой или заменой в данной заявке подразумевают аминокислотную замену в определенном положении в родительской полипептидной последовательности другой аминокислотой. Например, замена Ι332Ε относится к варианту полипептида, в этом случае варианту константной тяжелой цепи, в котором изолейцин в положении 332 замещен глутаминовой кислотой. Остаток дикого типа может быть обозначен или может быть не обозначен. Для предыдущего примера 332Е указывает на замену положения 332 глутаминовой кислотой. Для этой цели многочисленные замены, как правило, разделяются косой чертой. Например, 239Ό/332Ε относится к двойному варианту, содержащему замены 239Ό и 332Е.

Под аминокислотной вставкой или вставкой, как использовано в данной заявке, подразумевают добавление аминокислоты в определенном положении родительской полипептидной последовательности. Например, вставка -236С означает введение глицина в положении 236.

Под аминокислотной делецией или делецией, как использовано в данной заявке, подразумевают удаление аминокислоты в определенном положении родительской полипептидной последовательности. Например, С236- означает делецию глицина в положении 236.

Под родительским полипептидом, родительским белком, полипептидом-предшественником или белком-предшественником, как взаимозаменяемо использовано в данной заявке, подразумевают полипептид, который впоследствии модифицируют для получения варианта, например, любого полипептида, который служил в качестве матрицы и/или основы для по меньшей мере одной аминокислотной модификации, описанной в данной заявке. Родительский полипептид может представлять собой встречающийся в природе полипептид, или вариант, или сконструированный вариант встречающегося в природе полипептида. Родительский полипептид может относиться к самому полипептиду, композициям, которые содержат родительский полипептид, или аминокислотной последовательности, которая кодирует его. Соответственно под родительским антителом или родительским иммуноглобулином, как использовано в данной заявке, подразумевают антитело или иммуноглобулин, которые модифицированы для получения варианта (например, родительское антитело может включать, но не ограничивается этим, белок, содержащий константную область встречающегося в природе 1д).

Под белком или полипептидом, как использовано в данной заявке, подразумевают по меньшей мере две ковалентно присоединенные аминокислоты, которые включают белки, полипептиды, олигопептиды и пептиды. Белок может состоять из встречающихся в природе аминокислот и пептидных связей или синтетических пептидомиметических структур, т.е. аналогов, таких как пептоиды.

Под положением, как использовано в данной заявке, подразумевают локализацию в последовательности белка. Положения могут быть пронумерованы последовательно или в соответствии с установленным форматом, например, согласно Ευ индексу по Кабату (КаЬа1 с1 а1., 1983). Если не указано иное, все положения, упомянутые здесь, пронумерованы в соответствии с Ευ индексом. Соответствующие положения определяются, как описано здесь, обычно через выравнивание с другими родительскими по- 6 027502 следовательностями.

Под остатком, как использовано в данной заявке, подразумевают положение в белке и ассоциированную с ним аминокислотную идентичность. Например, серин 239 (также называемый как 8ег239 и 8239) представляет собой остаток в положении 239 в человеческом антителе 1дС1.

Под антигеном-мишенью или мишенью или антигеном, как использовано в данной заявке, подразумевают молекулу, которая специфически связана с вариабельной областью данного антитела. Антиген-мишень может представлять собой белок, углевод, липид или другое химическое соединение.

Под клеткой-мишенью, как использовано в данной заявке, подразумевают клетку, которая экспрессирует антиген-мишень.

Под вариабельной областью, как использовано в данной заявке, подразумевают область иммуноглобулина, которая содержит один или более доменов 1д, по существу кодируемых любым из генов Ук, νλ и/или УН, которые составляют соответственно каппа, лямбда и генетические локусы тяжелой цепи иммуноглобулина.

Под вариантом белка, белковым вариантом, вариантом полипептида или полипептидным вариантом, как использовано в данной заявке, подразумевают полипептидную последовательность, которая отличается от последовательности родительского полипептида по меньшей мере одной аминокислотной модификацией. Вариант полипептида может относиться к самому полипептиду, композиции, содержащей полипептид, или аминокислотной последовательности, которая кодирует его. В одном воплощении вариант полипептида имеет по меньшей мере одну аминокислотную модификацию по сравнению с родительским полипептидом, например, от примерно одной до примерно десяти аминокислотных модификаций, например, от примерно одной до примерно пяти аминокислотных модификаций по сравнению с родительским полипептидом. Вариант полипептидной последовательности в данной заявке может иметь по меньшей мере примерно 80%-ную гомологию с родительской полипептидной последовательностью, например, по меньшей мере примерно 90%-ную гомологию, по меньшей мере примерно 95%-ную гомологию и т.д. Соответственно под вариантом антитела или антительным вариантом, как использовано в данной заявке, подразумевают последовательность антитела, которая отличается от последовательности родительского антитела по меньшей мере одной аминокислотной модификацией. Вариант антитела или антительный вариант может относиться к самому полипептиду антитела, композициям, содержащим вариант полипептида антитела, или аминокислотной последовательности, которая кодирует его. Соответственно под вариантом константной тяжелой цепи или вариантом константной легкой цепи или Рс-вариантом, как использовано в данной заявке, подразумевают соответственно константную тяжелую цепь, константную легкую цепь, или полипептид или последовательность Рс-области, последовательность которых отличается от родительской последовательности по меньшей мере одной аминокислотной модификацией.

Под дикого типа или \УТ в данной заявке подразумевают аминокислотную последовательность или нуклеотидную последовательность, которая обнаруживается в природе, включая аллельные вариации. \УТ белок, полипептид, антитело, иммуноглобулин, 1§С и т.д. имеют аминокислотную последовательность или нуклеотидную последовательность, которые не были намеренно модифицированы.

Для всех положений константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, описанных в настоящем изобретении, нумерация соответствует ЕЙ индексу по Кабату (КаЬа! е! а1., 1991, 8ециепсез о£ Рто!ешз о£ 1ттипо1ощса1 1п1егеь1. 5ΐ1ι Еб, Иийеб 8!а!ез РиЬйс Неайй 8егуюе, Ναΐίοηαΐ 1пзй!и!ез о£ Неайй, ВеШезба). ЕЙ индекс по Кабату относится к нумерации остатков человеческого 1§С1 ЕЙ антитела, как описано в Ебе1тап е! а1., 1969, Вюсйет1зйу 63 78-85).

Антигены представляют собой макромолекулы, способные вызывать антительный ответ у животного и распознаваемые полученным антителом. Как антигены, так и гаптены содержат по меньшей мере одну антигенную детерминанту или эпитоп, который представляет собой область антигена или гаптена, которая связывается с антителом. Как правило, эпитоп на гаптене представляет собой целую молекулу.

Термин образец, как использовано в данной заявке, относится к аликвоте материала, часто биологическим матриксам, водному раствору или водной суспензии, полученным из биологического материала. Образцы, подлежащие анализу на присутствие аналита способами по настоящему изобретению, включают, например, клетки, ткани, гомогенаты, лизаты, экстракты и очищенные или частично очищенные белки и другие биологические молекулы и их смеси.

Неограничивающие примеры образцов, обычно используемых в способах по изобретению, включают жидкости из организма человека и животного, такие как цельная кровь, сыворотка, плазма, цереброспинальная жидкость, мокрота, бронхиальные смывы, бронхиальные аспираты, моча, сперма, лимфатическая жидкость и различные экзокринные секреции дыхательных путей, кишечных и мочеполовых путей, слезы, слюну, молоко, лейкоциты, миеломы и тому подобное; биологические жидкости, такие как супернатанты клеточных культур; препараты тканей, которые могут быть фиксированными или не фиксированными, и препараты клеток, которые могут быть фиксированными или не фиксированными. Образцы, используемые в способах по настоящему изобретению, будут варьироваться в зависимости от

- 7 027502 формата анализа и природы тканей, клеток, экстрактов и других анализируемых материалов, особенно биологических материалов. Способы получения белковых экстрактов из клеток или образцов хорошо известны в данной области техники и могут быть легко адаптированы с целью получения образца, который совместим со способами по изобретению.

Специфически связывающееся или специфическое связывание, как использовано в данной заявке, означает, что антитело связывается с его мишенью (аналитом), основываясь на распознавании эпитопа на молекуле-мишени. Антитело предпочтительно распознает и связывается с молекулой-мишенью с более высокой аффинностью связывания, чем оно связывается с другими соединениями, которые могут присутствовать. В различных воплощениях изобретения специфически связывающееся может означать, что антитело связывается с молекулой-мишенью с по меньшей мере примерно в 10⁶ раз более высокой аффинностью, предпочтительно по меньшей мере с примерно в 10⁷ раз более высокой аффинностью, более предпочтительно по меньшей мере с примерно в 10⁸ раз более высокой аффинностью и наиболее предпочтительно с по меньшей мере примерно в 10⁹ раз более высокой аффинностью, чем оно связывается с молекулами, не имеющими отношения к молекуле-мишени. Как правило, специфическое связывание относится к аффинностям в диапазоне от примерно в 10⁶ раз до примерно в 10⁹ раз более высоким, чем неспецифическое связывание. В некоторых воплощениях специфическое связывание можно охарактеризовать аффинностями, более чем в 10⁹ раз превышающими неспецифическое связывание. Аффинность связывания можно определить с помощью походящего способа. Такие способы известны в данной области техники и включают, без ограничения, поверхностный плазмонный резонанс и изотермическую калориметрию титрования. В конкретном воплощении антитело однозначно распознает и связывается с аналитом-мишенью.

Термин моноклональное антитело, как использовано в данной заявке, относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в небольшом количестве. Моноклональные антитела являются высоко специфическими, направленными против одного антигенного сайта. Кроме того, в отличие от обычных препаратов (поликлональных) антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. В дополнение к их специфичности, моноклональные антитела предпочтительны тем, что их можно синтезировать с помощью гибридомной культуры, незагрязненной другими иммуноглобулинами. Определение моноклональное указывает на характер антитела, как получаемого по существу из однородной популяции антител и не сконструированного, как того требует получение антитела любым конкретным способом. Моноклональные антитела могут включать химерные антитела (патент США № 4816567; и Моткой е! а1. (1984) Ргос. ЫаН. Асаб. δα. И8А, 81: 6851-6855) и гуманизированные антитела Нопек е! а1. (1986) №1иге. 321: 522-525; КасЬтаии е! а1. (1988) Ыа!иге, 332: 323-329; Ртек!а (1992) Сигг. Ор. 8!тис!. Бю1. 2: 593-596).

Моноклональные антитела могут быть получены любым способом, который обеспечивает продукцию молекул антитела постоянными клеточными линиями в культуре. Они включают, но не ограничиваются этим, гибридомный метод КоеЬ1ег и МПкЮт (1975), Ыа!иге, 256: 495-7; и патент США № 4376110), гибридомный метод на основе человеческих В-клеток (КокЬот, е! а1. (1983), 1ттипо1оду Тобау, 4: 72; Со!е, е! а1. (1983), Ргос. Ыа!1. Асаб. δα. υδΑ, 80: 2026-30), и ЕВУ-гибридомный метод (Со1е, е! а1. (1985), в Мопос1опа1 АпбЬоб1ек Апб Сапсег ТЬегару, А1ап К. Ыкк, 1пс., Ые\у Уогк, рр. 77-96). Получение моноклональных антител, специфических в отношении целевого соединения, также описан в Наг1о\у апб Ьапе, ебк. (1988) АпбЬоб1ек - А ЬаЬота!огу Мапиа1. Со1б δр^^пд НагЬог ЬаЬога!оту, СЬар!ег 6. Такие антитела могут представлять собой иммуноглобулины любого класса, включая 1§О, 1дМ, 1дЕ, 1дА, Ι§Ό, и любой их подкласс. Гибридому, продуцирующую тАЬ, можно культивировать ш νίΙΐΌ или ш у|уо. Получение высоких титров тАЬк ш у|уо делает ее очень эффективным методом получения.

Поликлональные антитела представляют собой гетерогенные популяции молекул антител, происходящих из сывороток животных, иммунизированных антигеном, или из их антигенного функционального производного. Для получения поликлональных антител, животные-хозяева, такие как кролики, мыши и козы, могут быть иммунизированы посредством инъекции антигеном или конъюгатом гаптенноситель, возможно дополненным адъювантами.

Методы, описывающие получение одноцепочечных антител (патент США № 4946778; Впб (1988), δα^Ίΐ^ν 242: 423-26; Ник!оп, е! а1. (1988), Ргос. Ыаб. Асаб. δοΐ. ГОА 85: 5879-83; и №атб, е! а1. (1989), Ыа!иге, 334: 544-46), могут быть адаптированы для получения ген-одноцепочечных антител. Одноцепочечные антитела, как правило, образуются путем связывания фрагментов Ρν-области тяжелой и легкой цепи посредством аминокислотного мостика, что приводит к получению одноцепочечного полипептида.

Фрагменты антител, которые распознают специфические эпитопы, могут быть получены известными методами. Например, такие фрагменты включают, но не ограничиваются этим: Р(аЬ')₂-фрагменты, которые могут быть получены путем переваривания пепсином молекулы антитела, и РаЬ-фрагменты, которые могут быть получены путем восстановления дисульфидных мостиков Р(аЬ')₂-фрагментов. Альтернативно, можно сконструировать библиотеки экспрессии РаЬ (Нике, е! а1. (1989), δ^ιτ^ 246: 1275- 8 027502

1281) для обеспечения быстрой и легкой идентификации РаЬ-фрагментов моноклонального антитела с желаемой специфичностью.

Термины полинуклеотид и нуклеиновая кислота (молекула) используют в данной заявке взаимозаменяемо по отношению к полимерным формам нуклеотидов любой длины, включая встречающиеся в природе и не встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты. Полинуклеотиды могут содержать дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды и/или их аналоги. Способы селекции и получения нуклеиновых кислот разнообразны и хорошо описаны в стандартных биомолекулярных протоколах. Типичным путем является препаративная ПЦР (полмеразная цепная реакция) и хроматографическая очистка, начиная с существующих матричных ДНК или ступенчатого синтеза искусственных нуклеиновых кислот. Как правило, молекулы нуклеиновой кислоты, указанные в данной заявке, представляют собой молекулы ДНК.

Термин по меньшей мере один, как использовано в данной заявке в связи с аминокислотными заменами, относится по меньшей мере к 1, но предпочтительно по меньшей мере к 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или множеству аминокислотных замен.

Термины приведение в контакт или инкубирование, используемые в данной заявке взаимозаменяемо, относятся обычно к обеспечению доступа одного компонента, реагента, аналита или образца к другому.

Термин обнаружение, используемый в данной заявке, относится к любому способу подтверждения присутствия данной молекулы. Методы, используемые для достижения этой цели, могут включать, но не ограничиваются этим, иммуноанализ, такой как ЕЫБЛ и иммуно-ПЦР (1РСК).

Гематологические злокачественные заболевания представляют собой типы рака, которые влияют на кровь, костный мозг и лимфатические узлы. Гематологические злокачественные заболевания могут происходить из любой из двух основных линий клеток крови: миелоидной и лимфоидной линий клеток. Миелоидная линия клеток в норме продуцирует гранулоциты, эритроциты, тромбоциты, макрофаги и тучные клетки; лимфоидная линия клеток продуцирует В-, Т-, ΝΚ- и плазматические клетки. Лимфомы, лимфоцитарные лейкозы и миелома происходят из лимфоидной линии, в то время как острый и хронический миелоидный лейкоз, миелодиспластические синдромы и миелопролиферативные заболевания имеют миелоидное происхождение.

Лейкоз представляет собой рак крови или костного мозга и характеризуется аномальной пролиферацией клеток крови, обычно белых клеток крови (лейкоцитов). Лейкоз клинически и патологически подразделяется на различные большие группы. Острый лейкоз характеризуется быстрым ростом незрелых клеток крови. Такое скопление незрелых клеток делает костный мозг неспособным продуцировать здоровые клетки крови. Необходимо немедленное лечение при остром лейкозе в связи с быстрым развитием и накоплением злокачественных клеток, которые затем попадают в кровоток и распространяются в другие органы тела. Острые формы лейкоза являются наиболее распространенными формами лейкоза у детей. Хронический лейкоз отличается чрезмерным образованием относительно зрелых, но все же аномальных белых клеток крови. Как правило, учитывая месяцы или годы для развития, данные клетки образуются при гораздо более высокой скорости, чем нормальные клетки, что приводит к образованию множества аномальных белых кровяных телец в крови. В то время как острый лейкоз следует лечить немедленно, хронические формы иногда контролируют в течение некоторого времени до лечения для того, чтобы обеспечить максимальную эффективность терапии. Хронический лейкоз чаще всего наблюдается у пожилых людей, но теоретически может наблюдаться в любой возрастной группе. Кроме того, заболевания подразделяются по типу пораженной клетки крови. Такое разделение делит лейкозы на лимфобластные или лимфоцитарные лейкозы и миелоидные или миелогенные лейкозы: в лимфобластных или лимфоцитарных лейкозах злокачественное изменение происходит у типа клеток костного мозга, которые в норме развиваются с образованием лимфоцитов, которые представляют собой клетки иммунной системы, борющиеся с инфекцией. Большинство лимфоцитарных лейкозов вовлекают конкретный подтип лимфоцита: В-клетку. При миелоидных или миелогенных лейкозах злокачественное изменение происходит в типе клетки костного мозга, которая в норме развивается с образованием красных клеток крови, некоторых других типов лейкоцитов, и тромбоцитов.

Острый миелоидный лейкоз (ЛМЬ), также известный как острый миелогенный лейкоз, представляет собой рак миелоидной линии клеток крови, характеризующийся быстрым ростом атипичных белых клеток крови, которые накапливаются в костном мозге и мешают продукции нормальных клеток крови. ЛМЬ представляет собой наиболее распространенный острый лейкоз, поражающий взрослых, и его частота увеличивается с возрастом. Хотя ЛМЬ является относительно редким заболеванием, насчитывающим приблизительно 1,2% смертельных случаев от рака в Соединенных Штатах, ожидают, что его частота будет увеличиваться, поскольку население стареет.

Симптомы ЛМЬ вызваны замещением нормального костного мозга лейкозными клетками, что вызывает снижение числа красных клеток крови, тромбоцитов и нормальных белых клеток крови. Эти симптомы включают утомляемость, одышку, легкие синяки и кровотечения и повышенный риск инфекции. Хотя было идентифицировано несколько факторов риска возникновения ЛМЬ, конкретная причина этого заболевания остается неясной. Так как это острый лейкоз, ЛМЬ быстро развивается и, как правило, является смертельным в течение нескольких недель или месяцев, если его не лечить.

- 9 027502

ЛМЬ имеет несколько подтипов, лечение и прогноз варьируется в зависимости от подтипа. Пятилетняя выживаемость колеблется от 15 до 70%, а частота рецидивов колеблется от 78 до 33% в зависимости от подтипа.

Моноклональные антитела представляют собой класс терапевтических белков, которые могут быть использованы для лечения клеточных пролиферативных заболеваний и расстройств, в частности тех, которые поражают гемопоэтическую систему. Ряд благоприятных свойств антител, включая, но не ограничиваясь этим, специфичность к мишени, способность опосредовать иммунные эффекторные механизмы и продолжительный период полувыведения из сыворотки, делает антитела эффективными терапевтическими средствами. В настоящем изобретении описаны антитела против протоонкогена РЬТ3.

Было обнаружено, что РЬТ3 играет значительную роль в возникновении и развитии лейкозов, в частности ЛМЬ, и первые испытания с ингибиторами РЬТ3 у пациентов с ЛМЬ показали обнадеживающие результаты. Однако до сих пор существует потребность в антителах против РЬТ3, которые полезны в лечении лейкозов, таких как ЛМЬ.

Клинический успех антител, направленных против РЬТ3, зависит от их потенциального(ых) механизма(ов) действия. Существует ряд возможных механизмов, с помощью которых антитела опосредуют клеточные эффекты, включая антипролиферацию посредством блокирования необходимых путей роста, внутриклеточных сигнальных путей, ведущих к апоптозу, повышающую регуляцию и/или оборот рецепторов, комплемент-зависимую цитотоксичность (СЭС), антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (АЭСС), антитело-зависимый клеточно-опосредованный фагоцитоз (АЭСР) и стимуляцию адаптивного иммунного ответа (Сгадд е! а1., 1999, Сигг Θρίπ 1ттипо1 11 541-547, О1епте е! а1., 2000, 1ттипо1 Тойау 21, 403-410). Эффективность антител может определяться комбинацией этих механизмов, и их относительное значение в клинической терапии онкологии, по-видимому, зависит от рака.

Важность РсуК-опосредованных эффекторных функций для активности некоторых антител было продемонстрирована на мышах (С1упе8 е! а1., 1998, Ргос ЫаЙ Асай 8а И8А 95 652-656, С1упе8 е! а1., 2000, Ν;·Π Мей 6 443-446) и из наблюдаемых корреляций между клинической эффективностью у людей и их аллотипом полиморфных форм РсуКШа с высокой (У158) или низкой (Р158) аффинностью (Сайгоп е! а1., 2002, В1оой 99 754-758, ХУепд & Ьеуу, 2003, 1оигпа1 о£ Сйшса1 Опсо1оду, 21 3940-3947). В совокупности, эти данные свидетельствуют о том, что антитело, которое оптимизировано для связывания с определенными РсуКк, может лучше опосредовать эффекторные функции и таким образом более эффективно разрушать клетки-мишени у пациентов. Таким образом, многообещающим средством повышения противоопухолевой активности антител является увеличение их способности опосредовать цитотоксические эффекторные функции, такие как АЭСС, АЭСР и СЭС. Кроме того, антитела могут опосредовать противоопухолевый механизм через рост-ингибирующий или апоптотический сигнальный путь, который может наблюдаться при связывании антитела с его мишенью на опухолевых клетках. Такой сигнальной путь может потенциироваться, когда антитела представлены на опухолевых клетках, связанных с иммунными клетками посредством РсуК. Поэтому повышенная аффинность антител к РсуКк может привести к увеличенным антипролиферативным эффектам.

Некоторый успех был достигнут при модификации антител с селективно повышенным связыванием с РсуКк для обеспечения повышенной эффекторной функции. Антитело, сконструированное для оптимизированной эффекторной функции, было получено с использованием аминокислотных модификаций (см., например, патентную заявку США И8 2004-0132101 или патентную заявку США 2006-0024298.

К сожалению, не известно априори, какие механизмы действия могут быть оптимальными для данного целевого антигена. Кроме того, неизвестно, какие антитела способны опосредовать данный механизм действия против клетки-мишени. В некоторых случаях отсутствие антительной активности, либо Ρν-опосредованное, либо Рс-опосредованное, может быть из-за нацеливания эпитопа на антиген-мишень, который является недостаточным для опосредования такой активности. В других случаях целевой эпитоп может быть пригоден для желаемой Ρν-опосредованной или Рс-опосредованной активности, хотя аффинность (аффинность Ρν-области в отношении антигена или аффинность Рс-области в отношении Рсрецепторов) может быть недостаточной. Для решения этой проблемы в настоящем изобретении описаны модификации антител против РЬТ3, которые обеспечивают Рс-опосредованные активности, например, генерированную йе ηоνо или оптимизированную Рс-опосредованную активность.

Антитела представляют собой иммунологические белки, которые связывают специфический антиген. У большинства млекопитающих, включая людей и мышей, антитела сконструированы из спаренных тяжелых и легких полипептидных цепей. Вариабельные области легкой и тяжелой цепей демонстрируют значительное разнообразие последовательностей между антителами и отвечают за связывание антигенамишени. Каждая цепь состоит из отдельных иммуноглобулиновых (1д) доменов и, таким образом, для таких белков используется общий термин иммуноглобулин.

Структурные единицы природного антитела, как правило, содержат тетрамер. Каждый тетрамер обычно содержит две идентичные пары полипептидных цепей, где каждая пара имеет одну легкую цепь (обычно имеющую молекулярную массу примерно 25 кДа) и одну тяжелую цепь (обычно имеющую молекулярную массу примерно 50-70 кДа). Каждая из легких и тяжелых цепей состоит из двух раз- 10 027502 личных областей, называемых вариабельной и константной областями. Для иммуноглобулинов класса 1дС тяжелая цепь состоит из четырех иммуноглобулиновых доменов, соединенных от Ν- к С-концу в порядке УН-СН1-СН2-СН3, относящихся соответственно к вариабельному домену тяжелой цепи, константному домену 1 тяжелой цепи, константному домену 2 тяжелой цепи и константному домену 3 тяжелой цепи (также называемых УН-Су1-Су2-Су3, относящихся соответственно к вариабельному домену тяжелой цепи, константному домену гамма 1, константному домену гамма 2 и константному домену гамма 3). Легкая цепь 1§С состоит из двух иммуноглобулиновых доменов, соединенных от Ν- к С-концу в порядке УЪ-СЬ, относящихся соответственно к вариабельному домену легкой цепи и константному домену легкой цепи. Константные области демонстрируют меньшее разнообразие последовательностей и отвечают за связывание ряда природных белков для индукции важных биохимических событий.

Вариабельная область антитела содержит антиген-связывающие детерминанты молекулы и, таким образом, определяет специфичность антитела в отношении его антигена-мишени. Вариабельная область называется так потому, что ее последовательность в наибольшей степени отличается от других антител в пределах того же класса. В вариабельной области три петли собраны для каждого из У-доменов тяжелой цепи и легкой цепи с образованием антиген-связывающего сайта. Каждая из петель известна как участок, определяющий комплементарность (далее называемый СОК), в котором изменение аминокислотной последовательности является наиболее значимым. Имеется всего 6 СЭКк, по три на каждую тяжелую и легкую цепь, обозначенных как У_Н СЭК1, У_Н СЭК2, У_Н СЭК3, У_ъ СЭК1, У_ъ СЭК2 и У_ъ СЭК3. Вариабельная область за пределами СЭКк называется каркасной областью (РК). Хотя она не столь разнообразна, как СЭКк, между различными антителами наблюдается вариабельность последовательностей в РК области. В целом, эта характерная архитектура антител обеспечивает стабильный каркас (РК область), в котором значительное разнообразие связывания с антигеном (СЭКк) может быть выявлено иммунной системой с получением специфичности в отношении широкого круга антигенов. Имеется ряд структур с высоким разрешением для множества фрагментов вариабельной области из различных организмов, некоторых несвязанных и некоторых находящихся в комплексе с антигеном. Последовательность и структурные признаки вариабельных областей антитела раскрыты, например, в Могеа е! а1., 1997, Вюрйук СЬет 68:9-16; Могеа е1 а1., 2000, Ме!Ьобк 20:267-279, а консервативные признаки антител раскрыты, например, в Маупагб е! а1., 2000, Аппи Кеу Вютеб Епд 2:339-376.

Антитела группируются по классам, также известным как изотипы, генетически определяемым по константной области. Человеческие константные легкие цепи классифицируются как каппа (Ск) и лямбда (СХ) легкие цепи. Человеческие тяжелые цепи классифицируются как мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон и определяют изотип антитела соответственно как 1дМ, Ι§ϋ, 1§С, 1дА и 1дЕ. 1§С класс является наиболее распространенным, используемым для терапевтических целей.

Под ЛдС, как использовано в данной заявке, подразумевают полипептид, относящийся к классу антител, которые по существу кодируются общепризнанным геном иммуноглобулина гамма. У людей этот класс включает подклассы 1дС1, 1дС2, 1дС3 и 1дС4. У мышей этот класс включает подклассы 1дС1, 1дС2а, 1дС2Ь и 1дС3. 1дМ имеет подклассы, включая, но не ограничиваясь этим, 1дМ1 и 1дМ2. 1дА имеет несколько подклассов, включая, но не ограничиваясь этим, 1дА1 и 1дА2. Таким образом, изотип, как использовано в данной заявке, означает любой из классов или подклассов иммуноглобулинов, определяемых химическими и антигенными характеристиками их константных областей. Известные изотипы человеческих иммуноглобулинов представляют собой Ι§Ο1, 1§О2, 1§О3, 1§О4, 1§А1, 1§А2, 1§М1, 1§М2, Ι§Ό и 1дЕ.

Для изобретение также могут быть полезны 1§С, которые представляют собой гибридные композиции природных изотипов 1§С человека. Эффекторные функции, такие как АЭСС, АЭСР, СЭС и период полувыведения из сыворотки, существенно различаются между различными классами антител, включая, например, человеческие Ι§Ο1, Ι§Ο2, Ι§Ο3, Ι§Ο4, 1§А1, 1§А2, Ι§ϋ, 1дЕ, Ι§Ο и 1дМ (МюЬаекеп е! а1., 1992, Мо1еси1аг Iттиио1оду, 29(3): 319-326). В ряде исследований изучали Ι§Ο1, Ι§Ο2, Ι§Ο3 и Ι§Ο4 варианты для того, чтобы определить детерминанты различий эффекторных функций между ними. См., например, Сапйе1б & Моткоп, 1991, I. Ехр. Меб. 173: 1483-1491; СЬарре1 е! а1., 1991, Ргос. Νηΐ1. Асаб. 8с1. И8А 88(20): 9036-9040; СЬарре1 е! а1., 1993, 1оита1 о£ Вю1одюа1 СЬеш1к!гу 268:25124-25131; Тао е! а1., 1991, I. Ехр. Меб. 173: 1025-1028; Тао е! а1., 1993, I. Ехр. Меб. 178: 661-667; Кебра!Ь е! а1., 1998, Нитап Iттиио1оду, 59, 720-727.

Как описано в патентной заявке США 2006-0134105, озаглавленной ЛдС ПптиподюЬиНп УапаШк мпП ОрРии/еб Е££ес!ог РипсРоп, можно сконструировать аминокислотные модификации в антителе, которые содержат константные области из других иммуноглобулиновых классов. Такие сконструированные гибридные ΙβΟ композиции могут обеспечивать улучшенные эффекторные функциональные свойства, включая улучшенные АЭСС, фагоцитоз, СЭС и период полувыведения из сыворотки.

В данной области техники хорошо известно, что в человеческой популяции существует иммуноглобулиновые полиморфизмы. Ст полиморфизм определяется генами ЮНО1, ЮНО2 и ЮНО3, которые имеют аллели, кодирующие аллотипические антигенные детерминанты, известные как С1т, С2т и С3т аллотипы для маркеров человеческих молекул ЦС!, ^С2 и ЦС3 (Ст аллотипы не были обнаружены на

- 11 027502 гамма 4 цепи). Маркеры можно классифицировать как аллотипы и изоаллотипы. Они различаются по различной серологической основе, зависящей от строгой гомологии последовательностей между изотипами. Аллотипы представляют собой антигенные детерминанты, определяемые аллельными формами 1д генов. Аллотипы представляют незначительные различия в аминокислотных последовательностях тяжелых или легких цепей различных индивидуумов. Даже различие по одному аминокислотному остатку может привести к аллотипической детерминанте, хотя во многих случаях наблюдалось несколько аминокислотных замен. Аллотипы представляют различия последовательности между аллелями подкласса, на основании которых антисыворотки распознают только аллельные различия. Изоаллотип представляет собой аллель в одном изотипе, который дает эпитоп, который является общим с неполиморфной гомологичной областью одного или более других изотипов, и вследствие этого антисыворотка будет реагировать с соответствующими аллотипами и соответствующими гомологичными изотипами (С1агк, 1997, 1дО ейес!ог тесЬап18т8, Сйет. 1ттипо1. 65-88-110, Оогтап & С1агк, 1990, §етт. 1ттипо1. 2(6):457-66).

Аллельные формы человеческих иммуноглобулинов хорошо охарактеризованы. Дополнительно были охарактеризованы другие полиморфизмы (Ктт, е! а1., 2001, I. Мой Еуо1. 54 1-9, включен в данную заявку посредством ссылки). В настоящее время известны 18 От аллотипов: О1т (1, 2, 3, 17) или О1т (а, χ, ί, ζ), О2т (23) или О2т (п), О3т (5, 6, 10, 11, 13,14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) или О3т (Ь1, с3, Ь5, Ь0, Ь3, Ь4, 8, !, д1, с5, и, ν, д5) (Ье&апс, е! а1., Тйе йитап 1дО 8иЬс1а88е8: то1еси1аг апа1у818 о! 51гис1иге. Гипсйоп апб геди1а!юп Регдатоп, О.хГогб, рр 43-78 (1990), ЙеГгапс, О. е! а1., 1979, Нит. Оепе!.: 50, 199-211). Аллотипы, которые наследуются в фиксированных комбинациях, называются От гаплотипами. Антитела по настоящему изобретению по существу могут кодироваться любым аллотипом, изоаллотипом или гаплотипом любого гена иммуноглобулина. Антитела по настоящему изобретению по существу могут кодироваться генами из любого организма, например, млекопитающих, включая, но не ограничиваясь этим, людей, грызунов, включающих, но не ограничивающихся этим, мышей и крыс, зайцеобразных, включающих, но не ограничивающихся этим, кроликов и зайцев, верблюжьих, включающих, но не ограничивающихс этим, верблюдов, лам и дромедаров, и приматов, не являющихся человеком, включая, но не ограничиваясь этим, полуобезьян, капуцинов (обезьян Нового Света), СегсорййесоМеа (обезьян Старого Света) и гоминоидов, включающих гиббонов и гиббоновых, а также человекообразных приматов.

В одном воплощении антитела по настоящему изобретению являются по существу человеческими. Антитела по настоящему изобретению по существу могут кодироваться иммуноглобулиновыми генами, принадлежащими к любому классу антител. В одном воплощении антитела по настоящему изобретению содержат последовательности, принадлежащие к 1дО классу антител, включая человеческие подклассы 1дО1, 1дО2, 1дО3 и 1дО4. В альтернативном воплощении антитела по настоящему изобретению содержат последовательности, принадлежащие к 1дА (включая человеческие подклассы 1дА1 и 1дА2), 1дИ, 1дЕ, 1дО или 1дМ классам антител. Антитела по настоящему изобретению могут содержать больше чем одну белковую цепь. Таким образом, настоящее изобретение может найти применение в антителе, которое является мономером или олигомером, в том числе гомо- или гетеро-олигомером.

В одном воплощении антитела по изобретению основаны на человеческих последовательностях 1дО, и, таким образом, человеческие последовательности 1дО используют в качестве основных последовательностей, с которыми сравниваются другие последовательности, включая, но не ограничиваясь этим, последовательности из других организмов, например, последовательности грызунов и приматов, а также последовательности других классов иммуноглобулинов, таких как 1дА, 1дЕ, 1дИ, 1дМ и тому подобное. Предусматривается, что хотя антитела по настоящему изобретению конструируют в контексте одного родительского антитела, варианты можно конструировать или переносить в контекст другого, второго родительского антитела. Это достигается путем определения эквивалентных или соответствующих остатков и замен между первым и вторым антителами, как правило, на основании последовательности или структурной гомологии между последовательностями двух антител. Для того чтобы установить гомологию, аминокислотную последовательность первого антитела, охарактеризованного в данной заявке, сравнивают непосредственно с последовательностью второго антитела. После выравнивания последовательностей с использованием одной или более программ выравнивания, известных в данной области техники (например, с использованием консервативных остатков между видами), с учетом необходимых вставок и делеций для установления выравнивания (т.е. во избежание элиминации консервативных остатков в результате случайной делеций и вставки), определяют остатки, эквивалентные конкретным аминокислотам в первичной последовательности первого антитела. Выравнивание консервативных остатков может сохранить 100% таких остатков. Однако выравнивание более чем 75% или до 50% консервативных остатков также является адекватным для определения эквивалентных остатков. Эквивалентные остатки также могут быть определены путем определения структурной гомологии между первым и вторым антителом, т.е. на уровне третичной структуры для антител, структура которых была определена. В этом случае эквивалентные остатки определяют как остатки, для которых атомные координаты двух или более основных атомов цепи конкретного аминокислотного остатка родительского или предшественника (Ν на Ν, СА на С А, С на С и О на О) находятся в пределах 0,13 нм, например, 0,1 нм после выравнивания. Выравнивание достигается после того, как лучшая модель была ориентирована и расположена для получения максимального перекрывания атомных координат неводородных белковых

- 12 027502 атомов белков. Независимо от того, как определяют эквивалентные или соответствующие остатки и независимо от идентичности родительского антитела, на основании которого получают антитела, подразумевается, что антитела, раскрытые в настоящем изобретении, могут быть сконструированы в любое второе родительское антитело, которое имеет значительную гомологию последовательности или структурную гомологию с антителом. Таким образом, например, если получают вариант антитела, где родительское антитело представляет собой 1д01 человека, с использованием способов, описанных выше или других способов определения эквивалентных остатков, вариант антитела можно сконструировать в родительском антителе 1д02 человека, родительском антителе 1дА человека, родительском антителе 1д02а или 1д02Ь мыши и тому подобном. Опять же, как описано выше, контекст родительского антитела не влияет на способность переносить антитела по настоящему изобретению на другие родительские антитела. Например, варианты антитела, которые сконструированы на основе человеческого антитела 1дО1, которое нацелено на один антигенный эпитоп, можно перенести в человеческое антитело 1дО2, которое нацелено на другой антигенный эпитоп и так далее.

В 1д0 классе иммуноглобулинов имеется несколько иммуноглобулиновых доменов в тяжелой цепи. Под иммуноглобулиновым (1д) доменом в данной заявке подразумевают область иммуноглобулина, имеющую определенную третичную структуру. В настоящем изобретении представляют интерес домены константной тяжелой цепи, включая константные домены тяжелой (СН) цепи и шарнир. В контексте 1д0 антител, каждый из изотипов 1д0 имеет три СН области: СН1 относится к положениям 118-220, СН2 относится к положениям 237-340, и СНЗ относится к положениям 341-447 согласно ЕЙ индексу по Кабату. Под шарниром, или шарнирной областью, или шарнирной областью антитела, или шарнирной областью иммуноглобулина в данной заявке подразумевают гибкий полипептид, содержащий аминокислоты между первым и вторым константными доменами антитела. Структурно СН1-домен 1д0 заканчивается в ЕЙ положении 220 и СН2-домен 1д0 начинается в остатке в ЕЙ положении 237. Таким образом, для 1д0 шарнир определяют в данной заявке как включающий положения с 221 (Э221 в 1дО1) до 236 (0236 в 1дО1), где нумерация соответствует ЕЙ индексу по Кабату. В некоторых воплощениях, например в контексте Ре-области, включают более нижний шарнир, где более нижний шарнир обычно относится к положениям 226 или 230. Константная тяжелая цепь, как определено в данной заявке, относится к области от Ν-конца СН1-домена до С-конца СН3-домена, таким образом, содержащей положения 118-447, где нумерация соответствует ЕЙ индексу. Константная легкая цепь содержит единственный домен и, как определено в данной заявке, относится к положениям 108-214 Ск или СХ, где нумерация соответствует ЕЙ индексу.

В частности, в определение антитело включены полноразмерные антитела. Под полноразмерным антителом в данной заявке подразумевают структуру, которая составляет природную биологическую форму антитела, включая вариабельную и константную области. Например, у большинства млекопитающих, включая людей и мышей, полноразмерное антитело 1д0 класса представляет собой тетрамер и состоит их двух идентичных пар двух иммуноглобулиновых цепей, где каждая пара имеет одну легкую и одну тяжелую цепь, каждая легкая цепь содержит иммуноглобулиновые домены УЬ и СЬ и каждая тяжелая цепь содержит иммуноглобулиновые домены УН, СН1 (Су1), СН2 (Су2) и СНЗ (Су3). У некоторых млекопитающих, например у верблюдов и лам, 1д0 антитела могут состоять только из двух тяжелых цепей, где каждая тяжелая цепь содержит вариабельный домен, присоединенный к Рс-области.

Альтернативно, антитела могут иметь различные структуры, включая, но не ограничиваясь этим, фрагменты антител. Фрагменты антител включают, но не ограничиваются этим, биспецифические антитела, мини-антитела, доменные антитела, синтетические антитела, миметики антитела, химерные антитела, слияния антител (иногда называемые конъюгатами антител) и фрагменты каждого из них соответственно. Специфические фрагменты антител включают, но не ограничиваются этим, (1) РаЬ-фрагмент, состоящий из УЬ-, УН-, СЬ- и СН1-доменов, (2) Рй-фрагмент, состоящий из УН- и СН1-доменов, (3) Ρνфрагмент, состоящий из УЬ- и УН-доменов одного антитела; (4) йАЬ фрагмент, который состоит из единичной вариабельной области, (5) выделенные СЭК участки, (6) Р(аЬ')₂-фрагменты, бивалентный фрагмент, содержащий два связанных РаЬ-фрагмента, (7) одноцепочечные Ρν молекулы ΚΡν). где УН-домен и УЪ-домен соединены пептидным линкером, который позволяет двум доменам связываться с образованием антиген-связывающего сайта, (8) биспецефические одноцепочечные Ρν-димеры и (9) диатела или триатела, поливалентные или полиспецифические фрагменты, сконструированные посредством слияния генов. Фрагменты антитела могут быть модифицированы. Например, молекулы можно стабилизировать посредством включения дисульфидных мостиков, связывающих УН- и УЪ-домены. Примеры форматов и архитектуры антител описаны в НоШдет & Нийкоп, 2006, №Цигс Вю!есЬпо1о§у 23(9):1126-1136 и Сайет 2006, №Циге КеОе\У5 1шшипо1о§у 6:343-357 и ссылки, приведенные в них.

Антитела по изобретению могут включать полиспецифические антитела, особенно биспецифические антитела, иногда также называемые диателами. Последние представляют собой антитела, которые связываются с двумя (или более) различными антигенами. Диатела могут быть получены различными способами, известными в данной области техники, например, получены химически или из гибридом. В одном воплощении антитело представляет собой мини-антитело. Мини-антитела представляют собой

- 13 027502 минимизированные антитело-подобные белки, содержащие есРу, присоединенные к СН3-домену. В некоторых случаях есРу может быть присоединен к Рс-области и может включать часть или всю шарнирную область. Для описания полиспецифических антител см. НоШдет & Нибеоп, 2006, №Циге Вю!есЬпо1оду 23(9): 1126-1136 и ссылки, приведенные в данном документе.

В одном воплощении антитело по изобретению представляет собой фрагмент антитела. Особый интерес представляют антитела, содержащие Рс-области, Рс-слияния и константную область тяжелой цепи (СН1-шарнир-СН2-СН3). Антитела по настоящему изобретению могут содержать Рс-фрагменты.

Рс-фрагмент по настоящему изобретению может содержать от 1 до 90% Рс-области, например, от 10 до 90%, от 30 до 90% и т.д. Таким образом, например, Рс-фрагмент по настоящему изобретению может содержать Су2-домен 1дО1, Су2-домен 1дО1 и шарнирную область, Су3-домен 1дО1 и тому подобное. В одном воплощении Рс-фрагмент по настоящему изобретению дополнительно содержит партнер слияния, эффективно осуществляющий слияние с Рс-фрагментом. Рс-фрагменты могут содержать или не содержать дополнительную полипептидную последовательность.

Иммуногенность является результатом сложной последовательности ответов на вещество, которое воспринимаются как чужеродное, и может включать продукцию нейтрализующих и ненейтрализующих антител, образование иммунных комплексов, активацию комплемента, активацию тучных клеток, воспаления, реакции гиперчувствительности и анафилаксию. Некоторые факторы могут вносить вклад в иммуногенность белка, включая, но не ограничиваясь этим, белковую последовательность, способ и частоту введения и популяцию пациентов. Иммуногенность может ограничивать эффективность и безопасность белкового терапевтического средства различными путями. Эффективность может быть непосредственно уменьшена путем образования нейтрализующих антител. Эффективность также может быть уменьшена опосредованно, поскольку связывание либо с нейтрализующими, либо с ненейтрализующими антителами, как правило, приводит к быстрому выведению из сыворотки. Серьезные побочные эффекты и даже смерть может произойти при увеличении иммунного ответа. Таким образом, в одном воплощении конструирование белка используют для уменьшения иммуногенности антител по настоящему изобретению.

В некоторых воплощениях каркасные компоненты могут представлять собой смесь из разных видов. Такое антитело может представлять собой химерное антитело и/или гуманизированное антитело. В целом, как химерные антитела, так и гуманизированные антитела относятся к антителам, которые объединяют участки из более чем одного вида. Химерные антитела традиционно содержат вариабельную(ые) область(и) из мыши (или крысы, в некоторых случаях) и константную(ые) область(и) из человека (Μοττίβοη е! а1., 1984, Ргос Ыаб Асаб 8с1 И8А 81, 6851-6855).

Под гуманизированным антителом, как использовано в данной заявке, подразумевают антитело, содержащее человеческий каркасный участок (РК) и один или более участков, определяющих комплементарность (СГОКе), из нечеловеческого (обычно мышиного или крысиного) антитела. Нечеловеческое антитело, предоставляющее СГОКе, называют донорным, а человеческий иммуноглобулин, предоставляющий каркас, называют акцепторным. Гуманизация основана главным образом на переносе донорных СГОКе на акцепторные (человеческие) УЬ- и УН-каркасы (\Уш1ег И8 5225539). Эта стратегия называется переносом СОК. Часто требуется обратная мутация выбранных акцепторных каркасных остатков в соответствующие донорные остатки для восстановления аффинности, которая теряется в исходной перенесенной конструкции (И8 5693762). Гуманизированное антитело оптимально будет содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, как правило, человеческого иммуноглобулина, и, таким образом, обычно будет содержать человеческую Рс-область. Разные методы и способы гуманизации и перестройки нечеловеческих антител хорошо известны в данной области техники (см. ТеигиеЫ!а & Уаесще/, 2004, Ниташ/аОоп оГ Мопос1опа1 АпИЬоб1ее, Мо1еси1аг Вю1оду оГ В Се11е, 533-545, Е1ееу1ег 8с1епсе (И8А) и ссылки, приведенные в данном документе). Гуманизация или другие способы снижения иммуногенности вариабельных областей нечеловеческого антитела могут включать способы изменения поверхности, как описано, например, в Кодиека е! а1., 1994, Ргос Ыаб Асаб 8а И8А 91 969973). В одном воплощении способы на основе селекции могут быть использованы для гуманизации и/или созревания аффинности вариабельных областей антитела, т.е. для увеличения аффинности вариабельной области в отношении его целевого антигена. Другие способы гуманизации могут вовлекать перенос только частей СГОКе, включая, но не ограничиваясь этим, способы, описанные в Тап е! а1., 2002, 1. 1ттипо1 169 1119-1125, Эе РаесаПе е! а1., 2002, 1. 1ттипо1 169 3076-3084. Для гуманизации и созревания аффинности могут быть использованы структурные способы, например, как описано в патенте США 7117096 и родственных заявках.

В некоторых вариантах иммуногенность антитела уменьшают с использованием способа, описанного в патентной заявке США 2006-0008883, озаглавленной Мебюбе оГ Оепетайпд Уапап! Рто!ете νίΐΠ 1псгеаееб Ное! 81тшд Соп!еп! апб С’отроеПюпе ТНегеоГ, поданной З декабря 2004 г.

Модификации для уменьшения иммуногенности могут включать модификации, которые уменьшают связывание процессированных пептидов, происходящих из родительской последовательности, с белками МНС (главный комплекс гистосовместимости). Например, аминокислотные модификации сконструированы таким образом, что нет или имеется минимальное число иммунных эпитопов, которые теоре- 14 027502 тически могут связываться с высокой аффинностью с любыми преобладающими аллелями МНС. Некоторые способы идентификации МНС-связывающих эпитопов в белковых последовательностях известны в данной области техники и могут быть использованы для оценки эпитопов в антителе по настоящему изобретению. См., например, патентные заявки США 2002-0119492, 2004-0230380 или 2006-0148009 и ссылки, приведенные в данных документах.

В альтернативном воплощении антитела по настоящему изобретению могут быть полностью человеческими, т.е. последовательности антител являются полностью или по существу человеческими. Полностью человеческое антитело или полное человеческое антитело относится к человеческому антителу, имеющему генную последовательность антитела, происходящего из человеческой хромосомы с модификациями, описанными в данной заявке. В данной области техники известно множество способов получения полностью человеческих антител, включая применение трансгенных мышей (Вгиддетапп е! а1., 1997, Сигг Ορΐη Вю1есЪпо1 8:455-458) или библиотек человеческих антител в сочетании со способами селекции (ΘτΐίϊΐίΗδ е! а1., 1998, Сигг Ορΐη Вю1есЬпо1 9:102-108).

Антитела по настоящему изобретению нацелены на РЬТ3 и могут содержать вариабельные области (например, С1Ж+) любого известного или неизвестного антитела против РЬТ3. Антитела по изобретению могут демонстрировать селективность в отношении РЬТ3. Примеры включают полноразмерные против сплайс-вариантов, находящиеся на клеточной поверхности против растворимых форм, селективность в отношении различных полиморфных вариантов или селективность в отношении специфических конформационных форм мишени. Антитело по настоящему изобретению может связывать любой эпитоп или участок на 14.Т3 и может быть специфическим в отношении фрагментов, мутантных форм, сплайсформ или аберрантных форм антигенов. Был обнаружен ряд полезных антител, которые нацелены на РЬТ3 и могут найти применение в настоящем изобретении.

Подходящие 14.Т3 антитела включают анти-РЬТ3 антитела 4С8 и ВУ10, как раскрыто в патенте США № 5777084 и патенте США № 6156882.

Антитела по настоящему изобретению могут найти применение в широком диапазоне продуктов. В одном воплощении антитело по изобретению представляет собой терапевтическое средство, диагностическое средство или реагент для исследования. В одном воплощении антитело по изобретению представляет собой терапевтическое средство. Антитело по настоящему изобретению может найти применение в антительной композиции, которая является моноклональной или поликлональной. В одном воплощении антитела по настоящему изобретению используют для цитолиза клеток-мишеней, которые несут целевой антиген, например, раковые клетки. В альтернативном воплощении антитела по настоящему изобретению используют для блокирования, осуществления антагонической или агонистической активности в отношении целевого антигена. В альтернативном воплощении антитела по настоящему изобретению используют для блокирования, осуществления антагонической или агонистической активности целевого антигена и цитолиза клеток-мишеней, которые несут целевой антиген.

Признано, что последовательности вариабельных доменов, включающих С1Ж+ идентифицированные в данной заявке, могут быть объединены в любой комбинации в антителе. Кроме того, эти последовательности могут быть независимо модифицированы путем добавления всей или части Рс-области или Рс-варианта, как описано здесь. Модифицированные последовательности также могут быть объединены в любой комбинации в антителе.

Настоящее изобретение направлено на антитела, содержащие модификации, где указанные модификации изменяют аффинность к одному или более Рс рецепторам и/или изменяют способность антитела опосредовать одну или более эффекторных функций. Модификации по изобретению включают аминокислотные модификации.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что путем введения аминокислотных замен 239Ώ и 332Е в СН2-домене Рс-части известных антител против РЬТ3, таких как 4С8 и ВУ10 (выше), активность этих антител при цитолизе клеток может быть значительно увеличена или даже впервые выявлена и вызвана. В одном воплощении аминокислотные замены представляют собой 8239Ώ и Ι332Ε. Это удивительно, поскольку экспериментально было показано, что такие же модификации обычно не увеличивают активность при цитолизе клеток. Другими словами, в различных антителах, направленных на другой целевой антиген, введение этих замен не оказывало заметного влияния на цитолиз клеток.

В дополнение к этому, такие модифицированные антитела могут содержать дополнительные аминокислотные модификации в положениях константной области тяжелой цепи

221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231,

232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 240, 241,243, 244, 245, 246, 247, 249, 255, 258,

260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271,272, 273, 274, 275, 276, 278,

280, 281,282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291,292, 293, 294, 295, 296, 297, 298,

299, 300, 301,302, 303, 304, 305, 313, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327,

328, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 336 и 337,

- 15 027502 которые, как было обнаружено, допускают модификацию РсуК-связывающих свойств, эффекторной функции и потенциальных клинических свойств антител (см. υδδΚ 11/124,620, поданную 5 мая 2005 г., озаглавленную 'ΌρΙίηιί/οίΙ Рс Уапап1§).

В частности, дополнительные варианты, которые изменяют связывание с одним или более человеческими Рс-рецепторами, могут содержать аминокислотную модификацию в константной области тяжелой цепи, как описано в данной заявке, выбранную из группы, состоящей из

221 К, 221Υ,

222Е, 222Υ, 223Е, 223К, 224Е, 224Υ, 225Е, 225К, 225\Л/, 227Е, 2270, 227К, 227Υ,

228Е, 2280, 228К, 228Υ, 230А, 230Е, 230С, 230Υ, 231Е, 2310, 231 К, 231 Р, 231Υ,

232Е, 2320, 232К, 232Υ, 233А, 233ϋ, 233Е, 2330, 233Н, 233Ι, 233К, 233Ι_, 233М,

233Ν, 2330, 233В, 2338, 233Т, 233У, 233\Л/, 233Υ, 234А, 234ϋ, 234Е, 234Е,

2340, 234Н, 234Ι, 234К, 234М, 234Ν, 234Р, 2340, 234В, 2348, 234Т, 234У, 234\Л/,

234Υ, 235А, 235ϋ, 235Е, 235Е, 2350, 235Н, 235Ι, 235К, 235М, 235Ν, 235Р, 2350,

235В, 2358, 235Т, 235У, 235\Л/, 235Υ, 236А, 236ϋ, 236Е, 236Е, 236Н, 236Ι, 236К,

236Ь, 236М, 236Ν, 236Р, 2360, 236В, 2368, 236Т, 236У, 236\Л/, 236Υ, 237ϋ,

237Е, 237Е, 237Н, 237Ι, 237К, 237Ι_, 237М, 237Ν, 237Р, 2370, 237В, 2378, 237Т,

237У, 23777, 237Υ, 238ϋ, 238Е, 238Е, 2380, 238Н, 238Ι, 238К, 238Ι_, 238М, 238Ν,

2380, 238В, 2388, 238Т, 238У, 238\Л/, 238Υ, 240А, 240Ι, 240М, 240Т, 241 ϋ, 241Е,

241Ь, 241В, 2418, 24177, 241 Υ, 243Е, 243Н, 243Ι-, 2430, 243В, 24377, 243Υ,

244Н, 245А, 246ϋ, 246Е, 246Н, 246Υ, 2470, 247У, 249Н, 2490, 249Υ, 255Е, 255Υ,

258Н12583, 258Υ, 260ϋ, 260Е, 260Н, 260Υ, 262А, 262Е, 262Е, 262Ι, 262Т, 263А,

263Ι, 263М, 263Т, 264А, 264ϋ, 264Е, 264Е, 2640, 264Н, 264Ι, 264К, 264Ι_, 264М,

264Ν, 264Р, 2640, 264В, 2648, 264Т, 264\Л/, 264Υ, 265Е, 2650, 265Н, 265Ι, 265К,

265Ι-, 265М, 265Ν, 265Р, 2650, 265В, 2653, 265Т, 265У, 265\Л/, 265Υ, 266А, 266Ι,

266М, 266Т, 267ϋ, 267Е, 267Е, 267Н, 267Ι, 267К, 267Ι_, 267М, 267Ν, 267Р, 2670,

267В, 267Т, 267ν, 267\Ν, 267Υ, 268ϋ, 268Е, 268Е, 2680, 268Ι, 268К, 268Ι_, 268М,

268Р, 2680, 268В, 268Т, 268У, 268\Л/, 269Е, 2690, 269Н, 269Ι, 269К, 269Ι_, 269М,

269Ν, 269Р, 269В, 2693, 269Т, 269У, 269\Л/, 269Υ, 270Е, 2700, 270Н, 270Ι, 270Ι-,

270М, 270Р, 2700, 270В, 2703, 270Т, 27077, 270Υ, 271 А, 271 ϋ, 271Е, 271Е,

2710, 271Н, 2711, 271К, 2711_, 271М, 271Ν, 2710, 271В, 2718, 271Т, 271У, 27177,

271 Υ, 272ϋ, 272Е, 2720, 272Н, 272Ι, 272К, 272Ι_, 272М, 272Р, 272В, 2723, 272Т,

272\/, 27277, 272Υ, 273Ι, 274ϋ, 274Е, 274Р, 2740, 274Н, 274Ι, 274Ι_, 274М, 274Ν,

274Р, 274В, 274Т, 274У, 27477, 274Υ, 275Ι-, 27577 , 276ϋ, 276Е, 276Е, 2760,

276Н, 276Ι, 276Ι_, 276М, 276Р, 276В, 2768, 276Т, 276У, 27677, 276Υ, 278ϋ, 278Е,

2780, 278Н, 278Ι, 278К, 278Ι_, 278М, 278Ν, 278Р, 2780, 278В, 2788, 278Т, 278У,

27877, 2800 , 280К, 280Ι_, 280Р, 28077, 281 ϋ, 281Е, 281 К, 281Ν, 281Р, 2810,

281 Υ, 282Е, 2820, 282К, 282Р, 282Υ, 2830, 283Н, 283К, 283Ι_, 283Р, 283В, 283Υ,

284ϋ, 284Е, 284Ι_, 284Ν, 2840, 284Т, 284Υ, 285ϋ, 285Е, 285К, 2850, 28577,

285Υ, 286Е, 2860, 286Р, 286Υ, 288ϋ, 288Е, 288Υ, 290ϋ, 290Н, 290Ι_, 290Ν,

29077, 291 ϋ, 291Е, 2910, 291 Η, 2911, 2910, 291Т, 292ϋ, 292Ε, 292Τ, 292Υ, 293Ε,

2930, 293Η, 293Ι, 293Ι_, 293Μ, 293Ν, 293Ρ, 293Β, 2933, 293Τ, 293У, 29377, 293Υ,

294Ε, 2940, 294Η, 294Ι, 294Κ, 294Ι_, 294Μ, 294Ρ, 294Β, 2948, 294Τ, 294У, 29477,

294Υ, 295ϋ, 295В, 295Ε, 2950, 295Η, 295Ι, 295Μ, 295Ν, 295Ρ, 295Β, 2953, 295Τ,

295У, 29577, 295Υ, 296Α, 296ϋ, 296Ε, 2960, 296Η, 296Ι, 296Κ, 296Ι_, 296Μ, 296Ν,

2960, 296Β, 2968, 296Τ, 296У, 297ϋ, 297Ε, 297Ε, 2970, 297Η, 297Ι, 297Κ, 297Ι_,

297Μ, 297Ρ, 2970, 297Β, 2973, 297Τ, 297У, 29777, 297Υ, 298Α, 298ϋ, 298Ε,

298Ε, 298Η, 298Ι, 298Κ, 298Μ, 298Ν, 2980, 298Β, 298Τ, 29877, 298Υ, 299Α, 299ϋ,

299Ε, 299Ε, 2990, 299Η, 299Ι, 299Κ, 299Ι_, 299Μ, 299Ν, 299Ρ, 2990, 299Β, 2993,

299Υ, 29977, 299Υ, 300Α, 300ϋ, 300Ε, 3000, 300Η, 300Κ, 300Μ, 300Ν, 300Ρ,

- 16 027502

3000, 300В, 3008, 300Т, 300ν, 300М, ЗОЮ, 301 Ε, 301 Η, 301 Υ, 302Ι, 303ϋ, 303Ε, 303Υ, 304ϋ, 304Η, 304Ι_, 304Ν, 304Τ, 305Ε, 305Τ, 305Υ, 313Ε, 317Ε, 3170, 318Η, 318Ι_, 3180, 318Β, 318Υ, 320ϋ, 320Ε, 3200, 320Η, 320Ι, 320Ι_, 320Ν, 320Ρ, 3208,

320Τ, 320ν, 320νν, 320Υ, 322ϋ, 322Ε, 3220, 322Η, 322Ι, 322Ρ, 3228, 322Τ, 322У,

322\Л/, 322Υ, 323Ι, 324ϋ, 324Ε, 3240, 324Η, 324Ι, 324Ι_, 324Μ, 324Ρ, 324Β, 324Τ, 324ν, 324Μ, 324Υ, 325Α, 325ϋ, 325Ε, 325Ε, 3250, 325Η, 325Ι, 325Κ, 325Ι_, 325Μ,

325Ρ, 3250, 325Β, 3258, 325Τ, 325У, 325Μ, 325Υ, 326Ε, 326Ι, 326Ι_, 326Ρ, 326Τ,

327ϋ, 327Ε, 327Ε, 327Η, 327Ι, 327Κ, 327Ι_, 327Μ, 327Ν, 327Ρ, 327Β, 3278, 327Τ, 327У, 327\Λ/, 327Υ, 328Α, 328ϋ, 328Ε, 328Ε, 3280, 328Η, 328Ι, 328Κ, 328Μ, 328Ν, 328Ρ, 3280, 328Β, 3288, 328Τ, 328У, 328\Λ/, 328Υ, 329ϋ, 329Ε, 329Ε, 3290, 329Η, 329Ι, 329Κ, 329Ι_, 329Μ, 329Ν, 3290, 329Β, 3298, 329Τ, 329У, 329Μ, 329Υ, 330Ε, 330Ε, 3300, 330Η, 330Ι, 330Ι_, 330Μ, 330Ν, 330Ρ, 330Β, 3308, 330Τ, ЗЗОУ, 330νν, 330Υ, 331 ϋ, 331 Ε, 331 Η, 3311, 3311_, 331 Μ, 3310, 331 Β, 331 Τ, 331V, 331 νν, 331 Υ, ЗЗЗА, 333Ε, 333Η, 333Ι, 333Ι_, ЗЗЗМ, ЗЗЗР, 333Τ, 333Υ, 334Α, 334Ε, 334Ι, 334Ι_, 334Ρ, 334Τ, 335ϋ, 335Ε, 3350, 335Η, 335Ι, 335Ι_, 335Μ, 335Ν, 335Ρ, 335Β, 3358, 335Υ, 335\Λ/, 335Υ, 336Ε, 336Κ, 336Υ, 337Ε, 337Η и 337Ν, где нумерация соответствует ЕЙ индексу.

Кроме того, антитела по изобретению могут содержать дополнительные аминокислотные модификации за пределами Ре-области, такие как описано в патенте США 7276585, поданном 24 марта 2005 г., озаглавленном 1шшипо§1оЬи1т уапап!з оШзЫе 11те Рс гедюп, включающие аминокислотные модификации в положениях константной области тяжелой цепи

118, 119, 120,

121, 122, 124, 126, 129, 131, 132, 133, 135, 136, 137, 138, 139, 147, 148, 150, 151,

152, 153, 155, 157, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 171, 172,

173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 183, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194,

195, 196, 197, 198, 199, 201,203, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211,212, 213, 214,

216, 217, 218, 219, 221,222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231,232, 233,

234, 235 и 236 и/или включающие аминокислотные модификации в положениях константной области легкой цепи 108, 109, 110, 111, 112, 114, 116, 121, 122,

123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 131, 137, 138, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 149,

150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167,

168, 169, 170, 171,172, 173, 174, 176, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 187, 188, 189,

190, 191, 193, 195, 197,199, 200, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 210, 211,212 и213.

Эти модификации могут обеспечить дополнительные модификации РсуК-связывающих свойств, эффекторной функции и потенциальных клинических свойств антител. В частности, варианты, которые изменяют связывание с одним или более человеческими Рс-рецепторами, могут содержать аминокислотную модификацию в константной области тяжелой цепи, как описано в данной заявке, выбранную из группы, состоящей из

- 17 027502

118К, 118Е,

118Υ, 119В, 119Е, 119Υ, 120В, 120Е, 1201, 121Е, 121 Υ, 121Н, 122Е, 122В, 124К,

124Е, 124Υ, 126К, 126ϋ, 129Ι_, 129ϋ, 1310, 131Т, 132ϋ, 132В, 132Ι_, 133В, 133Е,

133Ι_, 1351, 135Е, 135К, 136Е, Ι36Κ, 1361, 137Е, 1388, 138В, 138ϋ, 1391, 139Е,

139К, 147А, 147Е, 148Υ, 148К, 150Ι_, 150К, 150Е, 151А, 15Ю, 152Ι_, 152К, 1531_,

153ϋ, 155Е, 155К, 1551, 157Е, 157К, 157Υ, 159К, 159ϋ, 159Ι_, 160К, 160Е, 160Υ,

16Ю, 162ϋ, 162К, 162Υ, 163В, 164В, 164Е, 164Υ, 165ϋ, 165В, 165Υ, 166ϋ, 167А,

1681_, 169Е, 1710, 171Н, 172К, 172Ι_, 172Е, 173Т, 173ϋ, 174Е, 174К, 174Υ, 175ϋ,

175Ι_, 176ϋ, 176В, 176Ι_, 177В, 177Е, 177Υ, 178ϋ, 179К, 179Υ, 179Е, 180К, 180Ι_,

180Е, 183Т, 1871, 187К, 187Е, 1881, 189ϋ, 1890, 1901, 190К, 190Е, 19Ю, 191В,

191Υ, 192Ν, 192В, 1921_, 193Е, 193Е, 194В, 194ϋ, 195В, 195ϋ, 195Υ, 196К, 196ϋ,

196Ι_, 197В, 197Е, 197Υ, 198Ι_, 199Т, 199ϋ, 199К, 201Е, 201 К, 201Ь, 203ϋ, 203Ι_,

203К, 205ϋ, 205Ь, 206А, 206Е, 207К, 207ϋ, 208В, 208Е, 208Υ, 209Е, 209К, 209Υ,

2101_, 210Е, 210Υ, 211В, 211Е, 211Υ, 2120, 212К, 212Н, 212Ι_, 212Υ, 213Ν, 213Е,

213Н, 2131_, 213Υ, 214Ν, 214Е, 214Н, 214Ι_, 214Υ, 216Ν, 216К, 216Н, 216Ι_, 216Υ,

217ϋ, 217Н, 217А, 217Ϋ, 2170, 218ϋ, 218Е, 2180, 218Т, 218Н, 218Ι_, 218Υ, 219ϋ,

219Е, 2190, 219К, 219Т, 219Н, 2191_, 2191, 219Υ, 205А, 21ОА, 21 ЗА, 214А, 218А,

221 К, 221Υ, 221 Е, 221 Ν, 2210, 221В, 2218, 221Т, 221 Η, 221А, 221V, 221Ь, 2211,

221Е, 221 Μ, 22177, 221 Р, 2210, 222Е, 222Υ, 2220, 222Ν, 2220, 222В, 2228,

222Т, 222Н, 222Ϋ, 222Ι_, 222Ι, 222Е, 222М, 222\Ν, 222Р, 2220, 222А, 223ϋ, 223Ν,

2230, 223В, 2238, 223Н, 223А, 223У, 223Ι_, 223Ι, 223Е, 223М, 223Υ, 223\Л/, 223Р,

2230, 223Е, 223К, 224ϋ, 224Ν, 2240, 224К, 224В, 2248, 224Т, 224Ϋ, 224Ι_, 224Ι,

224Е, 224М, 224\Л/, 224Р, 2240, 224Е, 224Υ, 224А, 225ϋ, 225Ν, 2250, 225В,

2258, 225Н, 225А, 225У, 225Ι_, 225Ι, 225Е, 225М, 225Υ, 225Р, 2250, 225Е, 225К,

22577, 2268, 227Е, 227К, 227Υ, 2270, 227ϋ, 227Ν, 2270, 227В, 2278, 227Т,

227Н, 227А, 227Ϋ, 227Ι_, 227Ι, 227Е, 227М, 227\Ν, 228К, 228Υ, 2280, 228ϋ, 228Ν,

2280, 228В, 228Т, 228Н, 228А, 228У, 228Ι_, 228Ι, 228Е, 228М, 228\Л/, 2298, 230А,

230Е, 230Υ, 2300, 230ϋ, 230Ν, 2300, 230К, 230В, 2308, 230Т, 230Н, 230ν, 230Ι_,

230Ι, 230Е, 230М, 23077, 231 К, 231 Р, 231 ϋ, 231 Ν, 2310, 231В, 2318, 231Т, 231Н,

231V, 231 ί, 2311, 231Е, 231 М, 23177, 232Е, 232К, 232Υ, 2320, 232ϋ, 232Ν, 2320,

232В, 2328, 232Т, 232Н, 232А, 232У, 232Ι_, 232Ι, 232Е, 232М, 23277, 233ϋ, 233Ν,

2330, 233В, 2338, 233Т, 233Н, 233А, 233ν, 233Ι_, 233Ι, 233Е, 233М, 233Υ, 233\Л/,

2330, 234ϋ, 234Е, 234Ν, 2340, 234Т, 234Н, 234Υ, 234Ι, 234У, 234Е, 234К, 234В,

2348, 234А, 234М, 2340, 235ϋ, 2358, 235Ν, 2350, 235Т, 235Н, 235Υ, 235Ι, 235У,

235Е, 235Е, 235К, 235В, 235А, 235М, 23577, 235Р, 2350, 236ϋ, 236Е, 236Ν,

2360, 236К, 236В, 2368, 236Т, 236Н, 236А, 236ν, 236Ι_, 236Ι, 236Е, 236М, 236Υ,

23677 и 236Р, где нумерация соответствует Εϋ индексу.

В частности, варианты, которые изменяют связывание с одним или более человеческими Рсрецепторами, могут содержать аминокислотную модификацию в константной области легкой цепи, как описано в данной заявке, выбранную из группы, состоящей из

где нумерация соответствует Εϋ индексу.

Дополнительные замены, которые также могут быть использованы в настоящем изобретении, включают другие замены, которые модулируют Рс-рецепторную аффинность, РсγК-опосредованную эффекторную функцию и/или комплементопосредованную эффекторную функцию, и включают, но не ог- 18 027502 раничиваются этим, 298А, 298Т, З26А, З26П, З26Е, З26№, З26У, ЗЗЗА, ЗЗЗ8, ЗЗ4Ь и ЗЗ4А (И8 6,7З7,056; 8Ые1Й5 е! а1., 1оигпа1 о£ Βίοίοβ+αΐ СНет151гу, 200ΐ, 276(9):659ΐ-6604; И8 6,528,624; Ии8од1е е! а1., 200ΐ, 1. 1ттипо1о§у ΐ66:257ΐ-2572), 247Ь, 255Ь, 270Ε, З92Т, З96Ь и 42ΐΚ (υ88Ν ΐ0/754922; υ88Ν 10/902588) и 280Н, 280Ц и 280Υ (υ88Ν 10/З70749).

В других воплощениях антитела по настоящему изобретению можно комбинировать с вариантами константной тяжелой цепи, которые изменяют РсКп связывание. Они включают модификации, которые изменяют аффинность РсКп рН-специфическим образом. В частности, варианты, которые увеличивают связывание Рс с РсКп, включают, но не ограничиваются этим: 250Е, 250Ц, 428Ь, 428Р, 250Ц/428Ь (Нш!оп е! а1., 2004, 1. Βω. СЫет. 279(8): 621З-6216, Нш!оп е! а1. 2006 .)оигпа1 о£ 1ттипо1о§у 176:З46-З56, υ88Ν 11/102621, РСТ/υ82003/033037, РСТ/υ82004/011213, υ88Ν 10/822З00, υ88Ν 10/687118,

РСТ/П82004/0З4440, υ88Ν 10/96667З), 256Α, 272Α, 286Α, З05А, З07А, З11А, З12А, З76А, З78Ц, З80А, З82А, 4З4А (8ЫеМ8 е! а1., ,1оагаа1 о£ Βώ^εα! СЫет151гу, 2001, 276(9):6591-6604, υ88Ν 10/982470, ГО67З7056, υ88Ν 11/42979З, υ88Ν 11/429786, РСТ/ГО2005/0295П, υ88Ν 11/208422), 252Р, 252Т, 252Υ, 252^, 254Т, 2568, 256К, 256Ц, 256Ε, 256Ό, 256Т, З09Р, З118, 4ЗЗК, 4ЗЗ8, 4ЗЗ1, 4ЗЗР, 4ЗЗЦ, 4З4Н, 4З4Р, 434Υ, 252У/254Т/256Е, 4ЗЗК/4З4Р/4З6Н, З08Т/З09Р/З118 (Оа11 Асцаа е! а1. .)оигпа1 о£ 1ттипо1о§у, 2002, 169:5171-5180, ГО708З784, РСТ/υ897/03321, υ86821505, РСТ/υ801/48432, υ88Ν 11/З97З28), 257С, 257М, 257Ь, 257Ν, 257Υ, 279Ε, 279Ц, 279Υ, вставку 8ег после 281, 28ЗР, 284Ε, З06А З07А З08Р, З08А З11А З85Н, З85А (РСТ/П82005/041220, υ88Ν 11/274065, υ88Ν 11/4З6,266), 204Ό, 284Ε, 285Ε, 286Ό и 290Е (РСТ/П82004/0З7929, включенная в данную заявку посредством ссылки).

В некоторых воплощениях изобретения антитела могут содержать изотипические модификации, т.е. модификации в родительском 1дО на аминокислотный тип в альтернативном 1дО.

В настоящем изобретении предложены варианты антитела, которые оптимизированы для ряда терапевтически применимых свойств. Вариант антитела содержит одну или более аминокислотных модификаций относительно родительского антитела, где аминокислотная(ые) модификация(и) обеспечивают одно или более оптимизированных свойств. Таким образом, антитела по настоящему изобретению представляют собой варианты антител. Антитело по настоящему изобретению отличается аминокислотной последовательностью от его родительского антитела благодаря по меньшей мере двум аминокислотным модификациям 2З9Э и ЗЗ2Е. Кроме того, варианты антитела по настоящему изобретению могут содержать более двух вышеупомянутых аминокислотных модификаций по сравнению с родительским антителом, например, от примерно трех до пятидесяти аминокислотных модификаций, например, от примерно трех до десяти аминокислотных модификаций, от примерно трех до примерно пяти аминокислотных модификаций и т.д., по сравнению с родительским антителом. Таким образом, последовательности вариантов антитела и последовательности родительских антител являются по существу гомологичными. Например, последовательности вариантов антитела в данной заявке имеют примерно 80%-ную гомологию с последовательностью родительского антитела, например, по меньшей мере примерно 90%-ную гомологию, по меньшей мере примерно 95%-ную гомологию и т.д.

Антитела по настоящему изобретению могут содержать аминокислотные модификации, которые обеспечивают оптимизированные свойства эффекторной функции по сравнению с родительским антителом. Замены и оптимизированные свойства эффекторной функции описаны в патентной заявке США 2004-01З2101, РСТ заявке ГО0З/З0249 и патенте США 7З17091 10/8222З1. Свойства, которые могут быть оптимизированы, включают, но не ограничиваются этим, увеличение или уменьшение аффинности в отношении РсγК. В одном воплощении антитела по настоящему изобретению оптимизированы для приобретения повышенной аффинности в отношении человеческого активирующего РсγК, например, РсγКI, РсγКIIа, РсγКIIс, РсγКШа и РсγКШЬ. В одном воплощении антитело по изобретению оптимизировано для приобретения повышенной аффинности в отношении человеческого РсγКШа. В альтернативном воплощении антитела оптимизированы для приобретения пониженной аффинности в отношении человеческого ингибирующего рецептора РсγКIIЬ. В этих воплощениях, как ожидается, предложены антитела с улучшенными терапевтическими свойствами у людей, например, улучшенной эффекторной функцией и большей противораковой активностью.

В других воплощениях антитела по настоящему изобретению обеспечивают повышенную аффинность в отношении одного или более РсγКδ, в то же время пониженную аффинность в отношении одного или более других РсγК8. Например, антитело по настоящему изобретению может иметь повышенное связывание с РсγКШа, но в то же время пониженное связывание с РсγКIIЬ. С другой стороны, антитело по настоящему изобретению может иметь повышенное связывание с РсγКIIа и РсγКI, но в то же время пониженное связывание с РсγКIIЬ.

Модификации по изобретению могут улучшить аффинность связывания в отношении одного или более РсγК8. Под более высокой аффинностью, или улучшенной аффинностью, или повышенной аффинностью, или лучшей аффинностью, чем у родительского иммуноглобулина, как использовано в данной заявке, подразумевают, что Рс-вариант связывается с Рс-рецептором со значительно более высокой константой равновесия реакции ассоциации (Ка) или более низкой константой равновесия реакции диссоциации (Κά), чем родительский полипептид, когда количества варианта и родительского полипеп- 19 027502 тида в анализе связывания по существу являются одинаковыми. Например, Рс-вариант с улучшенной аффинностью связывания РсуК может демонстрировать от примерно 5-кратного до примерно 1000кратного, например, от примерно 10-кратного до примерно 500-кратного улучшения аффинности связывания Рс-рецептора по сравнению с родительским полипептидом, где аффинность связывания Рсрецептора определяется способами, известными в данной области техники. Соответственно под пониженной аффинностью по сравнению с родительским Рс-полипептидом, как использовано в данной заявке, подразумевают, что Рс-вариант связывает Рс-рецептор со значительно более низкой Ка или более высокой Кб, чем родительский полипептид.

Воплощения включают оптимизацию связывания Рс с человеческим РсуК, однако в альтернативных воплощениях антитела по настоящему изобретению обладают повышенной или пониженной аффинностью в отношении РсуКз из организмов, не являющихся человеческими, включая, но не ограничиваясь этим, грызунов и приматов, не являющихся людьми. Антитела, оптимизированные для связывания с нечеловеческим РсуК, могут найти применение в экспериментах. Например, для целого ряда заболеваний имеются мышиные модели, которые позволяют тестировать такие свойства, как эффективность, токсичность и фармакокинетика для заданного кандидата лекарственного средства. Как известно в данной области техники, раковые клетки можно пересаживать или инъецировать мышам для имитации человеческого рака: процесс, названный ксенотрансплантацией. Тестирование антител, которые содержат антитела, которые оптимизированы для одного или более мышиных РсуКз, может дать ценную информацию в отношении эффективности белка, механизма его действия и тому подобного. Антитела по настоящему изобретению также могут быть оптимизированы для улучшенной функциональности и/или свойств раствора в гликозилированной форме. В одном воплощении не подвергнутые гликозилированию антитела по настоящему изобретению связывают Рс-лиганд с более высокой аффинностью, чем не подвергнутая гликозилированию форма родительского антитела. Рс-лиганды включают, но не ограничиваются этим, РсуКз, С1ц. РсКп и белки А и О и могут происходить из любого источника, включая, но не ограничиваясь этим, человека, мышь, крысу, кролика или обезьяну. В альтернативном воплощении антитела оптимизированы с тем, чтобы быть более устойчивыми и/или более растворимыми, чем не подвергнутая гликозилированию форма родительского антитела.

Антитела по изобретению могут содержать модификации, которые модулируют взаимодействие с Рс-лигандами, отличными от РсуКз, включая, но не ограничиваясь этим, белки комплемента, РсКп и гомологи Рс-рецептора (РсКНз). РсКНз включают, но не ограничиваются этим, РсКН1, РсКН2, РсКН3, РсКН4, РсКН5 и РсКН6 (Эауй е! а1., 2002, 1ттипо1. Ке\зе\\ъ 190:123-136).

Антитела по настоящему изобретению могут содержать одну или более модификаций, которые обеспечивают оптимизированные свойства, не связанные конкретно с эффекторной функцией как таковой. Модификации могут представлять собой аминокислотные модификации или могут представлять собой модификации, которые получают ферментативно или химически. Такая(ие) модификация(и), вероятно, обеспечат некоторое улучшение в антителе, например, повышение его устойчивости, растворимости, функции или клинического применения. Настоящее изобретение предусматривает различные улучшения, которых добиваются посредством сочетания антитела по настоящему изобретению с дополнительными модификациями.

В одном воплощении вариабельная область антитела по настоящему изобретению может быть со зрелой аффинностью, т.е. аминокислотные модификации были осуществлены в УН- и/или УЬ-доменах антитела для улучшения связывания антитела с его целевым антигеном. Такие типы модификаций могут улучшить кинетику ассоциации и/или диссоциации для связывания с целевым антигеном. Другие модификации включают такие, которые улучшают селективность в отношении целевого антигена по сравнению с альтернативными мишенями. Они включают модификации, которые улучшают селективность в отношении антигена, экспрессирующегося на клетках-мишенях по сравнению с клетками, не являющимися мишенями. Другие улучшения свойств распознавания мишени могут обеспечиваться дополнительными модификациями. Такие свойства могут включать, но не ограничиваются этим, специфические кинетические свойства (т.е. кинетику ассоциации и диссоциации), селективность в отношении конкретной мишени по сравнению с альтернативными мишенями и селективность в отношении конкретной формы мишени по сравнению с альтернативными формами. Примеры включают полноразмерные варианты против сплайс-вариантов, находящиеся на клеточной поверхности формы против растворимых форм, селективность в отношении различных полиморфных вариантов или селективность в отношении специфических конформационных форм целевого антигена.

Антитела по изобретению могут содержать одну или более модификаций, которые обеспечивают пониженную или повышенную интернализацию антитела. В одном воплощении антитела по настоящему изобретению можно использовать или комбинировать с дополнительными модификациями с целью уменьшения клеточной интернализации антитела, которая происходит посредством взаимодействия с одним или более Рс-лигандами. Можно ожидать, что это свойство будет увеличивать эффекторную функцию и, возможно, уменьшать иммуногенность антител по изобретению. Альтернативно, антитела по настоящего изобретению можно использовать непосредственно или комбинировать с дополнительными

- 20 027502 модификациями с целью увеличения клеточной интернализации антитела, которая происходит посредством взаимодействия с одним или более Рс-лигандами.

В одном воплощении модификации осуществляют для улучшения биофизических свойств антител по настоящему изобретению, включая, но не ограничиваясь этим, стабильность, растворимость и олигомерное состояние. Модификации могут включать, например, замены, которые обеспечивают более благоприятные внутримолекулярные взаимодействия в антителе, с тем чтобы обеспечить большую стабильность, или замену экспонированных неполярных аминокислот полярными аминокислотами для более высокой растворимости. В патентной заявке США 2004-0110226 описаны различные цели и способы оптимизации, которые могут найти применение при конструировании дополнительных модификаций для дополнительной оптимизации антител по настоящему изобретению. Антитела по настоящему изобретению также можно комбинировать с дополнительными модификациями, которые уменьшают олигомерное состояние или размер, так что усиливается проникновение в опухоль или увеличиваются скорости клиренса ίη νίνο, при желании.

Другие модификации в антителах по настоящему изобретению включают такие, которые обеспечивают специфическое образование гомодимерных или гомомультимерных молекул. Такие модификации включают, но не ограничиваются этим, конструированные дисульфиды, а также химические модификации или способы агрегирования, которые могут обеспечивать механизм получения ковалентных гомодимеров или гомомультимеров. Например, способы конструирования и композиции таких молекул описаны в Кап е1 а1., 2001, 1. Iттиηο1., 2001, 166: 1320-1326; §1^еп8оп е1 а1., 2002, Кесей КекиЙк Сапсег Кек. 159 104-12; υδ 5681566; Сагоп е1 а1., 1992, 1. Εχρ. Μеб. 176:1191-1195 и δЬορек, 1992, 1. ]ттипо1. 148(9):2918-22. Дополнительные модификации в вариантах по настоящему изобретению включают такие, которые обеспечивают специфическое образование гетеродимерных, гетеромультимерных, бифункциональных и/или многофункциональных молекул. Такие модификации включают, но не ограничиваются этим, одну или более аминокислотных замен в СН3-домене, в которых замены уменьшают образование гомодимеров и увеличивают образование гетеродимеров. Например, способы конструирования и композиции таких молекул описаны в ΑΙ\\ό11 е1 а1., 1997, 1. Μο1. Вю1. 270(1):26-35, и Сайег е1 а1., 2001, 1. Iттиηο1. ΜеΐЬοбк 248:7-15, которые все включены в данную заявку посредством ссылки во всей своей полноте. Дополнительные модификации включают модификации в шарнирном и СН3 доменах, в которых указанные модификации уменьшают склонность к образованию димеров.

В других воплощениях антитела по настоящему изобретению содержат модификации, которые удаляют сайты протеолитической деградации. Они могут включать, например, протеазные сайты, которые уменьшают выходы продукции, а также протеазные сайты, которые разрушают вводимый белок ίη νίνο. В одном воплощении дополнительные модификации осуществляют для удаления ковалентных сайтов деградации, таких как сайты деамидирования (т.е. деамидирование остатков глутаминила и аспарагинила в соответствующие остатки глутамила и аспартила), окисления и протеолитической деградации. Сайтами деамидирования, которые особенно полезны для удаления, являются такие, которые увеличивают склонность к деамидированию, включая, но не ограничиваясь этим, остатки аспарагинила и глутамила, за которыми следуют глицины (мотивы Ν0 и 00 соответственно). В таких случаях замена любого остатка может значительно уменьшить тенденцию к деамидированию. Обычные сайты окисления включают остатки метионина и цистеина. Другие ковалентные модификации, которые можно либо вводить, либо удалять, включают гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп серильных или треонильных остатков, метилирование аминогрупп лизина, аргинина и боковых цепей гистидина (Т.Е. Οΐί^Ηίοη, Рго1етк: δΙπκΙιιΐΌ апб ΜοΚαιΡίΓ РгорегПек, Н. Ргеетан & Οο., δаη ΡππκΖο, ρρ. 79-86 (1983)), ацетилирование Ν-концевого амина и амидирование любой С-концевой карбоксильной группы. Дополнительные модификации также могут включать, но не ограничиваются этим, посттрансляционные модификации, такие как Ν-связанное или О-связанное гликозилирование и фосфорилирование.

Модификации могут включать такие, которые улучшают выходы экспрессии и/или очистки из хозяев или клеток хозяев, обычно используемых для продукции биологических препаратов. Они включают, но не ограничиваются этим, различные линии клеток млекопитающих (например, СНО), линии дрожжевых клеток, клеточные линии бактерий и растений. Дополнительные модификации включают модификации, которые удаляют или уменьшают способность тяжелых цепей образовывать межцепьевые дисульфидные связи. Дополнительные модификации включают модификации, которые удаляют или уменьшают способность тяжелых цепей образовывать внутрицепьевые дисульфидные связи.

Антитела по настоящему изобретению могут содержать модификации, которые включают применение неприродных аминокислот, включающих использование, например, способов, разработанных δθηι1ΐζ с коллегами, включая, но не ограничиваясь этим, способы, описанные в Сгорр & δΗυίΙζ, 2004, Тгсп6к 0еηеΐ. 20(12):625-30, Αι^^οπ е1 а1., 2004, Ртос. №б. Αсаб. δ^. υ.δ.Α. 101 (2):7566-71, Ζΐκπίβ е1 а1., 2003, 303(5656):371-3 и Сйп е1 а1., 2003, δΖη^ 301(5635):964-7. В некоторых воплощениях эти модификации позволяют манипулировать различными функциональными, биофизическими, иммунологическими или технологическими свойствами, описанными выше. В дополнительных воплощениях эти модификации обеспечивают дополнительные химические модификации для других целей. В данной заявке пре- 21 027502 дусмотрены и другие модификации. Например, антитело может быть связано с одним из множества небелковоподобных полимеров, например, с полиэтиленгликолем (ПЭГ), полипропиленгликолем, полиоксиалкиленами или сополимерами полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля. Могут быть осуществлены дополнительные аминокислотные модификации для обеспечения специфических или неспецифических химических или посттрансляционных модификаций антител.

Такие модификации включают, но не ограничиваются этим, пэгилирование и гликозилирование. Специфические замены, которые могут быть использованы для обеспечения пэгилирования, включают, но не ограничиваются этим, введение новых цистеиновых остатков или неприродных аминокислот, так что эффективное и специфическое связывание можно использовать для присоединения ПЭГ или другой полимерной группировки.

Введение специфических сайтов гликозилирования может быть достигнуто путем введения новых последовательностей Ν-Χ-Τ/δ в антитела по настоящему изобретению.

Ковалентные модификации антител включены в объем данного изобретения и обычно, но не всегда, осуществляются посттрансляционно. Например, некоторые типы ковалентных модификаций антитела вводят в молекулу путем взаимодействия специфических аминокислотных остатков антитела с органическим дериватизирующим агентом, который способен реагировать с выбранными боковыми цепями или Ν- или С-концевыми остатками.

В некоторых воплощениях ковалентная модификация антител по изобретению включает добавление одной или более меток. Термин группа мечения представляет собой любую обнаружимую метку. В некоторых воплощениях группу мечения присоединяют к антителу через спейсерные ножки различных длин для уменьшения возможного стерического затруднения. Различные способы мечения белков известны в данной области техники и могут быть использованы при выполнении настоящего изобретения. В общем, метки подразделяются на множество классов, в зависимости от анализа, в котором они будут обнаруживаться: а) изотопные метки, которые могут быть радиоактивными или тяжелыми изотопами; б) магнитные метки (например, магнитные частицы); в) окислительно-восстановительные активные группировки; г) оптические красители; ферментные группы (например, пероксидаза хрена, [бета]галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза); д) биотинилированные группы; и е) ранее установленные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичной репортерной группой (например, спаренные последовательности с лейциновыми застежками, сайты связывания для вторичных антител, домены связывания металлов, эпитопные метки и т.д.). В некоторых воплощениях группа мечения присоединена к антителу через спейсерные ножки различных длин для уменьшения возможного стерического затруднения. Различные способы мечения белков известны в данной области техники и могут быть использованы при осуществлении настоящего изобретения. Специфические метки включают оптические красители, включая, но не ограничиваясь этим, хромофоры, фосфоры и флуорофоры, причем последние специфичны во многих случаях. Флуорофоры могут быть либо флуоресцентными маленькими молекулами, либо флуоресцентными белками. Под флуоресцентной меткой подразумевают любую молекулу, которую можно обнаружить благодаря присущим ей флуоресцентным свойствам.

В одном воплощении антитела по изобретению представляют собой антительные слитые белки, иногда называемые в данной заявке как конъюгаты антител. Партнер слияния или конъюгатный партнер может быть белковым или небелковым веществом; последнее обычно получают с использованием функциональных групп на антителе и на конъюгатном партнере. Конъюгатными партнерами и партнерами слияния могут быть любые молекулы, включая низкомолекулярные химические соединения и полипептиды. Например, различные конъюгаты антител и способы описаны в ТгаП с1 а1., 1999, Сигг. Θρίη. 1ттипо1. 11:584-588. Возможные конъюгатные партнеры включают, но не ограничиваются этим, цитокины, цитотоксические агенты, токсины, радиоактивные изотопы, химиотерапевтический агент, антиангиогенные агенты, ингибиторы тирозинкиназы и другие терапевтически активные агенты. В некоторых воплощениях конъюгатные партнеры можно рассматривать скорее как полезную нагрузку, т.е. цель конъюгата заключается в направленной доставке конъюгатного партнера к клетке-мишени, например к раковой клетке или иммунной клетке, с помощью антитела. Таким образом, например, конъюгирование токсина с антителом направляет доставку токсина к клеткам, экспрессирующим целевой антиген. Как будет понятно специалисту в данной области техники, в действительности принципы и определения слияния и конъюгата перекрываются. Обозначение антитела в виде слияния или конъюгата не означает его ограничение до любого конкретного воплощения настоящего изобретения. Скорее эти термины используются в общих чертах для выражения широкого понятия, что любое антитело по настоящему изобретению может быть связано генетически, химически или другим способом с одним или более полипептидами или молекулами для обеспечения некоторых желательных свойств.

Подходящие конъюгаты включают, но не ограничиваются этим, метки, как описано ниже, лекарственные средства и цитотоксические агенты, включающие, но не ограничивающиеся этим, цитотоксические лекарственные средства (например, химиотерапевтические агенты), или токсины, или активные фрагменты таких токсинов. Подходящие токсины и их соответствующие фрагменты включают цепь А дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина, цепь А рицина, цепь А абрина, курцин, кротин, феномицин, эномицин и тому подобное. Цитотоксические агенты также включают радиохимические агенты, полу- 22 027502 ченные путем конъюгирования радиоизотопов с антителами, или связывания радионуклида с хелатирующим агентом, который был ковалентно присоединен к антителу. В дополнительных воплощениях используют калихеамицин, аунстатины (аипкЮйпк), гелданамицин, мэйтанзин и дуокармицины и аналоги; для последнего см. патентную заявку США 200З/0050ЗЗ1.

В одном воплощении антитела по настоящему изобретению слиты или конъюгированы с цитокином. Под цитокином, как использовано в данной заявке, подразумевают общий термин для белков, высвобождаемых одной клеточной популяцией, которая действует на другую клетку, в качестве межклеточных медиаторов. Например, как описано в РешсНе! е! а1., 2001, 1 Iттиηο1 МеШоДк 248-91-101, цитокины могут быть подвергнуты слиянию с антителом для обеспечения целого ряда желаемых свойств. Примеры таких цитокинов представляют собой лимфокины, монокины и традиционные полипептидные гормоны. Среди цитокинов включены гормон роста, такой как гормон роста человека, Ν-метионильный гормон роста человека и бычий гормон роста; паратиреоидный гормон, тироксин; инсулин; проинсулин; релаксин, прорелаксин; гликопротеиновые гормоны, такие как фолликулостимулирующий гормон (РЗН), тиреостимулирующий гормон (ТЗН) и лютеинизирующий гормон (ЬН); печеночный фактор роста; фактор роста фибробластов, пролактин, плацентарный лактоген; фактор некроза опухоли-альфа и -бета; ингибирующая субстанция Мюллера, мышиный гонадотропин-ассоциированный пептид; ингибин; активин, сосудистый эндотелиальный фактор роста; интегрин; тромбопоэтин (ТРО); факторы роста нервов, такие как NΟР-бета; тромбоцитарный фактор роста, трансформирующие факторы роста (ТОРк), такие как ТОР-альфа и ТОР-бета; инсулиноподобный фактор роста-1 и -2; эритропоэтин (ЕРО); остеоиндуктивные факторы, интерфероны, такие как интерферон-альфа, -бета и -гамма; колониестимулирующие факторы (СЗР), такие как макрофагальный СЗР (М-СЗР), гранулоцитарно-макрофагальный СЗР (ОМСЗР); и гранулоцитарный СЗР (О-СЗР), интерлейкины (ΙΠ), такие как Ш-1, ΙΠ-1 альфа, Ш-2, Ш-З, Ш-4, Ш-5, Ш-6, Ш-7, Ш-8, Ш-9, ГБ-10, Ш-11, Ш-12, ГБ-15, фактор некроза опухолей, такой как ТЖ-альфа или ТNР-бета; С5а; и другие полипептидные факторы, включающие ЫР (фактор, ингибирующий лейкоз) и кй-лиганд (КЬ). Как использовано в данной заявке, термин цитокин включает белки из природных источников или из рекомбинантной клеточной культуры, и биологически активные эквиваленты нативных последовательностей цитокинов.

В альтернативном воплощении антитела по настоящему изобретению слиты, конъюгированы или функциональным образом связаны с токсином, включая, но не ограничиваясь этим, низкомолекулярные токсины и ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, включая их фрагменты и/или варианты. Например, различные иммунотоксины и иммунотоксиновые методы описаны в Тйгикй е! а1., 1996, Апп. Кеу. Iттипο1. 14:49-71. Низкомолекулярные токсины включают, но не ограничиваются этим, калихеамицин, мэйтанзин (ИЗ 5208020), трихотен и СС1065. В одном воплощении изобретения антитело конъюгировано с одной или более молекулами мэйтанзина (например, от примерно 1 до примерно 10 молекул мэйтанзина на молекулу антитела). Например, мэйтанзин может быть превращен в Мау-ЗЗ-Ме, который может быть восстановлен до Мау-ЗНЗ и подвергнут взаимодействию с модифицированным антителом (С1ап е! а1., 1992, Сапсег Кекеагсй 52 1271З1) с получением конъюгата мэйтанзиноида с антителом. Другой конъюгат, представляющий интерес, содержит антитело, конъюгированное с одной или более молекулами калихеамицина. Калихеамициновое семейство антибиотиков способно образовывать двухцепочечные разрывы ДНК при субпикомолярных концентрациях. Структурные аналоги калихеамицина, которые могут быть использованы, включают, например, раскрытые в Нттап е! а1., 199З, Сапсег Кекеагсй 5З ЗЗЗ6-ЗЗ42, ЬоДе е! а1., 1998, Сапсег Кекеагсй 58 2925-2928, ИЗ 5714586; ИЗ 5712З74, ИЗ 5264586; и ИЗ 577З001. Аналоги доластатина-10, такие как ауристатин Е (АЕ) и монометилауристатин Е (ММАЕ), могут найти применение в качестве конъюгатов для антител по настоящему изобретению (ТОогошпа е! а1., 200З, Ν;·ιΙ Вю1есНпо1 21(7):778-84; Ргапаксо е! а1., 200З В1ооД 102(4): 1458-65). Полезные ферментативно активные токсины включают, но не ограничиваются этим, цепь А дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина (из РкеиДотопак аегидшока), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модецина, альфа-сарцин, белки А1ешйе8 ГогДй диантиновые белки, белки Р1у!о1аса атепсапа (ΡΑΡΙ, ΡΑΡΙΙ и РАРЗ), ингибитор тотогФса сйагапйа, курцин, кротин, ингибитор караопапа оГйсшайк, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. См., например, РСТ \У0 9З/212З2. Настоящее изобретение также предусматривает конъюгат между антителом по настоящему изобретению и соединением с нуклеолитической активностью, например, рибонуклеазой или ДНК-эндонуклеазой, такой как дезоксирибонуклеаза (ДНКаза).

В альтернативном воплощении антитело по настоящему изобретению может быть подвергнуто слиянию, конъюгированию или функциональному связыванию с радиоактивным изотопом с образованием радиоактивного конъюгата. Для получения радиоконъюгатных антител доступны различные радиоактивные изотопы. Примеры включают, но не ограничиваются этим, Αΐ211, ПЗ1, Ι125, Υ90, Ке186, Ке188, Зт15З, Βί212, РЗ2 и радиоактивные изотопы Ьи.

В еще одном воплощении антитело по настоящему изобретению может быть конъюгировано с рецептором (таким как стрептавидин) для применения в предварительном нацеливании на опухоль, где антитело-рецепторный конъюгат вводят пациенту с последующим удалением несвязанного конъюгата из

- 2З 027502 кровотока с использованием очищающего агента и затем введением лиганда (например, авидина), который конъюгирован с цитотоксическим агентом (например, радионуклеотидом). В альтернативном воплощении антитело конъюгируют или функциональным образом связывают с ферментом с целью использования антитело-опосредованной фермент-опосредованной пролекарственной терапии (АОЕРТ). ЛЭЕРТ можно использовать посредством конъюгирования или функционального связывания антитела с пролекарство-активирующим ферментом, который превращает пролекарство (например, пептидильный химиотерапевтический агент, см. заявку РСТ \УО 81/01145, включенную в данную заявку посредством ссылки) в активное противораковое лекарственное средство. См., например, заявку РСТ \УО 88/07378 или патент США 4975278, где каждый включен в данную заявку посредством ссылки во всей своей полноте. Ферментный компонент иммуноконъюгата, используемого для АОЕРТ, включает любой фермент, способный активировать пролекарство таким образом, чтобы превратить его в более активную, цитотоксическую форму. Ферменты, которые полезны в способе по данному изобретению, включают, но не ограничиваются этим, щелочную фосфатазу, полезную для превращения фосфат-содержащих пролекарств в свободные лекарственные средства; арилсульфатазу, полезную для превращения сульфат-содержащих пролекарств в свободные лекарственные средства; цитозиндезаминазу, полезную для превращения нетоксичного 5-фторцитозина в противораковое лекарственное средство, 5-фторурацил; протеазы, такие как протеаза 8еггайа, термолизин, субтилизин, карбоксипептидазы и катепсины (такие как катепсины В и Ь), которые полезны для превращения пептид-содержащих пролекарств в свободные лекарственные средства; Ό-аланилкарбоксипептидазы, полезные для превращения пролекарств, которые содержат Όаминокислотные заместители, углевод-отщепляющие ферменты, такие как бета-галактозидаза и нейраминидаза, полезные для превращения гликозилированных пролекарств в свободные лекарственные средства, бета-лактамазу, полезную для превращения лекарственных средств, дериватизированных альфалактамами, в свободные лекарственные средства, и пенициллинамидазы, такие как пенициллин V амидаза или пенициллин О амидаза, полезные для превращения лекарственных средств, дериватизированных по их аминным азотам феноксиацетильной или фенилацетильной группами, соответственно в свободные лекарственные средства. Альтернативно, антитела с ферментативной активностью, также известные в данной области техники как абзимы, могут быть использованы для превращения пролекарств по изобретению в свободные активные лекарственные средства (см., например, Ма88еу, 1987, №1иге 328. 457458, включенную в данную заявку посредством ссылки во всей своей полноте). Антитело-абзимные конъюгаты могут быть получены для доставки абзима к популяции опухолевых клеток. Различные дополнительные конъюгаты рассматриваются для антител по настоящему изобретению. Различные химиотерапевтические агенты, антиангиогенные агенты, ингибиторы тирозинкиназы и другие терапевтические агенты, которые могут найти применение в качестве конъюгатов антител, описаны ниже.

Рс-полипептиды также рассматриваются в качестве партнеров слияния и конъюгирования. Таким образом, антитело может быть мультимерным Рс-полипептидом, содержащим две или более Рс-области. Преимуществом такой молекулы является то, что она обеспечивает множество связывающих сайтов для Рс-рецепторов с одной белковой молекулой. В одном воплощении Рс-области могут быть связаны с использованием подхода химического конструирования. Например, РаЬ и Рс могут быть связаны тиоэфирными связями, происходящими из цистеиновых остатков в шарнирах, с получением таких молекул, как РаЬРс₂. Рс-области могут быть связаны с помощью конструирования дисульфидных связей и/или химического сшивания. В одном воплощении Рс-области могут быть связаны генетически. В одном воплощении Рс-области в антителе связаны генетически с образованием тандемно связанных Рс-областей, как описано в патентной заявке США 2005-0249723, озаглавленной Рс ро1урерйбе8 \\йй ηоνе1 Рс йдапб Ыпйшд 8Йе8. Тандемно связанные Рс-полипептиды могут содержать две или более Рс-областей, например, от одной до трех, двух и т.д. Рс-областей. Это может быть полезным для исследования целого ряда инженерных конструкций с целью получения гомо- или гетеротандемно связанных антител с наиболее благоприятными структурными и функциональными свойствами. Тандемно связанные антитела могут быть гомо- тандемно связанными антителами, т.е. антитело одного изотипа подвергают генетическому слиянию с другим антителом такого же изотипа. Предполагается, что поскольку существуют многочисленные РсуК, С1с| и/или РсКп сайты связывания на тандемно связанных Рс-полипептидах, эффекторные функции и/или фармакокинетика могут быть увеличены. В альтернативном воплощении антитела различных изотипов могут быть тандемно связаны и называются гетеротандемно связанными антителами. Например, благодаря способности нацеливаться на рецепторы РсуК и РсуК1, антитело, которое связывает как РсуК8, так и РсуК1, может обеспечить значительное клиническое улучшение.

Партнеры слияния и конъюгирования могут быть связаны с любой областью антитела по настоящему изобретению, в том числе на Ν- или С-концах или с некоторым остатком между концами. В одном воплощении партнер слияния или конъюгирования связан на Ν- или С-конце антитела, например, на Νконце. Различные линкеры могут найти применение в настоящем изобретении для ковалентного связывания антитела с партнером слияния или конъюгирования. Под линкером, последовательностью линкера, спейсером, последовательностью связывания или его грамматическими эквивалентами в данной заявке подразумевают молекулу или группу молекул (таких как мономер или полимер), которые со- 24 027502 единяют две молекулы и часто служат для размещения двух молекул в желаемой конфигурации. Линкеры известны в данной области техники, например, хорошо известны гомо- или гетеробифункциональные линкеры (см. каталог 1994 Р1егсе СЬетюа1 Сотрапу, технический раздел по кросс-линкерам, с. 155-200). Для ковалентного связывания молекул вместе можно использовать целый ряд стратегий. Они включают, но не ограничиваются этим, полипептидные связи между Ν- и С-концами белков или белковых доменов, связывание посредством дисульфидных связей и связывание посредством химических сшивающих регентов. В одном из аспектов этого воплощения линкер представляет собой пептидную связь, полученную рекомбинантными методами пептидного синтеза. Линкер может содержать аминокислотные остатки, которые обеспечивают гибкость. Таким образом, линкерный пептид может преимущественно включать следующие аминокислотные остатки О1у, δе^. А1а или ТЬг. Линкерный пептид должен иметь длину, которая является достаточной для связывания двух молекул таким образом, чтобы они приняли правильную конформацию друг относительно друга с сохранением желаемой активности. Подходящие длины для этой цели включают по меньшей мере один и не более 50 аминокислотных остатков. В одном воплощении линкер имеет длину от примерно 1 до 30 аминокислот, где желательным является линкер с длиной от 1 до 20 аминокислот. Полезные линкеры включают глицин-сериновые полимеры (включающие, например, (Οδ)π, (ΌδΟΟδ)π (ΌΟΟΟδ)π и (ΟΟΟδ)π, где п представляет собой целое число по меньшей мере один), глицин-аланиновые полимеры, аланин-сериновые полимеры и другие гибкие линкеры, как будет понятно специалистам в данной области техники. Альтернативно, различные небелковые полимеры, включая, но не ограничиваясь этим, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропиленгликоль, полиоксиалкилены или сополимеры полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля, могут найти применение в качестве линкеров, т.е. могут найти применение для связывания антител по настоящему изобретению с партнером слияния или конъюгирования или для связывания антител по настоящему изобретению с конъюгатом.

В настоящем изобретении предложены способы получения и экспериментального тестирования антител. Описанные способы не предназначены для ограничения настоящего изобретения до какого-либо конкретного применения или теории операции. Скорее, предложенные способы предназначены для иллюстрации в общем, что одно или более антител могут быть получены и экспериментально протестированы для получения вариантов антитела. Общие методы молекулярной биологии антител, экспрессии, очистки и скрининга описаны в АпЬЬобу ЕпЦпееппд, ебйеб Ьу ЭиеЬе1 & Коп!егтагт, δр^^п§е^-Vе^1ад, Не1бе1Ьег§, 2001, и НауЬигк! & Оеогдюи, 2001, Сигг Орш СЬет Вю1 5 683-689; Маупагб & Оеогдюи, 2000, Аппи Ке\' Вютеб Епд 2 339-76, АпЬЬоб1ек. А ЬаЬога!огу Мапиа1 Ьу Наг1оте & Ьапе, Ые\у Уогк: Со1б δр^^пд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, 1988.

В одном воплощении настоящего изобретения созданы нуклеиновые кислоты, которые кодируют антитела и которые затем могут быть клонированы в клетки-хозяева, экспрессируемые и анализируемые, при желании. Таким образом, могут быть получены нуклеиновые кислоты и, в частности, ДНК, которые кодируют каждую белковую последовательность. Эти практики выполняют с использованием хорошо известных процедур.

Например, различные способы, которые могут найти применение в настоящем изобретении, описаны в Мо1еси1аг С1отпд - А ЬаЬога!огу Мапиа1, 3^гб Еб. (Матайк, Со1б δр^^пд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, Ые\у Уогк, 2001) и Сштеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1о§у ЦоЬп \УПеу & δопк). Как будет понятно специалистам в данной области техники, получение точных последовательностей для библиотеки, содержащей большое число последовательностей, потенциально требует больших затрат и много времени. Под библиотекой в данной заявке подразумевают набор вариантов в любой форме, включая, но не ограничиваясь этим, перечень нуклеиновокислотных или аминокислотных последовательностей, перечень нуклеиновокислотных или аминокислотных замен в вариабельных положениях, физическую библиотеку, содержащую нуклеиновые кислоты, которые кодируют последовательности библиотеки, или физическую библиотеку, содержащую варианты белков, либо в очищенной, либо в неочищенной форме. Соответственно имеются различные методы, которые могут быть использованы для эффективного получения библиотек по настоящему изобретению. Такие способы, которые могут найти применение в настоящем изобретении, описаны или процитированы в патенте США 6403312; патентной заявке США 2002-0048772, патенте США 7315786; патентной заявке США 2003-0130827, заявке РСТ \УО 01/40091 или заявке РСТ \УО 02/25588. Такие способы включают, но не ограничиваются этим, способы сборки генов, способ на основе ПЦР и способы, в которых используются варианты ПЦР, способы на основе лигазной цепной реакции, способы объединения олигомеров (роо1еб оЬдо те!Ьобк), такие как способы, используемые в синтетической перетасовке, способы склонной к ошибкам амплификации и способы, в которых используются олигомеры со случайными мутациями, классические способы сайт-направленного мутагенеза, кассетный мутагенез и другие способы амплификации и синтеза генов. Как известно в данной области техники, существует целый ряд коммерчески доступных наборов и способов генной сборки, мутагенеза, субклонирования векторов и тому подобного, и такие коммерческие продукты находят применение в настоящем изобретении для получения нуклеиновых кислот, которые кодируют антитела.

Антитела по настоящему изобретению могут быть получены путем культивирования клеткихозяина, трансформированного нуклеиновой кислотой, например, экспрессирующего вектора, содержа- 25 027502 щего нуклеиновую кислоту, кодирующую антитела, в соответствующих условиях для индукции или активации экспрессии белка. Соответствующие условия для экспрессии будут варьироваться в зависимости от выбора экспрессирующего вектора и клетки-хозяина и будут легко определяться специалистом в данной области посредством рутинного экспериментирования. Может быть использован широкий диапазон соответствующих клеток-хозяев, включая, но не ограничиваясь этим, клетки млекопитающих, бактерий, насекомых и дрожжей. Например, различные линии, которые могут найти применение в настоящем изобретении, описаны в каталоге клеточных линий АТСС, доступном от Американской коллекции типовых культур (Атепсап Туре СиЙиге Сойесйоп).

В одном воплощении антитела экспрессируются в экспрессирующих системах млекопитающих, включая системы, в которых экспрессирующие конструкции вводят в клетки млекопитающих с использованием вируса, такого как ретровирус или аденовирус. Могут быть использованы любые клетки млекопитающих, например, клетки человека, мыши, крысы, хомяка, примата и т.д. Подходящие клетки также включают известные экспериментальные клетки, включая, но не ограничиваясь Т-клетки 1игка1, №Н3Т3, СНО, ВНК, СОЗ, НЕК293, РЕК С.6, НеЬа, 8р2/0, клетки N80 и их варианты. В альтернативном воплощении белки библиотеки экспрессируются в бактериальных клетках. Бактериальные экспрессирующие системы хорошо известны в данной области техники и включают ЕксйепсЫа сой (Е. сой). Васй1ик кийййк, ЗйерЮсоссик сгетопк и ЗйерЮсоссик йутйапк. В альтернативных воплощениях антитела продуцируют в клетках насекомых (например, 8£21/8ί9) или клетках дрожжей (например 8. сегсуМае, РюЫа и т.д.). В альтернативном воплощении антитела экспрессируются ш У11го с использованием бесклеточных систем трансляции. Трансляционные системы ш уйго, происходящие из прокариотических (например, Е. сой) и эукариотических клеток (например, пшеничный зародыш, ретикулоциты кролика), доступны и могут быть выбраны на основе уровней экспрессии и функциональных свойств белка, представляющего интерес. Например, как понятно специалистам в данной области техники, трансляция ш У11го требуется для некоторых дисплейных технологий, например, рибосомного дисплея. Кроме того, антитела могут быть получены методами химического синтеза. Кроме того, трансгенные экспрессирующие системы как животных (например, коровье, овечье или козье молоко, эмбрионы куриных яиц, личинки насекомых полностью и т.д.), так и растений (например, кукуруза, табак, ряска и т.д.). Нуклеиновые кислоты, которые кодируют антитела по настоящему изобретению, могут быть включены в экспрессирующий вектор с целью экспрессии белка. Различные экспрессирующие векторы могут быть использованы для экспрессии белка. Экспрессирующие векторы могут содержать самореплицирующиеся экстра-хромосомные векторы или векторы, которые интегрируются в геном хозяина. Экспрессирующие векторы конструируют таким образом, чтобы они были совместимы с клетками-хозяевами. Таким образом, экспрессирующие векторы, которые находят применение в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются этим, векторы, которые способны экспрессировать белок в клетках млекопитающих, бактерий, насекомых, дрожжей и в системах ш У11го. Как известно в данной области техники, различные экспрессирующие векторы имеются в продаже или доступны иным образом, которые могут найти применение в настоящем изобретении для экспрессии антител.

Экспрессирующие векторы, как правило, содержат белок, функциональным образом связанный с контрольными или регуляторными последовательностями, селектируемыми маркерами, любыми партнерами слияния и/или дополнительными элементами. Под функциональным образом связанным в данной заявке подразумевают, что нуклеиновая кислота находится в функциональной взаимосвязи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Как правило, эти экспрессирующие векторы включают транскрипционную и трансляционную регуляторную нуклеиновую кислоту, функциональным образом связанную с нуклеиновой кислотой, кодирующей антитело, и обычно соответствуют клетке-хозяину, используемой для экспрессии белка. В целом, транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности могут включать промоторные последовательности, рибосомные сайты связывания, последовательности начала и остановки транскрибции, последовательности начала и остановки трансляции и энхансерные или активаторные последовательности. В данной области техники также известно, что экспрессирующие векторы обычно содержат селективный ген или маркер для обеспечения селекции трансформированных клеток-хозяев, содержащих экспрессирующий вектор. Селективные гены хорошо известны в данной области техники и будут варьироваться в зависимости от используемой клетки-хозяина.

Антитела могут быть функциональным образом связаны с партнером слияния для обеспечения нацеливания на экспрессируемый белок, очистки, скрининга, экспонирования и тому подобного. Партнеры слияния могут быть связаны с последовательностью антитела через линкерную последовательность. Линкерная последовательность, как правило, содержит небольшое число аминокислот, обычно менее десяти, хотя могут быть использованы и более длинные линкеры. Обычно выбирают линкерные последовательности, которые являются гибкими и устойчивыми к деградации. Как будет понятно специалистам в данной области техники, любая из широкого спектра последовательностей может быть использована в качестве линкеров. Например, общая линкерная последовательность содержит аминокислотную последовательность 00008. Партнер слияния может представлять собой нацеливающую или сигнальную последовательность, которая направляет антитело и любые ассоциированные партнеры слияния в нужное место клетки или во внеклеточную среду. Как известно в данной области техники, определенные

- 26 027502 сигнальные последовательности могут направлять белок либо секретироваться в ростовые среды, либо в периплазматическое пространство, расположенное между внутренней и наружной мембраной клетки. Партнером слияния также может быть последовательность, которая кодирует пептид или белок, который обеспечивает очистку и/или скрининг. Такие партнеры слияния включают, но не ограничиваются этим, полигистидиновые метки (Н18-1ад8) (например, Н6 и Н10 или другие метки для применения с системами афинной хроматографии с использованием иммобилизованных металлов (1МАС) (например, Νί²⁺ аффинные колонки)), слияния с С8Т, слияния с МВР, §1гер-метка, В8Р биотинилированная целевая последовательность бактериального фермента ВпА и эпитопные метки, которые направляются антителами (например, с-тус метки, йад-метки, и тому подобное). Как будет понятно специалистам в данной области техники, такие метки могут быть полезны для очистки, для скрининга или для того и другого. Например, антитело может быть очищено с использованием Ηίδ-метки посредством его иммобилизации на Νί²⁺ аффинной колонке и затем после очистки та же Ηίδ-метка может быть использована для иммобилизации антитела на №²⁺-покрытом планшете для осуществления ЕЬРЗА или другого анализа связывания (как описано ниже). Партнер слияния может обеспечить применение метода селекции для скрининга антител (см. ниже). Партнеры слияния, которые обеспечивают различные методы селекции, хорошо известны в данной области техники, и все они находят применение в настоящем изобретении. Например, можно использовать фаговый дисплей путем слияния членов библиотеки антител с белком гена III (Кау е! а1. РЬаде бйр1ау о£ рерйбез апб ргоЮиъ: а 1аЪогаЮгу тапиа1, Асабетю Рге88, 8ап О1едо, СА, 1996; Ьо^тап е! а1., 1991, ВюсЬет18йу 30: 10832-10838; §тйЬ, 1985, §с1епсе 228:1315-1317). Партнеры слияния позволяют метить антитела. Альтернативно, партнер слияния может связываться со специфической последовательностью экспрессирующего вектора, позволяя партнеру слияния и ассоциированному антителу связываться ковалентно или нековалентно с нуклеиновой кислотой, которая их кодирует.

Способы введения экзогенных нуклеиновых кислот в клетки-хозяева хорошо известны в данной области техники и будут варьироваться в зависимости от используемой клетки-хозяина. Методы включают, но не ограничиваются этим, декстран-опосредованную трансфекцию, преципитацию фосфатом кальция, обработку хлоридом кальция, полибрен-опосредованную трансфекцию, слияние протопластов, электропорацию, вирусную или фаговую инфекцию, инкапсуляцию полинуклеотида(ов) в липосомы и прямую микроинъекцию ДНК в ядра. В случае клеток млекопитающих трансфекция может быть либо временной, либо стабильной.

В одном воплощении антитела очищают или выделяют после экспрессии. Белки могут быть выделены или очищены различными путями, известными специалистам в данной области техники. Стандартные способы очистки включают хроматографические методы, в том числе ионный обмен, гидрофобное взаимодействие, аффинность, фильтрацию по размеру или гель-фильтрацию и обращенную фазу, выполняемые при атмосферном давлении или при высоком давлении с использованием таких систем как РРЬС и НРЬС. Способы очистки также включают электрофоретические, иммунологические методы, преципитацию, диализ и хроматофокусирование. Также используют методы ультрафильтрации и диафильтрация, в сочетании с концентрированием белка. Как хорошо известно в данной области техники, различные природные белки связывают Рс и антитела, и эти белки могут найти применение в настоящем изобретении для очистки антител. Например, бактериальные белки А и С связывают Рс-область. Аналогично, бактериальный белок Ь связывается с РаЪ-областью некоторых антител, поскольку, разумеется, является целевым антигеном антитела. Очистка часто может обеспечиваться конкретным партнером слияния. Например, антитела можно очищать с использованием глутатионовой смолы, если используют С8Т слияние, Νί²⁺ аффинной хроматографии, если используют Ηίδ-метку, или иммобилизованного анти-йад антитела, если используют йад-метку. Для общего руководства в подходящих методах очистки см., например, Рго1ет Рипйсайоп: Ргтар1е8 апб Ргасйсе, 3^гб Еб., 8сорез, 8рйпдег-Уег1ад, ΝΥ, 1994. Необходимая степень очистки будет варьироваться в зависимости от теста или применения антител. В некоторых случаях нет необходимости в очистке. Например, в одном воплощении, если антитела секретируются, то скрининг может осуществляться непосредственно из сред. Как хорошо известно в данной области техники, некоторые способы селекции не вовлекают очистку белков. Таким образом, например, если библиотеку антител превращают в фаг-дисплейную библиотеку, то очистку белка можно не выполнять.

Антитела могут быть подвергнуты скринингу с использованием различных способов, включая, но не ограничиваясь этим, способы, используемые в анализах ш уйго, анализах ш νί\Ό и клеточных анализах и технологиях селекции. Технологии автоматизированного и высокопроизводительного скрининга могут быть использованы в процедурах скрининга. В скрининге может использоваться применение партнера слияния или метки. Применение партнеров слияния обсуждалось выше. Под меченными в данной заявке подразумевают, что антитела по изобретению имеют один или более элементов, изотопов или химических соединений, присоединенных для обеспечения обнаружения при скрининге. В общем, метки подразделятся на три класса: а) иммунные метки, которые могут представлять собой эпитоп, встроенный в качестве партнера слияния, который распознается антителом, б) изотопные метки, которые могут представлять собой радиоактивные или тяжелые изотопы и в) низкомолекулярные метки, которые могут включать флуоресцентные и колориметрические красители, или молекулы, такие как биотин, которые делают возможными другие способы мечения. Метки могут быть включены в соединение в любом

- 27 027502 положении и могут быть включены ίη νίΙΐΌ или ίη νί\Ό во время экспрессии белка.

В одном воплощении функциональные и/или биофизические свойства антител подвергают скринингу в анализе ίη νίίΐΌ. Анализы ίη νίΙΐΌ могут обеспечить широкий динамический диапазон для скрининга свойств, представляющих интерес. Свойства антител, которые могут быть подвергнуты скринингу, включают, но не ограничиваются этим, стабильность, растворимость и аффинность в отношении Рслигандов, например РсуКк. Разнообразные свойства могут подвергаться скринингу одновременно или по отдельности. Белки могут быть очищены или не очищены в зависимости от требований анализа. В одном воплощении скрининг представляет собой качественный или количественный анализ связывания антител с белковой или небелковой молекулой, которая известна или, как предполагают, связывает антитело. В одном воплощении скрининг представляет собой анализ связывания для измерения связывания с целевым антигеном. В альтернативном воплощении скрининг представляет собой анализ связывания антител с Рс-лигандом, включая, но не ограничиваясь этим, семейство РсуКк, неонатальный рецептор РсКп, белок С.'1с| комплемента и бактериальные белки А и О. Рс-лиганды могут происходить из любого организма, например, людей, мышей, крыс, кроликов, обезьян и т.д. Анализы связывания можно осуществлять с использованием различных способов, известных в данной области техники, включая, но не ограничиваясь этим, анализы на основе РКЕТ (метод резонансного переноса энергии флуоресценции) и ВКЕТ (метод резонансного переноса энергии биолюминесценции), А1рЬа8стееп(ТМ) (гомогенный анализ усиленной за счет эффекта близости люминесценции), сцинтилляционный анализ близости, ЕЫ8А (иммуноферментный твердофазный анализ), §РК (поверхностный плазмонный резонанс, также известный как В1асоге(ТМ)), изотермическую титрационную калориметрию, дифференциальную сканирующую калориметрию, гель-электрофорез и хроматографию, включающую гель-фильтрацию. В этих и других способах можно использовать определенный партнер слияния или метку антитела. В анализах можно использовать различные способы обнаружения, включающие, но не ограничивающиеся этим, хромогенные, флуоресцентные, люминесцентные или изотопные метки.

Биофизические свойства антител, например, стабильность и растворимость могут быть подвергнуты скринингу с использованием различных способов, известных в данной области техники. Стабильность белка может быть определена путем измерения термодинамического равновесия между свернутым и развернутым состоянием. Например, антитела по настоящему изобретению могут быть развернуты с использованием химического денатурирующего агента, нагревания или рН, и этот переход можно регистрировать с использованием способов, включающих, но не ограничивающихся этим, спектроскопию кругового дихроизма, флуоресцентную спектроскопию, спектроскопию поглощения, ЯМР спектроскопию, калориметрию и протеолиз. Как будет понятно специалистам в данной области техники, кинетические параметры переходов сворачивания и разворачивания также могут быть подвергнуты мониторингу с помощью этих и других методов. Растворимость и общая структурная целостность антитела может быть количественно или качественно определена с использованием широкого спектра способов, которые известны в данной области техники. Способы, которые могут найти применение в настоящем изобретении для характеристики биофизических свойств антител, включают гель-электрофорез, изоэлектрическое фокусирование, капиллярный электрофорез, хроматографию, такую как гель-хроматография, ионообменная хроматография и высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой, пептидное картирование, олигосахаридное картирование, масс-спектрометрию, спектроскопию ультрафиолетового поглощения, флуоресцентную спектроскопию, спектроскопию кругового дихроизма, изотермическую титрационную калориметрию, дифференциальную сканирующую калориметрию, аналитическое ультрацентрифугирование, динамическое рассеяние света, протеолиз и перекрестное сшивание, измерение мутности, анализы задержки на фильтре (йИет ге1агйа1юп аккаук), иммунологические анализы, анализы связывания флуоресцентных красителей, анализы окрашивания белков, микроскопию и обнаружение агрегатов посредством ЕЫ8А или другого анализа связывания. Структурный анализ, использующий рентгеновские кристаллографические методы и ЯМР спектроскопию, также может найти применение. В одном воплощении стабильность и/или растворимость могут быть измерены путем определения количества белкового раствора после некоторого определенного периода времени. В этом анализе белок может быть подвергнут или не подвергнут воздействию экстремального условия, например, повышенной температуры, низкого рН или присутствия денатурирующего агента. Поскольку функция обычно требует стабильного, растворимого и/или правильно свернутого/структурированного белка, вышеупомянутые функциональные анализы и анализы связывания также обеспечивают пути выполнения такого измерения. Например, раствор, содержащий антитело, может быть проанализирован в отношении его способности связывать целевой антиген, затем подвергнут воздействию повышенной температуры в течение одного или более определенных периодов времени, затем снова проанализирован в отношении связывания антигена. Поскольку развернутый и агрегированный белок, по-видимому, не способен связывать антиген, количество оставшейся активности обеспечивает критерий стабильности и растворимости антитела.

Биологические свойства антител по настоящему изобретению могут быть охарактеризованы в экспериментах на клетке, ткани и всем организме. Как известно в данной области техники, лекарственные средства часто тестируют на животных, включая, но не ограничиваясь этим, мышей, крыс, кроликов,

- 28 027502 собак, кошек, свиней и обезьян, с целью измерения эффективности лекарственного средства для лечения заболевания или модели заболевания, а также для измерения фармакокинетики, токсичности и других свойств лекарственного средства. Животных можно рассматривать в качестве моделей заболеваний. Что касается антител по настоящему изобретению, то особая проблема возникает при использовании животных моделей для оценки возможной эффективности кандидатных полипептидов у человека - это вызвано, по меньшей мере частично, тем, что антитела, которые оказывают специфический эффект на аффинность в отношении человеческого Рс-рецептора, могут не оказывать подобного эффекта на аффинность с ортологическим рецептором животного. Эти проблемы могут дополнительно усугубляться неизбежной неопределенностью, связанной с правильным распределением реальных ортологов (МесЬейпа е! а1., Ιιηтиподепейск, 2002 54:463-468), и фактом, что у животных просто нет некоторых ортологов (например, люди имеют РсуКПа, тогда как мыши нет). Терапевтические средства часто тестируют на мышах, включая, но не ограничиваясь этим, бестимусных мышей, 8СГО мышей, ксенотрансплантатных мышей и трансгенных мышей (в том числе нокины и нокауты). Например, антитело по настоящему изобретению, которое предназначено в качестве противоракового терапевтического средства, можно тестировать в мышиной модели рака, например, на ксенотрансплантатных мышах. В этом способе опухоль или опухолевую клеточную линию пересаживают или инъецируют мыши и впоследствии указанную мышь обрабатывают терапевтическим средством для того, чтобы определить способность антитела уменьшать или подавлять рост рака и метастазов. Альтернативный подход заключается в применении 8СГО мышиной модели, в которой мышам с дефектной иммунной системой инъецируют лимфоциты периферической крови (РВЬк) человека, предоставляя полуфункциональную и человеческую иммунную систему - с соответствующим набором человеческих РсКк - мышам, которым впоследствии были инъецированы антитела или Рс-полипептиды, которые нацелены на инъецированные человеческие опухолевые клетки. В такой модели Рс-полипептиды, которые нацелены на желаемый антиген, взаимодействуют с человеческими РВЬк у мышей для запуска противоопухолевых эффекторных функций. Такое экспериментирование может предоставить значащую информацию для определения потенциала антитела, используемого в качестве терапевтического средства. Любой организм, например, млекопитающие, могут быть использованы для тестирования. Например, благодаря своему генетическому сходству с людьми, обезьяны могут быть подходящими терапевтическими моделями и, таким образом, могут использоваться для тестирования эффективности, токсичности, фармакокинетики или других свойств антител по настоящему изобретению. Тестирование антител по настоящему изобретению на людях, в конечном счете, требуется для одобрения их в качестве лекарственных средств, и, таким образом, эти эксперименты, конечно, рассматриваются. Таким образом, антитела по настоящему изобретению можно протестировать на людях для определения их терапевтической эффективности, токсичности, фармакокинетики и/или других клинических свойств.

Исследования токсичности осуществляют для определения связанных с антителом или Рс-слиянием эффектов, которые невозможно оценить в стандартном фармакологическом профиле или наблюдаются только после многократного введения агента. Большинство тестов на токсичность осуществляют на двух видах - грызуне и не грызуне - для гарантии того, что любые неожиданные побочные эффекты не будут упущены из виду перед введением человеку нового терапевтического средства. В целом, в этих моделях можно измерять различные типы токсичности, включающие генотоксичность, хроническую токсичность, иммуногенность, репродуктивную токсичность/токсичность для развития и канцерогенность. В пределы вышеупомянутых параметров включены стандартное измерение потребления пищи, массы тела, образования антител, клинической химии и макро- и микроскопического определения стандартных органов/тканей (например, кардиотоксичности). Дополнительными параметрами измерения являются травма в области инъекции и измерение нейтрализующих антител, если они есть. Традиционно, терапевтические средства на основе моноклональных антител, свободных или конъюгированных, оценивают в отношении перекрестной реактивности с нормальными тканями, иммуногенности/продукции антител, токсичности конъюгата или линкера и неспецифической (Ьук1апбег) токсичности разновидностей, меченных радиоактивным изотопом. Тем не менее, такие исследования желательно конкретизировать для решения конкретных задач и в соответствии с руководством, установленным ЮН 86 (Международная конференция по гармонизации, от англ. Iи!етайоиа1 СопГегепсе оп Нагтош/айоп) (Исследования по безопасности биотехнологических продуктов, также отмеченные выше). По существу, основные принципы заключаются в том, что продукты достаточно хорошо охарактеризованы и в них были удалены примеси/загрязнения, так что тестируемый материал заслуживает сравнения в процессе разработки и соответствует СЬР (надлежащая лабораторная практика).

Фармакокинетику (РК) антител по изобретению можно исследовать в различных животных системах, где наиболее релевантными являются приматы, не являющиеся человеком, такие как яванский макак и макаки-резус. Однократные или повторные в.в./п.к. введения с 6000-кратным дозовым диапазоном (0,05-300 мг/кг) можно оценивать по периоду полувыведения (от суток до недель), используя концентрацию в плазме и клиренс, а также объем распределения в состоянии равновесия (к!еабу к!а!е) и уровень системного поглощения. Примеры таких параметров измерения обычно включают максимальную наблюдаемую концентрацию в плазме (С_тах), время достижения С_тах (Т_тах), площадь под кривой зависимо- 29 027502 сти концентрации в плазме от времени от 0 до бесконечности [АИС_0-1пГ] и кажущийся период полувыведения (Т_1/2). Дополнительные измеряемые параметры могут включать компартментный анализ данных зависимости концентрации от времени после в/в введения и биодоступность. Примеры фармакологических/ токсикологических исследований с использованием яванского макака были установлены для Кт!ихап® и 2еуа1т®, в которых моноклональные антитела к СГО20 являются перекрестно-реактивными. Биораспределение, дозиметрия (для меченных радиоактивным изотопом антител) и РК (фармакокинетические) исследования также могут быть осуществлены на моделях грызунов. Такие исследования оценивают переносимость при всех вводимых дозах, токсичность для конкретных тканей, локализацию в животных моделях ксенотрансплантата у грызунов, истощение клеток-мишеней. Антитела по настоящему изобретению могут обеспечивать превосходную фармакокинетику в животных системах и у людей. Например, повышенное связывание с РсКп может увеличить период полувыведения и воздействия терапевтического антитела. Альтернативно, пониженное связывание с РсКп может уменьшить период полувыведения и воздействия Рс-содержащего лекарственного средства в случаях, когда уменьшенное воздействие является благоприятным, т.е. когда такое лекарственное средство имеет побочные эффекты. В данной области техники известно, что группа Рс-рецепторов по-разному экспрессируется на различных типах иммунных клеток, а также в различных тканях. Различное распределение Рс-рецепторов в тканях может в конечном итоге оказывать влияние на фармакодинамические (РО) и фармакокинетические (РК) свойства антител по настоящему изобретению. Поскольку антитела для презентации имеют варьирующие аффинности в отношении группы Рс-рецепторов, дополнительный скрининг полипептидов на РР и/или РК свойства может быть чрезвычайно полезен для определения оптимального баланса РР, РК и терапевтической эффективности, предоставляемых каждым кандидатным полипептидом.

Фармакодинамические исследования могут включать, но не ограничиваются этим, нацеливание на специфические опухолевые клетки или блокирование сигнальных механизмов, измерение истощения клеток, экспрессирующих целевой антиген, или сигналов и т.д. Такие фармакодинамические эффекты могут быть продемонстрированы в животных моделях или у людей.

Антитела по настоящему изобретению могут быть использованы для терапевтических целей. Как будет понятно специалистам в данной области техники, антитела по настоящему изобретению могут быть использованы для любой терапевтической цели, для которой используют антитела и тому подобное. В одном воплощении антитела вводят пациенту для лечения расстройств, включающих, но не ограничивающихся этим, рак.

Пациент для целей настоящего изобретения включает как людей, так и других животных, например млекопитающих, например людей. Таким образом, антитела по настоящему изобретению находят применение как в терапии людей, так и в ветеринарии. Термин лечение или проведение лечения в настоящем изобретении означает включение терапевтического воздействия, а также профилактических или супрессивных мер для заболевания или расстройства. Таким образом, например, успешное введение антитела перед началом заболевания приводит к лечению данного заболевания. В качестве другого примера успешное введение оптимизированного антитела после клинического проявления заболевания для борьбы с симптомами заболевания составляет лечение заболевания. Лечение и проведение лечения также охватывает введение оптимизированного антитела после появления признаков заболевания с целью устранения заболевания. Успешное введение агента после начала заболевания и после развития клинических симптомов с возможным уменьшением клинических симптомов и возможным облегчением заболевания составляет лечение заболевания. Те, кто нуждаются в лечении, включают млекопитающих, уже имеющих заболевание или расстройство, а также тех, кто предрасположен к развитию заболевания или расстройства, включая тех, у кого заболевание или расстройство следует предупредить.

В одном воплощении антитело по настоящему изобретению вводят пациенту, имеющему заболевание, вовлекающее неадекватную экспрессию белка или другой молекулы, такой как РЬТ3. В объеме настоящего изобретения это означает включение заболеваний и расстройств, характеризующихся аберрантными белками, благодаря, например, изменениям в количестве присутствующего белка, локализации белка, посттрансляционной модификации, конформационном состоянии, присутствии мутантного белка и т.д. Избыток может быть вызван любой причиной, включая, но не ограничиваясь этим, сверхэкспрессию на молекулярном уровне, пролонгированное или аккумулированное появление в участке действия, или повышенную активность белка по сравнению с нормой. В данное определение включены заболевания и расстройства, характеризующиеся уменьшением белка. Это уменьшение может быть вызвано любой причиной, включая, но не ограничиваясь этим, уменьшенную экспрессию на молекулярном уровне, сокращенное или уменьшенное появление в участке действия, мутантные формы белка или пониженную активность белка по сравнению с нормой. Такой избыток или уменьшение белка можно измерить относительно нормальной экспрессии, появления или активности белка, и данное измерение может играть важную роль в разработке и/или клиническом тестировании антител по настоящему изобретению.

Рак и раковый в данной заявке относится или описывает физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примеры рака включают, но не ограничиваются этим, карциному, лимфому, бластому, саркому (включая липосаркому), нейроэндокринные опухоли, мезотелиому, шваному, менингиому, аденокарциному, меланому и лейкоз или лим- 30 027502 фоидные злокачественные заболевания.

Более конкретные примеры таких опухолей включают гематологические злокачественные опухоли, такие как неходжкинские лимфомы (ΝΗΕ), В-клеточный острый лимфобластный лейкоз/лимфому (ВЛЬЬ) и Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз/лимфому (Т-ЛЬЬ), тимому, гистиоцитоз из клеток Лангерганса, множественную миелому (ММ), миелоидные неоплазии, такие как острые миелогенные лейкозы (АМЬ), включая АМЬ с созреванием, АМЬ без дифференцировки, острый промиелоцитарный лейкоз, острый миеломоноцитарный лейкоз и острые моноцитарные лейкозы, миелодиспластические синдромы и хронические миелопролиферативные расстройства (МЭ8), в том числе хронический миелогенный лейкоз (ОМЬ).

Если рак или опухоль представляет собой лимфому или лейкоз, то заболевание может находиться на стадии минимального остаточного заболевания (МКЭ). Эта стадия, например, может быть достигнута после традиционной химиотерапии с трансплантацией или без трансплантации стволовых клеток. В этом контексте МКО относится к болезненному состоянию, где небольшое количество лимфомных/лейкозных клеток остается у пациента во время лечения или после лечения, когда пациент находится на стадии ремиссии, включая полную ремиссию (никаких симптомов или признаков заболевания). Это является основной причиной рецидива рака и лейкозов. На этой стадии, несмотря на полную ремиссию у пациента, заболевание все еще обнаруживается с помощью методов из уровня техники, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и проточная цитометрия (РАС8).

Мишень антител по настоящему изобретению может быть полиморфной в человеческой популяции. Для данного пациента или популяции пациентов на эффективность антител по настоящему изобретению, таким образом, может влиять присутствие или отсутствие специфических полиморфизмов у белков. Например, РсуКША является полиморфным по положению 158, которое обычно либо У (высокая аффинность), либо Р (низкая аффинность). Пациенты с гомозиготным генотипом У/У, как наблюдается, имеют лучший клинический ответ для лечения с помощью анти-СЭ20 антитела Кйихап® (ритуксимаб), вероятно, потому, что эти пациенты обладают более сильным ΝΚ ответом (Эа11'О//о е! а1. (2004) Сапсег Кез 64-4664-9). Дополнительные полиморфизмы включают, но не ограничиваются этим, РсуКИА К131 или Н131, и такие полиморфизмы, как известно, либо увеличивают, либо уменьшают связывание Рс и последующую биологическую активность, зависящую от полиморфизма. Антитела по настоящему изобретению могут связываться с конкретной полиморфной формой рецептора, например РсуКША 158 У, или связываться с эквивалентной аффинностью со всеми полиморфизмами в конкретном положении в рецепторе, например, как с 158У, так и с 158Р полиморфизмами РсуКША. В одном воплощении антитела по настоящему изобретению могут иметь эквивалентное связывание с полиморфизмами, которые могут быть использованы в антителе для элиминации различной эффективности, наблюдаемой у пациентов с различными полиморфизмами. Такое свойство может приводить к большей стабильности терапевтического ответа и уменьшению популяции не отвечающих на нее пациентов. Такой вариант Рс с идентичным связыванием с рецепторными полиморфизмами может иметь повышенную биологическую активность, такую как АЭСС, СЭС или период полувыведения из кровотока, или, альтернативно, пониженную активность благодаря модулированию связывания с соответствующими Рс-рецепторами. В одном воплощении антитела по настоящему изобретению могут связываться с более высокой или более низкой аффинностью с одним из полиморфизмов рецептора, либо усугубляя существующую разницу в связывании, либо обращая данное различие. Такое свойство может позволить создать терапевтические средства, специально адаптированные для эффективности в популяции пациентов, обладающих таким полиморфизмом. Например, популяция пациентов, обладающих полиморфизмом с более высокой аффинностью к ингибиторному рецептору, такому как РсуКИЬ, может получать лекарственное средство, содержащее антитело с пониженным связыванием с такой полиморфной формой рецептора, создавая более эффективное лекарственное средство.

В одном воплощении пациентов подвергали скринингу в отношении одного или более полиморфизмов с целью предсказания эффективности антител по настоящему изобретению. Эту информацию можно использовать, например, для отбора пациентов для включения или исключения из клинических исследований или, после регистрации, для обеспечения руководства для врачей и пациентов в отношении соответствующих дозировок и вариантов лечения. В одном воплощении пациентов отбирают для включения в клинические испытания антител по настоящему изобретению, если их генотип указывает на то, что они, по-видимому, отвечают существенно лучше на антитело по настоящему изобретению, по сравнению с одним или более используемыми в настоящее время терапевтическими средствами, содержащими антитело. В другом воплощении соответствующие дозировки и схемы лечения определяют с использованием такой генотипической информации. В другом воплощении пациентов выбирают для включения в клиническое испытание или для получения пострегистрационной терапии, основанной на их генотипе полиморфизма, где такая терапия содержит антитело, сконструированное для того, чтобы быть особенно эффективным для такой популяции или, альтернативно, где такая терапия содержит антитело, которое не демонстрирует разную активность для различных форм полиморфизма.

В настоящее изобретение включены диагностические тесты для идентификации пациентов, кото- 31 027502 рые, по-видимому, демонстрируют благоприятный клинический ответ на антитело по настоящему изобретению или которые, по-видимому, демонстрирует значительно лучший ответ при лечении антителом по настоящему изобретению по сравнению с одним или более используемыми в настоящее время терапевтическими средствами на основе антител. Можно использовать любой из целого ряда способов, известных в данной области техники, для определения полиморфизма РсуК у людей.

Кроме того, настоящее изобретение включает прогностические тесты, проводимые на клинических образцах, таких как кровь и образцы тканей. В таких тестах можно анализировать эффекторную функциональную активность, включая, но не ограничиваясь этим, ЛЭСС. СЭС. фагоцитоз и опсонизацию, или киллинг, независимо от механизма, раковых или иных патогенных клеток. В одном воплощении анализы ЛЭСС, такие как описано ранее, используются для прогнозирования эффективности данного антитела по настоящему изобретению для конкретного пациента. Такую информацию можно использовать для идентификации пациентов для включения или исключения из клинических испытаний или для обоснования решений в отношении соответствующих дозировок и схем лечения. Такую информацию также можно использовать для выбора лекарственного средства, которое содержит конкретное антитело, которое демонстрирует превосходную активность в таком анализе.

Предусмотрены фармацевтические композиции, где антитело по настоящему изобретению и один или более терапевтически активных агентов приготовлены в виде препарата. Препараты антител по настоящему изобретению готовят для хранения путем смешивания антитела, имеющего желаемую степень чистоты, с возможными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Кеш1пд1ои'8 РЬагтасеийса1 8с1еисе§ 16'¹' еШйои, О§о1, А. Ей., 1980) в форме лиофилизированных препаратов или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов при используемых дозировках и концентрациях и включают буферы, такие как фосфатный, цитратный, ацетатный, и другие органические кислоты; антиоксиданты, включающие аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмония хлорид; гексаметония хлорид; бензалкония хлорид, бензетония хлорид, фенол, бутиловый или бензиловый спирт, алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехин, резорцин, циклогексанол, 3пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (менее чем примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включающие глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; подсластители и другие ароматизаторы; наполнители, такие как микрокристаллическая целлюлоза, лактоза, кукурузный крахмал и другие крахмалы; связующие агенты; добавки; красящие агенты; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, Ζη-белковые комплексы); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как Т\УЕЕ№™, РЬиКО№С8™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ). В одном воплощении фармацевтическая композиция, которая содержит антитело по настоящему изобретению, может находиться в водорастворимой форме, такой как представлена в виде фармацевтически приемлемых солей, что означает включение солей присоединения как кислоты, так и основания. Фармацевтически приемлемая соль присоединения кислоты относится к таким солям, которые сохраняют биологическую эффективность свободных оснований и которые не являются биологически или иным образом нежелательными, образованные с неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и тому подобное, и органическими кислотами, такими как уксусная кислота, пропионовая кислота, гликолевая кислота, пировиноградная кислота, щавелевая кислота, малеиновая кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, фумаровая кислота, винная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, коричная кислота, миндальная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, салициловая кислота и тому подобное. Фармацевтически приемлемые соли присоединения оснований включают соли, происходящие из неорганических оснований, такие как соли натрия, калия, лития, аммония, кальция, магния, железа, цинка, меди, марганца, алюминия и тому подобного. Особенно полезны соли аммония, калия, натрия, кальция и магния. Соли, происходящие из фармацевтически приемлемых органических нетоксичных оснований, включают соли первичных, вторичных и третичных аминов, замещенных аминов, включающих природные замещенные амины, циклические амины и основные ионообменные смолы, такие, как изопропиламин, триметиламин, диэтиламин, триэтиламин, трипропиламин и этаноламин. Препарата, используемые для введения ίη νί\Ό, должны быть стерильными. Это легко достигается путем фильтрования через стерильные мембраны для фильтрации или другими способами.

Антитела, раскрытые в данной заявке, также могут быть приготовлены в виде иммунолипосом. Липосома представляет собой небольшой пузырек, содержащий различные типы липидов, фосфолипидов и/или поверхностно-активного вещества, что полезно для доставки терапевтического агента млекопитающему. Липосомы, содержащие антитело, получают способами, известными в данной области техники, такими как описано в ЕрЦет е! а1., 1985, Ргос Ν;·ι11 Асай 8с1 И8А, 82:3688; Нмаид е! а1., 1980, Ргос Ν;·ι11 Асай 8с1 И8А, 77:4030; И8 4485045; И8 4544545 и заявка РСТ \УО 97/38731. Липосомы с повышенным

- 32 027502 временем циркуляции раскрыты в патенте США 5013556. Компоненты липосомы, как правило, расположены в двухслойном образовании, напоминающем расположение липидов в биологических мембранах. Особенно полезные липосомы могут быть получены методом выпаривания в обращенной фазе с липидной композицией, содержащей фосфатидилхолин, холестерин и ПЭГ-дериватизированный фосфатидилэтаноламин (РНС-РЕ). Липосомы подвергают экструзии через фильтры с определенным размером пор с получением липосом с желаемым диаметром. Внутри липосомы возможно может находиться химиотерапевтический агент или другой терапевтически активный агент (СаЫ/оп с1 а1., 1989, 1. №Юопа1 Сапсег 1П81 81:1484).

Антитело и другие терапевтически активные агенты также могут быть заключены в микрокапсулах, полученных с помощью методов, включающих, но не ограничивающихся этим, методы коацервации, межфазную полимеризацию (например, с использованием гидроксиметилцеллюлозных или желатиновых микрокапсул или поли(метилметакрилат)ных микрокапсул), коллоидные системы для доставки лекарственных средств (например, липосомы, микросферы альбумина, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) и макроэмульсии.

Такие методы раскрыты в Реттфоп'х РЬаттасеийса1 δ^ιτ^δ 161Н ебйюп, 0§о1, Α, Ε6, 1980. Могут быть получены препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердого гидрофобного полимера, которые находятся в виде формованных изделий, например, пленок или микрокапсул. Примеры матриц, обеспечивающих замедленное высвобождение, включают полиэфиры, гидрогели (например, поли(2гидроксиэтилметакрилат), или поли(виниловый спирт)), полилактиды (патент США 3,773,919), сополимеры Ь-глутаминовой кислоты и гамма-этил-Ь-глутамата, неразлагаемый этилен-винилацетат, разлагаемые сополимеры молочной кислоты-гликолевой кислоты, такие как Ьиргоп Эеро1® (которые представляет собой инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты-гликолевой кислоты и лейпролида ацетата), поли-Э-(-)-3-оксимасляную кислоту и РтоЬеаке® (коммерчески доступный от А1кегте§), который представляет собой систему доставки на основе микросфер, состоящую из желаемой биоактивной молекулы, включенной в матрицу из поли-ЭЬ-лактид-со-гликолида (РЬС).

Введение фармацевтической композиции, содержащей антитело по настоящему изобретению, например, в форме стерильного водного раствора, может быть осуществлено различными путями, включая, но не ограничиваясь этим, пероральный, подкожный, внутривенный, интраназальный, внутриушной, чрескожный, местный (например, гели, мази, лосьоны, кремы и т.д.), внутрибрюшинный, внутримышечный, внутрилегочный, вагинальный, парентеральный, ректальный или внутриглазной. Как известно в данной области техники, фармацевтическую композицию можно приготовить в виде препарата соответственно в зависимости от способа введения.

Как известно в данной области техники, белковые терапевтические средства часто доставляются посредством в/в инфузии или болюса. Антитела по настоящему изобретению также можно доставлять с помощью таких способов. Например, введение может быть внутривенной инфузией 0,9% хлорида натрия в качестве инфузионного носителя.

Кроме того, любая из множества систем доставки известна в данной области техники и может быть использована для введения антител по настоящему изобретению. Примеры включают, но не ограничиваются этим, инкапсуляцию в липосомы, микрочастицы, микросферы (например, микросферы РЬА/РСА) и тому подобное. Альтернативно, может быть использован имплант из пористого, непористого или гелеобразного материала, в том числе мембран или волокон. Системы с замедленным высвобождением могут содержать полимерный материал или матрицу, такие как полиэфиры, гидрогели, поли(виниловый спирт), полилактиды, сополимеры Ь-глутаминовой кислоты и этил-Ь-глутамата, этилен-винилацетат, сополимеры молочной кислоты-гликолевой кислоты, такие как Ьиргоп ЭероКР) и поли-Э-(-)-3-гидроксимасляная кислота. Также можно вводить нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело по настоящему изобретению, например, посредством ретровирусной инфекции, прямой инъекции или нанесения покрытия из липидов, рецепторов клеточной поверхности или других агентов трансфекции. Во всех случаях могут быть использованы системы с контролируемым высвобождением для высвобождения антитела в желаемом месте действия или рядом с ним.

Дозируемые количества и частоты введения в одном воплощении выбраны так, чтобы они были терапевтически или профилактически эффективными. Как известно в данной области техники, могут потребоваться корректировки с учетом белковой деградации, системной доставки по сравнению с локальной доставкой и скорости нового протеазного синтеза, а также возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола, диеты, времени введения, взаимодействия лекарственных средств и тяжести состояния, и будут определены с помощью рутинного экспериментирования специалистами в данной области техники.

Концентрация терапевтического активного антитела в композиции может варьироваться от примерно 0,1 до 100 мас.%. В одном воплощении концентрация антитела находится в диапазоне от 0,003 мкМ до 1,0 М. Для лечения пациента можно вводить терапевтически эффективную дозу антитела по настоящему изобретению. Под терапевтически эффективной дозой в данной заявке подразумевают дозу,

- 33 027502 которая производит эффекты, для которых ее вводят. Точная доза будет зависеть от назначения лечения и будет определяться специалистом в данной области техники с использованием известных методов. Дозы могут варьироваться от 0,0001 до 100 мг/кг массы тела или больше, например 0,1, 1, 10 или 50 мг/кг массы тела, например, от 1 до 10 мг/кг массы тела.

В некоторых воплощениях используют только одну дозу антитела. В других воплощениях вводят многократные дозы антитела. Время между введениями может составлять менее 1 ч, примерно 1 ч, примерно 1-2 ч, примерно 2-3 ч, примерно 3-4 ч, примерно 6 ч, примерно 12 ч, примерно 24 ч, примерно 48 ч, примерно 2-4 суток, примерно 4-6 суток, примерно 1 неделю, примерно 2 недели или более чем 2 недели.

В других воплощениях антитела по настоящему изобретению вводят в регулярных режимах дозирования, либо посредством непрерывной инфузии, либо посредством частого введения без длительных периодов отдыха. Такое регулярное введение может включать введение доз с постоянными интервалами без периодов отдыха. Обычно такие схемы охватывают постоянную низкодозовую или непрерывную инфузию в течение длительного периода времени, например, в течение 1-2 суток, 1-2 недель, 1-2 месяцев вплоть до 6 месяцев или более. Применение более низких доз может минимизировать побочные эффекты и потребность в периодах отдыха.

В некоторых воплощениях антитело по настоящему изобретению и один или более других профилактических или терапевтических агентов вводят пациенту циклически. Циклическая терапия включает введение первого агента в одно время, второго агента во второе время, возможно дополнительных агентов в дополнительное время, возможно период отдыха и затем повторение этой последовательности введений один или более раз. Число циклов обычно составляет от 2 до 10. Циклическая терапия может уменьшить развитие устойчивости к одному или более агентам, может минимизировать побочные эффекты или может улучшить эффективность лечения.

Антитела по настоящему изобретению можно вводить одновременно с одной или более другими терапевтическими схемами или агентами. Дополнительные терапевтические схемы или агенты могут быть использованы для улучшения эффективности или безопасности антитела. Также могут быть использованы дополнительные терапевтические схемы или агенты для лечения того же заболевания или сочетанного заболевания вместо того, чтобы изменить действие антитела. Например, антитело по настоящему изобретению можно вводить пациенту одновременно с химиотерапией, лучевой терапией или и с химиотерапией, и с лучевой терапией. Антитело по настоящему изобретению можно вводить в комбинации с одним или более другими профилактическими или терапевтическими агентами, включая, но не ограничиваясь этим, цитотоксические агенты, химиотерапевтические агенты, цитокины, ингибирующие рост агенты, антигормональные агенты, ингибиторы киназ, антиангиогенные агенты, кардиопротекторы, иммуностимулирующие агенты, иммунодепрессанты, агенты, которые стимулируют пролиферацию гематологических клеток, ингибиторы ангиогенеза, ингибиторы протеинтирозинкиназы (РТК), дополнительные антитела, ингибиторы РсуКПЪ или других Рс-рецепторов или другие терапевтические агенты.

Термины в комбинации с и совместное введение не ограничиваются введением профилактических или терапевтических агентов точно в то же самое время. Напротив, это подразумевает, что антитело по настоящему изобретению и другой агент или агенты вводят последовательно и в течение временного интервала, так что они могут действовать вместе для обеспечения преимущества, которое увеличивается по сравнению с лечением только либо антителом по настоящему изобретению, либо другим агентом или агентами. В одном воплощении антитело и другой агент или агенты действуют аддитивно, например, они действуют синергически. Такие молекулы соответственно присутствуют в комбинации в количествах, которые являются эффективными для предполагаемого назначения. Опытный врач-терапевт сможет определить эмпирически или с учетом фармакокинетики и способов действия агентов подходящую дозу или дозы каждого терапевтического агента, а также подходящие сроки и способы введения.

В одном воплощении антитела по настоящему изобретению вводят с одной или более дополнительными молекулами, содержащими антитела или Рс. Антитела по настоящему изобретению можно вводить совместно с одним или более другими антителами, которые обладают эффективностью в лечении того же заболевания или дополнительного сочетанного заболевания, например, можно вводить два антитела, которые распознают два антигена, которые сверхэкспрессируются при данном типе рака.

В одном воплощении антитела по настоящему изобретению вводят с химиотерапевтическим агентом. Под химиотерапевтическим агентом, как использовано в данной заявке, подразумевают химическое соединение, полезное в лечении рака. Примеры химиотерапевтических агентов включают, но не ограничиваются этим, алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан, андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон, антиадренальные средства, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан, антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и гозерелин; антибиотики, такие как аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасенне, блеомицины, кактиномицин, калихеамицин, карабицин, каминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-Ь-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, ида- 34 027502 рубицин, марцелломицин, митомицины, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиэстрогены, включающие, например, тамоксифен, ралоксифен, ингибирующие ароматазу 4(5)-имидазолы, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, ЬУ 117018, онапристон и торемифен (Фарестон); антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-РИ); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включающие альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилолмеламин; пополнитель фолиевой кислоты, такой как фолиновая кислота; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид оксида мехлорэтамина, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урациловый иприт; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платину; белки, такие как аргининдезиминаза и аспарагиназа; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, триамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как, анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, еноцитабин, флоксуридин, 5-РИ; таксаны, например, паклитаксел (ТАХОЬ®, Вг18!о1-Муег8 ЗсцнЬЬ Опсо1оду, Ргшсе!оп, Ν.Ρ) и доцетаксел (ТАХОТЕКЕ®, Кйпе-Рои1епс Когег, Ап!опу, Франция); ингибитор топоизомеразы КР§ 2000; ингибитор тимидилатсинтазы (такой как Тотибех); дополнительные химиотерапевтические средства, включающие ацеглатон; гликозид альдофосфамид; аминолевулиновую кислоту; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; дифторметилорнитин (ОМРО); элформитин; эллиптиния ацетат; этоглуцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидамин; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; подофиллиновую кислоту; 2-этилгидразид; прокарбазин; РЖ®; разоксан; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2-трихлортриэтиламин; уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид (Ага-С); циклофосфамид; тиотепу; хлорамбуцил, гемцитабин, 6-тиогуанин, меркаптопурин, метотрексат, этопозид (νΓ-16); ифосфамид, митомицин С, митоксантрон, винкристин; винорелбин; навелбин; новантрон; тенипозид; дауномицин; аминоптерин; кселоду; ибандронат; СРТ-11; ретиноевую кислоту; эсперамицины; капецитабин. Фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеупомянутых соединений также могут быть использованы.

Химиотерапевтический или другой цитотоксический агент можно вводить в виде пролекарства. Под пролекарством, как использовано в данной заявке, подразумевают предшественник или производную форму фармацевтически активного вещества, которое является менее цитотоксичным по отношению к опухолевым клеткам по сравнению с родительским лекарственным средством и способно ферментативно активироваться или превращаться в более активную родительскую форму. См., например, ^ΐ1тап, 1986, Вюсйетюа1 8ос1е1у Тгап8ас1юп8, 615!й Меебпд Ве1£а8!, 14:375-382; §!е11а е! а1., Ргобгид8: А Сйетюа1 Арргоасй !о Тагде!еб Огид Ое1Кегу, Онес!еб Огид Ое1Кегу; и Вогсйагб! е! а1., (еб.): 247-267, Нитапа Рге88, 1985. Пролекарства, которые могут найти применение в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются этим, фосфатсодержащие пролекарства, тиофосфатсодержащие пролекарства, сульфатсодержащие пролекарства, пептидсодержащие пролекарства; пролекарства, модифицированные ϋ-аминокислотами; гликозилированные пролекарства, бета-лактамсодержащие пролекарства, возможно замещенные феноксиацетамидсодержащие пролекарства или возможно замещенные фенилацетамидсодержащие пролекарства, 5-фторцитозин и другие 5-фторуридиновые пролекарства, которые могут быть превращены в более активное цитотоксическое свободное лекарственное средство. Примеры цитотоксических лекарственных средств, которые могут быть дериватизированы в пролекарственную форму для применения с антителами по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются этим, любые из вышеупомянутых химиотерапевтических агентов.

В другом воплощении антитело вводят с одним или более иммуномодулирующими агентами. Такие агенты могут увеличивать или уменьшать продукцию одного или более цитокинов, активировать или ингибировать презентацию аутоантигенов, маскировать МНС антигены или стимулировать состояние пролиферации, дифференцировки, миграции или активации одного или более типов иммунных клеток. Иммуномодулирующие агенты включают, но не ограничиваются этим, нестероидные противовоспалительные лекарственные средства Щ§АГО8), такие как аспирин, ибупрофен, целекоксиб, диклофенак, этодолак, фенопрофен, индометацин, кеторолак, оксапрозин, набументон, сулиндак, толментин, рофекоксиб, напроксен, кетопрофен и набуметон, стероиды (например, глюкокортикоиды, дексаметазон, кортизон, гидроксикортизон, метилпреднизолон, преднизолон, преднизолон, триамцинолон, азульфидинэйкозаноиды, такие как простагландины, тромбоксаны и лейкотриены, а также местные стероиды, такие как антран, кальципотриен, клобетазол и тазаротен), цитокины, такие как ТОРЬ, ΙΕΝα, ΙΕΝβ, ΙΕΝγ, 1Ь-2, 1Ь-4, 1Ь-10, цитокин, хемокин или антагонисты рецепторов, включающие антитела, растворимые рецепторы и рецептор-Рс слияния против ВАРР, В7, ССК2, ССК5, СО2, СО3, СО4, СО6, СО7, СО8, СО11, СО14, СО15, СО17, СО18, СО20, СО23, СО28, СО40, СО40Ь, СО44, СО45, СО402, СО64, СО80, СО86, СО147,

- 35 027502

СО152, факторов комплемента (С5, Ό) СΤ^Α4. эотаксина, Рак, IСΑΜ, ΚΌδ, ΙΡΝα, ΙΡΝβ, ΙΡΝγ, ΙΡΝΑΚ, Ι§Ε, ΙΕ-1, ΙΌ-2, ΙΌ-2Κ, Ш-4, ΙΌ-5Κ, Ш-6, ΙΌ-8, Ιϋ-9 ΙΌ-12, Ш-13, ГО-13К1, ΙΌ-15, ГО-18К, ΙΌ-23, интегринов, ΌΡΑ-1, ΕΡΑ-3, ΜΗ^ селектинов, Т0РЗ, ТОТа, ТИРЗ, ТМР-К1, Т-клеточного рецептора, включая ΕηЬге1® (этанерцепт), Нитка® (адалимумаб) и Кетюабе® (инфликсимаб), гетерологичного антилимфоцитарного глобулина; другие иммуномодулирующие молекулы, такие как 2-амино-6-арил-5-замещенные пиримидины, антиидиотипические антитела в отношении МНС-связывающих пептидов и МНС фрагментов, азатиоприн, бреквинар, бромокриптин, циклофосфамид, циклоспорин А, Ό-пеницилламин, дезоксиспергуалм (беοχукρе^§иаίт), РК506, глутаральдегид, золото, гидроксихлорохин, лефлуномид, малононитрилоамиды (например лефлуномид), метотрексат, миноциклин, мизорибин, микофенолата мофетил, рапамицин и сульфасалазин.

В альтернативном воплощении антитела по настоящему изобретению вводят с цитокином. Под цитокином, как использовано в данной заявке, подразумевают общий термин для белков, высвобождаемых одной клеточной популяцией, которые действуют на другую клетку в качестве межклеточных медиаторов. Примерами таких цитокинов являются лимфокины, монокины и традиционные полипептидные гормоны. Среди цитокинов включены гормоны роста, такие как человеческий гормон роста, Νметионильный человеческий гормон роста и бычий гормон роста; паратиреоидный гормон, тироксин; инсулин; проинсулин, релаксин, прорелаксин, гликопротеиновые гормоны, такие как фолликулостимулирующий гормон (ΡδΗ), тиреостимулирующий гормон (ΎδΗ) и лютеинизирующий гормон (ЬН), печеночный фактор роста, фактор роста фибробластов; пролактин, плацентарный лактоген, фактор некроза опухоли -альфа и -бета; ингибирующая субстанция Мюллера, мышиный гонадотропин-ассоциированный пептид, ингибин; активин, фактор роста сосудистого эндотелия; интегрин; тромбопоэтин (ТРО); факторы роста нервов, такие как N0Ρ-бета; тромбоцитарный фактор роста, трансформирующие факторы роста (Т0Рк), такие как Т0Р-альфа и Т0Р-бета, инсулиноподобный фактор роста-Ι и -ΙΙ; эритропоэтин (ЕРО), остеоиндуктивные факторы, интерфероны, такие как интерферон-альфа, -бета и -гамма, колониестимулирующие факторы (СδΡк), такие как макрофаг-СδΡ (ΜΖδΡ), гранулоцит-макрофаг-СδΡ (0ΜΖδΡ) и гранулоцит-СδΡ (С-СЪР), интерлейкины (Шк), такие как ΙΌ-1, ЕЬ-1 альфа, ΙΌ-2, ΙΌ-3, ΙΌ-4, ΙΌ-5, ΙΌ-6, ΙΌ-7, ΙΌ-8, ΙΌ-9, Εϋ-10, ΙΌ-11, ΙΌ-12, ЕЬ-15, фактор некроза опухолей, такой как ТЯР-альфа или ТНР-бета, и другие полипептидные факторы, включающие ЫР и ΡίΙ лиганд (КЬ). Как использовано в данной заявке, термин цитокин включает белки из природных источников или из рекомбинантной клеточной культуры и биологически активные эквиваленты цитокинов с нативной последовательностью.

В одном воплощении цитокины или другие агенты, которые стимулируют клетки иммунной системы, вводят совместно с антителом по настоящему изобретению. Такой режим лечения может усиливать желаемую эффекторную функцию. Например, агенты, которые стимулируют ΝΚ-клетки (натуральные киллеры), включая, но не ограничиваясь этим, ΙΕ-2, можно вводить совместно. В другом воплощении агенты, которые стимулируют макрофаги, включая, но не ограничиваясь этим, С5а, формил-пептиды, такие как Ν-формил-метионил-лейцил-фенилаланин (Ве^д^е^-Вοтρаб^е е1 а1. (2003) δсаηб Ε ΙιηιηιιποΡ 57. 221-8), можно вводить совместно. Также можно вводить агенты, которые стимулируют нейтрофилы, включая, но не ограничиваясь этим, 0-СδΡ, 0Μ-СδΡ и тому подобное. Кроме того, могут быть использованы агенты, которые стимулируют миграцию таких иммуностимулирующих цитокинов. Также дополнительные агенты, включающие, но не ограничивающиеся этим, интерферон-гамма, ΙΕ-3 и ΙΕ-7, могут стимулировать одну или более эффекторных функций.

В альтернативном воплощении цитокины или другие агенты, которые ингибируют эффекторную клеточную функцию, вводят совместно с антителом по настоящему изобретению. Такой режим лечения может ограничивать нежелательную эффекторную функцию.

Антитела по настоящему изобретению можно комбинировать с другими терапевтическими схемами. Например, в одном воплощении пациент, которого лечат антителом по настоящему изобретению, также может получать лучевую терапию. Лучевую терапию можно применять согласно протоколам, обычно используемым в данной области техники и известным специалисту в данной области. Такая терапия включает, но не ограничивается этим, облучение цезием, иридием, йодом или кобальтом. Лучевая терапия может представлять собой облучение всего тела или может быть направлена локально на конкретные участок или ткань в организме или на теле, такие как легкое, мочевой пузырь или предстательная железа. Обычно лучевую терапию применяют импульсно в течение периода времени от примерно 1 до 2 недель. Лучевую терапию, однако, можно применять в течение более длительных периодов времени. Например, лучевую терапию можно применять к пациентам, имеющим рак головы и шеи, в течение от примерно 6 до примерно 7 недель. При желании, лучевую терапию можно применять в виде однократной дозы или нескольких последовательных доз. Опытный врач-терапевт сможет определить эмпирически подходящую дозу или дозы лучевой терапии, полезные в данной работе. Согласно другому воплощению изобретения антитело по настоящему изобретению и одну или более других противораковых терапий используют для воздействия на раковые клетки ех νίνο. Предусматривается, что такое лечение ех νίνο может быть полезным при трансплантации костного мозга и, в частности, аутологичной трансплантации костного мозга. Например, воздействие на клетки или ткань(и), содержащие раковые клетки, с

- 36 027502 помощью антитела и одной или более других противораковых терапий, таких как описано выше, можно использовать для истощения или по существу истощения раковых клеток перед трансплантацией пациенту-реципиенту.

Конечно, предполагается, что антитела по изобретению можно использовать в комбинации с еще другими способами терапии, такими как хирургия или фототерапия.

Настоящее изобретение также иллюстрируется следующими примерами. Однако следует понимать, что изобретение не ограничивается приведенными в примерах воплощениями.

Примеры

Материалы и методы

А. Бактериальные штаммы и плазмиды

ЕзсЬепсЫа соЬ ЭН5а (1пуЬгодеп, Каг1згиЬе, Германия) использовали для амплификации плазмид и клонирования.

Β. Клеточные линии

Клеточную линию миеломы мыши 8р2/0-Ад14 (АТСС, Американская коллекция типовых культур, Мапаззаз, νΑ, США), используемую для продукции рекомбинантных производных Ьит-РЬТЗ специфического антитела, культивировали в 1МОМ (РΑN-Β^ο!есЬ, АЫепЬасЬ, Германия), дополненной 10% эмбриональной телячьей сыворотки (РΑN-Β^ο!есЬ, АЫепЬасЬ, Германия), 1% пенициллина и стрептомицина Ъоп/а, Βазе1, Швейцария). Стабильные трансфектанты отбирали с помощью 1 мг/мл 0418 (1пуЬгодеп, Каг1згиЬе, Германия).

Гибридомные клеточные линии Βνΐ0 и 408, секретирующие мышиные 1д01/к специфические антитела против РЬТЗ человека (полученные от д-ра НЪ Βτι1ΐΓίιτ£, НКТ ТиЬшдеп, Германия), культивировали в КРМ1 1640 (РΑN-Β^ο!есЬ, АЫепЬасЬ, Германия), дополненной 10% эмбриональной телячьей сыворотки (РΑN-Β^ο!есЬ, АЫепЬасЬ, Германия), 1% пенициллина и стрептомицина Ъоп/а, Βазе1, Швейцария).

Мононуклеарные клетки периферической крови (РΒМСз), выделенные с помощью центрифугирования в градиенте плотности (Ь8М 1077, Ьоп/а, Βазе1, Швейцария), гибридомные клетки и клетки НАЬМ16 (любезный подарок К. НапДдгейпдег, Педиатрический факультет, Университет Тюбингена) поддерживали в КРМ1 1640, мышиные клетки 8р2/0-Ад14 (АТСС, Мапаззаз, США) в среде 1МОМ Ъоп/а). Все среды дополняли 10% инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 1 мМ пирувата натрия, заменимыми аминокислотами, 2 мМ Ь-глутамина и 57 нМ бета-меркаптоэтанола.

С. РЬТЗ-трансфектан

Полноразмерную кДНК человеческого РЬТЗ (ΟеηΒаηк #ΒС 126З50) получали из 1та0епез, Берлин, Германия. кДНК клонировали в вектор рсЭНАЗ с использованием добавленных ΒатНI- и ХЬа1-сайтов рестрикции и трансфицировали в клетки 8р2/0-Ад14 посредством электропорации.

Ό. Антитела и проточная цитометрия

СОЗЗ-РЕ-Оу5 (клон №М5З), СОЗ4-АРС (клон 581), СО-45-Р1ТС (клон Н1З0), СП12З-РЕ^5 (клон 9Р5), СЭ11с-РЕ (клон Β-^6) и изотипические контрольные антитела приобретали в ΒΌ Β^^ικ^ (Не1Де1Ьегд, Германия), антитело СЭЗ0З-Р1ТС в М11!епу1 Β^ο!есЬ (Βе^д^зсЬ-01аάЬасЬ, Германия). Все антитела инкубировали с клетками в течение З0 минут при 4°С. Для непрямой иммунофлуоресценции использовали РЕ- или АРС-конъюгированные козьи анти-мышиные Р(аЬ)₂-фрагменты и козьи анти-человеческие Р(аЬ)₂-фрагменты соответственно Цаскзоп 1ттипоКезеагсЬ, \Уез1 0гоуе, США). В нескольких экспериментах авторы объединяли непрямую и прямую иммунофлуоресценцию для многомерного анализа, добавляя меченые антитела на конечной стадии. Клетки анализировали на РАС8Сап!о II или на РАС8СаЬЬиг ЪесЮп Эюктзоп). Шарики для количественного анализа непрямой иммунофлуоресценции (0ΙР1К1Т®) приобретали в Эако (НатЬигд, Германия) и использовали согласно протоколу производителя. Для количественной оценки гуманизированных антител не было подходящих шариков. Таким образом, специфический индекс флуоресценции (8Р1) рассчитывали путем деления средней интенсивности флуоресценции, полученной с 4С88Э1ЕМ, на значение, обнаруженное с несвязывающим, 8Э1Е-модифицированным контрольным антителом 9.2.27. Для этих экспериментов использовали РЕ-конъюгированные антитела, полученные с помощью набора Ьупх для быстрой конъюгации РЕ антител (АЬЭ 8его!ес, ЭпззеИогГ, Германия). Рекомбинантный РЬТЗ лиганд (гРЬТЗЬ) приобретали в Рерго!есЬ ЕС (ЬопДоп, Великобритания). Для экспериментов по конкуренции различные концентрации гРЬТЗЬ инкубировали с клетками НАБ-МИ) и ΒVΐ08^IΕМ или 4С88Э1ЕМ (1 мкг/мл) в течение З0 мин при 4°С и анализировали с помощью непрямой иммунофлуоресценции и проточной цитометрии.

Е. Анализ поглощения З[Н]-метил-тимидина

2х10⁵ АМЬ бластов сеяли в трех повторностях в 96-луночных планшетах и инкубировали с различными концентрациями оптимизированных антител. Через 24 ч клетки подвергали воздействию З[Н]метил-тимидина (0,5 мкКи/лунка) в импульсном режиме в течение еще 20 ч и собирали на плоских фильтрах. Включенную радиоактивность определяли с помощью жидкостно-сцинтилляционного подсчета в счетчике для микропланшетов 2450 (Регк1п Е1тег, ХУаМинп, США).

- З7 027502

Р. Анализы высвобождения ⁵¹ Сг

Клетки NА^М16 и первичные АМЬ бласты использовали в качестве мишеней. Для выделения бластов и эффекторных клеток из препаратов РВМС от пациентов с лейкозом, клетки метили с помощью СЭ34 и СЭ33 микрошариков и разделяли на ЬО колонках в соответствии с протоколом производителя (МШепу1 Вю1ес). Количество контаминирующих бластных клеток в популяции отрицательно отобранных эффекторных клеток определяли с помощью РАС8 анализа, и оно варьировало от 1 до 10% в зависимости от исходной бластной контаминации. В некоторых экспериментах меченые ОСк использовали в качестве клеток-мишеней. Анализы высвобождения хрома выполняли, как ранее описано (Οΐζ Т., ОгоккеНоуек! Ь., НоГтагт М., Каттепкее Н.О., 1ипд О. А Ыкресйгс кшд1е сйаш апйЬойу 1йа1 тека1ек 1агде1 се11гек1пс1ей, кирга-адоткйс СЭ28 кйти1айоп апй кййпд оГ 1утр1юта се11к. Ьеикет1а. 2009;23(1):71-77). Кратко, меченые клетки-мишени и РВМСк инкубировали при 37°С в течение 4 или 8 ч в 96-луночных плоскодонных планшетах в присутствии различных концентраций антител при соотношении РВМС:мишень 50:1. Процент специфического высвобождения ⁵¹[Сг] рассчитывали согласно формуле [срт (число импульсов в минуту) (тест)-срт (спонтанный)/[срт (лизис тритоном)]-срт (спонтанный)]. Если лейкозные бласты использовали в качестве мишеней, то добавление эффекторных клетой без антитела уменьшало спонтанное высвобождение 51 [Сг] в некоторых экспериментах, приводящих к отрицательным значениям для специфического высвобождения.

0. Антигенный сдвиг

Клетки NА^М16 или АМЬ бласты инкубировали с различными концентрациями 4О88Э1ЕМ или ВУ108О1ЕМ в среде КРМ1 1640. Через 24 или 48 ч клетки промывали ледяным РАС8-буфером, инкубировали с насыщающей концентрацией 4О88Э1ЕМ (2 мкг/мл) в течение 30 минут при 4°С, окрашивали РЕ-конъюгированными козьими анти-человеческими Р(аЬ)₂-фрагментами и анализировали с помощью РАС8. Относительную поверхностную экспрессию РЬТ3 рассчитывали, определяя среднюю интенсивность флуоресценции клеток, предварительно инкубированных без антитела как 100%.

H. Выделение и созревание дендритных клеток (ЭС)

ЭСк выделяли из препаратов лейкоцитных пленок здоровых людей с использованием набора II для выделения ОС из крови согласно протоколу производителя (МП1епу1 В1о1ес). Миелоидные (тЭС) и плазмацитоидные (рЭС) субпопуляции окрашивали смесью антител СЭНс-РЕ, СЭ303-Р1ТС и СЭ123-РЕСу5. Для получения ш уйго шЭС, 1х 10⁸ РВМСк здоровых людей сеяли в 10 мл среды Х-Угуо15 (01Ьсо, Оагтйак, Германия). Через 2 ч при 37°С прикрепленные клетки культивировали в среде КРМ1 1640, дополненной 50 нг/мл ОМ-С8Р и 1Ь-4 (20 нг/мл) в течение 5 суток. На 6-е сутки добавляли ЬР8 (100 нг/мл). Клетки собирали на 7-е сутки и анализировали с помощью проточной цитометрии.

I. Анализ колониеобразующих единиц

Клетки костного мозга получали путем промывания головки бедренной кости пациентов, подвергнутых операции на тазобедренном суставе. Клетки очищали с помощью центрифугирования в градиенте плотности и сеяли при 10⁷/мл в среде КРМ1 1640, содержащей 5 мкг/мл 4О88Э1ЕМ или 9.2.278Э1Е. После 24 ч инкубации клетки переносили в антитело-содержащую (5 пг/мл) метилцеллюлозную среду (10000 клеток/мл, МекоСиЙ Н4434 с1аккю, 81етсе11 ТесЬпо1од1ек, ОгепоЬ1е, Франция). Анализ выполняли в трех повторностях. Через 12 суток колонии подсчитывали и классифицировали.

Пример 1. Идентификация неизвестных последовательностей из РЬТ3 специфических антител

А. Клонирование ДНК, кодирующей У-области

Клонирование У-областей осуществляли с помощью ПЦР. Большинство методов начинаются с получения мРНК и определяли сходство У-областей антител (КаЬа!, Е.А., Уи, Т.Т., Ке1й-Ми11ег, М., Реггу, Н.М., ОоНектап, К.8. 8ециепсек оГ РгсЛешк оГ ^шшиηо1од^са1 пИегекР 4к ей. и.8. ОерагИпет оГ Неа1к апй Нитап 8егуюек, РиЬНс Неа1к 8егуюе, №копа1 1пк1ПШе оГ Неа1к, Векекйа, МО. 1987), что делало возможным конструирование вырожденных праймеров для ПЦР-амплификации (Ьатск, МУ., ОашеПкоп, Ь., Вгеппег, С.А., ХУайасе, Е.Р., Акайаткоп, М., Ргу, К.Е., ВоггеЬаеск, С.А.К. Ро1утегаке сйат геасйоп икей т1хей рптегк: с1ошпд оГ а Нитап топос1опа1 апйЬойу уапаЬ1е гедюп депек Ггош кшд1е НуЬпйота се11к. Вю/Тесйпо1оду 7: 934-938, 1989; Ойапк, РЕ, Оикко\у, Э.Н., кпек, Р.Т., ХУйНен О. С1опшд ^шшипод1оЬи1^п уапаЬ1е йоташк Гог ехргеккюп Ьу ке ро1утегаке сйаш геасйоп. Ргос. №Й. Асай. 8сг И8А 86: 3833-3837, 1989). Однако несмещенная (ипЫакей) амплификация полных репертуаров У-областей требует очень сложных наборов вырожденных праймеров (Магкк Ю., НоодепЬоот Н.К., Воплей Т.Р., МсСаГГейу 1, ОйГйкк АГО, \Уш1ег О. Ву-раккшд ^тшил^ζайоп. Нитап апйЬокек Ггош У-депе ПЬгапек ккр1ауей оп рйаде. I. Мо1. Вю1. 222: 581-597, 1991). Клонирование У-областей с очень нетипичными последовательностями по-прежнему невозможно при таком подходе. Кроме того, исходная последовательность будет потеряна в тех частях, которые покрываются праймерами. По-видимому, аминокислоты в этих областях вносят вклад в правильное сворачивание СОК участков (Сйок1а, С., Ьекк, А.М., ТгатоШапо, А., Ьеук, М., 8т1к-ОШ, 8. 1., е! а1. СопГогтаПопк оГ ^шшипод1оЬи1^п йурегуапаЫе гедюпк. №кге, 342: 877-883, 1989). По этой причине клонирование У-областей с применением вырожденных праймеров может приводить к уменьшенной аффинности антител. Способ обойти эти потенциальные проблемы заключается в клонировании обеих цепей антитела с помощью обратной цепной полимеразной реакции (ФСК) с праймерами, соответствующими последовательностям известной константной области антитела. Процедура

- 38 027502 клонирования схематически проиллюстрирована на фиг. 1.

Цитоплазматические РНК получали из гибридомных клеточных линий ВУ10 и 408 (Карро1б I., 21е§1ег В.Б., КоЬ1ег I., МагсЬе!!о δ., Кокпе! О., ВйпЬаит Ό., δ^ттопк Р.6., /аппеЦто А.С., НШ В., Ыеи δ., Кпарр А1йа1о К., А1йа1о К., и11псЬ А., Кап/ Б., ВиЬгтд Н.б. Рипс!юпа1 апб рЬепо!урю сЬагас!еп/а!юп оР согб Ь1ооб апб Ьопе тагго\у киЬке!к ехргекктд РБТ3 (СО135) гесер!ог !угокте ктаке. В1ооб, 90: 111-125, 1997) с использованием РНК-азного набора ^1адеп, Нйбеп, Германия), применяя модифицированный протокол выделения только цитоплазматических РНК.

Используя олиго (бТ)₁₅ праймер, двухцепочечную кДНК (дц-кДНК) получали из 0,3-2 мкг мРНК с использованием системы синтеза кДНК (сГ)ЫА δуη!Ьек^к δук!ет) (КосЬе, МаппЬе1т, Германия). Более конкретно, для образования тупого конца на цепях ДНК, двухцепочечную кДНК инкубировали с Т4ДНК-полимеразой. Реакционную смесь экстрагировали один раз равным объемом фенол-хлороформизоамилового спирта (25:24:1) и осаждали этанолом. Растворенный осадок дц-кДНК инкубировали с Т4ДНК-лигазой (КосЬе, МаппЬе1т, Германия) для циркуляризации кДНК (иета!ки Υ. А поνе1 апб гар1б с1отпд те!Ьоб Рог !Ье Т-се11 гесер!ог νа^^аЬ1е гедюп кедиепсек. 1ттиподепейск, 34:174-178, 1991). 3' поли(А)-хвост лигировали с неизвестным 5' концом кДНК посредством циркуляризации.

В. ПЦР-амплификация кДНК вариабельной области иммуноглобулина Применение двух направленных наружу специфических праймеров для константной области (приведены в табл. 1) в реакции обратной ПЦР обеспечивало амплификацию полной кДНК перестроенных генных сегментов легкой и тяжелой цепи. 1-5 мкл кольцевой дц-кДНК включали в 50 мкл стандартной ПЦР реакции (Но^!аг Тад Р)ЫА Ро1утегаке, ^^адеη, Нйбеп, Германия) с парой праймеров Ск-Рог и Ск-Ьаск для амплификации легкой цепи и парой праймеров гамма 1-Рог и гамма 1-Ьаск для амплификации тяжелой цепи. Праймеры предназначены для отжига константных областей кДНК. Сорок циклов амплификации выполняли с следующих условиях: 30 с при 94°С, 1 мин при 56°С, 2 мин 30 с при 72°С. Полученный продукт амплификации содержит полную У-область, 5' иТ-область, рА-хвост, 3' иТ-область и фланкирован последовательностями константной области. ДНК, полученную в результате обратной ПЦР, разделяли на 1%-ном агарозном геле. ДНК полосы соответствующего размера (легкая цепь приблиз. 1000 п.н.; тяжелая цепь приблиз. 1600 п.н.) вырезали, выделяли стандартными методами (Матайк е! а1. 1982) и клонировали в вектор рОЕМ-Т Еаку (Рготеда, Маб1коп, ^1, США). Для определения последовательности использовали стандартные праймеры для данной векторной системы и специфические праймеры для константной области иммуноглобулина (легкая цепь: к-Рог1 и к-Рог2; тяжелая цепь: СО1-Рог1, СО1-Рог2, СО1-^еν1, СО1-^еν2) (см. табл. 1).

Таблица 1. Праймеры, используемые для амплификации и секвенирования Уб- и УОб-областей РБТ3 специфических антител

Олигонуклеотиды, используемые для обратной ПЦР
А	гамма14ог	5’-САА ССС ТТА САА ССА САА ТСС СТС С-3’ (ЗЕО Ю

		N0:45)
А’	гамма1-Ьаск	5’-САТ АТС ТАС АСТ ССС АСА АСТ АТС АТС ТС-3’ (ЗЕО Ю N0:46)
В	Скбог	5’-ТСТ ТСА АСА АСС АСА ССА СТС АСС САС СТС С-3’ (ЗЕО Ю N0:47)
В’	Ск-Ьаск	5’-АСТ ТСТ АСС ССА ААС АСА ТСА АТС ТСА АС-3’ (ЗЕО Ю N0:48)

Олигонуклеотиды, используемые для секвенирования
к-ίοΠ	5’-ССТ ОТТ САА ОСТ СТТ САС ДАТ ССС-3’ (ЗЕО Ю N0:49)
к-1ог2	5’-АТС ТСТ ТОТ САС ТСС ССТ САС АСС-3’ (ЗЕО Ю N0:50)
СО14ог1	5’-С0Т СТА САС САА ОСТ САА ТСТ ОС-3’ (ЗЕО Ю N0:51)
СО14ог2	5’-ССА ТСТ СТС ТАТ ССА СТС ССС-3’ (ЗЕО Ю N0:52)
001-Γθν1	5’-ССА СОТ САС ТОТ САС ТСС СТС АС-3’ (ЗЕО Ю N0:53)
СС1-геу2	5-ССТ САТ СТА АСА САС АСС АСС-3’ (ЗЕО Ю N0:54)

Таким образом, были идентифицированы полные легкие цепи и тяжелые цепи мышиных антител 408 (аминокислотная последовательность легкой цепи представлена в δЕ^ ΙΌ ЫО: 15, включающая вариабельный домен (δЕ^ ΙΌ ЫО:13), где вариабельный домен включает СОК1 (δЕ^ ΙΌ ЫО:1), СРЖ2 (δЕ^ ΙΌ ЫО:2) и СРЖ3 (δЕ^ ΙΌ ЫО:3); аминокислотная последовательность тяжелой цепи представлена в δЕ^ ΙΌ ЫО:16, включающая вариабельный домен (δЕ^ ΙΌ ЫО:14), где вариабельный домен включает СОК1 (δΡΟ ΙΌ ЫО:4), СРЖ2 (δЕ^ ΙΌ ЫО:5) и СОК3 (δЕ^ ΙΌ ЫО:6)) и ВУ10 (аминокислотная последовательность легкой цепи представлена в δЕ^ ΙΌ ЫО:31, включающая вариабельный домен (δЕ^ ΙΌ ЫО:29), где вариабельный домен включает СОК1 (δЕ^ ΙΌ ЫО:7), С4Ж2 (δЕ^ ΙΌ ЫО:8) и СРЖ3 (δЕ^ ΙΌ ЫО:9); ами- 39 027502 нокислотная последовательность тяжелой цепи представлена в δΕΟ ΙΌ N0:32, включающая вариабельный домен (δΕΟ ΙΌ N0:30), где вариабельный домен включает СОК1 (δΕΟ ΙΌ N0:10), СОК2 (δΕΟ ΙΌ N0:11) и СОК3 (δΕΟ ΙΌ N0:12)).

Легкая цепь мышиного антитела 408 кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в δΕΟ ΙΌ N0:19 (полная последовательность кДНК представлена в δΕΟ ΙΌ N0:20), где вариабельный домен кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в δΕΌ ΙΌ N0:17. Тяжелая цепь антитела 408 кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в δΕΟ ΙΌ N0:21 (полная последовательность кДНК представлена в δΕΟ ΙΌ N0:22), где вариабельный домен кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в δΕΟ ΙΌ N0:18.

Легкая цепь мышиного антитела ВУ10 кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в δΕΟ ΙΌ N0:35 (полная последовательность кДНК представлена в δΕΟ ΙΌ N0:36), где вариабельный домен кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в δΕΌ ΙΌ N0:33. Тяжелая цепь антитела ВУ10 кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в δΕΟ ΙΌ N0:37 (полная последовательность кДНК представлена в δΕΟ ΙΌ N0:38), где вариабельный домен кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в δΕΟ ΙΌ N0:34.

Пример 2. Конструкция и экспрессия химерных РЬТ3-специфических антител и их производных

На второй стадии конструирования рекомбинантных антител клонированные У-области объединяли с желаемыми С-областями в экспрессирующем векторе. Процедура клонирования, выполненная в данной заявке, позволяет вводить полные У-области Ι§ и экспрессировать их в лимфоидных клетках без каких-либо изменений их аминокислотной последовательности. Для этого нуклеотидную последовательность ампликона, полученного в примере 1, определяли после субклонирования путем секвенирования (праймер в табл. 1) и использовали для конструирования пар праймеров (С С'; Ό Ό'; табл. 2). Реамплифицированные ДНК-фрагменты У-сегментов вырезают подходящими рестриктазами (приведены в табл. 2) и затем лигируют в экспрессирующие векторы. Векторы (фиг. 2 и 3) содержат гены константных областей легкой и тяжелой цепей человека. Таким образом, вставка амплифицированных и вырезанных Усегментов восстанавливает первоначальную геномную организацию Ιμ генов в векторах без изменения какой-либо аминокислоты У-областей.

Родительский вектор легкой цепи содержит У1-область мышиной легкой цепи и С-область человеческого к гена. Сайты рестрикции вводили в необходимые положения (ΧΙιοΙ и δροΙ) с целью замещения ХЬо^реЬфрагмента легкой цепи соответствующим У1-фрагментом легкой цепи моноклонального антитела ВУ10 или 408 или любого другого моноклонального антитела. Область, относящаяся к обмену фрагмента, показана увеличенной на фиг. 2. Фрагмент для обмена содержит часть второго экзона лидерной последовательности, подходящий сайт (ΧΙιοΙ) для слияния в рамке, УТ-область и часть второго интрона с сайтом рестрикции δρеI.

Исходный вектор для тяжелой цепи содержит тяжелую цепь γ1 изотипа Ιμ человека. Сайты рестрикции вводили в требуемые положения в интроне Ι и ΙΙ для замены АаШ-СЫ-фрагмента на УО1фрагмент тяжелой цепи моноклональных антител ВУ10 или 408 или любого другого моноклонального антитела. Область, подходящая для клонирования УО1-фрагмента, представлена в увеличенном виде на фиг. 3 а. Фрагмент, подлежащий замещению, содержит части первого интрона с сайтом рестрикции АаШ, второй экзон лидерной последовательности, УОГобласть и часть второго интрона с сайтом рестрикции С1аЕ Для замещения всех экзонов константной области вводили сайты рестрикции в требуемое положение интрона ΙΙ (Μ1πΤ) и интрона У ^реЦ. ΜΜ-δρеI-фрагмент, подлежащий замещению (представлен в увеличенном виде на фиг. 3Ь), содержит целую константную область человеческой γ1 тяжелой цепи и две аминокислотные модификации в СН2-домене, как указано ^ег239-А§р; Пе332-01и).

Кроме того, с использованием экспрессирующих векторов можно заменить целую константную область человеческого Ι§γ1 изотипа (Μ1иI-δρеI фрагмент; см. фиг. 3) либо против константных областей всех других изотипов антитела, либо против Рс-частей с оптимизированной или уменьшенной эффекторной функцией. В случае антител, оптимизированных для запуска АОСС, обмен δ239Ό и Ι332Ε (аминокислотные положения в соответствии с номенклатурой Кабата) вводили в СН2-домен человеческой γ1 константной области. Это осуществляли согласно публикации Еа/аг е1 а1. (Ба/аг 0.А., Όαημ Кагк1 δ., УаГа 0., Репд Γδ., Нуип Ь., СЬап С., СЬипд Η.δ., Είνηχί А., Υοάе^ 8.С., У1е1тейег 1., СагтюЬае1 Ό.Ε., Науек К.1, ЭаЫуа! ВТ. Εηд^ηее^еά аηι^Ьοάу Рс уапапц χνίΐΐι епЬапсей еГГесЮг ГипсТюп. Ргос. №·ιΐ1. Асай. δα. ^А 103: 4005-4010, 2006).

- 40 027502

Таблица 2. Олигонуклеотиды, используемые для амплификации У.1-и УВКсегментов, полученных с помощью 1РСК для включения в экспрессирующие векторы

Олигонуклеотиды, используемые для νϋΰ-сегмента тяжелой цепи
С	4О8-Н4ог	5’-1с1 сП сас адд 1д1 сс1 с1с 1са дд1 сса ас1 дса дса дсс 1дд ддс 1да дс-3’ (ЗЕО Ю N0:55)
С’	4Ο8-Η-Γβν	5’-дад аад д1а дда с1с асс 1да дда дас 1д1 дад ад1 дд1 дсс Пд дсс сса д-3’ (ЗЕО Ю N0:56)
С	ΒνΐΟ-Η-ίθΓ	5’-ада сд1 сса с1с 1д1 сП 1с1 сП сас адд 1д1 сс1 с1с сса дд1 дса дс1 даа дса д1с-3’ (ЗЕО Ю N0:57)
С’	ΒνίΟ-Η-Γβν	5’-дад аад д1а дда с1с асс 1да дда дас дд1 дас 1да дд11сс Пд асс с-3’ (ЗЕО Ю N0:58)
с	универсальный 1ог (Аа1П)	5’-ада сд1 сса с1с 1д1 сП 1с1 сП сас адд 1д1 сс1 с1с с-3’ (ЗЕО Ю N0:59)
С’	универсальный геу (С1а!)	5Ча1 еда 1Н ада а1д дда даа дд1 адд ас1 сас-3’ (ЗЕО Ю N0:60)
Олигонуклеотиды, используемые для νΰ-сегмента легкой цепи
ϋ	4Ο8-Ι_-ίθΓ (ΧήοΙ)	5’-ас1 еда дда да1 аН д1д с1а ас1 сад 1с1 сса дсс асс с1д-3’ (ЗЕО Ю N0:61)
ϋ’	4Ο8-Ι_-Γβν (Зре1)	5Час 1ад 1ас На сд1 Ш аН 1сс аде Нд д1с ссс сс1 сс-3’ (ЗЕО Ю N0:62)
ϋ	ΒνΐΟ-Ι_-ίθΓ (ΧήοΙ)	5’-ас1 еда дда дас аП д1д а1д аса сад 1с1 сса 1сс 1сс с-3’ (ЗЕО Ю N0:63)
ϋ’	ΒνίΟ-ί-Γβν (5ре!)	5’-ас1 ад1 ас11ас дН 1са дс1 сса дс11дд 1сс сад сас еда асд 1д-3’ (ЗЕО Ю N0:64)

Сайты рестрикции выделены жирным шрифтом и указаны буквами в скобках.

Таким образом, получили химерные антитела 4О8 и ВУ10 и Рс-оптимизированные варианты ЗБШ 4О8 и ЗОН: ВУ10. Они содержат следующие аминокислотные и нуклеотидные последовательности:

Химерное антитело 4О8: аминокислотная последовательность легкой цепи, представленная в ЗЕ^ ΙΌ Ж):2З и кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной в ЗЕ^ ΙΌ N0:24, аминокислотная последовательность тяжелой цепи, представленная в ЗЕ^ ΙΌ N0:25 и кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной в ЗЕ^ ΙΌ N0:26.

ЗОН: 4О8 (химерное, Рс-оптимизированное антитело): аминокислотная последовательность легкой цепи, представленная в ЗЕ^ ΙΌ Ж):2З и кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной в ЗЕ^ ΙΌ N0:24, аминокислотная последовательность тяжелой цепи, представленная в ЗЕ^ ΙΌ N0:27 и кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной в ЗЕ^ ΙΌ N0:28.

Химерное антитело ВУ10: аминокислотная последовательность легкой цепи, представленная в ЗЕ^ ΙΌ N039 и кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной в ЗЕ^ ΙΌ N0:40, аминокислотная последовательность тяжелой цепи, представленная в ЗЕ^ ΙΌ N0:41 и кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной в ЗЕ^ ΙΌ N0:42.

ЗОН: ВУ10 (химерное, Рс-оптимизированное антитело): аминокислотная последовательность легкой цепи, представленная в ЗЕ^ ΙΌ N039 и кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной в ЗЕ^ ΙΌ N0:40, аминокислотная последовательность тяжелой цепи, представленная в ЗЕ^ ΙΌ Ж):4З и кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной в ЗЕ^ ΙΌ N0:44.

Пример З. Экспрессия и очистка антител против РЬТЗ

Котрансфекция экспрессирующих векторов, кодирующих химерные тяжелую и легкую цепь (Ι§01/κ) или модифицированные тяжелые цепи, в миеломную клеточную линию Зр2/0, не продуцирующую Ι§, давала стабильные трансфектомы, секретирующие химерные моноклональные антитела, которые способны специфически связываться с РЬТЗ на человеческих клетках КЕН и трансфектантах РЬТЗ (Зр2/0).

Химерные антитела очищали из супернатанта клеточной культуры с помощью аффинной хроматографии на белке А.

Пример 4. АБСС эффекторная функция антител против РЬТЗ

АБСС эффекторную функцию Рс-оптимизированных, химерных анти-РЬТЗ антител 4О8-ЗВШ и ВУЮ-ЗЭШ в сравнении с соответствующими химерными антителами без Рс-оптимизации (фиг. 4А и В), а также химерным апти-Ж'З антителом, содержащим такую же Рс-модификацию (фиг. 4С), демонстрировали с использованием анализов высвобождения хрома. Кроме того, активность в отношении цитолиза клеток для 4О8-ЗВШ и нестимулированных РВМСк в сравнении с родительским мышиным антителом 4О8 была показана для АМЬ бластов, выделенных от пациента-человека с острым миелобластным лейкозом (фиг. 5).

- 41 027502

Используемые клетки-мишени представляли собой

ЫАЬМ16: линия клеток острого лимфобластного лейкоза (АЬЬ), поставщик: Кафедра педиатрической онкологии ГОераПтеШ оГ Реб1а!пс Опсо1оду), Университет Тюбингена, первоначальная характеристика: Мшоуаба 1. е! а1. 1. Сапсег Кее С1ш Опсо1 101:91-100 (1981).

8К-Ме163: Человеческая линия клеток меланомы, исходный поставщик: Д-р А. Кпи!1, Ыогбуее1кгапкепкаие РгапкГий/Маш, Германия.

803: Лейкозные клетки выделены из периферической крови пациента с острым миелобластным лейкозом (АМЬ) с помощью центрифугирования в градиенте плотности; предоставлено: Д-р Н. 8аНН, Кафедра медицинской онкологии, Университет Тюбингена.

Используемые эффекторные клетки представляли собой мононуклеарные клетки периферической крови (РВМСе), выделенные из крови нормальных здоровых доноров.

Анализ высвобождения хрома выполняли следующим образом: 10⁶ клеток-мишеней метили хроматом натрия (⁵¹Сг, 150 мкКи/мл) в течение 1 ч, промывали и сеяли в 96-луночные микротитрационные планшеты (10000 клеток на лунку). РВМС и антитела затем добавляли в указанных концентрациях. Через 4 и 20 ч соответственно, супернатант собирали и считали в счетчике М1сгоВе!а. Цитотоксичность определяли согласно стандартной формуле: % специфического ⁵¹Сг-высвобождения = (экспериментальное высвобождение -спонтанное высвобождение) : (общее высвобождение - спонтанное высвобождение) х 100. Спонтанное и общее высвобождение определяли путем инкубации клеток-мишеней в среде с 2% Тп!оп-Х100 и без него соответственно.

Результаты, представленные на фиг. 4 и 5, ясно демонстрируют, что введение Рс-модификаций 8239Ό и 1332Е в СН2-домен тяжелой цепи химерных анти-РЬТ3 антител 408 и ВУ10 может индуцировать значительную активность в отношении цитолиза клеток у обоих антител. В отличие от этих результатов, введение таких же модификаций в химерное анти-Х02 антитело не давало такого эффекта. Соответственно нет общего правила, что две используемые модификации могут обеспечить активность в отношении цитолиза клеток в любом антителе, скорее следует тщательно подобрать их для каждого отдельного моноклонального антитела.

Пример 5. Продукция и очистка рекомбинантных и Рс-оптимизированных антител мРНК мышиных антител ВУ10 и 408 (оба 1дО1/к) выделяли из гибридом с помощью КЫеаеу набора (Ц1адеп, НПбеп, Германия). Неизвестные вариабельные области тяжелой (УОТ) и легкой (УТ) цепи идентифицировали путем секвенирования ампликонов обратной ПЦР, полученных как описано ранее (Неггтапп Т., 0гоеее-Ноуее! Ь., θ!ζ Т., Кгаттег Р.Н., Каттепеее Н.0., 1ипд 0. Сопе1гис!юп оГ орПип/еб ЫересШс ап!1Ьоб1ее Гог ее1есПуе асПуаПоп оГ Не беа!1 гесер!ог СГО95. Сапсег Кее. 2008;68(4):1221-1227), с использованием специфических праймеров для мышиных константных генов легкой (Ск-Гог (8ЕЦ ГО N0:47); Ск-Ьаск (8ЕЦ ГО N0:48)) и тяжелой цепи (гамма1-Гог (8ЕЦ ГО N0:45); гамма1-Ьаск (8ЕЦ 18 N0:46). Клонирование вариабельных генов из гибридомы 9.2.27 (ОепВапк: #А1459796; #А1459797), продуцирующих 1д02а/к С8Р04 антитело, было описано ранее (Огоеее-Ноуее! Ь., Найарр I., Магуап Вгет О., Каттепеее Н.О., 1ипд О. А гесотЫпап! Ыересйс етд1е-сЬаЫ апПЬобу шбисее !агде!еб, еиргаадотейс СГО28- ейти1а!юп апб !итог се11 кйшд. Еиг 1. 1ттипо1. 2003;33(5): 1334-1340). Для получения химерных и оптимизированных антител УТ- и УЛКэлементы повторно амплифицировали с использованием олигонуклеотидов, перечисленных в табл. 2, и клонировали в эукариотические экспрессирующие векторы, как показано на фиг. 2 и 3. Кроме аминокислотных замещений по 8239Ό и 1332Е, оптимизированная 01 Рс-часть содержит С-концевую М-метку (РТНУКУ8УУМАЕЕЦКЬ18ЕЕПЬЬК; 8ЕЦ ГО N0: 66, которая происходила из аминокислотных последовательностей РТНУКУ8УУМАЕ (аминокислоты #455466 хвостовой части (1аПр1есе) человеческого 1да1) (8ЕЦ ГО N0: 67) и с-тус эпитоп ЕЦКЫ8ЕЕПЬЬК (8ЕЦ ГО N0:68) (Еуап 0.1., Ьеу1е 0.К., Катеау 0., В|е1ор !М. 1ео1а!юп оГ топос1опа1 апйЬоб1ее ересйс Гог 1штап с-тус рго!о-опсодепе ргобис!. Мо1 Се11 Вю1. 1985; 5(12):3610-3616). Рекомбинантные антитела, а также родительские мышиные 408 и ВУ10 очищали из культурального супернатанта трансфектантов и гибридомных клеток соответственно с использованием аффинной хроматографии на белке А (0Е Неа1!1саге, Мишск, Германия). В случае 4088Э1ЕМ, крупную партию антитела (15 г) получали в 0МР соответствующих чистых помещений с использованием одноразовой технологии, включающей 100 л Ью\уауе реактор (8айогше; 0оеЫпдеп, Германия) для ферментации и систему Ак!а Кеабу для очистки с помощью протеин А-, ионообменной хроматографии и хроматографии с гидрофобным взаимодействием (колонки МаЬ8е1ес! 8иге и Сар!оАбкеге, 0.Е. НеаННсаге, МитсЬ, Германия).

Пример 6. РЬТ3-специфичность и авидность связывания антител

Родительские мышиные антитела 408 и ВУ10 первоначально были описаны и охарактеризованы как распознающие белок РЬТ3 (Карро1б I., 21ед1ег В.Ь., КоЫег I., е! а1. Рипс!юпа1 апб рНепо1ур1с скагас!еп/а!юп оГ согб Ь1ооб апб Ьопе таггоу еиЬее!е ехргееешд РЬТ3 (СГО135) гесер!ог 1угоеше ктаее. В1ооб. 1997;90(1):111-125). На фиг. 7А показано, что оба 8О1ЕМ-модифицированных антитела специфически связываются с этим белком на трансфицированных мышиных клетках 8р2/0. На фиг. 7В связывание двух антител с РЬТ3-положительными человеческими клетками НАЕМ1-6 оценивают с помощью проточной цитометрии. Антитела перекрестно не блокируют друг друга (данные не показаны) и, таким образом,

- 42 027502 распознают два пространственно разделенных эпитопа белка РЬТ3. Оба антитела насыщали РЬТ3молекулы на клетках ΝΛΡΜ16 при концентрациях ниже 1 мкг/мл. Связывание химерного антитела 408 было сильнее, чем связывание ВУ10. Это не связано с химеризацией или оптимизацией, поскольку сходную разницу наблюдали при сравнении связывания мышиных родительских вариантов 408 и ВУ10 (фиг. 7С). Не обнаружили различий в связывании между химерной и ЗЭГЕМ-модифицированными химерными вариантами антител (фиг. 7В). 8Э1Е-модифицированное антитело, названное 9.2.278Э1Е, направленное против поверхностного меланома-ассоциированного антигена, не связывалось с клетками NΛ^М16 и было использовано в качестве отрицательного контроля в этом и в некоторых последующих экспериментах.

Пример 7. Конкуренция связывания РЬТ3 лиганда (РЬТ3Ь)

В большинстве случаев, вмешательство в связывание природного лиганда может вносить вклад в терапевтическую активность антитела. На фиг. 8А показано, что рекомбинантный РЬТ3Ь частично ингибирует связывание 4088Э1ЕМ, но не ВУ108Э1ЕМ, с клетками NΛ^М16. указывая на то, что связывающий сайт антитела 408 находится в непосредственной близости к таковому РЬТ3 лиганда. Поэтому эффект 4088Э1ЕМ на спонтанную пролиферацию лейкозных бластов от трех разных пациентов оценивали ίη νίίΐΌ с использованием несвязывающегося 8Э1Е-модифицированного антитела 9.2.27 в качестве контроля. В то время как спонтанная пролиферация первичных АМЬ клеток значительно варьировалась, существенного воздействия антител на клеточную пролиферацию не наблюдалось (фиг. 8В).

Пример 8. Антитело-зависимая клеточная цитотоксичность

На фиг. 9 показано, что АЭСС активность РВМСк против клеток NΛ^М16 заметно усиливается в присутствии ЗЭГЕМ-модифицированных антител по сравнению с немодифицированными вариантами химерного антитела. В нескольких экспериментах концентрации, необходимые для достижения сравнимого лизиса немодифицированными и ЗЭГЕМ-модифицированными антителами, различались по меньшей мере в 100 раз. Цитолиз клеток с помощью 4088Э1ЕМ антитела было значительно лучше, чем цитолиз, достигаемый с помощью ВУ108Э1ЕМ, в частности, при низких концентрациях. Это соответствует относительно более низкой авидности связывания ВУ10 (фиг. 7).

На фиг. 10А показана АЭСС активность 4088Э1ЕМ с использованием РВМСк от трех различных здоровых доноров (#1-3). В этих экспериментах 8Э1Е-модифицированное тАЬ 9.2.27 использовали в качестве отрицательного контроля. Цитолитическая активность в присутствии этого реагента не превышала цитолитической активности ΝΚ-клеток в отсутствие антител, которая варьировалась от 0 до 20%. На фиг. 10В показана АЭСС активность РВМСк здорового донора (#2) против лейкозных бластов от трех различных пациентов. АЭСС активность, опосредованная против этих бластов (АМЬ #1, АМЬ #2, АМЬ #7), несущих соответственно 4000, 4500 и 3200 молекул РЬТ3 на клетку, была менее выраженной, чем против культивируемых клеток NΛ^М16. Это требовало 8 ч, а не 4 ч для того, чтобы стать явно обнаружимым. Как правило, АЭСС-, а также ΝΚ-активность против клеток NΛ^М16 и лейкозных бластов продолжала увеличиваться после 8 ч. Однако при использовании первичных бластов было трудно дополнительно продлить время анализа за счет увеличения спонтанного высвобождения хрома.

Затем оценивали АЭСС активность РВМСк, выделенных из крови АМЬ пациентов против аутологичных бластов. Для этого истощали лейкозные бласты из препаратов РВМС и истощенные РВМСк использовали в качестве эффекторных клеток против положительно отобранных бластов (см. Материалы и Методы). При этих условиях обнаружили значительный лизис в 2 (АМЬ #1, #15) из 5 независимых экспериментах с бластами и аутологичными РВМСк от соответствующих пациентов (фиг. 10С).

Пример 9. Антигенный сдвин

Модулирование экспрессии целевого антигена в результате связывания с антителом представляет собой феномен, часто наблюдаемый во время терапии антителами. В частности, устойчивая и полная потеря наблюдалась при лечении АМЬ пациентов насыщающей дозой СЭ33 антитела Линтузумаб (Ре1йтаη ЕЛ, ВгаШтеш ί., 8Юпс К., е1 а1. РЬаке III гаийопл/ей тиШсеШег к!ийу оГ а 1шташ/ей аШ1-СЭ33 тонос1ога1 айЛойу, ЬШи/итаЬ, ίη сотЫт!:^ \\ЦЬ сЬетоШегару, уегкик сЬетоШетару -1опс ίη раПеШк \\ί11ι геГгасЮгу ог Пгк1-ге1аркей аси1е туе1о1й 1еикет1а. I. С1ш Опсо1. 2005;23(18):4110-4116). На фиг. 11А показано антигенный сдвиг, индуцированный после инкубации клеток NА^М или первичных лейкозных бластов от двух пациентов (АМЬ #1 и #2) с различными концентрациями 4088Э1ЕМ в течение 48 ч. На всех этих клетках наблюдался умеренный антигенный сдвиг, который завершался уже после 24 ч инкубации (данные не показаны).

Пример 10. Связывание с нормальными и лейкозными клетками

На фиг. 11В и 11С показано связывание родительского мышиного антитела 408 и 4088Э1ЕМ соответственно с панелью лейкозных клеток, полученных от пациентов, страдающих указанными подтипами АМЬ. Анализировали клетки с сигналами СЭ33+СЭ45й1т или СЭ34+СЭ45й1т. РЬТ3 обнаружили на всех образцах от 15 пациентов. Число молекул на клетку, определенное с помощью непрямой иммунофлуоресценции и количественной проточной цитометрии, варьировалось от 500 до 6000, для клеток NА^М16 от 6000 до 9000 (фиг. 11В). На фиг. 11С, 4088Э1ЕМ-РЕ, а не мышиное 408, использовали для окрашивания. В этом случае значение 8Р1 вычисляли для количественной оценки связывания антитела. Для бластов от 4 из 15 доноров этот индекс не был определен из-за высокой, неспецифической реактив- 43 027502 ности с контрольным антителом 9.2.278ΌΙΒ. Как и ожидалось, значения 8ΡΙ анализируемых образцов близко совпадали со значениями молекул, определенных с помощью количественного РАС8 (фиг. 11С).

На фиг. 12А-С показано, что связывание мышиного 4С8 с СО11с-положительными тЭСк и с СО303- положительными рЭСк, очищенными из нормальных РВМСк, было минимальным в лучшем случае. Число молекул РЬТ3, экспрессирующихся на этих клетках, было ниже 100/клетка. Кроме того, были получены ЭСк из нормальных РВМСк. Хотя эти клетки экспрессировали большие количества ЭСассоциированных маркеров СЭ80, СЭ86 и СЭ123, связывание антител 4С8 было снова едва обнаружимым (данные не показаны). Затем оценивали связывание мышиного 4С8 с СО34-положительными клетками в нормальном костном мозге. И в этом случае связывание антитела с клетками костного мозга от трех разных доноров было минимальным, менее чем 300 молекул на клетку (фиг. 12Ό). Таким образом, связывание РЬТ3-антител с нормальными ЭСк и клетками костного мозга было значительно ниже, чем со всеми РЬТ3-экспрессирующими исследуемыми лейкозными клетками. Кроме того, связывание РЬТ3 антител с РВМСк, тромбоцитами, эритроцитами и гранулоцитами не наблюдалось (данные не показаны).

Пример 11. Токсичность ίπ νίΙΐΌ

Несмотря на относительно низкие уровни связывания 4С88ПГЕМ с нормальными клеткамипредшественниками костного мозга и ЭСк, оценивали потенциальную токсичность этого антитела в отношении таких клеток. С этой целью авторы изобретения инкубировали клетки костного мозга с насыщающими концентрациями 4С88ПГЕМ и 9.2.278ΌΙΒ и определяли влияние этих антител на способность клеток костного мозга образовывать колонии (СРИк) в полутвердой среде. Не было обнаружено значительного влияния антител на СРИ-образующую способность в двух экспериментах с клетками костного мозга от различных здоровых доноров (фиг. 13А). Аналогично, человеческие ЭСк инкубировали с аутологичными РВМСк в качестве эффекторных клеток. В то время как 4С88ОШМ опосредовало эффективную ЛЭСС активность против клеток ЫАЬМ16, используемых в качестве положительного контроля, не наблюдали никакого цитолиза аутологичных ЭСк (фиг. 13В).

Пример 12. Клиническое применение 4С8-8ОШМ

30-летнего мужчину, у которого диагностировали АМЬ в 2008 г. (РАВ МО, 45ΧΥ, сложный кариотип, включающий 1пу(3)(ц21ц26), -7), лечили с помощью 4С8-8ПГЕМ. Пациенту не удалось достичь полной ремиссии (СК) после двух различных режимов индукционной терапии. Впоследствии он получал аллогенную 8СТ (трансплантация стволовых клеток) от НЬА-совместимого донора, перенес рецидив болезни, получил гаплоидентичную 8СТ от его сестры и снова перенес рецидив. Рассматривали лечение 4С8-8ПГЕМ и осуществляли доклиническое испытание. РАС8 анализ бластов (СЭ34+) пациента выявил гомогенную экспрессию РЬТ3 при приблизительно 4000 молекул/клетку (фиг. 14А и данные не показаны). Ш уЬто 4С8-8ОШМ индуцировало эффективную АИСС мононуклеарных клеток периферической крови пациентов (РВМС) против лейкозных клеток ЫАЬМ16 и, в меньшей степени, против аутологичных бластов (фиг. 14В, С). Пациента затем лечили возрастающими дозами 4С8-8^IЕМ, варьирующимися от 10 мкг до 10 мг. Через несколько часов после первой дозы 10 мг, 5х10⁸ СО3/СЭ19-истощенных донорных РВМСк от его сестры были адоптивно пересажены. Концентрация 4С8-8ОШМ в сыворотке достигла 0,8 мкг/мл через 1 ч после первой дозы 10 мг и впоследствии упала до 0,3 нг/мл к 24 ч (фиг. 15А). Во время лечения наблюдали (1) почти полное насыщение лейкозных клеток в костном мозгу (ВМ) (фиг. 15В), (2) заметное увеличение активированных ΝΚ клеток в периферической крови (РВ) (фиг. 16А) и ВМ (фиг. 16В), что было связано с увеличением сывороточных уровней индекса цитокина ТЫР (фиг. 16С) и (3) заметное уменьшение лейкозных бластов в РВ (фиг. 16А). В то время как снижение РВ бластов было временным, но почти полным, снижение ВМ было менее выраженным (фиг. 16В). Скорее всего, это связано с различным соотношением ЫК:лейкозных клеток в двух компартментах: В РВ соотношение СЭ56+ ΝΚ-клеток и бластов составляло приблизительно 1, в то время как в ВМ составляло только 1/7, как определено с помощью РАС8 (данные не показаны). Побочные эффекты лечения были незначительными и состояли из субфебрильной температуры (макс. 38,2°С) и временного обострения уже существующей угревой сыпи на коже.

Несмотря на всего лишь временный ответ на лечение антителом пациент неожиданно оставался в хорошем клиническом состоянии в течение нескольких месяцев с медленно растущим числом бластов при оптимальной поддерживающей терапии и гидроксимочевине. Поэтому выполняли вторую гаплоидентичную 8СТ от другого донора. После выздоровления пациент достигал СК без обнаружимого минимального остаточного заболевания (МКЭ). Авторы изобретения затем применяли 45,5 мг 4С8-8ОШМ в возрастающих дозах. На этот раз не наблюдали ни соответствующего высвобождения цитокина, ни значительной активации ΝΚ-клеток (фиг. 16Ό), и побочные эффекты полностью отсутствовали.

Изобретение было описано в данной заявке широко и в общем смысле. Каждая из более узких разновидностей и конкретных групп, подпадающих под общее описание, также образуют часть изобретения. Оно включает общее описание изобретения при условии или отрицательном ограничении удаления любого объекта из рода объектов, независимо от того, указан конкретно или нет исключенный материал в данной заявке. Другие воплощения находятся в пределах следующей формулы изобретения. Кроме того, если признаки или аспекты изобретения описываются в терминах групп Маркуша, то специалистам в данной области техники будет понятно, что изобретение является также тем самым описано в терминах

- 44 027502 любого индивидуального члена или подгруппы членов группы Маркуша.

Специалист в данной области техники легко поймет, что настоящее изобретение хорошо адаптировано для осуществления задач и получения упомянутых результатов и преимуществ, а также того, что характерно для данной заявки. Кроме того, специалисту будет очевидно, что различные замены и модификации могут быть сделаны в изобретении, описанном в данной заявке без отклонения от объема и сущности изобретения. Композиции, способы, процедуры, обработки, молекулы и специфические соединения, описанные в данной заявке, соответствующие в настоящее время предпочтительным воплощениям, являются примерными и не предназначены для ограничения объема изобретения. Изменения в данной заявке и другие применения, которые находятся в пределах сущности изобретения и определены объемом формулы изобретения, будут понятны специалистам в данной области техники. Перечисление или обсуждение ранее опубликованного документа в этом описании не обязательно должно быть принято в качестве подтверждения того, что документ является частью уровня техники или общедоступных сведений.

Изобретение, иллюстративно описанное в данной заявке, может быть соответствующим образом осуществлено в отсутствие любого элемента или элементов, ограничения или ограничений, конкретно не описанных в данной заявке. Таким образом, например, термины содержащий, включающий, вмещающий и т.д. следует читать в широком смысле и без ограничений. Слово содержать или вариации, такие как содержит или содержащий, следует понимать соответственно как включение указанного целого или группы целых чисел, но не исключение любого другого целого или группы целых чисел. Кроме того, термины и выражения, используемые в данной заявке, были использованы в качестве терминов описания, а не ограничения, и нет намерения использовать такие термины и выражения для исключения каких-либо эквивалентов признаков, показанных или описанных или их частей, но следует понимать, что в объеме заявленного изобретения возможны различные модификации. Таким образом, следует понимать, что хотя настоящее изобретение было конкретно раскрыто с помощью примерных воплощений и возможных признаков, модификации и варианты изобретений, воплощенные в них и раскрытые здесь, могут быть использованы специалистами в данной области техники, и что такие модификации и варианты рассматриваются как находящиеся в объеме данного изобретения.

Содержание всех документов и патентных документов, указанных в настоящем документе в качестве ссылки, включено в полном объеме.

- 45 027502

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> ЗинИммуне ГмбХ <120> Антитела против ЕЬТЗ и способы их применения <130> Р45481 <150> из 61/289,529 <151> 2009-12-23 <160> 68 <170> РаЬепЫп сегзюп 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственный <220>

<223> СЬН1 УЬ 408 <400> 1

Агд А1а Зег 01п Зег 11е Зег Азп Азп Ьеи Н1з

5 10 <210> 2 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственный <220>

<223> СЬК.2 УЬ 408 <400> 2

Туг А1а Зег 01п Зег 11е Зег

5 <210> 3 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственный <220>

<223> СЬН3 УЬ 408 <400> 3

01п 01п Зег Азп ТНг Тгр Рго Туг ТНг

5 <210> 4 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственный <220>

<223> СЬН1 УН 408

- 46 027502 <400> 4

Зег Туг Тгр МеЬ Н1з

5 <210> 5 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственный <220>

<223> СБН2 УН 408 <400> 5

01и 11е Азр Рго Зег Азр Зег Туг Ьуз Азр Туг Азп 01п Ьуз РЬе Ьуз 1 5 10 15

Азр <210> 6 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственный <220>

<223> СЬК.3 УН 408 <400> 6

А1а 11е ТЬг ТЬг ТЬг Рго РЬе Азр РЬе

5 <210> 7 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственный <220>

<223> СБН1 УЬ ВУ10 <400> 7

Ьуз Зег Зег 01п Зег Ьеи Ьеи Азп Зег 01у Азп 01п Ьуз Азп Туг МеЬ

5 10 15

А1а <210> 8 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственный <220>

<223> СБН2 УЬ ВУ10 <400> 8

- 47 027502

С1у А1а Зег ТЬг Агд	С1и	Зег
1 5
<210>	9
<211>	9
<212>	ПРТ
<213>	Искусственный
<220>
<223>	СБН3 УЬ ВУ10
<400>	9
С1п Азп Азр Н1з Зег	Туг	Рго Ьеи ТЬг
1 5
<210>	10
<211>	5
<212>	ПРТ
<213>	Искусственный
<220>
<223>	СБН1 УН ВУ10
<400>	10

Азп Туг С1у Ьеи Н1з 1 5 <210> 11 <211> 16 <212> ПРТ <213> Искусственный <220>

<223> СЬК.2 УН ВУ10 <400> 11

Уа1 11	е Тгр Зег О1у	О1у	Зег	ТЬг	Азр	Туг	Азп	А1а	А1а	РЬе	11е Зег
1 5 10	15
<210>	12
<211>	15
<212>	ПРТ
<213>	Искусственный
<220>
<223>	сьн3 ун ву10
<400>	12
Ьуз 01	у О1у 11е Туг	Туг	А1а	Азп	Н1з	Туг	Туг	А1а	МеЬ	Азр	Туг

5 10 15 <210> 13 <211> 108

- 48 027502 <212> ПРТ <213> Искусственный <220>

<223> УД-сегмент УЬ 408 <400> 13

Азр

11е Уа1

Ьеи

ТЬг

01п

Зег

Рго

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Уа1

ТЬг

Рго

01у

1 5

10 15

Азр

Зег Уа1

Зег

Ьеи

Зег

Суз

Агд

А1а

Зег

01п

Зег

11е

Зег

Азп

Азп

20

25 30

Ьеи

Н1з Тгр

Туг

01п

01п

Ьуз

Зег

Н1з

01и

Зег

Рго

Агд

Ьеи

Ьеи

11е

35

40 45

Ьуз

Туг А1а

Зег

01п

Зег

11е

Зег

01у

11е

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

01у

50

55 60

Зег

01у Зег

01у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Зег

11е

Азп

Зег

Уа1

01и

ТЬг

65

70 75 80

01и

Азр РЬе

01у

Уа1

Туг

РЬе

Суз

01п

01п

Зег

Азп

ТЬг

Тгр

Рго

Туг

85

90 95

ТЬг

РЬе 01у

01у

01у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

01и

11е

Ьуз

Агд

100 105 <210> 14 <211> 118 <212> ПРТ <213> Искусственный

<220>

<223> УЬД-сегмент УН 408

<400> 14

01п Уа1 01п Ьеи 01п 01п Рго 01у А1а 01и Ьеи Уа1 Ьуз Рго 01у А1а

1 5 10 15

Зег Ьеи Ьуз Ьеи Зег Суз Ьуз Зег Зег 01у Туг ТЬг РЬе ТЬг Зег Туг

20 25 30

Тгр МеЬ Н1з Тгр Уа1 Агд 01п Агд Рго 01у Н1з 01у Ьеи 01и Тгр 11е

35 40 45

01у 01и 11е Азр Рго Зег Азр Зег Туг Ьуз Азр Туг Азп 01п Ьуз РЬе

50 55 60

Ьуз Азр Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Азр Агд Зег Зег Азп ТЬг А1а Туг

65 70 75 80

МеЬ Н1з Ьеи Зег Зег Ьеи ТЬг Зег Азр Азр Зег А1а Уа1 Туг Туг Суз

85 90 95

А1а Агд А1а 11е ТЬг ТЬг ТЬг Рго РЬе Азр РЬе Тгр 01у 01п 01у ТЬг

100 105 110

ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Зег Зег

115

- 49 027502 <210> 15 <211> 234 <212> ПРТ <213> Миз тизси1из <400> 15

МеЬ

Уа1

РЬе

ТЬг

Рго

С1п

11е

Ьеи

С1у

Ьеи

МеЬ

Ьеи

РЬе

Тгр

11е

Зег

1 5

10 15

А1а

Зег

Агд

С1у

Азр

11е

Уа1

Ьеи

ТЬг

С1п

Зег

Рго

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

20

25 30

Уа1

ТЬг

Рго

С1у

Азр

Зег

Уа1

Зег

Ьеи

Зег

Суз

Агд

А1а

Зег

С1п

Зег

35

40 45

11е

Зег

Азп

Азп

Ьеи

Н1з

Тгр

Туг

С1п

С1п

Ьуз

Зег

Н1з

С1и

Зег

Рго

50

55 60

Агд

Ьеи

Ьеи

11е

Ьуз

Туг

А1а

Зег

С1п

Зег

11е

Зег

С1у

11е

Рго

Зег

65

70 75

80

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Зег

11е

Азп

85

90 95

Зег

Уа1

С1и

ТЬг

С1и

Азр

РЬе

С1у

Уа1

Туг

РЬе

Суз

С1п

С1п

Зег

Азп

100

105

110

ТЬг

Тгр

Рго

Туг

ТЬг

РЬе

С1у

С1у

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

11е

Ьуз

Агд

115

120

125

А1а

Азр

А1а

А1а

Рго

ТЬг

Уа1

Зег

11е

РЬе

Рго

Рго

Зег

Зег

С1и

С1п

130

135

140

Ьеи

ТЬг

Зег

С1у

С1у

А1а

Зег

Уа1

Уа1

Суз

РЬе

Ьеи

Азп

Азп

РЬе

Туг

145

150

155

160

Рго

Ьуз

Азр

11е

Азп

Уа1

Ьуз

Тгр

Ьуз

11е

Азр

С1у

Зег

С1и

Агд

С1п

165

170

175

Азп

С1у

Уа1

Ьеи

Азп

Зег

Тгр

ТЬг

Азр

С1п

Азр

Зег

Ьуз

Азр

Зег

ТЬг

180

185

190

Туг

Зег

МеЬ

Зег

Зег

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьуз

Азр

С1и

Туг

С1и

Агд

195

200

205

Н1з

Азп

Зег

Туг

ТЬг

Суз

С1и

А1а

ТЬг

Н1з

Ьуз

ТЬг

Зег

ТЬг

Зег

Рго

210

215

220

11е

Уа1

Ьуз

Зег

РЬе

Азп

Агд

Азп

С1и

Суз

225 230 <210> 16 <211> 461 <212> ПРТ <213> Миз тизси1из <400> 16

МеЬ С1у Тгр Зег Суз 11е 11е Ьеи РЬе Ьеи Уа1 Зег ТЬг А1а ТЬг С1у 1 5 10 15

- 50 027502

Уа1 20

Н1з 25 30

Зег

01п

Уа1

01п

Ьеи

01п

01п

Рго

01у

А1а

01и

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

01у

А1а

Зег

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Зег

Суз

Ьуз

Зег

Зег

01у

Туг

ТНг

РНе

35

40 45

ТНг

Зег

Туг

Тгр

МеЬ

Н1з

Тгр

Уа1

Агд

01п

Агд

Рго

01у

Н1з

01у

Ьеи

50

55 60

01и

Тгр

11е

01у

01и

11е

Азр

Рго

Зег

Азр

Зег

Туг

Ьуз

Азр

Туг

Азп

65

70 75

80

01п

Ьуз

РНе

Ьуз

Азр

Ьуз

А1а

ТНг

Ьеи

ТНг

Уа1

Азр

Агд

Зег

Зег

Азп

85

90 95

ТНг

А1а

Туг

МеЬ

Н1з

Ьеи

Зег

Зег

Ьеи

ТНг

Зег

Азр

Азр

Зег

А1а

Уа1

100

105

110

Туг

Туг

Суз

А1а

Агд

А1а

11е

ТНг

ТНг

ТНг

Рго

РНе

Азр

РНе

Тгр

01у

115

120

125

01п

01у

ТНг

ТНг

Ьеи

ТНг

Уа1

Зег

Зег

А1а

Ьуз

ТНг

ТНг

Рго

Рго

Зег

130

135

140

Уа1

Туг

Рго

Ьеи

А1а

Рго

01у

Зег

А1а

А1а

01п

ТНг

Азп

Зег

МеЬ

Уа1

145

150

155

160

ТНг

Ьеи

01у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

01у

Туг

РНе

Рго

01и

Рго

Уа1

ТНг

Уа1

165

170

175

ТНг

Тгр

Азп

Зег

01у

Зег

Ьеи

Зег

Зег

01у

Уа1

Н1з

ТНг

РНе

Рго

А1а

180

185

190

Уа1

Ьеи

01п

Зег

Азр

Ьеи

Туг

ТНг

Ьеи

Зег

Зег

Зег

Уа1

ТНг

Уа1

Рго

195

200

205

Зег

Зег

ТНг

Тгр

Рго

Зег

01и

ТНг

Уа1

ТНг

Суз

Азп

Уа1

А1а

Н1з

Рго

210

215

220

А1а

Зег

Зег

ТНг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

Ьуз

11е

Уа1

Рго

Агд

Азр

Суз

01у

225 230 235 240

- 51 027502

Суз 245

Ьуз 250

Рго 255

Суз

11е

Суз

ТЬг

Уа1

Рго

01и

Уа1

Зег

Зег

Уа1

РЬе

11е

РЬе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

Уа1

Ьеи

ТЬг

11е

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Рго

Ьуз

260

265

270

Уа1

ТЬг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

11е

Зег

Ьуз

Азр

Азр

Рго

01и

Уа1

01п

275

280

285

РЬе

Зег

Тгр

РЬе

Уа1

Азр

Азр

Уа1

01и

Уа1

Н1з

ТЬг

А1а

01п

ТЬг

01п

290

295

300

Рго

Агд

01и

01и

01п

РЬе

Азп

Зег

ТЬг

РЬе

Агд

Зег

Уа1

Зег

01и

Ьеи

305

310

315

320

Рго

11е

МеЬ

Н1з

01п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

01у

Ьуз

01и

РЬе

Ьуз

Суз

Агд

325

330

335

Уа1

Азп

Зег

А1а

А1а

РЬе

Рго

А1а

Рго

11е

01и

Ьуз

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

340

345

350

- 52 027502

7 ТЬг

Ьуз

01у

Агд

Рго

Ьуз

А1а

Рго

01п

Уа1

Туг

ТЬг

11е

Рго

Рго

Рго

355

360

365

Ьуз

01и

01п

МеЬ

А1а

Ьуз

Азр

Ьуз

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

МеЬ

11е

ТЬг

370

375

380

Азр

РЬе

РЬе

Рго

01и

Азр

11е

ТЬг

Уа1

01и

Тгр

01п

Тгр

Азп

01у

01п

385

390

395

400

Рго

А1а

01и

Азп

Туг

Ьуз

Азп

ТЬг

01п

Рго

11е

МеЬ

Азр

ТЬг

Азр

01у

405

410

415

Зег

Туг

РЬе

Уа1

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

Азп

Уа1

01п

Ьуз

Зег

Азп

Тгр

01и

420

425

430

А1а

01у

Азп

ТЬг

РЬе

ТЬг

Суз

Зег

Уа1

Ьеи

Н1з

01и

01у

Ьеи

Н1з

Азп

435

440

445

Н1з

Н1з

ТЬг

01и

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Н1з

Зег

Рго

01у

Ьуз

450

455

460

<210> 17 <211> 324 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> СЬЗ УЭ-сегмента УЬ 408 <400> 17 даЬаЬЬдЬдс ЬаасЬсадЬс Ьссадссасс сЬдЬсЬдЬда сЬссаддада ЬадсдЬсадЬ 60 сЬЬЬссЬдса дддссадсса дадЬаЬЬадс аасаассЬас асЬддЬаЬса асаааааЬса 120 саЬдадЬсЬс сааддсЬЬсЬ саЬсаадЬаЬ дсЬЬсссадЬ ссаЬсЬсЬдд даЬссссЬсс 180 аддЬЬсадЬд дсадЬддаЬс адддасадаЬ ЬЬсасЬсЬса дЬаЬсаасад ЬдЬддадасЬ 240 даадаЬЬЬЬд дадЬдЬаЬЬЬ сЬдЬсаасад адЬаасассЬ ддссдЬасас дЬЬсддаддд 300 дддассаадс ЬддаааЬааа асдд 324 <210> 18 <211> 354 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> СЬЗ УЬЭ-сегмента УН 408 <400> 18 саддЬссаас Ьдсадсадсс ЬддддсЬдад сЬЬдЬдаадс сЬддддсЬЬс аЬЬдаадсЬд 60

ЬссЬдсаадЬ сЬЬссдддЬа сассЬЬсасс адсЬасЬдда ЬдсасЬдддЬ даддсададд 120 ссЬддасаЬд дссЬЬдадЬд даЬсддадад аЬЬдаЬссЬЬ сЬдасадЬЬа ЬааадасЬас 180 ааЬсадаадЬ Ьсааддасаа ддссасаЬЬд асЬдЬддаса даЬссЬссаа сасадссЬас 240 аЬдсассЬса дсадссЬдас аЬсЬдаЬдас ЬсЬдсддЬсЬ аЬЬаЬЬдЬдс аададсдаЬЬ 300

- 53 027502 асдасдассс ссЬЬЬдасЬЬ сЬддддссаа ддсассасЬс ЬсасадЬсЬс сЬса 354 <210> 19 <211> 705 <212> ДНК <213> Миз тизси1из <400> 19 аЬддЬЬЬЬса сассЬсадаЬ асЬЬддасЬЬ аЬдсЬЬЬЬЬЬ ддаЬЬЬсадс сЬссададдЬ 60 даЬаЬЬдЬдс ЬаасЬсадЬс Ьссадссасс сЬдЬсЬдЬда сЬссаддада ЬадсдЬсадЬ 120 сЬЬЬссЬдса дддссадсса дадЬаЬЬадс аасаассЬас асЬддЬаЬса асаааааЬса 180 саЬдадЬсЬс сааддсЬЬсЬ саЬсаадЬаЬ дсЬЬсссадЬ ссаЬсЬсЬдд даЬссссЬсс 240 аддЬЬсадЬд дсадЬддаЬс адддасадаЬ ЬЬсасЬсЬса дЬаЬсаасад ЬдЬддадасЬ 300 даадаЬЬЬЬд дадЬдЬаЬЬЬ сЬдЬсаасад адЬаасассЬ ддссдЬасас дЬЬсддаддд 360 дддассаадс ЬддаааЬааа асдддсЬдаЬ дсЬдсассаа сЬдЬаЬссаЬ сЬЬсссасса 420

ЬссадЬдадс адЬЬаасаЬс ЬддаддЬдсс ЬсадЬсдЬдЬ дсЬЬсЬЬдаа саасЬЬсЬас 480 сссааадаса ЬсааЬдЬсаа дЬддаадаЬЬ даЬддсадЬд аасдасаааа ЬддсдЬссЬд 540 аасадЬЬдда сЬдаЬсадда садсааадас адсассЬаса дсаЬдадсад сасссЬсасд 600

ЬЬдассаадд асдадЬаЬда асдасаЬаас адсЬаЬассЬ дЬдаддссас Ьсасаадаса 660

ЬсаасЬЬсас ссаЬЬдЬсаа дадсЬЬсаас аддааЬдадЬ дЬЬад 705 <210> 20 <211> 948 <212> ДНК <213> Миз тизси1из <400> 20 сЬсадддааа дсЬсдаадаЬ ддЬЬЬЬсаса ссЬсадаЬас ЬЬддасЬЬаЬ дсЬЬЬЬЬЬдд 60 аЬЬЬсадссЬ ссададдЬда ЬаЬЬдЬдсЬа асЬсадЬсЬс садссасссЬ дЬсЬдЬдасЬ 120 ссаддадаЬа дсдЬсадЬсЬ ЬЬссЬдсадд дссадссада дЬаЬЬадсаа саассЬасас 180

ЬддЬаЬсаас аааааЬсаса ЬдадЬсЬсса аддсЬЬсЬса ЬсаадЬаЬдс ЬЬсссадЬсс 240 аЬсЬсЬддда ЬссссЬссад дЬЬсадЬддс адЬддаЬсад ддасадаЬЬЬ сасЬсЬсадЬ 300 аЬсаасадЬд ЬддадасЬда адаЬЬЬЬдда дЬдЬаЬЬЬсЬ дЬсаасадад ЬаасассЬдд 360 ссдЬасасдЬ Ьсддаддддд дассаадсЬд даааЬаааас дддсЬдаЬдс ЬдсассаасЬ 420 дЬаЬссаЬсЬ ЬсссассаЬс садЬдадсад ЬЬаасаЬсЬд даддЬдссЬс адЬсдЬдЬдс 480

ЬЬсЬЬдааса асЬЬсЬассс сааадасаЬс ааЬдЬсаадЬ ддаадаЬЬда ЬддсадЬдаа 540 сдасааааЬд дсдЬссЬдаа садЬЬддасЬ даЬсаддаса дсааадасад сассЬасадс 600 аЬдадсадса сссЬсасдЬЬ дассааддас дадЬаЬдаас дасаЬаасад сЬаЬассЬдЬ 660

- 54 027502 даддссасЬс асаадасаЬс Ьададасааа ддЬссЬдада ЬааддЬсЬЬд даддсЬЬссс ссссассЬсс ЬЬсЬссЬссЬ аааЬаЬЬсаа ЬааадЬдадЬ <210> 21 <211> 1386 <212> ДНК <213> Миз тизси1из <400> 21 аЬдддаЬдда дсЬдЬаЬсаЬ дЬссаасЬдс адсадссЬдд ЬдсаадЬсЬЬ ссдддЬасас ддасаЬддсс ЬЬдадЬддаЬ садаадЬЬса аддасааддс сассЬсадса дссЬдасаЬс асдасссссЬ ЬЬдасЬЬсЬд асасссссаЬ сЬдЬсЬаЬсс асссЬдддаЬ дссЬддЬсаа ддаЬсссЬдЬ ссадсддЬдЬ сЬдадсадсЬ садЬдасЬдЬ дЬЬдсссасс сддссадсад ЬдЬаадссЬЬ дсаЬаЬдЬас сссааддаЬд ЬдсЬсассаЬ адсааддаЬд аЬсссдаддЬ дсЬсадасдс аассссддда сссаЬсаЬдс ассаддасЬд дсЬЬЬсссЬд сссссаЬсда саддЬдЬаса ссаЬЬссасс ЬдсаЬдаЬаа садасЬЬсЬЬ ссадсддада асЬасаадаа Ьасадсаадс ЬсааЬдЬдса дЬдЬЬасаЬд адддссЬдса аасЬЬсассс аЬЬдЬсаада дсЬЬсаасад дааЬдадЬдЬ 720 сдссассасс адсЬссссад сЬссаЬссЬа ЬсЬЬсссЬЬс 780 сасаадсдас сЬассасЬдЬ ЬдсддЬдсЬс сааассЬссЬ 840 ссЬсссЬЬЬс сЬЬддсЬЬЬЬ аЬсаЬдсЬаа ЬаЬЬЬдсада 900 сЬЬЬдсасЬЬ дааааааааа аааааааа 948 ссЬсЬЬсЬЬд дЬаЬсаасад сЬасаддЬдЬ ссасЬсссад 60 ддсЬдадсЬЬ дЬдаадссЬд дддсЬЬсаЬЬ даадсЬдЬсс 120 сЬЬсассадс ЬасЬддаЬдс асЬдддЬдад дсададдссЬ 180 сддададаЬЬ даЬссЬЬсЬд асадЬЬаЬаа адасЬасааЬ 240 сасаЬЬдасЬ дЬддасадаЬ ссЬссаасас адссЬасаЬд 300 ЬдаЬдасЬсЬ дсддЬсЬаЬЬ аЬЬдЬдсаад адсдаЬЬасд 360 дддссааддс ассасЬсЬса садЬсЬссЬс адссаааасд 420 асЬддссссЬ ддаЬсЬдсЬд сссааасЬаа сЬссаЬддЬд 480 дддсЬаЬЬЬс ссЬдадссад ЬдасадЬдас сЬддаасЬсЬ 540 дсасассЬЬс ссадсЬдЬсс ЬдсадЬсЬда ссЬсЬасасЬ 600 ссссЬссадс ассЬддссса дсдадассдЬ сассЬдсаас 660 сассааддЬд дасаадаааа ЬЬдЬдсссад ддаЬЬдЬддЬ 720 адЬсссадаа дЬаЬсаЬсЬд ЬсЬЬсаЬсЬЬ ссссссааад 780 ЬасЬсЬдасЬ ссЬааддЬса сдЬдЬдЬЬдЬ ддЬадасаЬс 840 ссадЬЬсадс ЬддЬЬЬдЬад аЬдаЬдЬдда ддЬдсасаса 900 ддадсадЬЬс аасадсасЬЬ ЬссдсЬсадЬ садЬдаасЬЬ 960 дсЬсааЬддс ааддадЬЬса ааЬдсадддЬ саасадЬдса 1020 даааассаЬс Ьссаааасса ааддсадасс дааддсЬсса 1080 Ьсссааддад садаЬддсса аддаЬааадЬ садЬсЬдасс 1140 сссЬдаадас аЬЬасЬдЬдд адЬддсадЬд дааЬдддсад 1200 сасЬсадссс аЬсаЬддаса садаЬддсЬс ЬЬасЬЬсдЬс 1260 даададсаас Ьдддаддсад даааЬасЬЬЬ сассЬдсЬсЬ 1320 саассассаЬ асЬдадаада дссЬсЬссса сЬсЬссЬддЬ 1380

- 55 027502 аааЬда 1386 <210> 22 <211> 1593 <212> ДНК <213> Миз тизси1из <400> 22 дЬЬсдЬЬаЬс ддааЬЬаасс адасаааЬсд сЬссассаас Ьаадаасддс ссЬдЬЬсЬсЬ 60 сЬасадЬЬас Ьдадсасаса ддассЬсасс аЬдддаЬдда дсЬдЬаЬсаЬ ссЬсЬЬсЬЬд 120 дЬаЬсаасад сЬасаддЬдЬ ссасЬсссад дЬссаасЬдс адсадссЬдд ддсЬдадсЬЬ 180 дЬдаадссЬд дддсЬЬсаЬЬ даадсЬдЬсс ЬдсаадЬсЬЬ ссдддЬасас сЬЬсассадс 240

ЬасЬддаЬдс асЬдддЬдад дсададдссЬ ддасаЬддсс ЬЬдадЬддаЬ сддададаЬЬ 300 даЬссЬЬсЬд асадЬЬаЬаа адасЬасааЬ садаадЬЬса аддасааддс сасаЬЬдасЬ 360 дЬддасадаЬ ссЬссаасас адссЬасаЬд сассЬсадса дссЬдасаЬс ЬдаЬдасЬсЬ 420 дсддЬсЬаЬЬ аЬЬдЬдсаад адсдаЬЬасд асдасссссЬ ЬЬдасЬЬсЬд дддссааддс 480 ассасЬсЬса садЬсЬссЬс адссаааасд асасссссаЬ сЬдЬсЬаЬсс асЬддссссЬ 540 ддаЬсЬдсЬд сссааасЬаа сЬссаЬддЬд асссЬдддаЬ дссЬддЬсаа дддсЬаЬЬЬс 600 ссЬдадссад ЬдасадЬдас сЬддаасЬсЬ ддаЬсссЬдЬ ссадсддЬдЬ дсасассЬЬс 660 ссадсЬдЬсс ЬдсадЬсЬда ссЬсЬасасЬ сЬдадсадсЬ садЬдасЬдЬ ссссЬссадс 720 ассЬддссса дсдадассдЬ сассЬдсаас дЬЬдсссасс сддссадсад сассааддЬд 780 дасаадаааа ЬЬдЬдсссад ддаЬЬдЬддЬ ЬдЬаадссЬЬ дсаЬаЬдЬас адЬсссадаа 840 дЬаЬсаЬсЬд ЬсЬЬсаЬсЬЬ ссссссааад сссааддаЬд ЬдсЬсассаЬ ЬасЬсЬдасЬ 900 ссЬааддЬса сдЬдЬдЬЬдЬ ддЬадасаЬс адсааддаЬд аЬсссдаддЬ ссадЬЬсадс 960

ЬддЬЬЬдЬад аЬдаЬдЬдда ддЬдсасаса дсЬсадасдс аассссддда ддадсадЬЬс 1020 аасадсасЬЬ ЬссдсЬсадЬ садЬдаасЬЬ сссаЬсаЬдс ассаддасЬд дсЬсааЬддс 1080 ааддадЬЬса ааЬдсадддЬ саасадЬдса дсЬЬЬсссЬд сссссаЬсда даааассаЬс 1140

Ьссаааасса ааддсадасс дааддсЬсса саддЬдЬаса ссаЬЬссасс Ьсссааддад 1200 садаЬддсса аддаЬааадЬ садЬсЬдасс ЬдсаЬдаЬаа садасЬЬсЬЬ сссЬдаадас 1260 аЬЬасЬдЬдд адЬддсадЬд дааЬдддсад ссадсддада асЬасаадаа сасЬсадссс 1320 аЬсаЬддаса садаЬддсЬс ЬЬасЬЬсдЬс Ьасадсаадс ЬсааЬдЬдса даададсаас 1380

Ьдддаддсад даааЬасЬЬЬ сассЬдсЬсЬ дЬдЬЬасаЬд адддссЬдса саассассаЬ 1440 асЬдадаада дссЬсЬссса сЬсЬссЬддЬ аааЬдаЬссс адЬдЬссЬЬд дадсссЬсЬд 1500 дЬссЬасадд асЬсЬдасас сЬассЬссас сссЬсссЬдЬ аЬаааЬааад сасссадсас 1560

ЬдссЬЬддда сссЬдсаааа аааааааааа ааа 1593

- 56 027502 <210> 23 <211> 234 <212> ПРТ <213> Искусственный <220>

<223> Химерная каппа-легкая цепь 408 <400> 23

МеЬ

Уа1

РЬе

ТЬг

Рго

01п

11е

Ьеи

01у

Ьеи

МеЬ

Ьеи

РЬе

Тгр

11е

Зег

1 5

10 15

01у

А1а

Агд

01у

Азр

11е

Уа1

Ьеи

ТЬг

01п

Зег

Рго

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

20

25 30

Уа1

ТЬг

Рго

01у

Азр

Зег

Уа1

Зег

Ьеи

Зег

Суз

Агд

А1а

Зег

01п

Зег

35

40 45

11е

Зег

Азп

Азп

Ьеи

Н1з

Тгр

Туг

01п

01п

Ьуз

Зег

Н1з

01и

Зег

Рго

50

55 60

Агд

Ьеи

Ьеи

11е

Ьуз

Туг

А1а

Зег

01п

Зег

11е

Зег

01у

11е

Рго

Зег

65

70 75

80

Агд

РЬе

Зег

01у

Зег

01у

Зег

01у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Зег

11е

Азп

85

90 95

Зег

Уа1

01и

ТЬг

01и

Азр

РЬе

01у

Уа1

Туг

РЬе

Суз

01п

01п

Зег

Азп

100

105

110

ТЬг

Тгр

Рго

Туг

ТЬг

РЬе

01у

01у

01у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

01и

11е

Ьуз

Агд

115

120

125

ТЬг

Уа1

А1а

А1а

Рго

Зег

Уа1

РЬе

11е

РЬе

Рго

Рго

Зег

Азр

01и

01п

130

135

140

Ьеи

Ьуз

Зег

01у

ТЬг

А1а

Зег

Уа1

Уа1

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

РЬе

Туг

145

150

155

160

Рго

Агд

01и

А1а

Ьуз

Уа1

01п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

01п

Зег

165

170

175

01у

Азп

Зег

01п

01и

Зег

Уа1

ТЬг

01и

01п

Азр

Зег

Ьуз

Азр

Зег

ТЬг

180

185

190

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

01и

Ьуз

195

200

205

Н1з

Ьуз

Уа1

Туг

А1а

Суз

01и

Уа1

ТЬг

Н1з

01п

01у

Ьеи

Зег

Зег

Рго

210

215

220

Уа1

ТЬг

Ьуз

Зег

РЬе

Азп

Агд

01у

01и

Суз

225 230 <210> 24 <211> 705 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> СЬЗ химерной каппа-легкой цепи 408

- 57 027502 <400> 24 аЕддЕЕЕЕса сассЕсадаЕ асЕЕддасЕЕ аЕдсЕЕЕЕЕЕ ддаЕЕЕсадд ЕдсЕсдадда 60 даЕаЕЕдЕдс ЕаасЕсадЕс Ессадссасс сЕдЕсЕдЕда сЕссаддада ЕадсдЕсадЕ 120 сЕЕЕссЕдса дддссадсса дадЕаЕЕадс аасаассЕас асЕддЕаЕса асаааааЕса 180 саЕдадЕсЕс сааддсЕЕсЕ саЕсаадЕаЕ дсЕЕсссадЕ ссаЕсЕсЕдд даЕссссЕсс 240 аддЕЕсадЕд дсадЕддаЕс адддасадаЕ ЕЕсасЕсЕса дЕаЕсаасад ЕдЕддадасЕ 300 даадаЕЕЕЕд дадЕдЕаЕЕЕ сЕдЕсаасад адЕаасассЕ ддссдЕасас дЕЕсддаддд 360 дддассаадс ЕддаааЕааа асддасЕдЕд дсЕдсассаЕ сЕдЕсЕЕсаЕ сЕЕсссдсса 420

ЕсЕдаЕдадс адЕЕдаааЕс ЕддаасЕдсс ЕсЕдЕЕдЕдЕ дссЕдсЕдаа ЕаасЕЕсЕаЕ 480 сссадададд ссааадЕаса дЕддааддЕд даЕаасдссс ЕссааЕсддд ЕаасЕсссад 540 дададЕдЕса сададсадда садсааддас адсассЕаса дссЕсадсад сасссЕдасд 600 сЕдадсааад садасЕасда дааасасааа дЕсЕасдссЕ дсдаадЕсас ссаЕсадддс 660 сЕдадсЕсдс ссдЕсасааа дадсЕЕсаас аддддададЕ дЕЕад 705 <210> 25 <211> 467 <212> ПРТ <213> Искусственный <220>

<223> Химерная 1дС гамма 1 тяжелая цепь 408 <400> 25

МеЕ

01у Тгр

Зег

Тгр

11е

РЬе

Ьеи

РЬе

Ьеи

Ьеи

Зег

01у

ТЬг

А1а

01у

1 5

10 15

Уа1

Ьеи Зег

01п

Уа1

01п

Ьеи

01п

01п

Рго

01у

А1а

01и

Ьеи

Уа1

Ьуз

20

25 30

Рго

01у А1а

Зег

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Зег

Суз

Ьуз

Зег

Зег

01у

Туг

ТЬг

РЬе

35

40 45

ТЬг

Зег Туг

Тгр

МеЕ

Н1з

Тгр

Уа1

Агд

01п

Агд

Рго

01у

Н1з

01у

Ьеи

50

55 60

01и

Тгр 11е

01у

01и

11е

Азр

Рго

Зег

Азр

Зег

Туг

Ьуз

Азр

Туг

Азп

65

70 75 80

01п

Ьуз РЬе

Ьуз

Азр

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Агд

Зег

Зег

Азп

85

90 95

ТЬг

А1а Туг

МеЕ

Н1з

Ьеи

Зег

Зег

Ьеи

ТЬг

Зег

Азр

Азр

Зег

А1а

Уа1

100

105 110

Туг

Туг Суз

А1а

Агд

А1а

11е

ТЬг

ТЬг

ТЬг

Рго

РЬе

Азр

РЬе

Тгр

01у

115

120 125

01п

01у ТЬг

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

А1а

Зег

ТЬг

Ьуз

01у

Рго

Зег

130 135 140

- 58 027502

Уа1

РНе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Зег

Зег

Ьуз

Зег

ТНг

Зег

01у

01у

ТНг

А1а

145

150

155

160

А1а

Ьеи

01у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РНе

Рго

01и

Рго

Уа1

ТНг

Уа1

165

170

175

Зег

Тгр

Азп

Зег

01у

А1а

Ьеи

ТНг

Зег

01у

Уа1

Н1з

ТНг

РНе

Рго

А1а

180

185

190

Уа1

Ьеи

01п

Зег

Зег

01у

Ьеи

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

Уа1

ТНг

Уа1

195

200

205

Рго

Зег

Зег

Зег

Ьеи

01у

ТНг

01п

ТНг

Туг

11е

Суз

Азп

Уа1

Азп

Н1з

210

215

220

Ьуз

Рго

Зег

Азп

ТНг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

Ьуз

Уа1

01и

Рго

Ьуз

Зег

Суз

225

230

235

240

Азр

Ьуз

ТНг

Н1з

ТНг

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

01и

Ьеи

Ьеи

01у

245

250

255

01у

Рго

Зег

Уа1

РНе

Ьеи

РНе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТНг

Ьеи

МеЬ

260

265

270

11е

Зег

Агд

ТНг

Рго

01и

Уа1

ТНг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

Зег

Н1з

275

280

285

01и

Азр

Рго

01и

Уа1

Ьуз

РНе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

01у

Уа1

01и

Уа1

290

295

300

Н1з

Азп

А1а

Ьуз

ТНг

Ьуз

Рго

Агд

01и

01и

01п

Туг

Азп

Зег

ТНг

Туг

305

310

315

320

Агд

Уа1

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

ТНг

Уа1

Ьеи

Н1з

01п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

01у

325

330

335

Ьуз

01и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

Рго

А1а

Рго

11е

340

345

350

01и

Ьуз

ТНг

11е

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

01у

01п

Рго

Агд

01и

Рго

01п

Уа1

355 360 365

- 59 027502

Туг 370

ТЬг 375

Ьеи 380

Рго

Рго

Зег

Агд

Азр

С1и

Ьеи

ТЬг

Ьуз

Азп

С1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

ναι

Ьуз

С1у

РЬе

Туг

Рго

Зег

Азр

11е

А1а

Уа1

С1и

385

390

395

400

Тгр

61и

Зег

Азп

С1у

С1п

Рго

С1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

405

410

415

ναι

Ьеи

Азр

Зег

Азр

С1у

Зег

РЬе

РЬе

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

420

425

430

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

С1п

С1п

С1у

Азп

ναι

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

МеЬ

435

440

445

Н1з

61и

А1а

Ьеи

Н1з

Азп

Н1з

Туг

ТЬг

С1п

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

450 455 460

Рго С1у Ьуз

465

- 60 027502 <210> 26 <211> 1407 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> СБЗ химерной 1д0 гамма 1 тяжелой цепи 408 <400> 26 аЬдддаЬдда дсЬддаЬсЬЬ ЬсЬсЬЬЬсЬс сЬдЬсаддаа сЬдсаддЬдЬ ссЬсЬсЬсад 60 дЬссаасЬдс адсадссЬдд ддсЬдадсЬЬ дЬдаадссЬд дддсЬЬсаЬЬ даадсЬдЬсс 120

ЬдсаадЬсЬЬ ссдддЬасас сЬЬсассадс ЬасЬддаЬдс асЬдддЬдад дсададдссЬ 180 ддасаЬддсс ЬЬдадЬддаЬ сддададаЬЬ даЬссЬЬсЬд асадЬЬаЬаа адасЬасааЬ 240 садаадЬЬса аддасааддс сасаЬЬдасЬ дЬддасадаЬ ссЬссаасас адссЬасаЬд 300 сассЬсадса дссЬдасаЬс ЬдаЬдасЬсЬ дсддЬсЬаЬЬ аЬЬдЬдсаад адсдаЬЬасд 360 асдасссссЬ ЬЬдасЬЬсЬд дддссааддс ассасЬсЬса садЬсЬссЬс адссЬссасс 420 аадддсссаЬ сддЬсЬЬссс ссЬддсассс ЬссЬссаада дсассЬсЬдд дддсасадсд 480 дсссЬдддсЬ дЬсЬддЬсаа ддасЬасЬЬс сссдаассдд ЬдасддЬдЬс дЬддаасЬса 540 ддсдсссЬда ссадсддсдЬ дсасассЬЬс ссддсЬдЬсс ЬасадЬссЬс аддасЬсЬас 600

ЬсссЬсадса дсдЬддЬдас сдЬдсссЬсс адсадсЬЬдд дсасссадас сЬасаЬсЬдс 660 аасдЬдааЬс асаадсссад саасассаад дЬддасаада аадЬЬдадсс саааЬсЬЬдЬ 720 дасаааасЬс асасаЬдссс ассдЬдссса дсассЬдаас ЬссЬдддддд сссдЬсадЬс 780

ЬЬссЬсЬЬсс ссссаааасс сааддасасс сЬсаЬдаЬсЬ сссддасссс ЬдаддЬсаса 840

ЬдсдЬддЬдд ЬддасдЬдад ссасдаадас ссЬдаддЬса адЬЬсаасЬд дЬасдЬддас 900 ддсдЬддадд ЬдсаЬааЬдс саадасааад ссдсдддадд адсадЬасаа садсасдЬаЬ 960 сдЬдЬддЬса дсдЬссЬсас сдЬссЬдсас саддасЬддс ЬдааЬддсаа ддадЬасаад 1020

ЬдсааддЬсЬ ссаасааадс ссЬсссадсс сссаЬсдада ааассаЬсЬс сааадссааа 1080 дддсадсссс дадаассаса ддЬдЬасасс сЬдсссссаЬ сссдддаЬда дсЬдассаад 1140 аассаддЬса дссЬдассЬд ссЬддЬсааа ддсЬЬсЬаЬс ссадсдасаЬ сдссдЬддад 1200

Ьдддададса аЬдддсадсс ддадаасаас Ьасаадасса сдссЬсссдЬ дсЬддасЬсс 1260 дасддсЬссЬ ЬсЬЬссЬсЬа садсаадсЬс ассдЬддаса ададсаддЬд дсадсадддд 1320 аасдЬсЬЬсЬ саЬдсЬссдЬ даЬдсаЬдад дсЬсЬдсаса ассасЬасас дсадаададс 1380 сЬсЬсссЬдЬ сЬссдддЬаа аЬдаЬаа 1407 <210> 27 <211> 467 <212> ПРТ <213> Искусственный

- 61 027502 <220>

<223> Тяжелая цепь ЗЬЬЕ 408 <400> 27

МеЬ

01у

Тгр

Зег

Тгр

11е

РЬе

Ьеи

РЬе

Ьеи

Ьеи

Зег

01у

ТЬг

А1а

01у

1 5

10 15

Уа1

Ьеи

Зег

01п

Уа1

01п

Ьеи

01п

01п

Рго

01у

А1а

01и

Ьеи

Уа1

Ьуз

20

25 30

Рго

01у

А1а

Зег

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Зег

Суз

Ьуз

Зег

Зег

01у

Туг

ТЬг

РЬе

35

40 45

ТЬг

Зег

Туг

Тгр

МеЬ

Н1з

Тгр

Уа1

Агд

01п

Агд

Рго

01у

Н1з

01у

Ьеи

50

55 60

01и

Тгр

11е

01у

01и

11е

Азр

Рго

Зег

Азр

Зег

Туг

Ьуз

Азр

Туг

Азп

65

70 75

. 80

01п

Ьуз

РЬе

Ьуз

Азр

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Агд

Зег

Зег

Азп

85

90 95

ТЬг

А1а

Туг

МеЬ

Н1з

Ьеи

Зег

Зег

Ьеи

ТЬг

Зег

Азр

Азр

Зег

А1а

Уа1

100

105

110

Туг

Туг

Суз

А1а

Агд

А1а

11е

ТЬг

ТЬг

ТЬг

Рго

РЬе

Азр

РЬе

Тгр

01у

115

120

125

01п

01у

ТЬг

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

А1а

Зег

ТЬг

Ьуз

01у

Рго

Зег

130

135

140

Уа1

РЬе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Зег

Зег

Ьуз

Зег

ТЬг

Зег

01у

01у

ТЬг

А1а

145

150

155

160

А1а

Ьеи

01у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РЬе

Рго

01и

Рго

Уа1

ТЬг

Уа1

165

170

175

Зег

Тгр

Азп

Зег

01у

А1а

Ьеи

ТЬг

Зег

01у

Уа1

Н1з

ТЬг

РЬе

Рго

А1а

180

185

190

Уа1

Ьеи

01п

Зег

Зег

01у

Ьеи

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

Уа1

ТЬг

Уа1

195

200

205

Рго

Зег

Зег

Зег

Ьеи

01у

ТЬг

01п

ТЬг

Туг

11е

Суз

Азп

Уа1

Азп

Н1з

210

215

220

Ьуз

Рго

Зег

Азп

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

Ьуз

Уа1

01и

Рго

Ьуз

Зег

Суз

225

230

235

240

Азр

Ьуз

ТЬг

Н1з

ТЬг

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

01и

Ьеи

Ьеи

01у

245

250

255

01у

Рго

Азр

Уа1

РЬе

Ьеи

РЬе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

МеЬ

260

265

270

11е

Зег

Агд

ТЬг

Рго

01и

Уа1

ТЬг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

Зег

Н1з

275

280

285

01и

Азр

Рго

01и

Уа1

Ьуз

РЬе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

01у

Уа1

01и

Уа1

290

295

300

Н1з

Азп

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд

01и

01и

01п

Туг

Азп

Зег

ТЬг

Туг

305

310

315

320

- 62 027502

Агд

Уа1

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

ТНг

Уа1

Ьеи

Н1з

01п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

01у

325

330

335

Ьуз

01и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

Рго

А1а

Рго

01и

340

345

350

01и

Ьуз

ТНг

11е

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

01у

01п

Рго

Агд

01и

Рго

01п

Уа1

355

360

365

Туг

ТНг

Ьеи

Рго

Рго

Зег

Агд

Азр

01и

Ьеи

ТНг

Ьуз

Азп

01п

Уа1

Зег

370

375

380

Ьеи

ТНг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

01у

РНе

Туг

Рго

Зег

Азр

11е

А1а

Уа1

01и

385

390

395

400

Тгр

01и

Зег

Азп

01у

01п

Рго

01и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТНг

ТНг

Рго

Рго

405

410

415

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

01у

Зег

РНе

РНе

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТНг

Уа1

420

425

430

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

01п

01п

01у

Азп

Уа1

РНе

Зег

Суз

Зег

Уа1

МеЬ

435

440

445

Н1з

01и

А1а

Ьеи

Н1з

Азп

Н1з

Туг

ТНг

01п

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

450 455 460

Рго О1у Ьуз

465 <210> 28 <211> 1407 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> СЬЗ тяжелой цепи ЗЬЬЕ 408 <400> 28 аЬдддаЬдда дсЬддаЬсЬЬ ЬсЬсЬЬЬсЬс сЬдЬсаддаа сЬдсаддЬдЬ ссЬсЬсЬсад 60 дЬссаасЬдс адсадссЬдд ддсЬдадсЬЬ дЬдаадссЬд дддсЬЬсаЬЬ даадсЬдЬсс 120

ЬдсаадЬсЬЬ ссдддЬасас сЬЬсассадс ЬасЬддаЬдс асЬдддЬдад дсададдссЬ 180 ддасаЬддсс ЬЬдадЬддаЬ сддададаЬЬ даЬссЬЬсЬд асадЬЬаЬаа адасЬасааЬ 240 садаадЬЬса аддасааддс сасаЬЬдасЬ дЬддасадаЬ ссЬссаасас адссЬасаЬд 300 сассЬсадса дссЬдасаЬс ЬдаЬдасЬсЬ дсддЬсЬаЬЬ аЬЬдЬдсаад адсдаЬЬасд 360 асдасссссЬ ЬЬдасЬЬсЬд дддссааддс ассасЬсЬса садЬсЬссЬс адссЬссасс 420 аадддсссаЬ сддЬсЬЬссс ссЬддсассс ЬссЬссаада дсассЬсЬдд дддсасадсд 480 дсссЬдддсЬ дЬсЬддЬсаа ддасЬасЬЬс сссдаассдд ЬдасддЬдЬс дЬддаасЬса 540 ддсдсссЬда ссадсддсдЬ дсасассЬЬс ссддсЬдЬсс ЬасадЬссЬс аддасЬсЬас 600

ЬсссЬсадса дсдЬддЬдас сдЬдсссЬсс адсадсЬЬдд дсасссадас сЬасаЬсЬдс 660 аасдЬдааЬс асаадсссад саасассаад дЬддасаада аадЬЬдадсс саааЬсЬЬдЬ 720

- 63 027502 дасаааасЕс асасаЕдссс ассдЕдссса дсассЕдаас ЕссЕдддддд сссддаЕдЕс 780

ЕЕссЕсЕЕсс ссссаааасс сааддасасс сЕсаЕдаЕсЕ сссддасссс ЕдаддЕсаса 840

ЕдсдЕддЕдд ЕддасдЕдад ссасдаадас ссЕдаддЕса адЕЕсаасЕд дЕасдЕддас 900 ддсдЕддадд ЕдсаЕааЕдс саадасааад ссдсдддадд адсадЕасаа садсасдЕаЕ 960 сдЕдЕддЕса дсдЕссЕсас сдЕссЕдсас саддасЕддс ЕдааЕддсаа ддадЕасаад 1020

ЕдсааддЕсЕ ссаасааадс ссЕсссадсс сссдаддада ааассаЕсЕс сааадссааа 1080 дддсадсссс дадаассаса ддЕдЕасасс сЕдсссссаЕ сссдддаЕда дсЕдассаад 1140 аассаддЕса дссЕдассЕд ссЕддЕсааа ддсЕЕсЕаЕс ссадсдасаЕ сдссдЕддад 1200

Едддададса аЕдддсадсс ддадаасаас Еасаадасса сдссЕсссдЕ дсЕддасЕсс 1260 дасддсЕссЕ ЕсЕЕссЕсЕа садсаадсЕс ассдЕддаса ададсаддЕд дсадсадддд 1320 аасдЕсЕЕсЕ саЕдсЕссдЕ даЕдсаЕдад дсЕсЕдсаса ассасЕасас дсадаададс 1380 сЕсЕсссЕдЕ сЕссдддЕаа аЕдаЕаа 1407 <210> 29 <211> 113 <212> ПРТ <213> Искусственный <220>

<223> УЛ-сегмент УЬ ВУ10 <400> 29

Азр

11е Уа1

МеЕ

ТИг

С1п

Зег

Рго

Зег

Зег

Ьеи

Зег

Уа1

Зег

А1а

С1у

1 5

10 15

С1и

Ьуз Уа1

ТИг

МеЕ

Зег

Суз

Ьуз

Зег

Зег

С1п

Зег

Ьеи

Ьеи

Азп

Зег

20

25 30

С1у

Азп С1п

Ьуз

Азп

Туг

МеЕ

А1а

Туг

С1п

С1п

Ьуз

Рго

С1у

С1п

Рго

35

40 45

Рго

Ьуз Ьеи

Ьеи

11е

Туг

С1у

А1а

Зег

ТИг

Агд

С1и

Зег

С1у

Уа1

Рго

50

55 60

Азр

Агд РИе

ТИг

С1у

Зег

С1у

Зег

С1у

ТИг

Азр

РИе

ТИг

Ьеи

ТИг

11е

65

70 75 80

Зег

Зег Уа1

С1п

А1а

С1и

Азр

Ьеи

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

С1п

Азп

Азр

85

90 95

Н1з

Зег Туг

Рго

Ьеи

ТИг

РИе

С1у

А1а

С1у

ТИг

Ьуз

Ьеи

С1и

Ьеи

Ьуз

100 105 110 Агд <210> 30 <211> 123 <212> ПРТ <213> Искусственный

- 64 027502 <220>

<223> УБЭ-сегмент УН ВУ10 <400> 30

01п

Уа1 01п

Ьеи

Ьуз

01п

Зег

01у

Рго

01у

Ьеи

Уа1

01п

Рго

Зег

01п

1 5

10 15

Зег

Ьеи Зег

11е

ТЬг

Суз

ТЬг

Уа1

Зег

01у

РЬе

Зег

Ьеи

ТЬг

Азп

Туг

20

25 30

01у

Ьеи Н1з

Тгр

Уа1

Агд

01п

Зег

Рго

01у

Ьуз

01у

Ьеи

01и

Тгр

Ьеи

35

40 45

01у

Уа1 11е

Тгр

Зег

01у

01у

Зег

ТЬг

Азр

Туг

Азп

А1а

А1а

РЬе

11е

50

55 60

Зег

Агд Ьеи

Зег

11е

Зег

Ьуз

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Зег

01п

Уа1

РЬе

РЬе

65

70 75 80

Ьуз

МеЬ Азп

Зег

Ьеи

01п

А1а

Азр

Азр

ТЬг

А1а

11е

Туг

Туг

Суз

А1а

85

90 95

Агд

Ьуз 01у

01у

11е

Туг

Туг

А1а

Азп

Н1з

Туг

Туг

А1а

МеЬ

Азр

Туг

100

105 110

Тгр

01у 01п

01у

ТЬг

Зег

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115 120 <210> 31 <211> 240 <212> ПРТ <213> Миз тизси1из

<400> 31

МеЬ

01и Зег

01п

ТЬг

01п

Уа1

Ьеи

11е

Зег

Ьеи

Ьеи

РЬе

Тгр

Уа1

Зег

1 5

10 15

01у

ТЬг Суз

01у

Азр

11е

Уа1

МеЬ

ТЬг

01п

Зег

Рго

Зег

Зег

Ьеи

Зег

20

25 30

Уа1

Зег А1а

01у

01и

Ьуз

Уа1

ТЬг

МеЬ

Зег

Суз

Ьуз

Зег

Зег

01п

Зег

35

40 45

Ьеи

Ьеи Азп

Зег

01у

Азп

01п

Ьуз

Азп

Туг

МеЬ

А1а

Тгр

Туг

01п

01п

50

55 60

Ьуз

Рго 01у

01п

Рго

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

01у

А1а

Зег

ТЬг

Агд

65

70 75 80

01и

Зег 01у

Уа1

Рго

Азр

Агд

РЬе

ТЬг

01у

Зег

01у

Зег

01у

ТЬг

Азр

85

90 95

РЬе

ТЬг Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Зег

Уа1

01п

А1а

01и

Азр

Ьеи

А1а

Уа1

Туг

100

105 110

Туг

Суз 01п

Азп

Азр

Н1з

Зег

Туг

Рго

Ьеи

ТЬг

РЬе

01у

А1а

01у

ТЬг

115

120 125

Ьуз

Ьеи 01и

Ьеи

Ьуз

Агд

А1а

Азр

А1а

А1а

Рго

ТЬг

Уа1

Зег

11е

РЬе

130

135 140

- 65 027502

Рго

Рго

Зег

Зег

61и

С1п

Ьеи

ТЬг

Зег

С1у

С1у

А1а

Зег

Уа1

Уа1

Суз

145

150

155

160

РЬе

Ьеи

Азп

Азп

РЬе

Туг

Рго

Ьуз

Азр

11е

Азп

Уа1

Ьуз

Тгр

Ьуз

11е

165

170

175

Азр

С1у

Зег

61и

Агд

С1п

Азп

С1у

Уа1

Ьеи

Азп

Зег

Тгр

ТЬг

Азр

С1п

180

185

190

Азр

Зег

Ьуз

Азр

Зег

ТЬг

Туг

Зег

МеЬ

Зег

Зег

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

ТЬг

195

200

205

Ьуз

Азр

61и

Туг

61и

Агд

Н1з

Азп

Зег

Туг

ТЬг

Суз

61и

А1а

ТЬг

Н1з

210

215

220

Ьуз

ТЬг

Зег

ТЬг

Зег

Рго

11е

Уа1

Ьуз

Зег

РЬе

Азп

Агд

Азп

61и

Суз

225 230 235 240 <210> 32 <211> 466 <212> ПРТ <213> Искусственный <220>

<223> ЬдС гамма 1 тяжелая цепь мышиного Βν10 <400> 32

МеЬ

А1а

Уа1

Ьеи

С1у

Ьеи

Ьеи

РЬе

Суз

Ьеи

Уа1

ТЬг

РЬе

Рго

Зег

Суз

1 5

10 15

Уа1

Ьеи

Зег

С1п

Уа1

С1п

Ьеи

Ьуз

С1п

Зег

С1у

Рго

С1у

Ьеи

Уа1

С1п

20

25 30

Рго

Зег

С1п

Зег

Ьеи

Зег

11е

ТЬг

Суз

ТЬг

Уа1

Зег

С1у

РЬе

Зег

Ьеи

35

40 45

ТЬг

Азп

Туг

С1у

Ьеи

Н1з

Тгр

Уа1

Агд

С1п

Зег

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

50

55 60

61и

Тгр

Ьеи

С1у

Уа1

11е

Тгр

Зег

С1у

С1у

Зег

ТЬг

Азр

Туг

Азп

А1а

65

70 75

80

А1а

РЬе

11е

Зег

Агд

Ьеи

Зег

11е

Зег

Ьуз

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Зег

С1п

85

90 95

Уа1

РЬе

РЬе

Ьуз

МеЬ

Азп

Зег

Ьеи

С1п

А1а

Азр

Азр

ТЬг

А1а

11е

Туг

100

105

110

Туг

Суз

А1а

Агд

Ьуз

С1у

С1у

11е

Туг

Туг

А1а

Азп

Н1з

Туг

Туг

А1а

115

120

125

МеЬ

Азр

Туг

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

Зег

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

А1а

Ьуз

130

135

140

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

Зег

Уа1

Туг

Рго

Ьеи

А1а

Рго

С1у

Зег

А1а

А1а

С1п

145

150

155

160

ТЬг

Азп

Зег

МеЬ

Уа1

ТЬг

Ьеи

С1у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1у

Туг

РЬе

Рго

165

170

175

61и

Рго

Уа1

ТЬг

Уа1

ТЬг

Тгр

Азп

Зег

С1у

Зег

Ьеи

Зег

Зег

С1у

Уа1

180 185 190

- 66 027502

Н1з	ТЬг	РЬе	Рго	А1а	Уа1	Ьеи	С1и
195	200	205
Зег	Уа1	ТЬг	Уа1	Рго	Зег	Зег	Рго
210	215	220
Азп	Уа1	А1а	Н1з	Рго	А1а	Зег	Зег
225	230	235	240
Рго	Агд	Азр	Суз	С1у	Суз	Ьуз	Рго
245	250	255
Зег	Зег	Уа1	РЬе	11е	РЬе	Рго	Рго
260	265	270
ТЬг	Ьеи	ТЬг	Рго	Ьуз	Уа1	ТЬг	Суз
275	280	285
Азр	Рго	С1и	Уа1	С1п	РЬе	Зег	Тгр
290	295	300
ТЬг	А1а	С1п	ТЬг	С1п	Рго	Агд	С1и
305	310	315	320
Зег	Уа1	Зег	С1и	Ьеи	Рго	11е	МеЬ
325	330	335
Θ1υ	РЬе	Ьуз	Суз	Агд	Уа1	Азп	Зег
340	345	350
Ьуз	ТЬг	11е	Зег	Ьуз	ТЬг	Ьуз	С1у
355	360	365
ТЬг	11е	Рго	Рго	Рго	Ьуз	С1и	С1п
370	375	380
ТЬг	Суз	МеЬ	11е	ТЬг	Азр	РЬе	РЬе
385	390	395	400
С1п	Тгр	Азп	С1у	С1п	Рго	А1а	С1и
405	410	415
МеЬ	Азп	ТЬг	Азп	С1у	Зег	Туг	РЬе
420	425	430
Ьуз	Зег	Азп	Тгр	С1и	А1а	С1у	Азп
435	440	445
С1и	С1у	Ьеи	Н1з	Азп	Н1з	Н1з	ТЬг
450	455	460
С1у	Ьуз

465 <210> 33 <211> 342 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> СЬЗ УД-сегмента УЬ ВУ10 <400> 33

Зег	Азр	Ьеи	Туг	ТЬг	Ьеи	Зег	Зег
Агд	Рго	Зег	С1и	ТЬг	Уа1	ТЬг	Суз
ТЬг	Ьуз	Уа1	Азр	Ьуз	Ьуз	11е	Уа1
Суз	11е	Суз	ТЬг	Уа1	Рго	С1и	Уа1
Ьуз	Рго	Ьуз	Азр	Уа1	Ьеи	ТЬг	11е
Уа1	Уа1	Уа1	Азр	11е	Зег	Ьуз	Азр
РЬе	Уа1	Азр	Азр	Уа1	С1и	Уа1	Н1з
61и	С1п	РЬе	Азп	Зег	ТЬг	РЬе	Агд
Н1з	С1п	Азр	Тгр	Ьеи	Азп	С1у	Ьуз
А1а	А1а	РЬе	Рго	А1а	Рго	11е	С1и
Агд	Рго	Ьуз	А1а	Рго	С1п	Уа1	Туг
МеЬ	А1а	Ьуз	Азр	Ьуз	Уа1	Зег	Ьеи
Рго	С1и	Азр	11е	ТЬг	Уа1	С1и	Тгр
Азп	Туг	Ьуз	Азп	ТЬг	С1п	Рго	11е
Уа1	Туг	Зег	Ьуз	Ьеи	Азп	Уа1	С1п
ТЬг	РЬе	ТЬг	Суз	Зег	Уа1	Ьеи	Н1з
С1и	Ьуз	Зег	Ьеи	Зег	Н1з	Зег	Рго

- 67 027502 дасаЬЬдЬда ЬдасасадЬс ЬссаЬссЬсс сЬдадЬдЬдЬ садсаддада дааддЬсасЬ 60 аЬдадсЬдса адЬссадЬса дадЬсЬдЬЬа аасадЬддаа аЬсаааадаа сЬаЬаЬддсс 120

ЬддЬаЬсадс адааассадд дсадссЬссЬ ааасЬдЬЬда ЬсЬасддддс аЬссасЬадд 180 дааЬсЬдддд ЬсссЬдаЬсд сЬЬсасаддс адЬддаЬсЬд даассдаЬЬЬ сасЬсЬЬасс 240 аЬсадсадЬд ЬдсаддсЬда адассЬддса дЬЬЬаЬЬасЬ дЬсадааЬда ЬсаЬадЬЬаЬ 300 ссдсЬсасдЬ ЬсддЬдсЬдд дассаадсЬд дадсЬдааас дд 342 <210> 34 <211> 369 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> СБЗ УБЛ-сегмента УН ВУ10 <400> 34 саддЬдсадс ЬдаадсадЬс аддассЬддс сЬадЬдсадс ссЬсасадад ссЬдЬссаЬс 60 ассЬдсасад ЬсЬсЬддЬЬЬ сЬсаЬЬаасЬ аасЬаЬддЬЬ ЬасасЬдддЬ ЬсдссадЬсЬ 120 ссаддааадд дссЬддадЬд дсЬдддадЬд аЬаЬддадЬд дЬддаадсас адасЬаЬааЬ 180 дсадсЬЬЬса ЬаЬссадасЬ дадсаЬсадс ааддасаасЬ ссаададсса адЬЬЬЬсЬЬЬ 240 ааааЬдааса дЬсЬдсаддс ЬдаЬдасаса дссаЬаЬасЬ асЬдЬдссад ааааддаддд 300 аЬсЬасЬаЬд сЬаассаЬЬа сЬаЬдсЬаЬд дасЬасЬддд дЬсааддаас сЬсадЬсасс 360 дЬсЬссЬса 369 <210> 35 <211> 723 <212> ДНК <213> Миз тизси1из <400> 35 аЬддааЬсас адасЬсаддЬ ссЬсаЬсЬсс ЬЬдсЬдЬЬсЬ дддЬаЬсЬдд ЬассЬдЬддд 60 дасаЬЬдЬда ЬдасасадЬс ЬссаЬссЬсс сЬдадЬдЬдЬ садсаддада дааддЬсасЬ 120 аЬдадсЬдса адЬссадЬса дадЬсЬдЬЬа аасадЬддаа аЬсаааадаа сЬаЬаЬддсс 180

ЬддЬаЬсадс адааассадд дсадссЬссЬ ааасЬдЬЬда ЬсЬасддддс аЬссасЬадд 240 дааЬсЬдддд ЬсссЬдаЬсд сЬЬсасаддс адЬддаЬсЬд даассдаЬЬЬ сасЬсЬЬасс 300 аЬсадсадЬд ЬдсаддсЬда адассЬддса дЬЬЬаЬЬасЬ дЬсадааЬда ЬсаЬадЬЬаЬ 360 ссдсЬсасдЬ ЬсддЬдсЬдд дассаадсЬд дадсЬдааас дддсЬдаЬдс ЬдсассаасЬ 420 дЬаЬссаЬсЬ ЬсссассаЬс садЬдадсад ЬЬаасаЬсЬд даддЬдссЬс адЬсдЬдЬдс 480

ЬЬсЬЬдааса асЬЬсЬассс сааадасаЬс ааЬдЬсаадЬ ддаадаЬЬда ЬддсадЬдаа 540 сдасааааЬд дсдЬссЬдаа садЬЬддасЬ даЬсаддаса дсааадасад сассЬасадс 600

- 68 027502 аЬдадсадса сссЬсасдЬЬ дассааддас дадЬаЬдаас дасаЬаасад сЬаЬассЬдЬ 660 даддссасЬс асаадасаЬс аасЬЬсассс аЬЬдЬсаада дсЬЬсаасад дааЬдадЬдЬ 720 Ьад 723 <210> 36 <211> 907 <212> ДНК <213> Миз тизси1из <400> 36 аЬддааЬсас адасЬсаддЬ ссЬсаЬсЬсс ЬЬдсЬдЬЬсЬ дддЬаЬсЬдд ЬассЬдЬддд 60 дасаЬЬдЬда ЬдасасадЬс ЬссаЬссЬсс сЬдадЬдЬдЬ садсаддада дааддЬсасЬ 120 аЬдадсЬдса адЬссадЬса дадЬсЬдЬЬа аасадЬддаа аЬсаааадаа сЬаЬаЬддсс 180

ЬддЬаЬсадс адааассадд дсадссЬссЬ ааасЬдЬЬда ЬсЬасддддс аЬссасЬадд 240 дааЬсЬдддд ЬсссЬдаЬсд сЬЬсасаддс адЬддаЬсЬд даассдаЬЬЬ сасЬсЬЬасс 300 аЬсадсадЬд ЬдсаддсЬда адассЬддса дЬЬЬаЬЬасЬ дЬсадааЬда ЬсаЬадЬЬаЬ 360 ссдсЬсасдЬ ЬсддЬдсЬдд дассаадсЬд дадсЬдааас дддсЬдаЬдс ЬдсассаасЬ 420 дЬаЬссаЬсЬ ЬсссассаЬс садЬдадсад ЬЬаасаЬсЬд даддЬдссЬс адЬсдЬдЬдс 480

ЬЬсЬЬдааса асЬЬсЬассс сааадасаЬс ааЬдЬсаадЬ ддаадаЬЬда ЬддсадЬдаа 540 сдасааааЬд дсдЬссЬдаа садЬЬддасЬ даЬсаддаса дсааадасад сассЬасадс 600 аЬдадсадса сссЬсасдЬЬ дассааддас дадЬаЬдаас дасаЬаасад сЬаЬассЬдЬ 660 даддссасЬс асаадасаЬс аасЬЬсассс аЬЬдЬсаада дсЬЬсаасад дааЬдадЬдЬ 720

Ьададасааа ддЬссЬдада сдссассасс адсЬссссад сЬссаЬссЬа ЬсЬЬсссЬЬс 780

ЬааддЬсЬЬд даддсЬЬссс сасаадсдас сЬассасЬдЬ ЬдсддЬдсЬс сааассЬссЬ 840 ссссассЬсс ЬЬсЬссЬссЬ ссЬсссЬЬЬс сЬЬддсЬЬЬЬ аЬсаЬдсЬаа ЬаЬЬЬдсаЬд 900 аЬааааа 907 <210> 37 <211> 1401 <212> ДНК <213> Миз тизси1из <400> 37 аЬддсЬдЬсЬ ЬддддсЬдсЬ сЬЬсЬдссЬд дЬдасаЬЬсс саадсЬдЬдЬ ссЬсЬсссад 60 дЬдсадсЬда адсадЬсадд ассЬддссЬа дЬдсадсссЬ сасададссЬ дЬссаЬсасс 120

ЬдсасадЬсЬ сЬддЬЬЬсЬс аЬЬаасЬаас ЬаЬддЬЬЬас асЬдддЬЬсд ссадЬсЬсса 180 ддааадддсс ЬддадЬддсЬ дддадЬдаЬа ЬддадЬддЬд даадсасада сЬаЬааЬдса 240 дсЬЬЬсаЬаЬ ссадасЬдад саЬсадсаад дасаасЬсса ададссаадЬ ЬЬЬсЬЬЬааа 300 аЬдаасадЬс ЬдсаддсЬда Ьдасасадсс аЬаЬасЬасЬ дЬдссадааа аддадддаЬс 360

- 69 027502

РасРаРдсРа ассаРРасРа РссРсадсса ааасдасасс асРаасРсса РддРдасссР дРдассРдда асРсРддаРс РсРдассРсР асасРсРдад ассдРсассР дсаасдРРдс сссадддаРР дРддРРдРаа аРсРРссссс сааадсссаа дРРдРддРад асаРсадсаа дРддаддРдс асасадсРса РсадРсадРд аасРРсссаР адддРсааса дРдсадсРРР адассдаадд сРссасаддР ааадРсадРс РдассРдсаР садРддааРд ддсадссадс ддсРсРРасР РсдРсРасад асРРРсассР дсРсРдРдРР РсссасРсРс сРддРаааРд <210> 38 <211> 1563 <212> ДНК <213> Миз тизси1из <400> 38 ссРссаРсад адсаРддсРд РдРссРсРсс саддРдсадс ссРдРссаРс ассРдсасад РсдссадРсР ссаддааадд адасРаРааР дсадсРРРса адРРРРсРРР ааааРдааса ааааддаддд аРсРасРаРд сРсадРсасс дРсРссРсад аРсРдсРдсс сааасРаасР РдадссадРд асадРдассР

РдсРаРддас РасРддддРс ааддаассРс адРсассдРс 420 сссаРсРдРс РаРссасРдд ссссРддаРс РдсРдсссаа 480 дддаРдссРд дРсаадддсР аРРРсссРда дссадРдаса 540 ссРдРссадс ддРдРдсаса ссРРсссадс РдРссРддад 600 садсРсадРд асРдРссссР ссадсссРсд дсссадсдад 660 ссасссддсс адсадсасса аддРддасаа дааааРРдРд 720 дссРРдсаРа РдРасадРсс садаадРаРс аРсРдРсРРс 780 ддаРдРдсРс ассаРРасРс РдасРссРаа ддРсасдРдР 840 ддаРдаРссс даддРссадР РсадсРддРР РдРадаРдаР 900 дасдсаассс сдддаддадс адРРсаасад сасРРРссдс 960 саРдсассад дасРддсРса аРддсаадда дРРсаааРдс 1020 сссРдссссс аРсдадаааа ссаРсРссаа аассаааддс 1080 дРасассаРР ссассРссса аддадсадаР ддссааддаР 1140 даРаасадас РРсРРсссРд аадасаРРас РдРддадРдд 1200 ддадаасРас аадаасасРс адсссаРсаР даасасдааР 1260 саадсРсааР дРдсадаада дсаасРддда ддсаддаааР 1320 асаРдадддс сРдсасаасс ассаРасРда даададссРс 1380 а 1401

РсРРддддсР дсРсРРсРдс сРддРдасаР РсссаадсРд 60 РдаадсадРс аддассРддс сРадРдсадс ссРсасадад 120 РсРсРддРРР сРсаРРаасР аасРаРддРР РасасРдддР 180 дссРддадРд дсРдддадРд аРаРддадРд дРддаадсас 240 РаРссадасР дадсаРсадс ааддасаасР ссаададсса 300 дРсРдсаддс РдаРдасаса дссаРаРасР асРдРдссад 360 сРаассаРРа сРаРдсРаРд дасРасРддд дРсааддаас 420 ссаааасдас асссссаРсР дРсРаРссас РддссссРдд 480 ссаРддРдас ссРдддаРдс сРддРсаадд дсРаРРРссс 540 ддаасРсРдд аРсссРдРсс адсддРдРдс асассРРссс 600

- 70 027502 адсЕдЕссЕд дадЕсЕдасс ЕсЕасасЕсЕ дадсадсЕса дЕдасЕдЕсс ссЕссадссс 660

Есддсссадс дадассдЕса ссЕдсаасдЕ Едсссасссд дссадсадса ссааддЕдда 720 саадааааЕЕ дЕдсссаддд аЕЕдЕддЕЕд ЕаадссЕЕдс аЕаЕдЕасад ЕсссадаадЕ 780 аЕсаЕсЕдЕс ЕЕсаЕсЕЕсс ссссааадсс сааддаЕдЕд сЕсассаЕЕа сЕсЕдасЕсс 840

ЕааддЕсасд ЕдЕдЕЕдЕдд ЕадасаЕсад сааддаЕдаЕ сссдаддЕсс адЕЕсадсЕд 900 дЕЕЕдЕадаЕ даЕдЕддадд Едсасасадс Есадасдсаа ссссдддадд адсадЕЕсаа 960 садсасЕЕЕс сдсЕсадЕса дЕдаасЕЕсс саЕсаЕдсас саддасЕддс ЕсааЕддсаа 1020 ддадЕЕсааа ЕдсадддЕса асадЕдсадс ЕЕЕсссЕдсс сссаЕсдада ааассаЕсЕс 1080 саааассааа ддсадассда аддсЕссаса ддЕдЕасасс аЕЕссассЕс ссааддадса 1140 даЕддссаад даЕааадЕса дЕсЕдассЕд саЕдаЕааса дасЕЕсЕЕсс сЕдаадасаЕ 1200

ЕасЕдЕддад ЕддсадЕдда аЕдддсадсс адсддадаас Еасаадааса сЕсадсссаЕ 1260 саЕдаасасд ааЕддсЕсЕЕ асЕЕсдЕсЕа садсаадсЕс ааЕдЕдсада ададсаасЕд 1320 ддаддсадда ааЕасЕЕЕса ссЕдсЕсЕдЕ дЕЕасаЕдад ддссЕдсаса ассассаЕас 1380

Едадаададс сЕсЕсссасЕ сЕссЕддЕаа аЕдаЕсссад ЕдЕссЕЕдда дсссЕсЕддЕ 1440 ссЕасаддас ЕсЕдасассЕ ассЕссассс сЕсссЕдЕаЕ аааЕааадса сссадсасЕд 1500 ссЕЕдддасс сЕдааааааа ааадаааааа аааааааааа аааааааааа аааааааааа 1560 ааа 1563 <210> 39 <211> 240 <212> ПРТ <213> Искусственный <220>

<223> Химерная каппа-легкая цепь Βν10 <400> 39

МеЕ

νβΐ РЬе

ТЬг

Рго

С1п

11е

Ьеи

С1у

Ьеи

МеЕ

Ьеи

РЬе

Тгр

11е

Зег

1 5

10 15

С1у

А1а Агд

С1у

Азр

11е

νβ1

МеЕ

ТЬг

С1п

Зег

Рго

Зег

Зег

Ьеи

Зег

20

25 30

νβΐ

Зег А1а

С1у

С1и

Ьуз

νβ1

ТЬг

МеЕ

Зег

Суз

Ьуз

Зег

Зег

С1п

Зег

35

40 45

Ьеи

Ьеи Азп

Зег

С1у

Азп

С1п

Ьуз

Азп

Туг

МеЕ

А1а

Тгр

Туг

С1п

С1п

50

55 60

Ьуз

Рго С1у

С1п

Рго

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

С1у

А1а

Зег

ТЬг

Агд

65

70 75 80

С1и

Зег С1у

νβ1

Рго

Азр

Агд

РЬе

ТЬг

С1у

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

90 95

- 71 027502

РНе

ТНг

Ьеи

ТНг

11е

Зег

Зег

Уа1

01п

А1а

01и

Азр

Ьеи

А1а

Уа1

Туг

100

105

110

Туг

Суз

01п

Азп

Азр

Н1з

Зег

Туг

Рго

Ьеи

ТНг

РНе

01у

А1а

01у

ТНг

115

120

125

Ьуз

Ьеи

01и

Ьеи

Ьуз

Агд

ТНг

Уа1

А1а

А1а

Рго

Зег

Уа1

РНе

11е

РНе

130

135

140

Рго

Рго

Зег

Азр

01и

01п

Ьеи

Ьуз

Зег

01у

ТНг

А1а

Зег

Уа1

Уа1

Суз

145

150

155

160

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

РНе

Туг

Рго

Агд

01и

А1а

Ьуз

Уа1

01п

Тгр

Ьуз

Уа1

165

170

175

Азр

Азп

А1а

Ьеи

01п

Зег

01у

Азп

Зег

01п

01и

Зег

Уа1

ТНг

01и

01п

180

185

190

Азр

Зег

Ьуз

Азр

Зег

ТНг

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

ТНг

Ьеи

ТНг

Ьеи

Зег

195

200

205

Ьуз

А1а

Азр

Туг

01и

Ьуз

Н1з

Ьуз

Уа1

Туг

А1а

Суз

01и

Уа1

ТНг

Н1з

210

215

220

01п

01у

Ьеи

Зег

Зег

Рго

Уа1

ТНг

Ьуз

Зег

РНе

Азп

Агд

01у

01и

Суз

225

230

235

240

<210> 40 <211> 723 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> СЬЗ химерной каппа-легкой цепи ВУ10 <400> 40 аЬддЬЬЬЬса сассЬсадаЬ асЬЬддасЬЬ аЬдсЬЬЬЬЬЬ ддаЬЬЬсадд ЬдсЬсдадда 60 дасаЬЬдЬда ЬдасасадЬс ЬссаЬссЬсс сЬдадЬдЬдЬ садсаддада дааддЬсасЬ 120 аЬдадсЬдса адЬссадЬса дадЬсЬдЬЬа аасадЬддаа аЬсаааадаа сЬаЬаЬддсс 180

ЬддЬаЬсадс адааассадд дсадссЬссЬ ааасЬдЬЬда ЬсЬасддддс аЬссасЬадд 240 дааЬсЬдддд ЬсссЬдаЬсд сЬЬсасаддс адЬддаЬсЬд даассдаЬЬЬ сасЬсЬЬасс 300 аЬсадсадЬд ЬдсаддсЬда адассЬддса дЬЬЬаЬЬасЬ дЬсадааЬда ЬсаЬадЬЬаЬ 360 ссдсЬсасдЬ ЬсддЬдсЬдд дассаадсЬд дадсЬдааас ддасЬдЬддс ЬдсассаЬсЬ 420 дЬсЬЬсаЬсЬ ЬсссдссаЬс ЬдаЬдадсад ЬЬдаааЬсЬд даасЬдссЬс ЬдЬЬдЬдЬдс 480 сЬдсЬдааЬа асЬЬсЬаЬсс садададдсс ааадЬасадЬ ддааддЬдда ЬаасдсссЬс 540 сааЬсдддЬа асЬсссадда дадЬдЬсаса дадсаддаса дсааддасад сассЬасадс 600 сЬсадсадса сссЬдасдсЬ дадсааадса дасЬасдада аасасааадЬ сЬасдссЬдс 660 даадЬсассс аЬсадддссЬ дадсЬсдссс дЬсасааада дсЬЬсаасад дддададЬдЬ 720

Ьад 723

- 72 027502 <210> 41 <211> 472 <212> ПРТ <213> Искусственный <220>

<223> Химерная : <400> 41

1д0 гамма

1 тяжелая цепь

ВУ10

МеЬ 01у Тгр 1 5 10 15

Зег

Тгр

11е

РЬе

Ьеи

РЬе

Ьеи

Ьеи

Зег

01у

ТЬг

А1а

01у

Уа1 Ьеи Зег 20 25 30

01п

Уа1

01п

Ьеи

Ьуз

01п

Зег

01у

Рго

01у

Ьеи

Уа1

01п

Рго Зег 01п 35 40 45

Зег

Ьеи

Зег

11е

ТЬг

Суз

ТЬг

Уа1

Зег

01у

РЬе

Зег

Ьеи

ТЬг Азп Туг 50 55 60

01у

Ьеи

Н1з

Тгр

Уа1

Агд

01п

Зег

Рго

01у

Ьуз

01у

Ьеи

01и Тгр Ьеи 65 70 75 80

01у

Уа1

11е

Тгр

Зег

01у

01у

Зег

ТЬг

Азр

Туг

Азп

А1а

А1а РЬе 11е 85 90 95

Зег

Агд

Ьеи

Зег

11е

Зег

Ьуз

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Зег

01п

Уа1 РЬе РЬе 100 105 110

Ьуз

МеЬ

Азп

Зег

Ьеи

01п

А1а

Азр

Азр

ТЬг

А1а

11е

Туг

Туг Суз А1а 115 120 125

Агд

Ьуз

01у

01у

11е

Туг

Туг

А1а

Азп

Н1з

Туг

Туг

А1а

МеЬ Азр Туг 130 135 140

Тгр

01у

01п

01у

ТЬг

Зег

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

А1а

Зег

ТЬг Ьуз 01у 145 150 155

Рго 160

Зег

Уа1

РЬе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Зег

Зег

Ьуз

Зег

ТЬг

Зег 01у 01у 165 170 175

ТЬг

А1а

А1а

Ьеи

01у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РЬе

Рго

01и Рго Уа1 180 185 190

ТЬг

Уа1

Зег

Тгр

Азп

Зег

01у

А1а

Ьеи

ТЬг

Зег

01у

Уа1

Н1з ТЬг РЬе 195 200 205

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

01п

Зег

Зег

01у

Ьеи

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег Уа1 Уа1 210 215 220

ТЬг

Уа1

Рго

Зег

Зег

Зег

Ьеи

01у

ТЬг

01п

ТЬг

Туг

11е

Суз Азп Уа1 225 230 235

Азп 240

Н1з

Ьуз

Рго

Зег

Азп

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

Ьуз

Уа1

01и Рго Ьуз 245 250 255

Зег

Суз

Азр

Ьуз

ТЬг

Н1з

ТЬг

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго 01и Ьеи 260 265 270

Ьеи

01у

01у

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Ьеи

РЬе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз Азр ТЬг 275 280 285

Ьеи

МеЬ

11е

Зег

Агд

ТЬг

Рго

01и

Уа1

ТЬг

Суз

Уа1

Уа1

- 73 027502

Уа1

Азр

Уа1

Зег

Н1з

01и

Азр

Рго

01и

Уа1

Ьуз

РЬе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

290

295

300

Азр

01у

Уа1

01и

Уа1

Н1з

Азп

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд

01и

01и

01п

305

310

315

320

Туг

Азп

Зег

ТЬг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

Н1з

01п

325

330

335

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

01у

Ьуз

01и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Ьуз

А1а

340

345

350

Ьеи

Рго

А1а

Рго

11е

01и

Ьуз

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

01у

01п

Рго

355

360

365

Агд

01и

Рго

01п

Уа1

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

Рго

Зег

Агд

Азр

01и

Ьеи

ТЬг

370

375

380

Ьуз

Азп

01п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

01у

РЬе

Туг

Рго

Зег

385

390

395

400

Азр

11е

А1а

Уа1

01и

Тгр

01и

Зег

Азп

01у

01п

Рго

01и

Азп

Азп

Туг

405

410

415

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

01у

Зег

РЬе

РЬе

Ьеи

Туг

420

425

430

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

01п

01п

01у

Азп

Уа1

РЬе

435

440

445

Зег

Суз

Зег

Уа1

МеЬ

Н1з

01и

А1а

Ьеи

Н1з

Азп

Н1з

Туг

ТЬг

01п

Ьуз

450

455

460

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

01у

Ьуз

465 470 <210> 42 <211> 1422 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> СЬЗ химерной 1д0 гамма 1 тяжелой цепи ВУ10 <400> 42 аЬдддаЬдда дсЬддаЬсЬЬ ЬсЬсЬЬЬсЬс сЬдЬсаддаа сЬдсаддЬдЬ ссЬсЬсссад 60 дЬдсадсЬда адсадЬсадд ассЬддссЬа дЬдсадсссЬ сасададссЬ дЬссаЬсасс 120

ЬдсасадЬсЬ сЬддЬЬЬсЬс аЬЬаасЬаас ЬаЬддЬЬЬас асЬдддЬЬсд ссадЬсЬсса 180 ддааадддсс ЬддадЬддсЬ дддадЬдаЬа ЬддадЬддЬд даадсасада сЬаЬааЬдса 240 дсЬЬЬсаЬаЬ ссадасЬдад саЬсадсаад дасаасЬсса ададссаадЬ ЬЬЬсЬЬЬааа 300 аЬдаасадЬс ЬдсаддсЬда Ьдасасадсс аЬаЬасЬасЬ дЬдссадааа аддадддаЬс 360

ЬасЬаЬдсЬа ассаЬЬасЬа ЬдсЬаЬддас ЬасЬддддЬс ааддаассЬс адЬсассдЬс 420

ЬссЬсадссЬ ссассааддд сссаЬсддЬс ЬЬсссссЬдд сасссЬссЬс саададсасс 480

ЬсЬдддддса садсддсссЬ дддсЬдЬсЬд дЬсааддасЬ асЬЬссссда ассддЬдасд 540

- 74 027502 дЕдЕсдЕдда асЕсаддсдс ссЕдассадс ддсдЕдсаса ссЕЕсссддс ЕдЕссЕасад 600

ЕссЕсаддас ЕсЕасЕсссЕ садсадсдЕд дЕдассдЕдс ссЕссадсад сЕЕдддсасс 660 садассЕаса ЕсЕдсаасдЕ дааЕсасаад сссадсааса ссааддЕдда саадааадЕЕ 720 дадсссаааЕ сЕЕдЕдасаа аасЕсасаса ЕдсссассдЕ дсссадсасс ЕдаасЕссЕд 780 дддддсссдЕ садЕсЕЕссЕ сЕЕсссссса ааасссаадд асасссЕсаЕ даЕсЕсссдд 840 ассссЕдадд ЕсасаЕдсдЕ ддЕддЕддас дЕдадссасд аадасссЕда ддЕсаадЕЕс 900 аасЕддЕасд ЕддасддсдЕ ддаддЕдсаЕ ааЕдссаада сааадссдсд ддаддадсад 960

Еасаасадса сдЕаЕсдЕдЕ ддЕсадсдЕс сЕсассдЕсс Едсассадда сЕддсЕдааЕ 1020 ддсааддадЕ асаадЕдсаа ддЕсЕссаас ааадсссЕсс садсссссаЕ сдадаааасс 1080 аЕсЕссааад ссааадддса дссссдадаа ссасаддЕдЕ асасссЕдсс сссаЕсссдд 1140 даЕдадсЕда ссаадаасса ддЕсадссЕд ассЕдссЕдд ЕсаааддсЕЕ сЕаЕсссадс 1200 дасаЕсдссд ЕддадЕддда дадсааЕддд садссддада асаасЕасаа дассасдссЕ 1260 сссдЕдсЕдд асЕссдасдд сЕссЕЕсЕЕс сЕсЕасадса адсЕсассдЕ ддасаададс 1320 аддЕддсадс аддддаасдЕ сЕЕсЕсаЕдс ЕссдЕдаЕдс аЕдаддсЕсЕ дсасаассас 1380

Еасасдсада ададссЕсЕс ссЕдЕсЕссд ддЕаааЕдаЕ аа 1422 <210> 43 <211> 472 <212> ПРТ <213> Искусственный <220>

<223> Тяжелая цепь ЗБ1Е Βν10 <400> 43

МеЕ

Θΐγ Тгр

Зег

Тгр

Не

РЕе

Ьеи

РЕе

Ьеи

Ьеи

Зег

С1у

ТЕг

Аΐа

С1у

1 5

10 15

νβΐ

Ьеи Зег

Θΐη

νβΐ

Θΐη

Ьеи

Ьуз

Θΐη

Зег

С1у

Рго

С1у

Ьеи

Vаΐ

Θΐη

20

25 30

Рго

Зег Θΐη

Зег

Ьеи

Зег

Не

ТЕг

Суз

ТЕг

Vаΐ

Зег

С1у

РЕе

Зег

Ьеи

35

40 45

ТЕг

Азп Туг

Θΐγ

Ьеи

Н1з

Тгр

νβΐ

Агд

Θΐη

Зег

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

50

55 60

Θΐυ

Тгр Ьеи

Θΐγ

νβΐ

Не

Тгр

Зег

Θΐγ

О1у

Зег

ТЕг

Азр

Туг

Азп

Аΐа

65

70 75 80

А1а

РЕе Не

Зег

Агд

Ьеи

Зег

Не

Зег

Ьуз

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Зег

Θΐη

85

90 95

νβΐ

РЕе РЕе

Ьуз

МеЕ

Азп

Зег

Ьеи

Θΐη

Аΐа

Азр

Азр

ТЕг

Аΐа

Не

Туг

100

105 110

Туг

Суз А1а

Агд

Ьуз

Θΐγ

Θΐγ

Не

Туг

Туг

Аΐа

Азп

Н1з

Туг

Туг

Аΐа

115 120 125

- 75 027502

МеЕ 130

Азр 135

Туг 140

Тгр

01у

01п

01у

ТЬг

Зег

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

А1а

Зег

ТЬг

Ьуз

01у

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Зег

Зег

Ьуз

Зег

ТЬг

145

150

155

160

Зег

01у

01у

ТЬг

А1а

А1а

Ьеи

01у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РЬе

Рго

165

170

175

01и

Рго

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Тгр

Азп

Зег

01у

А1а

Ьеи

ТЬг

Зег

01у

Уа1

180

185

190

Н1з

ТЬг

РЬе

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

01п

Зег

Зег

01у

Ьеи

Туг

Зег

Ьеи

Зег

195

200

205

Зег

Уа1

Уа1

ТЬг

Уа1

Рго

Зег

Зег

Зег

Ьеи

01у

ТЬг

01п

ТЬг

Туг

11е

210

215

220

Суз

Азп

Уа1

Азп

Н1з

Ьуз

Рго

Зег

Азп

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

Ьуз

Уа1

225

230

235

240

01и

Рго

Ьуз

Зег

Суз

Азр

Ьуз

ТЬг

Н1з

ТЬг

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

245

250

255

Рго

01и

Ьеи

Ьеи

01у

01у

Рго

Азр

Уа1

РЬе

Ьеи

РЬе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

260

265

270

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

МеЕ

11е

Зег

Агд

ТЬг

Рго

01и

Уа1

ТЬг

Суз

Уа1

Уа1

275

280

285

Уа1

Азр

Уа1

Зег

Н1з

01и

Азр

Рго

01и

Уа1

Ьуз

РЬе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

290

295

300

Азр

01у

Уа1

01и

Уа1

Н1з

Азп

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд

01и

01и

01п

305

310

315

320

Туг

Азп

Зег

ТЬг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

Н1з

01п

325

330

335

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

01у

Ьуз

01и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Ьуз

А1а

340 345 350

- 76 027502

Ьеи 355

Рго 360

А1а 365

Рго

01и

01и

Ьуз

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

01у

01п

Рго

Агд

01и

Рго

01п

Уа1

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

Рго

Зег

Агд

Азр

01и

Ьеи

ТЬг

370

375

380

Ьуз

Азп

01п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

01у

РЬе

Туг

Рго

Зег

385

390

395

400

Азр

11е

А1а

Уа1

01и

Тгр

01и

Зег

Азп

01у

01п

Рго

01и

Азп

Азп

Туг

405

410

415

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

01у

Зег

РЬе

РЬе

Ьеи

Туг

420

425

430

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

01п

01п

01у

Азп

Уа1

РЬе

435

440

445

Зег

Суз

Зег

Уа1

МеЬ

Н1з

01и

А1а

Ьеи

Н1з

Азп

Н1з

Туг

ТЬг

01п

Ьуз

450

455

460

- 77 027502

Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз

465 470 <210> 44 <211> 1422 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> СЬЗ тяжелой цепи ЗБ1Е ВУ10 <400> 44 аРдддаРдда дсРддаРсРР РсРсРРРсРс сРдРсаддаа сРдсаддРдР ссРсРсссад 60 дРдсадсРда адсадРсадд ассРддссРа дРдсадсссР сасададссР дРссаРсасс 120

РдсасадРсР сРддРРРсРс аРРаасРаас РаРддРРРас асРдддРРсд ссадРсРсса 180 ддааадддсс РддадРддсР дддадРдаРа РддадРддРд даадсасада сРаРааРдса 240 дсРРРсаРаР ссадасРдад саРсадсаад дасаасРсса ададссаадР РРРсРРРааа 300 аРдаасадРс РдсаддсРда Рдасасадсс аРаРасРасР дРдссадааа аддадддаРс 360

РасРаРдсРа ассаРРасРа РдсРаРддас РасРддддРс ааддаассРс адРсассдРс 420

РссРсадссР ссассааддд сссаРсддРс РРсссссРдд сасссРссРс саададсасс 480

РсРдддддса садсддсссР дддсРдРсРд дРсааддасР асРРссссда ассддРдасд 540 дРдРсдРдда асРсаддсдс ссРдассадс ддсдРдсаса ссРРсссддс РдРссРасад 600

РссРсаддас РсРасРсссР садсадсдРд дРдассдРдс ссРссадсад сРРдддсасс 660 садассРаса РсРдсаасдР дааРсасаад сссадсааса ссааддРдда саадааадРР 720 дадсссаааР сРРдРдасаа аасРсасаса РдсссассдР дсссадсасс РдаасРссРд 780 дддддсссдд аРдРсРРссР сРРсссссса ааасссаадд асасссРсаР даРсРсссдд 840 ассссРдадд РсасаРдсдР ддРддРддас дРдадссасд аадасссРда ддРсаадРРс 900 аасРддРасд РддасддсдР ддаддРдсаР ааРдссаада сааадссдсд ддаддадсад 960

Расаасадса сдРаРсдРдР ддРсадсдРс сРсассдРсс Рдсассадда сРддсРдааР 1020 ддсааддадР асаадРдсаа ддРсРссаас ааадсссРсс садсссссда ддадаааасс 1080 аРсРссааад ссааадддса дссссдадаа ссасаддРдР асасссРдсс сссаРсссдд 1140 даРдадсРда ссаадаасса ддРсадссРд ассРдссРдд РсаааддсРР сРаРсссадс 1200 дасаРсдссд РддадРддда дадсааРддд садссддада асаасРасаа дассасдссР 1260 сссдРдсРдд асРссдасдд сРссРРсРРс сРсРасадса адсРсассдР ддасаададс 1320 аддРддсадс аддддаасдР сРРсРсаРдс РссдРдаРдс аРдаддсРсР дсасаассас 1380

Расасдсада ададссРсРс ссРдРсРссд ддРаааРдаР аа 1422

- 78 027502 <210> 45 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер гамма1-£ог <400> 45 сааддсЕЕас аассасааЕс ссЕдд 25 <210> 46 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер гамма1-Ьаск <400> 46 саЕаЕдЕаса дЕсссадаад ЕаЕсаЕсЕд 29 <210> 47 <211> 31 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер ск-£ог <400> 47

ЕдЕЕсаадаа дсасасдасЕ даддсассЕс с 31 <210> 48 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер ск-Ьаск <400> 48 асЕЕсЕассс сааадасаЕс ааЕдЕсаад 29 <210> 49 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер к-£ог1 <400> 49 ссЕдЕЕдаад сЕсЕЕдасаа Еддд 24

- 79 027502 <210> 50 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер <400> 50 аЕдЕсЕЕдЕд адЕддссЕса садд 24 <210> 51 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер <400> 51 сдЕсЕасадс аадсЕсааЕд Едс 23 <210> 52 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер <400> 52 ссаЕсЕдЕсЕ аЕссасЕддс с 21 <210> 53 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер <400> 53 ссаддЕсасЕ дЕсасЕддсЕ сад 23 <210> 54 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер <400> 54 ссЕсаЕдЕаа сасададсад д 21 к-£ог2

СС1-£ог1

СС1-£ог2

СС1-геу1

СС1-геу2

- 80 027502 <210> 55 <211> 53 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер 408-Н-£ог <400> 55

ЬсЬсЬЬсаса ддЬдЬссЬсЬ сЬсаддЬсса асЬдсадсад ссЬддддсЬд адс 53 <210> 56 <211> 52 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер 408-Н-геч <400> 56 дадааддЬад дасЬсассЬд аддадасЬдЬ дададЬддЬд ссЬЬддсссс ад 52 <210> 57 <211> 60 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер ВУ10-Н-£ог <400> 57 адасдЬссас ЬсЬдЬсЬЬЬс ЬсЬЬсасадд ЬдЬссЬсЬсс саддЬдсадс ЬдаадсадЬс 60 <210> 58 <211> 49 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер ВУ10-Н-^еν <400> 58 дадааддЬад дасЬсассЬд аддадасддЬ дасЬдаддЬЬ ссЬЬдассс 49 <210> 59 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер универсальный £ог (АаЬ11) <400> 59 адасдЬссас ЬсЬдЬсЬЬЬс ЬсЬЬсасадд ЬдЬссЬсЬсс 40

- 81 027502 <210> 60 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер универсальный Γβν (С1а1) <400> 60

ЬаЬсдаЬЬЬа дааЬдддада аддЬаддасЬ сас 33 <210> 61 <211> 42 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер 408-Ь-£ог (ХНо1) <400> 61 асЬсдаддад аЬаЬЬдЬдсЬ аасЬсадЬсЬ ссадссассс Ьд 42 <210> 62 <211> 41 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер 408-Ь-геу (Зре1) <400> 62

ЬасЬадЬасЬ ЬасдЬЬЬЬаЬ ЬЬссадсЬЬд дЬссссссЬс с 41 <210> 63 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер ВУ10-Ь-£ог (ХНо1) <400> 63 асЬсдаддад асаЬЬдЬдаЬ дасасадЬсЬ ссаЬссЬссс 40 <210> 64 <211> 47 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер ВУ10-Ь-геу (Зре1) <400> 64 асЬадЬасЬЬ асдЬЬЬсадс ЬссадсЬЬдд Ьсссадсасс даасдЬд 47

- 82 027502 <210> 65 <211> 952 <212> ПРТ <213> Ното зар1епз <400> 65

МеЕ

Рго

А1а

Ьеи

А1а

Агд

Азр

С1у

С1у

С1п

Ьеи

Рго

Ьеи

Ьеи

Уа1

Уа1

1 5

10 15

РНе

Зег

А1а

МеЕ

11е

РНе

С1у

ТНг

11е

ТНг

Азп

С1п

Азр

Ьеи

Рго

Уа1

20

25 30

11е

Ьуз

Суз

Уа1

Ьеи

11е

Азп

Н1з

Ьуз

Азп

Азп

Азр

Зег

Зег

Уа1

С1у

35

40 45

Ьуз

Зег

Зег

Зег

Туг

Рго

МеЕ

Уа1

Зег

С1и

Зег

Рго

С1и

Азр

Ьеи

С1у

50

55 60

Суз

А1а

Ьеи

Агд

Рго

С1п

Азп

Зег

С1у

ТНг

Уа1

Туг

С1и

А1а

А1а

А1а

65

70 75

. 80

Уа1

С1и

Уа1

Азр

Уа1

Зег

А1а

Зег

11е

ТНг

Ьеи

С1п

Уа1

Ьеи

Уа1

Азр

85

90 95

А1а

Рго

С1у

Азп

11е

Зег

Суз

Ьеи

Тгр

Уа1

РНе

Ьуз

Н1з

Зег

Зег

Ьеи

100

105

110

Азп

Суз

С1п

Рго

Н1з

РНе

Азр

Ьеи

С1п

Азп

Агд

С1у

Уа1

Уа1

Зег

МеЕ

115

120

125

Уа1

11е

Ьеи

Ьуз

МеЕ

ТНг

С1и

ТНг

С1п

А1а

С1у

С1и

Туг

Ьеи

Ьеи

РНе

130

135

140

11е

С1п

Зег

С1и

А1а

ТНг

Азп

Туг

ТНг

11е

Ьеи

РНе

ТНг

Уа1

Зег

11е

145

150

155

160

Агд

Азп

ТНг

Ьеи

Ьеи

Туг

ТНг

Ьеи

Агд

Агд

Рго

Туг

РНе

Агд

Ьуз

МеЕ

165

170

175

С1и

Азп

С1п

Азр

А1а

Ьеи

Уа1

Суз

11е

Зег

С1и

Зег

Уа1

Рго

С1и

Рго

180

185

190

11е

Уа1

С1и

Тгр

Уа1

Ьеи

Суз

Азр

Зег

С1п

С1у

С1и

Зег

Суз

Ьуз

С1и

195

200

205

С1и

Зег

Рго

А1а

Уа1

Уа1

Ьуз

Ьуз

С1и

С1и

Ьуз

Уа1

Ьеи

Н1з

С1и

Ьеи

210

215

220

РНе

С1у

МеЕ

Азр

11е

Агд

Суз

Суз

А1а

Агд

Азп

С1и

Ьеи

С1у

Агд

С1и

225

230

235

240

Суз

ТНг

Агд

Ьеи

РНе

ТНг

11е

Азр

Ьеи

Азп

С1п

ТНг

Рго

С1п

ТНг

ТНг

245

250

255

Ьеи

Рго

С1п

Ьеи

РНе

Ьеи

Ьуз

Уа1

С1у

С1и

Рго

Ьеи

Тгр

11е

Агд

Суз

260

265

270

Ьуз

А1а

Уа1

Н1з

Уа1

Азп

Н1з

С1у

РНе

С1у

Ьеи

ТНг

Тгр

С1и

Ьеи

С1и

275

280

285

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

С1и

С1и

С1у

Азп

Туг

РНе

С1и

МеЕ

Зег

ТНг

Туг

Зег

290 295 300

- 83 027502

ТНг

Азп

Агд

ТНг

МеР

11е

Агд

11е

Ьеи

РНе

А1а

РНе

Уа1

Зег

Зег

Уа1

305

310

315

320

А1а

Агд

Азп

Азр

ТНг

С1у

Туг

Туг

ТНг

Суз

Зег

Зег

Зег

Ьуз

Н1з

Рго

325

330

335

Зег

С1п

Зег

А1а

Ьеи

Уа1

ТНг

11е

Уа1

61и

Ьуз

С1у

РНе

11е

Азп

А1а

340

345

350

ТНг

Азп

Зег

Зег

С1и

Азр

Туг

61и

11е

Азр

С1п

Туг

61и

61и

РНе

Суз

355

360

365

РНе

Зег

Уа1

Агд

РНе

Ьуз

А1а

Туг

Рго

С1п

11е

Агд

Суз

ТНг

Тгр

ТНг

370

375

380

РНе

Зег

Агд

Ьуз

Зег

РНе

Рго

Суз

61и

С1п

Ьуз

С1у

Ьеи

Азр

Азп

С1у

385

390

395

400

Туг

Зег

11е

Зег

Ьуз

РНе

Суз

Азп

Н1з

Ьуз

Н1з

С1п

Рго

С1у

С1и

Туг

405

410

415

11е

РНе

Н1з

А1а

С1и

Азп

Азр

Азр

А1а

С1п

РНе

ТНг

Ьуз

МеР

РНе

ТНг

420

425

430

Ьеи

Азп

11е

Агд

Агд

Ьуз

Рго

С1п

Уа1

Ьеи

А1а

61и

А1а

Зег

А1а

Зег

435

440

445

С1п

А1а

Зег

Суз

РНе

Зег

Азр

С1у

Туг

Рго

Ьеи

Рго

Зег

Тгр

ТНг

Тгр

450

455

460

Ьуз

Ьуз

Суз

Зег

Азр

Ьуз

Зег

Рго

Азп

Суз

ТНг

61и

С1и

11е

ТНг

С1и

465

470

475

480

С1у

Уа1

Тгр

Азп

Агд

Ьуз

А1а

Азп

Агд

Ьуз

Уа1

РНе

С1у

С1п

Тгр

Уа1

485

490

495

Зег

Зег

Зег

ТНг

Ьеи

Азп

МеР

Зег

С1и

А1а

11е

Ьуз

С1у

РНе

Ьеи

Уа1

500

505

510

Ьуз

Суз

Суз

А1а

Туг

Азп

Зег

Ьеи

С1у

ТНг

Зег

Суз

61и

ТНг

11е

Ьеи

515 520 525

- 84 027502

Ьеи 530

Азп 535

Зег 540

Рго

С1у

Рго

РЬе

Рго

РЬе

11е

С1п

Азр

Азп

11е

Зег

РЬе

Туг

А1а

ТЬг

11е

С1у

Уа1

Суз

Ьеи

Ьеи

РЬе

11е

Уа1

Уа1

Ьеи

ТЬг

Ьеи

545

550

555

560

Ьеи

11е

Суз

Н1з

Ьуз

Туг

Ьуз

Ьуз

С1п

РЬе

Агд

Туг

С1и

Зег

С1п

Ьеи

565

570

575

С1п

МеЬ

ναι

С1п

Уа1

ТЬг

С1у

Зег

Зег

Азр

Азп

С1и

Туг

РЬе

Туг

Уа1

580

585

590

Азр

РЬе

Агд

С1и

Туг

С1и

Туг

Азр

Ьеи

Ьуз

Тгр

С1и

РЬе

Рго

Агд

С1и

595

600

605

Азп

Ьеи

С1и

РЬе

С1у

Ьуз

Уа1

Ьеи

С1у

Зег

С1у

А1а

РЬе

С1у

Ьуз

Уа1

610

615

620

МеЬ

Азп

А1а

ТЬг

А1а

Туг

С1у

11е

Зег

Ьуз

ТЬг

С1у

Уа1

Зег

11е

С1п

625 630 635 640

- 85 027502

Уа1 645

А1а 650

Уа1 655

Ьуз

МеЬ

Ьеи

Ьуз

01и

Ьуз

А1а

Азр

Зег

Зег

01и

Агд

01и

А1а

Ьеи

МеЬ

Зег

01и

Ьеи

Ьуз

МеЬ

МеЬ

ТЬг

01п

Ьеи

01у

Зег

Н1з

01и

660

665

670

Азп

11е

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

01у

А1а

Суз

ТЬг

Ьеи

Зег

01у

Рго

11е

Туг

675

680

685

Ьеи

11е

РЬе

01и

Туг

Суз

Суз

Туг

01у

Азр

Ьеи

Ьеи

Азп

Туг

Ьеи

Агд

690

695

700

Зег

Ьуз

Агд

01и

Ьуз

РЬе

Н1з

Агд

ТЬг

Тгр

ТЬг

01и

11е

РЬе

Ьуз

01и

705

710

715

720

Н1з

Азп

РЬе

Зег

РЬе

Туг

Рго

ТЬг

РЬе

01п

Зег

Н1з

Рго

Азп

Зег

Зег

725

730

735

МеЬ

Рго

01у

Зег

Агд

01и

Уа1

01п

11е

Н1з

Рго

Азр

Зег

Азр

01п

11е

740

745

750

Зег

01у

Ьеи

Н1з

01у

Азп

Зег

РЬе

Н1з

Зег

01и

Азр

01и

11е

01и

Туг

755

760

765

01и

Азп

01п

Ьуз

Агд

Ьеи

01и

01и

01и

01и

Азр

Ьеи

Азп

Уа1

Ьеи

ТЬг

770

775

780

РЬе

01и

Азр

Ьеи

Ьеи

Суз

РЬе

А1а

Туг

01п

Уа1

А1а

Ьуз

01у

МеЬ

01и

785

790

795

800

РЬе

Ьеи

01и

РЬе

Ьуз

Зег

А1а

Агд

Ьеи

Рго

Уа1

Ьуз

Тгр

МеЬ

А1а

Рго

805

810

815

01и

Зег

Ьеи

РЬе

01и

01у

11е

Туг

ТЬг

11е

Ьуз

Зег

Азр

Уа1

Тгр

Зег

820

825

830

Туг

01у

11е

Ьеи

Ьеи

Тгр

01и

11е

РЬе

Зег

Ьеи

01у

Уа1

Азп

Рго

Туг

835

840

845

Рго

01у

11е

Рго

Уа1

Азр

А1а

Азп

РЬе

Туг

Ьуз

Ьеи

11е

01п

Азп

01у

850

855

860

- 86 027502

РЬе

Ьуз

МеЬ

Азр

01п

Рго

РЬе

Туг

А1а

ТЬг

01и

01и

11е

Туг

11е

11е

865

870

875

880

МеЬ

01п

Зег

Суз

Тгр

А1а

РЬе

Азр

Зег

Агд

Ьуз

Агд

Рго

Зег

РЬе

Рго

885

890

895

Азп

Ьеи

ТЬг

Зег

РЬе

Ьеи

01у

Суз

01п

Ьеи

А1а

Азр

А1а

01и

01и

А1а

900

905

910

МеЬ

Туг

01п

Азп

Уа1

Азр

01у

Агд

Уа1

Зег

01и

Суз

Рго

Н1з

ТЬг

Туг

915

920

925

01п

Азп

Агд

Агд

Рго

РЬе

Зег

Агд

01и

МеЬ

Азр

Ьеи

01у

Ьеи

Ьеи

Зег

930

935

940

Рго

01п

А1а

01п

Уа1

01и

Азр

Зег

945 950 <210>

<211>

- 87 027502 <212> ПРТ <213> Искусственный <220>

<223> М-метка; аминокислоты #455-466 секреторного компонента 1д альфа 1 человека и эпитопа с-тус <400> 66

Рго ТЬг Н1з Уа1 Азп Уа1 Зег Уа1 Уа1 МеЬ А1а 01и 01и 01п Ьуз Ьеи 1 5 10 15

11е Зег 01и 01и Азр Ьеи Ьеи Агд <210> 67 <211> 12 <212> ПРТ <213> Искусственный <220>

<223> аминокислоты 455-466 секреторного компонента 1д альфа 1 человека <400> 67

Рго ТЬг Н1з Уа1 Азп Уа1 Зег Уа1 Уа1 МеЬ А1а 01и

5 10 <210> 68 <211> 12 <212> ПРТ <213> Искусственный <220>

<223> эпитоп с-тус <400> 68

01и 01п Ьуз Ьеи 11е Зег 01и 01и Азр Ьеи Ьеи Агд

5 10

Claims (14)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Антитело, которое связывает человеческую рецепторную тирозинкиназу РЬТЗ, содержащее тяжелую цепь и/или легкую цепь и по меньшей мере одну аминокислотную замену в константной области по сравнению с родительским антителом против РЬТЗ, где указанная по меньшей мере одна аминокислотная замена включает аминокислотные замены 8239Ό и Ι332Ε, где нумерация положений соответствует Ευ индексу и где У_ъ СИРТ имеет аминокислотную последовательность, представленную в 8Ε0 ГО N0: 1; У_ь СИР2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в 8Ε0 ГО N0: 2; У[, СИР3 имеет аминокислотную последовательность, представленную в 8Ε0 ГО N0: 3; У_н СИР1 имеет аминокислотную последовательность, представленную в 8Ε0 ГО N0: 4; У_н СИР2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в 8Ε0 ГО N0: 5; и У_н СИР3 имеет аминокислотную последовательность, представленную в 8Ε0 ГО N0: 6.
2. 2. Антитело, которое связывает человеческую рецепторную тирозинкиназу РЬТ3, содержащее тяжелую цепь и/или легкую цепь и по меньшей мере одну аминокислотную замену в константной области по сравнению с родительским антителом против РЬТ3, где указанная по меньшей мере одна аминокислотная замена включает аминокислотные замены 8239Ό и Ι332Ε, где нумерация положений соответствует Ευ индексу и где У_ъ СИР1 имеет аминокислотную последовательность, представленную в 8Ε0 ГО N0: 7; У_ь СИР2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в 8Ε0 ГО N0: 8; У_ь СИР3 имеет аминокислотную последовательность, представленную в 8Ε0 ГО N0: 9; У_н СИР1 имеет аминокислотную последовательность, представленную в 8Ε0 ГО N0: 10; У_н СИР2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в 8Ε0 ГО N0: 11; и У_н СИР3 имеет аминокислотную последовательность, представленную в 8Ε0 ГО N0: 12.
3. 3. Антитело по п.1, где тяжелая цепь содержит У_н-домен, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в 8Ε0 ГО N0: 14, и легкая цепь содержит У_ъ-домен, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в 8Ε0 ГО N0: 13.
4. 4. Антитело по п.2, где тяжелая цепь содержит У_н-домен, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в 8Ε0 ГО N0: 30, и легкая цепь содержит У_ъ-домен, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в 8Ε0 ГО N0: 29.
5. 5. Антитело по п.1, которое представляет собой химерное антитело и содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 8Ε0 ГО N0: 27, и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 8Ε0 ГО N0: 23.

   - 88 027502
6. 6. Антитело по п.2, которое представляет собой химерное антитело и содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 81Т) ГО N0: 43, и/или легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕР ГО N0: 39.
7. 7. Антитело по любому из пп.1-6, которое связывается с повышенной аффинностью с рецептором РсуКШа или имеет повышенную эффекторную функцию АЭСС (антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности) по сравнению с родительским антителом.
8. 8. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая тяжелую или легкую цепь антитела по любому из пп.1-7.
9. 9. Применение антитела по любому из пп.1-7 в лечении лимфомы или лейкоза у млекопитающего.
10. 10. Применение по п.9, где лимфома или лейкоз находится на стадии минимального остаточного заболевания (МКВ).
11. 11. Применение по п.9 или 10, где лимфома или лейкоз выбраны из группы, состоящей из неходжкинских лимфом ^НЬ), хронического лимфоцитарного лейкоза (СЬЬ), В-клеточного острого лимфобластного лейкоза/лимфомы (В-АЬЬ), мантийно-клеточной лимфомы (МСЬ), волосатоклеточного лейкоза (НСЬ), хронического миелоидного лейкоза (СМЬ), острого миелоидного лейкоза (АМЬ) и множественной миеломы (ММ).
12. 12. Применение по любому из пп.9-11 в комбинации по меньшей мере с одним агентом, выбранным из группы, состоящей из цитотоксического агента, химиотерапевтического агента, цитокина, ингибирующего рост агента, антигормонального агента, ингибитора киназы, антиангиогенного агента, кардиопротектора, иммуностимулирующего агента, иммунодепрессанта, ингибитора ангиогенеза, ингибитора протеинтирозинкиназы и второго антитела.
13. 13. Фармацевтическая композиция для лечения РЬТ3-связанного заболевания или расстройства, содержащая антитело по любому из пп.1-7 и фармацевтически приемлемый носитель.
14. 14. Клеточная линия, трансфицированная молекулой нуклеиновой кислоты по п.8, продуцирующая антитело по любому из пп.1-7.