EA015350B1

EA015350B1 - Применение эритропоэтина в низкой дозировке для стимуляции эндотелиальных клеток-предшественников, а также для регенерации органов и замедления прогрессирования повреждений конечных органов

Info

Publication number: EA015350B1
Application number: EA200601359A
Authority: EA
Inventors: Фердинанд Херманн Бальманн; Херманн Халлер
Original assignee: Эпоплус Гмбх Унд Ко. Кг
Priority date: 2004-01-23
Filing date: 2005-01-22
Publication date: 2011-06-30
Also published as: UA86400C2; KR20070007082A; AU2005205917A1; DE102004004509B4; CN101601857A; NO20063716L; JP2010235613A; SG149875A1; EP1711201A2; EA200601359A1; NZ548697A; US20070161552A1; AU2005205917B2; EP2156843A3; AU2010200621A1; DE102004063927A1; WO2005070450A2; WO2005070450A3; CA2554234A1; IL177017A0

Abstract

Изобретение относится к применению эритропоэтина в низкой дозировке для получения фармацевтических композиций для лечения пациентов по меньшей мере с одной дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, по меньшей мере одним сердечно-сосудистым фактором риска или по меньшей мере одним повреждением конечного органа, причем фармацевтическая композиция предназначена для предупреждения, уменьшения или замедления повреждения ткани почек или для регенерации поврежденной ткани почек для заживления ран.

Description

(57) Изобретение относится к применению эритропоэтина в низкой дозировке для получения фармацевтических композиций для лечения пациентов по меньшей мере с одной дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, по меньшей мере одним сердечно-сосудистым фактором риска или по меньшей мере одним повреждением конечного органа, причем фармацевтическая композиция предназначена для предупреждения, уменьшения или замедления повреждения ткани почек или для регенерации поврежденной ткани почек для заживления ран.

Изобретение относится к применению эритропоэтина (ЕРО), в частности, в низкой дозировке, отдельно или в комбинации с другими химическими, термическими, механическими, а также биологическими агентами для стимуляции физиологической мобилизации, пролиферации и дифференцировки эндотелиальных клеток-предшественников, для стимуляции образования и развития сосудов (васкулогенеза), для терапии заболеваний, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, и для получения фармацевтических композиций для лечения таких заболеваний, а также к фармацевтическим композициям, которые включают в себя эритропоэтин и другие подходящие биологически активные вещества, для стимуляции эндотелиальных клеток-предшественников, а также для защиты органов, регенерации органов, в частности новообразования сосудов и тканей и замедления прогрессирования повреждений органов.

Изобретение относится также к применению эритропоэтина, в частности, в низкой дозировке, т.е. ЕРО, предпочтительно дозированного так, как определено в нижеследующем разделе Дозировка ЕРО в соответствии с изобретением, для получения фармацевтической композиции, пригодной и предназначенной для применения, приспособленного к его природному циркадному ритму в теле человека или животного. Эндогенное продуцирование эритропоэтина имеет у человека его акрофазу (суточный максимум) под вечер, поэтому прием по данному изобретению эритропоэтина в низкой дозировке, как определено выше, происходит предпочтительно в первой половине дня, в частности в период времени от 6:00 до 10:00, для достижения максимального биологического и, следовательно, также терапевтического эффекта. В пределах этого периода времени ЕРО может вводиться в виде одноразовой дозы или в виде многократного введения доз.

Применение в виде одноразовой дозы или в виде многократного введения доз по изобретению является особенно предпочтительным для всех указанных в соответствии с настоящим техническим решением применений, в частности для косметического и терапевтического лечения организмов или клеток человека и животного.

Изобретение относится также к применению эритропоэтина, предпочтительно в низкой дозировке, в частности, для получения фармацевтической композиции или набора реагентов для профилактики или лечения заболеваний или применяемых в рамках трансплантаций или имплантаций, в последовательном, по времени следующем один за другим приемом по меньшей мере с одним другим химическим, термическим, механическим или биологическим агентом, в частности фармакологически активным веществом, для повышения количества и функции эндотелиальных клеток-предшественников и/или для регенерации или для замедления прогрессирования повреждений ткани.

Изобретение относится также к применению эритропоэтина в низкой дозировке по изобретению для терапии заболеваний, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, и для получения фармацевтических композиций для лечения таких заболеваний, а также фармацевтических композиций, которые включают в себя эритропоэтин и другие подходящие биологически активные вещества, для стимуляции эндотелиальных клеток-предшественников пациентов или для пациентов с а) дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников и Ь) по меньшей мере одним сердечнососудистым фактором риска, таким как гипертония, гиперхолестеринемия, повышенные показатели асимметричного диметиларгинина (ΆΌΜΆ), инсулинорезистентность, гипергомоцистеинемия, и с) по меньшей мере одним повреждением конечного органа, таким как гипертрофия левого желудочка, микроальбуминурия, когнитивная дисфункция, увеличение толщины внутренней оболочки (интимы)-средней оболочки (медии) сосудов в сонной артерии (А. сагобк), протеинурия или скорость гломерулярной (клубочковой) фильтрации (ОРК) <80 мл/мин, в частности 30, предпочтительно 40-80 мл/мин. Предпочтительно данное изобретение относится к вышеупомянутому применению эритропоэтина (ЕРО) в низкой дозировке при вышеупомянутой, определенной в а)-с) группе пациентов в варианте осуществления, который пригоден и предназначен для применения ЕРО в период времени от 6:00 до 10:00 утра.

Сосудистый эндотелий является слоем клеток, который выстилает кровеносные сосуды. Эндотелий отделяет кровь от других сосудистых слоев, причем эндотелий представляет собой не только пассивный барьер, но и активно вмешивается в регуляцию сосудистого тонуса. Соответственно этому, говорят также об эндотелийзависимой вазодилатации. На основе его положения эндотелий постоянно подвергается гемодинамическому стрессу и метаболическому стрессу. Поэтому при патогенных (вызывающих заболевание) состояниях, например повышенном кровяном давлении, повышенных ЬВЬ-показателях, повышенных показателях эндогенного ингибитора ΝΌ-синтетазы, Асимметричного Диметиларгинина (АЭМА), гиперхолестеринемии, ограниченной функции почек с гломерулярной скоростью фильтрации 30, предпочтительно 40-80 мл/мин, инсулинорезистентности или повышенном сахаре в крови, часто возникают функциональные дефекты эндотелия, за которыми могут затем следовать морфологически детектируемые повреждения, такие как образование атеросклеротических бляшек и/или дополнительные повреждения конечных органов, такие как гипертрофия левого желудочка, микроальбуминурия, протеинурия, невропатии или нарушения микроциркуляции. Одним очень ранним признаком измененной или уменьшенной эндотелиальной функции или эндотелиальной дисфункции является уменьшение эндотелийзависимой вазодилатации.

При ишемической болезни сердца (КНК), но также и при имеющихся в наличии факторах риска без

- 1 015350

КНК, например гипертонии, ограниченной функции почек, гиперлипопротеинемии, гипергомоцистеинемии, инсулинорезистентности или диабете, дефекты функции эндотелия проявляются в уменьшенном продуцировании N0 (=ЕЭВР) и повышенном продуцировании эндотелина. Высокие уровни эндотелина в плазме приводят к отклоняющемуся от нормы срастанию клеток, воспалениям, разрастаниям сосудов и сильным сужениям сосудов. К тому же нарушения функции эндотелия отличаются усиленным продуцированием адгезивных молекул, таких как 1САМ-1 и УСАМ-1, вследствие чего тромбоциты и моноциты в повышенной степени прилипают к эндотелию. В результате этого возникает повышение сосудистого тонуса. Таким образом, в различных системах образуется неравновесие, причем создаются условия, благоприятствующие вазоконстрикции, адгезии, агрегации, коагуляции, атеросклерозу и атеротромбозу. Даже психический стресс приводит к измеримой дисфункции эндотелия, которая может сохраняться до 4 ч.

Эндотелиальные клетки участвуют также в образовании новых кровеносных сосудов. Образование кровеносных сосудов имеет значение при множестве процессов, например, при эмбриогенезе, женском репродуктивном цикле, заживлении ран, опухолевом росте и образовании новых сосудов ишемических участков. Первоначально постнатальное образование кровеносных сосудов, следовательно, образование кровеносных сосудов после родов, объясняли в основном ангиогенными процессами. Под ангиогенезом понимают образование новых кровеносных сосудов путем формирования отростков капилляров из уже существующей сосудистой системы. При ангиогенезе разрушается сначала окружающая кровеносные сосуды базальная мембрана с помощью протеолитических ферментов, и внеклеточный матрикс в периваскулярном пространстве фрагментируется. Высвобождающиеся при этом ангиогенные стимулы вызывают миграцию уже имеющихся дифференцированных эндотелиальных клеток в направлении хемотаксического раздражителя, причем они одновременно пролиферируют и перестраиваются. Посредством напластования друг на друга эндотелиальных клеток образуются затем новые петли сосудов с капиллярообразным просветом. После этого начинается синтез новой базальной мембраны.

Однако новые исследования показали, что образование новых кровеносных сосудов во взрослых организмах основывается не только на ангиогенезе, но также на васкулогенных механизмах. Под васкулогенезом подразумевают образование новых сосудов из дифференцирующихся ίη кйи эндотелиальных клеток-предшественников. Догма, что васкулогенез ограничен эмбриогенезом, была опровергнута обнаружением эндотелиальных клеток-предшественников (ЕРС) в периферической крови здоровых людей и животных. С применением моделей животных удалось доказать, что происходящие из костного мозга эндотелиальные клетки-предшественники активно участвуют в образовании новых сосудов. Показано также, что в ишемических областях устанавливается специфическая СО34-положительная подгруппа лейкоцитов, которая экспрессирует эндотелий-специфические антигены. Кроме того, можно получить ίη νίίτο из СО133+- и СЭ34+-клеток эндотелиальные клетки-предшественники (ЕРС), которые вносят существенный вклад в образование кровеносных сосудов взрослых организмов (Акайага е! а1., 8с1епсе, 275 (1997), 964-967; СтокЬу е! а1., С1гс. Век., 87 (2000), 728-730; Оей1шд е! а1., Β1οο6, 95 (2000), 3106-3112). Далее, было показано, что инъекция выделенных СО34+-клеток или культивируемых эндотелиальных клеток-предшественников ускоряет восстановление кровотока у диабетических мышей (8сйайетап е! а1., 1. С11п. бкек!., 106 (2000), 571-578) и улучшает образование новых сосудов ίη νίνο (Акайага е! а1., Спс. Век., 85 (1999), 221-228; СгокЬу е! а1., Сйс. Век., 87 (2000), 728-730; Мигойата е! а1., 1. С1ш. 1^ек!., 105 (2000), 1527-1536). Кроме того, удалось показать, что индуцируемое СО34+-клетками образование новых сосудов улучшает функцию сердца (Клсйет е! а1., №11. Меб., 7 (2001), 430-436). Наряду с СЭ34+клетками, СО34-негативные мононуклеарные клетки крови могут также служить источником эндотелиальных клеток-предшественников в результате соответствующей трансдифференцировки (метаплазии).

Однако механизмы, лежащие в основе мобилизации и дифференцировки эндотелиальных клетокпредшественников, еще не выяснены полностью. Молекулярно- и клеточно-биологические исследования указывают на то, что различные цитокины и ангиогенные факторы роста действуют стимулирующим образом на мобилизацию эндотелиальных клеток-предшественников в костном мозге. Так, известно, что проангиогенные факторы, такие как УЕОР и ОМ-С8Р, могут повышать количество эндотелиальных клеток-предшественников (Акайага е! а1., ЕМВО 1. , 18 (1999), 3964-3972; Такайакй е! а1., №11. Меб., 5 (1999), 434-438). В случае УЕОР (васкулярного эндотелиального фактора роста) речь идет об одном, встречающемся в различных изоформах белке, который связывается с обоими рецепторами тирозинкиназы УЕОРВ1 (й!-1) и УЕОР-В2 (йк-1), которые, например, встречаются на поверхности растущих эндотелиальных клеток (^етпей е! а1., Апдете. Сйет1е, 21 (1999), 3432-3435). Активирование УЕОР-рецепторов приводит через путь Вак-ВаР-МАР-киназы к экспрессии протеиназ и специфических интегринов на поверхности эндотелиальных клеток или эндотелиальных клеток-предшественников и, наконец, к инициации пролиферации и миграции этих клеток в направлении ангиогенного стимула. В случае ОМ-С8Р (колониестимулирующего фактора гранулоцитов-макрофагов) речь идет о цитокине, который до сих пор известен, прежде всего, стимуляцией лейкоцитов, в том числе нейтрофилов, макрофагов и эозинофилов. О РЮР (факторе роста плаценты) известно, что он стимулирует мобилизацию эндотелиальных клетокпредшественников, но не их пролиферацию. Из исследований ΕΕνη6οΙ е! а1., (1. Сйп. йкек!.. 108 (2001), 399-405) вытекает, что ингибиторы ΗМ^-СοА-редуктазы (гидроксиметилглутарил-СοА-редуктазы, белка группы белков высокой мобильности), в частности статины, которые применяются в качестве снижаю

- 2 015350 щих липиды лекарственных средств и уменьшают заболеваемость и летальность ишемической болезни сердца, могут мобилизировать эндотелиальные клетки-предшественники. Далее, Оиптс1сг с1 а1., (1. С1ш. 1пуск1.. 108 (2001), 391-397) смогли показать, что статины, такие как аторвастатин и симвастатин, значимо улучшают ίη νίίτο и ίη νίνο дифференцировку эндотелиальных клеток-предшественников в мононуклеарных клетках и стволовых СО34+-клетках, которые были выделены из периферической крови. Так, лечение мышей статинами приводило к повышенному количеству дифференцированных эндотелиальных клеток-предшественников, причем статины оказывали такое же сильное действие, как и УЕСТ.

В основе настоящего изобретения лежит техническая проблема разработки средств и способов для улучшенной стимуляции эндотелиальных клеток-предшественников и для терапии заболеваний, которые, в частности, связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, а также разработки средств и способов для защиты и регенерации различных тканей.

Настоящее изобретение решает эту техническую проблему посредством технического решения, заключающегося в применении эритропоэтина, в частности, в низкой дозировке, и/или его производных для стимуляции физиологической мобилизации эндотелиальных клеток-предшественников, пролиферации эндотелиальных клеток-предшественников и/или миграции эндотелиальных клеток-предшественников в направлении ангиогенного или васкулогенного стимула в теле человека или животного. Стимуляция мобилизации и/или дифференцировки эндотелиальных клеток-предшественников представляет важную терапевтическую стратегию для повышения постнатальной неоваскуляризации, в частности васкулогенеза, и для лечения заболеваний, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клетокпредшественников и/или эндотелиальных клеток, а также для защиты и регенерации различных тканей посредством обладающих повреждающим действием химических, термических, механических и биологических агентов.

Настоящее изобретение решает эту техническую проблему также посредством технического решения, заключающегося в применении эритропоэтина в низкой дозировке и/или его производных для терапии заболеваний или патологических состояний, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников и/или эндотелиальных клеток.

Далее, изобретение решает эту техническую проблему также посредством технического решения, заключающегося в применении эритропоэтина в низкой дозировке и/или его производных для защиты и регенерации различных типов тканей в состоянии заболеваний или патологических состояниях, которые связаны с дисфункцией в каждом случае специфической функции ткани.

Лежащая в основе изобретения техническая проблема решается также последовательным, во времени следующим один за другим или одновременным приемом эритропоэтина в низкой дозировке, а также одного или нескольких химических, термических, механических, а также биологических агентов.

Таким образом, данное изобретение относится, в частности, к следующим вариантам осуществления, в каждом случае отдельно и/или в комбинации.

Применение эритропоэтина и/или производных для получения фармацевтической композиции, содержащей дозу 1-90 МЕ/кг массы тела в неделю, для профилактики или лечения пациентов-людей или пациентов-животных с а) по меньшей мере одной дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, Ь) по меньшей мере одним сердечно-сосудистым фактором риска, таким как гипертония, гиперхолестеринемия, повышенные показатели Асимметричного Диметиларгинина (ΑΌΜΑ), повышенная инсулинорезистентность или гипергомоцистеинемия, и с) по меньшей мере одним повреждением конечного органа, а именно гипертрофией левого желудочка, микроальбуминурией, когнитивной дисфункцией, увеличением толщины интимы-медии в сонной артерии (Α. сагойк) или скоростью гломерулярной фильтрации 30-80 мл/мин, и причем фармацевтическая композиция предназначена для предупреждения, уменьшения или замедления повреждения ткани почек или для регенерации поврежденной ткани почек.

Применение эритропоэтина и/или производных для получения фармацевтической композиции, содержащей дозу 1-90 МЕ/кг массы тела в неделю, для профилактики или лечения пациентов-людей или пациентов-животных с а) по меньшей мере одной дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, Ь) по меньшей мере одним сердечно-сосудистым фактором риска, таким как гипертония, гиперхолестеринемия, повышенные показатели Асимметричного Диметиларгинина (ΑΌΜΑ), повышенная инсулинорезистентность или гипергомоцистеинемия, и с) по меньшей мере одним повреждением конечного органа, а именно гипертрофией левого желудочка, микроальбуминурией, когнитивной дисфункцией, увеличением толщины интимы-медии в сонной артерии (Α. сагойк) или скоростью гломерулярной фильтрации 30-80 мл/мин, и причем фармацевтическая композиция предназначена для заживления ран.

Применение эритропоэтина и/или производных, в котором фармацевтическая композиция служит для стимуляции физиологической мобилизации эндотелиальных клеток-предшественников, пролиферации эндотелиальных клеток-предшественников, дифференцировки эндотелиальных клеток-предшественников в эндотелиальные клетки и/или миграции эндотелиальных клеток-предшественников в направлении ангиогенного или васкулогенного стимула.

Применение эритропоэтина и/или производных, в котором способность дифференцирующихся эндотелиальных клеток-предшественников к адгезии повышается.

Применение эритропоэтина и/или производных, в котором стимуляция эндотелиальных клеток

- 3 015350 предшественников приводит к образованию эндотелиальной ткани.

Применение эритропоэтина и/или производных, в котором стимуляция эндотелиальных клетокпредшественников приводит к образованию новых кровеносных сосудов.

Применение эритропоэтина и/или производных, в котором дисфункция эндотелиальных клетокпредшественников состоит в их нарушенной способности к пролиферации, их нарушенной способности к дифференцировке в эндотелиальные клетки, их нарушенной способности к адгезии и/или их нарушенной способности к миграции в направлении васкулогенного или ангиогенного стимула.

Применение эритропоэтина и/или производных, в котором дисфункция эндотелиальных клетокпредшественников ухудшает или предотвращает образование эндотелиальной ткани и/или кровеносных сосудов.

Применение эритропоэтина и/или производных, в котором дисфункция эндотелиальных клетокпредшественников является патогенно обусловленной.

Применение эритропоэтина и/или производных, в котором эритропоэтин вводят пациенту в дозе 145 единиц в неделю.

Применение эритропоэтина и/или производных, в котором эта фармацевтическая композиция пригодна как для парентерального, в частности внутривенного, внутримышечного, внутрикожного или подкожного, так и местного введения.

Применение эритропоэтина и/или производных, в котором эта фармацевтическая композиция представлена в виде инъекционного или инфузионного раствора.

Применение эритропоэтина и/или производных, в котором эта фармацевтическая композиция пригодна для легочного введения.

Применение эритропоэтина и/или производных, в котором эта фармацевтическая композиция представлена в виде водного раствора, неводного раствора или в виде порошка.

Применение эритропоэтина и/или производных, в котором эта фармацевтическая композиция представлена в форме аэрозольного препарата.

Применение эритропоэтина и/или производных, в котором эта фармацевтическая композиция пригодна для перорального введения.

Применение эритропоэтина и/или производных, в котором эта фармацевтическая композиция представлена в виде раствора, суспензии, эмульсии или таблетки.

Применение эритропоэтина и/или производных, в котором эта фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере одно дополнительное активное вещество для стимуляции эндотелиальных клеток-предшественников.

Применение эритропоэтина и/или производных, в котором в случае дополнительного активного вещества речь идет о УЕСЕ, Р1СЕ, СМ-С8Е, ингибиторе АСЕ (ангиотензинпревращающего фермента), блокаторе АТ-1, ингибиторе НМС-СоА-редуктазы (гидроксиметилглутарил-СоА-редуктазы) и/или доноре N0.

Применение эритропоэтина и/или производных, в котором ингибитором НМС-СоА-редуктазы является статин, такой как симвастатин, мевастатин или аторвастатин, ингибитором АСЕ является такое активное вещество, как эналаприл, рамиприл или трандолаприл, и/или блокатором АТ-1 является такое активное вещество, как ирбесартан, лорсартан или олмесаратан.

Применение эритропоэтина и/или производных, в котором эритропоэтин является эритропоэтином человека или животного.

Применение эритропоэтина и/или производных, в котором эритропоэтин является производным, аналогом, модификацией или мутеином эритропоэтина.

Применение эритропоэтина и/или производных, в котором эритропоэтин выделен из мочи человека, мочи или плазмы страдающих от апластической анемии пациентов, культур ткани раковых клеток почек человека, лимфобластных клеток, обнаруживающих способность к образованию эритропоэтина человека, или полученной клеточным слиянием гибридомной культуры, содержащей клеточную линию человека или животного.

Применение эритропоэтина и/или производных, в котором эритропоэтин является эритропоэтином, созданным с использованием способов рекомбинации ДНК.

Применение эритропоэтина и/или производных для получения фармацевтической композиции, для профилактики или лечения заболеваний, причем эритропоэтин или/и фармацевтическая композиция пригодны и предназначены для утреннего применения для организма человека или животного в период времени 6:00-10.00.

Согласно изобретению неожиданно было установлено, что лечение эритропоэтином в низкой дозировке приводит к физиологической мобилизации эндотелиальных клеток-предшественников, причем количество циркулирующих в кровотоке клеток-предшественников повышается и индуцируется их дифференцировка. Кроме того, при определенных патологических состояниях компенсируются возникающие функциональные дефициты эндотелиальных клеток-предшественников. Согласно данному изобретению удалось показать, что у пациентов с хроническим заболеванием почек в конечной стадии количество циркулирующих стволовых клеток является точно таким же высоким, как у здоровых пробандов,

- 4 015350 однако стволовые клетки у этих пациентов утрачивали способность дифференцировки в эндотелиальные клетки через эндотелиальные клетки-предшественники. Так, у пациентов с хроническим заболеванием почек количество клеток, которые являются способными к адгезии и обнаруживают фенотип эндотелиальных клеток, явно уменьшено по сравнению со здоровыми пробандами (бе Сгоо1 с1 а1.; К1биеу Ιηΐ. 2004; 66:641-6). Этот функциональный спад эндотелиальных клеток-предшественников может быть обнаружен уже при ограничении средней степени функции почек со скоростью гломерулярной фильтрации 30, предпочтительно 40-80 мл/мин. Согласно изобретению было установлено, что после лечения как этих пациентов, так и пациентов со здоровыми почками и/или пробандов эритропоэтином в низкой дозировке по изобретению количество циркулирующих стволовых клеток значимо повышается более чем на 50%. При этом разительно повышается, в частности, количество клеток, которые развивают фенотип эндотелиальных клеток. Как показано при помощи функционального теста с культурой клеток, посредством лечения эритропоэтином в низкой дозировке ухудшенная способность к адгезии эндотелиальных клетокпредшественников у пациентов с хроническим заболеванием почек со скоростью гломерулярной фильтрации 30, предпочтительно 40-80 мл/мин, увеличивается в три раза, у пробандов и/или пациентов со здоровыми почками в два-три раза. Способность дифференцирующихся эндотелиальных клеток-предшественников или эндотелиальных клеток к адгезии является одной из основных предпосылок для развития новых тканей и/или сосудов. Эритропоэтин может, таким образом, индуцировать неоваскуляризацию, в частности васкулогенез, в тканях или органах, в частности, например, в почках, в которых высвобождаются васкулогенные или ангиогенные стимулы.

В соответствии с изобретением эритропоэтин в низкой дозировке может применяться для стимуляции физиологической мобилизации эндотелиальных клеток-предшественников, пролиферации эндотелиальных клеток-предшественников, дифференцировки эндотелиальных клеток-предшественников в эндотелиальные клетки и/или миграции эндотелиальных клеток-предшественников в направлении васкулогенного или ангиогенного стимула в теле человека или животного, в частности взрослого организма. Таким образом, согласно изобретению эритропоэтин в низкой дозировке может применяться выгодным образом для стимуляции новообразования сосудов посредством васкулогенеза в тканях или органах, в которых имеют место патологические изменения сосудов. Кроме того, на основе стимуляции эндотелиальных клеток-предшественников эритропоэтином в низкой дозировке можно также индуцировать образование эндотелиальной ткани. В соответствии с данным изобретением эритропоэтин в низкой дозировке может также применяться для лечения заболеваний организма человека или животного, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников и/или эндотелиальных клеток. Популяции пациентов, которые обнаруживают такую дисфункцию, как правило, обнаруживают сердечно-сосудистый риск, такой как гипертония, гиперхолестеринемия, инсулинорезистентность, гипергомоцистеинемия, повышенный уровень ΆΌΜΆ и повреждение конечного органа, такое как гипертрофия левого желудочка, микроальбуминурия, протеинурия или скорость гломерулярной фильтрации (СЕЯ) 30, предпочтительно 40-80 мл/мин.

Изобретение относится также к применению эритропоэтина в низкой дозировке для защиты и регенерации ткани с нарушенной функцией на основе воздействия химических, термических, механических, а также биологических агентов. Местное применение эритропоэтина в низкой дозировке относится по изобретению также к профилактике и уменьшению уже существующих складок кожи, в частности кожи лица, а также к защите кожи, а также уменьшению старческих пятен. При этом согласно изобретению применение эритропоэтина в низкой дозировке или его производного может осуществляться последовательно, следующим во времени один за другим образом или одновременно с одним или несколькими другими химическими, термическими, механическими, а также биологическими агентами. В соответствии с изобретением эритропоэтин в низкой дозировке может применяться терапевтически с адаптацией к его природному циркадному ритму для получения, таким образом, максимального биологического эффекта. Эндотелиальные клетки-предшественники применяли в одном предпочтительном варианте осуществления одновременно с другими пригодными для клеточной терапии популяциями клеток при предварительной инкубации с эритропоэтином в низкой дозировке ίη νίΐτο и/или одновременно с местным, а также системным применением эритропоэтина в низкой дозировке ίη νΐνο для обеспечения, таким образом, приживления клеток ткани клеточной терапии с достаточным подключением к сосудистой системе.

В связи с изобретением под эритропоэтином или ЕРО понимают вещество, которое в соответственно высокой дозировке регулирует рост, дифференцировку и созревание стволовых клеток через эритробласты в эритроциты.

Эритропоэтин является гликопротеином, который имеет 166 аминокислот, три сайта гликозилирования и молекулярную массу приблизительно 34000 Да. В рамках ЕРО-индуцируемой дифференцировки клеток-предшественников эритроцитов индуцируется синтез глобина и синтез гем-комплексов, а также количество рецепторов ферритина. Благодаря этому клетка поглощает больше железа и синтезирует функциональный гемоглобин. В зрелых эритроцитах гемоглобин связывает кислород. Таким образом, эритроциты или содержащийся в них гемоглобин играют ключевую роль в обеспечении организма кислородом. Эти процессы провоцируются взаимодействием ЕРО с соответствующим рецептором на клеточной поверхности клеток-предшественников эритроцитов (СтаЬет ипб ΚπιηΙζ. Αηη. Яеу. Меб. 29 (1978), 51-56).

- 5 015350

Используемый здесь термин эритропоэтин включает в себя ЕРО любого происхождения, в частности ЕРО человека или животного. Используемый здесь термин включает в себя не только встречающиеся в природе формы, т.е. формы дикого типа ЕРО, но также его производные, аналоги, модификации, мутеины, мутанты и прочее, пока они обнаруживают биологические действия эритропоэтина дикого типа.

В связи с изобретением под производными понимают функциональные эквиваленты или производные эритропоэтина, которые были получены при сохранении основной структуры эритропоэтина заменой одного или нескольких атомов, или групп молекулы или остатков, в частности заменой сахарных цепей, таких как этиленгликоль, и/или аминокислотные последовательности которых отличаются от встречающихся в природе белков эритропоэтина человека или животных по меньшей мере одним положением, но сохраняют, по существу, высокую степень гомологии на уровне аминокислот и сравнимую биологическую активность. Производные эритропоэтина, которые, например, могут применяться в данном изобретении, известны, среди прочего, из \¥О 94/25055, ЕР 0148605 В1 или \УО 95/05465.

Гомология обозначает, в частности, идентичность последовательности по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85% и особенно предпочтительно более чем по меньшей мере 90, 95, 97 и 99%. Таким образом, известное специалисту выражение гомология обозначает степень родства между двумя или более молекулами полипептидов, которая определяется соответствием последовательностей. При этом соответствие может обозначать как идентичное соответствие, так и консервативную замену аминокислот.

В соответствии с изобретением понятие производное включает в себя также слитые белки, в которых на Ν-концевой части или на С-концевой части присутствуют функциональные домены другого белка. В одном варианте осуществления изобретения, в случае этого другого белка, речь может идти, например, о СМ-С8Е, УЕСЕ, Р1СЕ, статине или другом факторе, который обнаруживает стимулирующее действие на эндотелиальные клетки-предшественники. В следующем варианте осуществления изобретения речь может идти, в случае другого белка, о факторе, который оказывает стимулирующее действие на дифференцированные эндотелиальные клетки, например ангиогенине, УЕСЕ (васкулярном эндотелиальном факторе роста) или ЬЕСЕ (основном факторе роста фибробластов). О ЬЕСЕ и УЕСЕ известно, что этот фактор роста оказывает сильное митогенное и хемотаксическое действие на эндотелиальные клетки.

Различия между производным эритропоэтина и природным эритропоэтином могут возникать, например, в результате мутаций, например делеций, замен, инсерций, присоединений, обмена оснований и/или рекомбинаций нуклеотидных последовательностей, кодирующих аминокислотные последовательности эритропоэтина. Согласно изобретению в качестве эритропоэтина предпочтительно используют (ЕРО-)альфа, (ЕРО-)бета, аранесп (дарбепоэтин альфа) или Сега (непрерывный агонист рецептора эритропоэтина). Само собой разумеется, речь при этом может идти также о встречающихся в природе вариациях последовательностей, например о последовательностях из другого организма или о последовательностях, которые мутированы природным образом, или о мутациях, которые были введены при помощи обычного, известного в данной области средства, например с использованием химических агентов и/или физических агентов, нацеленных на последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие эритропоэтин. Таким образом, в связи с данным изобретением понятие производное включает в себя также мутированные молекулы эритропоэтина, а также мутеины эритропоэтина.

В соответствии с изобретением могут также использоваться пептидные или белковые аналоги эритропоэтина. В связи с изобретением понятие аналоги включает в себя соединения, которые не обнаруживают аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности эритропоэтина, трехмерная структура которых, однако, в сильной степени похожа на эритропоэтин и которая поэтому проявляет сравнимую биологическую активность. В случае аналогов эритропоэтина речь может идти, например, о соединениях, которые содержат аминокислотные остатки, ответственные за связывание эритропоэтина с его рецепторами, и которые поэтому могут имитировать существенные поверхностные свойства области связывания эритропоэтина. Подобные соединения описаны, например, в ХУгщЫоп е1 а1., 8с1еисе, 273 (1996), 458. Используемый в соответствии с изобретением ЕРО может быть получен различными способами, например выделением из мочи человека или из мочи или плазмы (в том числе сыворотки) страдающих от апластической анемии пациентов (М1уаке е1 а1., ТВ.С. 252 (1977), 5558). ЕРО человека может быть, например, получен из культур ткани раковых клеток почки человека (1Л-О8 55790/1979), из лимфобластных клеток человека, которые обнаруживают способность образования ЕРО человека (1Л-О8 40411/1982), и из культуры гибридомы, полученной клеточным слиянием клеточных линий человека. ЕРО может быть также получен способом генной инженерии, в котором с использованием подходящей ДНК или РНК, которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность ЕРО, получают генной инженерией желаемый белок, например, в бактерии, в дрожжах, в линии клеток растений, животных или человека. Подобные способы описаны, например, в ЕР 0148605 В2 или ЕР 0205564 В2, а также в ЕР 0411678 В1.

Изобретение относится, в частности, к применению эритропоэтина в низкой дозировке и/или его производных для стимуляции физиологической мобилизации эндотелиальных клеток-предшественников, пролиферации эндотелиальных клеток-предшественников, дифференцировки эндотелиальных клетокпредшественников в эндотелиальные клетки и/или миграции эндотелиальных клеток-предшественников

- 6 015350 в направлении васкулогенного или ангиогенного стимула в теле человека или животного, в частности взрослого организма.

Далее, изобретение относится к последовательному применению эритропоэтина в низкой дозировке и по меньшей мере одного дополнительного подходящего химического, термического, механического или биологического агента или биологически активного вещества, в частности фармакологически активного вещества, которое повышает функцию и количество эндотелиальных клеток-предшественников, а также усиливает органозащитное и регенеративное действие эритропоэтина в низкой дозировке.

Таким образом, изобретение также относится предпочтительно к последовательному, следующему во времени один за другим или одновременному приему эритропоэтина в низкой дозировке, а также одного или нескольких других фармакологически активных веществ, например УЕСР, СМ-С8Р, М-С8Р, тромбопоэтина, 8СР, 8ΌΡ-1, ΝΟΡ, Р1СР, одного ингибитора НМС-Со-редуктазы (гидроксиметилглутарил-СоА-редуктазы), одного ингибитора АСЕ (ангиотензинпревращающего фермента), одного ингибитора АТ-1 и одного ΝΟ-донора, для повышения, таким образом, количества и функции эндотелиальных клеток-предшественников и/или для достижения регенерации или замедления прогрессирования повреждения тканей. При этом в соответствии с изобретением должно происходить влияние на последовательность А) количественной и качественной оптимизации стволовых клеток и/или эндотелиальных клеток-предшественников в костном мозге или в происходящих из тканей нишах стволовых клеток, В) мобилизации стволовых клеток и/или эндотелиальных клеток-предшественников из костного мозга или других ниш стволовых клеток в периферическую кровь, С) количественной и качественной оптимизации стволовых клеток и/или эндотелиальных клеток-предшественников в периферической крови и/или ех νίνο в селективных условиях культивирования, предпочтительно в культуре в условиях гипоксии с долей кислорода 0,1-10%, Ό) хоминга стволовых клеток и/или эндотелиальных клеток-предшественников в место повреждения, Е) адгезии и миграции стволовых клеток и/или эндотелиальных клетокпредшественников в ткань-мишень, Р) образования новых сосудов эндотелиальными клетками-предшественниками.

Изобретение относится к применению эритропоэтина в низкой дозировке для стимуляции физиологической мобилизации, и/или пролиферации и дифференцировки эндотелиальных клеток-предшественников, и/или для стимуляции образования сосудов, и/или для терапии заболеваний, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, и/или для получения фармацевтических композиций для лечения таких заболеваний, а также фармацевтических композиций, которые включают в себя эритропоэтин и другие подходящие биологически активные вещества для стимуляции эндотелиальных клеток-предшественников у пациентов, которые обнаруживают а) по меньшей мере одну дисфункцию эндотелиальных клеток-предшественников и Ь) по меньшей мере один сердечно-сосудистый фактор риска, такой как гипертония, гиперхолестеринемия, инсулинорезистентность, гипергомоцистеинемия, повышенный уровень АЭМА, и с) по меньшей мере одно повреждение конечного органа, такое как гипертрофия левого желудочка, микроальбуминурия, когнитивная дисфункция, увеличение толщины внутренней оболочки (интимы)-средней оболочки (медии) сосудов в сонной артерии (А. сатойк), протеинурия или скорость гломерулярной (клубочковой) фильтрации (СРВ) <80 мл/мин, в частности 30, предпочтительно 40-80 мл/мин.

В связи с изобретением под эндотелиальными клетками-предшественниками (эндотелиальными клетками-предшественниками; ЕРС) понимают циркулирующие в кровотоке клетки, которые обладают способностью к дифференцировке в эндотелиальные клетки. В случае эндотелиальных клетокпредшественников, существующих во время эмбрионального развития, речь идет об ангиобластах. В случае эндотелиальных клеток-предшественников, существующих во взрослых организмах, речь идет об ангиобласт-подобных клетках, которые могут быть получены из мононуклеарных клеток, в частности СО34-СО14+-моноцитов и/или СО34+-стволовых клеток, которые выделены из периферической крови.

В связи с изобретением под мобилизацией или физиологической мобилизацией понимают процесс активации стволовых клеток и/или клеток-предшественников из костного мозга или из альтернативных ниш стволовых клеток факторами роста, причем стволовые клетки или клетки-предшественники попадают в кровоток, в частности в периферическую кровь.

В связи с изобретением под пролиферацией понимают способность клеток к увеличению и последующему делению на две или более дочерние клетки. Таким образом, ЕРО-опосредованная стимуляция эндотелиальных клеток-предшественников касается, в частности, количества и посредством этого поведения деления эндотелиальных клеток-предшественников.

В связи с изобретением под дифференцировкой эндотелиальных клеток-предшественников понимают развитие происходящих из костного мозга или происходящих из тканевых ниш мононуклеарных клеток через эндотелиальные клетки-предшественники в эндотелиальные клетки. Под эндотелиальными клетками понимают клетки, которые образуют эндотелий, т.е. однослойную клеточную выстилку сосудов и серозных полостей. Эндотелиальные клетки отличаются тем, что они высвобождают активные в отношении сосудов вещества, например расширяющие сосуды вещества, такие как ЕЭВР (происходящий из эндотелия фактор релаксации), или сжимающие сосуды вещества, такие как эндотелин, факторы для ингибирования или активации свертывания крови и факторы для регуляции проницаемости сосудов. Эн

- 7 015350 дотелиальные клетки синтезировали также компоненты субэндотелиальной соединительной ткани, в частности коллагены типа IV и V, белки клеточной адгезии, такие как ламинин, фибронектин и тромбоспондин, факторы роста, например, для клеток гладких мышц и факторы для новообразования сосудов.

В связи с изобретением под миграцией эндотелиальных клеток-предшественников понимают то, что находящиеся в кровотоке эндотелиальные клетки-предшественники перемещаются в направлении васкулогенного или ангиогенного стимула и концентрируются в области васкулогенного или ангиогенного стимула. Под васкулогенным стимулом понимают химический раздражитель в ткани или кровеносном сосуде тела человека или животного, который специфически действует на эндотелиальные клетки-предшественники и вызывает их перемещение к месту тела, из которого исходит этот химический раздражитель. Таким образом, посредством васкулогенного стимула индуцируется процесс васкулогенеза. Под ангиогенным стимулом понимают химический раздражитель в ткани или кровеносном сосуде тела человека или животного, который специфически действует на дифференцированные эндотелиальные клетки и вызывает их миграцию к месту тела, из которого исходит этот раздражитель. Таким образом, ангиогенный стимул вызывает индукцию ангиогенеза.

В следующем варианте осуществления изобретения предусмотрено применение эритропоэтина в низкой дозировке и/или его производных для повышения адгезионной способности дифференцирующихся эндотелиальных клеток-предшественников. Согласно изобретению эритропоэтин применяют, в частности, для улучшения способности эндотелиальных клеток-предшественников к адгезии, т.е. к межклеточной адгезии. Адгезия дифференцирующихся эндотелиальных клеток-предшественников или дифференцирующихся эндотелиальных клеток является одной из основных предпосылок к образованию новых сосудов или новой эндотелиальной ткани. Клеточная адгезия опосредована белковыми молекулами.

Изобретение относится также к применению эритропоэтина в низкой дозировке для стимуляции новообразования сосудов, в частности стимуляции васкулогенеза. В связи с изобретением под васкулогенезом понимают новообразование сосудов из дифференцирующихся ίη бШ эндотелиальных клетокпредшественников. Согласно изобретению посредством применения эритропоэтина в низкой дозировке достигается участие эндотелиальных клеток-предшественников в увеличенной степени в новообразовании сосудов или в локальном новообразовании сосудов для восстановления поврежденных участков сосудов. Согласно изобретению предусматривается также посредством применения эритропоэтина в низкой дозировке и/или его производных усиление образования новых кровеносных сосудов и/или замена поврежденных участков кровеносных сосудов.

В следующем варианте осуществления изобретения предусматривается применение эритропоэтина в низкой дозировке и/или его производных для стимуляции эндотелиальных клеток-предшественников к образованию эндотелиальной ткани.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения предусматривается применение эритропоэтина в низкой дозировке и/или его производных для терапии патологических состояний или заболеваний человека или животных, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клетокпредшественников, или их осложнений.

В связи с изобретением под терминами заболевания, болезненные (патологические) состояния или болезни понимают нарушения жизненных процессов в органах или в целом организме, следствием которых являются субъективно ощущаемые или объективно устанавливаемые телесные или психические изменения. Согласно изобретению речь идет, в частности, о заболеваниях, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, т. е. о заболеваниях, которые являются следствием подобной дисфункции этих клеток, или которые опосредованы этими клетками. Далее, под терминами заболевания, болезненные (патологические) состояния или болезни понимают нарушения жизненных процессов в органах или в целом организме, которые могут быть задержаны в их прогрессировании или, в частности, замедлены приемом эритропоэтина в низкой дозировке или подходящих активных веществ. Под осложнениями понимают вторичные заболевания, т.е. второе заболевание, добавляющееся к первичной картине заболевания.

В связи с изобретением под дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников понимают нарушение существенных клеточных функций, таких как производительность обмена веществ, отвечаемость на раздражители, подвижность, поведение деления или поведение дифференцировки этих клеток. Дисфункция эндотелиальных клеток-предшественников может, например, состоять в том, что эти клетки не пролиферируют или пролиферируют только в недостаточной степени. Поскольку посредством применения эритропоэтина пролиферация эндотелиальных клеток-предшественников стимулируется, благодаря этому может компенсироваться недостаточное поведение деления как эндотелиальных клетокпредшественников, так и уже дифференцированных эндотелиальных клеток и повышаться количество эндотелиальных клеток-предшественников или эндотелиальных клеток. Дисфункция эндотелиальных клеток-предшественников может, например, состоять в нарушенной способности этих клеток к дифференцировке в эндотелиальные клетки. Эта дисфункция эндотелиальных клеток-предшественников может быть также обусловлена их нарушенной способностью к адгезии и/или их нарушенной способностью к миграции в направлении ангиогенного или васкулогенного стимула. Такие дисфункции эндотелиальных клеток-предшественников могут приводить к тому, что, например, новообразование ткани эндотелия

- 8 015350 и/или васкулогенез будут нарушены или ингибированы. Дисфункция эндотелиальных клетокпредшественников может быть также обусловлена заболеванием, например гипертонией, гиперлипопротеинемией, повышенными уровнями ΆΌΜΆ в крови, уремией или диабетом. Дисфункция эндотелиальных клеток-предшественников может, например, выражаться в уменьшенном продуцировании N0 (=ΕΌΚΕ) ΝΟ-синтазами (N08) из Ь-аргинина, повышенном продуцировании эритропоэтина и/или в усиленном продуцировании адгезивных молекул, таких как 1САМ-1 и УСАМ-1.

Согласно изобретению в случае заболеваний, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, речь идет, в частности, о гиперхолестеринемии, сахарном диабете, инсулинорезистентности, опосредованных эндотелием хронических воспалительных заболеваниях, таких как воспаления сосудов, эндотелиоз, включая ретикулоэндотелиоз (ретикулез), атеросклероз, обусловленное старением сердечно-сосудистое заболевание, ишемические заболевания конечностей, болезнь Рейно, преэклампсия, индуцированная беременностью гипертония, хроническая или острая почечная недостаточность, в частности терминальная почечная недостаточность, ограничения функции почек со скоростями гломерулярной фильтрации 30-80 мл/мин, предпочтительно 40-80 мл/мин, микроальбуминурия, протеинурия, повышенные уровни АЭМА и раны, а также их осложнения.

Гиперхолестеринемия отличается повышенными концентрациями холестерина в крови. Наиболее частой формой первичных гиперхолестеринемий является полигенная гиперхолестеринемия. Вторичные гиперхолестеринемии возникают часто при сахарном диабете, нефротическом синдроме, гипотиреозе и заболеваниях печени.

Под сахарным диабетом понимают различные формы нарушений метаболизма глюкозы с различной этиологией и симптоматикой. За возникновение обусловленных сосудами диабетических осложнений ответственна, в частности, АСЕ-ВАСЕ-система. АСЕ (Абуаисеб С1усаИои Еибргобиск) (конечные продукты прогрессировавшего гликозилирования) возникают посредством ряда сложных реакций после продолжительного воздействия редуцирующих сахаров, например глюкозы, белков или липидов. Образование АСЕ имеет место во время нормальных процессов старения, а также в увеличенном размере при сахарном диабете и болезни Альцгеймера. В результате связывания АСЕ возникает окислительный стресс, активация фактора транскрипции ΝΡ-κΒ и посредством этого нарушение эндотелиального гомеостаза.

Под инсулинорезистентностью понимают нарушенную передачу сигнала в различных клетках тела, которые игнорируют физиологический каскад сигнала инсулина, и, следовательно, пораженные заболеванием пациенты не проявляют нормальный метаболизм глюкозы.

Опосредованные эндотелием хронические воспалительные заболевания являются заболеваниями или состояниями человека или животных, которые основаны на защитной реакции организма и его тканей на повреждающие раздражители, причем определенные сигнальные молекулы изменяют свойства эндотелиальных клеток, так что во взаимодействии с активацией других типов клеток лейкоциты остаются прикрепленными к эндотелиальным клеткам, в конце концов, проникают в ткань и там вызывают воспаление. Примером опосредованного эндотелием воспаления является лейкоцитарный васкулит. Центральную роль при активации опосредованного эндотелием воспалительного события играет фактор транскрипции ΝΡ-κΒ. Другой системой, которая приводит к возникновению опосредованных эндотелием воспалений, является система АСЕ-ВАСЕ.

Под эндотелиозом понимают дегенеративные и пролиферативные изменения эндотелия при простой (не-тромбопенической) пурпуре. Под ретикулоэндотелиозом понимают заболевания ретикулогистиоцитарной системы, такой как ретикулум, ретикулез, ретикулогистиоцитоз и болезнь ХендаКрисчена-Шюллера (липоидный гранулематоз).

Под болезнью Рейно понимают обусловленные вазоконстрикцией, т.е. сосудистыми судорогами, возникающие в виде приступов ишемические состояния, в основном в артериях пальцев. Первичная болезнь Рейно является чисто функциональным нарушением малых снабжающих сосудов кончиков пальцев, в то время как вторичная болезнь Рейно лежит в основе другого заболевания, например воспаления сосудов.

Преэклампсия является заболеванием эндотелия и сосудов организма матери и, по-видимому, следствием действия эндотелиотропных веществ из плаценты. Преэклампсия является полиорганным заболеванием, которое может привести к нарушениям функций многочисленных органов и может проявляться в многообразных симптомах. Типичные для этого заболевания нарушения кровоснабжения являются следствием повышенного сопротивления сосудов, которое может проявляться локально различным образом. Для преэклампсии считается доказанным, что центральным компонентом патогенеза является эндотелиальная дисфункция.

Под почечной недостаточностью в связи с изобретением понимают ограниченную способность почек к выделению содержащих мочевину веществ, причем в далеко зашедших стадиях утрачивается также способность регуляции содержания электролитов, воды и кислоты-основания домашнего хозяйства. Терминальная почечная недостаточность отличается разрушением экскреторной и эндокринной почечной функции.

- 9 015350

В случае почечной недостаточности в соответствии с изобретением может идти речь об острой почечной недостаточности, которую называют также отказом функционирования почек, шоковой почкой или шоковой анурией. Острая почечная недостаточность отличается неожиданной частичной или общей утратой экскреторной почечной функции как следствия большей частью обратимого повреждения почек. Причиной могут быть сниженное кровоснабжение в результате гиповолемии, гипотонии и дегидратации вследствие потерь крови (политравма (множественные повреждения), желудочно-кишечное или послеродовое кровотечение, большие операционные вмешательства на сердце, сосудах, брюшной полости или предстательной железе)), шок (инфаркт миокарда, эмболия), тяжелые инфекции (сепсис, перитонит, холецистит), гемолиз (гемолитически-уремический синдром, пароксизмальная гемоглобинурия, трансфузионный инцидент), миолиз (краш-синдром, рабдомиолиз, миозит, ожоги), потери воды и электролитов (массивная рвота, поносы, избыточное потение, острый панкреатит). Другими причинами могут быть нефротоксины, такие как экзогенные токсины, например анилин, производные гликоля, метанол и т. п., или эндогенные токсины, например миоглобин и оксалат. Дополнительными причинами острой недостаточности являются почечные заболевания, например воспалительные нефропатии или реакции отторжения после трансплантации почек. Острая почечная недостаточность может быть также вызвана задержкой мочи вследствие нарушений мочеиспускания. Лечение острой почечной недостаточности по данному изобретению эритропоэтином, предпочтительно в низкой дозировке, приводит в соответствии с изобретением к предотвращению или, по меньшей мере, уменьшению прогрессирования острой почечной недостаточности.

В случае почечной недостаточности в соответствии с изобретением речь может идти также о хронической почечной недостаточности. Причинами хронической почечной недостаточности являются сосудистые, гломерулярные и тубуло-интерстициальные заболевания почек, инфекции, а также врожденные или приобретенные дефекты структуры. Причинами хронической почечной недостаточности являются, среди прочего, хроническая гломерулопатия, хронический пиелонефрит, связанная с анальгетиками нефропатия, обструктивная уропатия, а также артерио- и артериолосклероз. Хроническая почечная недостаточность переходит терминально в уремию. Лечение хронической почечной недостаточности в соответствии с изобретением эритропоэтином в низкой дозировке приводит в соответствии с данным изобретением к уменьшению прогрессирования хронической почечной недостаточности.

Таким образом, изобретение относится, в частности, к применению ЕРО, предпочтительно в низкой дозировке, для получения лекарственного средства для предотвращения, уменьшения или замедления повреждения почечной ткани и/или регенерации поврежденной почечной ткани при острой или хронической почечной недостаточности.

Под ограничением почечной функции понимают согласно изобретению состояния, при которых скорость гломерулярной фильтрации уже уменьшается ниже 80 мл/мин. Ограничение функции почек относится также к ранней фазе гломерулярных, тубуло-интерстициальных, а также сосудистых заболеваний почек. Лечение ограничений почечной функции в соответствии с изобретением эритропоэтином в низкой дозировке приводит в соответствии с изобретением к уменьшению прогрессирования, а также к регенерации начинающегося нарушения ткани и/или функции почек.

В связи с изобретением под микроальбуминурией понимают картину заболевания, при которой пораженные заболеванием пациенты обнаруживают нефизиологическое выделение альбумина в моче, составляющее более чем 30 мг/24 ч. Это увеличенное выделение альбумина сопровождает в качестве раннего признака начинающееся ухудшение функции почек и является следствием первых патологических процессов распада в почке, сопровождающихся структурными изменениями архитектуры почки.

В связи с изобретением под протеинурией понимают заболевание, при котором пораженные заболеванием пациенты обнаруживают нефизиологическое выделение белков в моче, составляющее более чем 150 мг/24 ч. Это увеличенное выделение белка через мочу (>150 мг/24 ч) считается патологическим и требует дополнительного медицинского исследования и терапии.

В связи с изобретением под высокими показателями ΆΌΜΆ понимают картину заболевания, при которой пораженные заболеванием пациенты обнаруживают нефизиологические высокие концентрации в крови ΆΌΜΆ, составляющие более чем 1,3 мкмоль/л. Эта повышенная концентрация ΆΌΜΆ прогрессирует вместе с эндотелиальной дисфункцией и является следствием метаболических дисфункций в процессах распада или выделения этой молекулы.

В связи с изобретением под заживлением раны понимают физиологические процессы регенерации разрушенной ткани или закрытия раны, в частности новообразование соединительной ткани и капилляров. В случае заживления раны речь может идти о первичном заживлении раны (каиайо рег рйташ т!епйопет), которое отличается быстрым и неосложненным закрытием и значительным гекйшйо ай ш!едгит вследствие минимального новообразования соединительной ткани между хорошо снабжаемыми кровью и, в случае необходимости, адаптированными краями чистой раны. В случае ран с находящимися на большем расстоянии друг от друга, в частности с придавленными или некротическими краями, или с раневыми инфекциями, происходит замедленное заживление ран (каиайо рег кесипбат ш1еийоиет), при котором вследствие (а) бактериального воспаления происходит заполнение тканевых дефектов грануляционной тканью и расширенное образование рубцовой ткани. Эпителизация края завершает собой за

- 10 015350 живление раны. Заживление ран подразделяется на три фазы, а именно, латентную фазу, фазу пролиферации и фазу репарации. Латентная фаза вновь подразделяется на экссудативную фазу с образованием струпа, в частности в первые часы после возникновения раны, и резорбтивную фазу с катаболическим автолизом, которая распространяется на период времени от одного дня до трех дней после возникновения раны. Фаза пролиферации отличается анаболической репарацией с образованием коллагена фибробластами и наступает на четвертый-седьмой день после возникновения раны. С восьмого дня после возникновения раны наступает фаза репарации, которая отличается превращением грануляционной ткани в рубец.

Под термином рана в связи с изобретением понимают прерывание связи тканей тела с потерей или без потери веществ, которое вызвано механическим ранением или физически обусловленным повреждением клеток. В контексте изобретения рану называют также заболеванием. Формами ран являются механические раны, термические раны, химические раны, вызываемые облучением раны и вызываемые заболеванием раны. Механические раны возникают вследствие внешнего силового воздействия и появляются, прежде всего, в виде резаных и колотых ран, размозженных, ушибленных ран и ссадин, царапин и укусов и огнестрельных ран. Термические раны возникают под воздействием жары или холода. Химические раны возникают, в частности, вследствие прижигания кислотами или щелочами. Вызываемые облучением раны возникают, например, в результате воздействия актинического (содержащего много ультрафиолетовых лучей) или ионизирующего излучения. Появляющимися вследствие заболевания ранами являются, в частности, вызываемые застоем раны, травматические раны, диабетические раны и т.д. Согласно изобретению предусматривается применение для заживления ран эритропоэтина в низкой дозировке, предпочтительно местное или внутривенное.

Изобретение относится к применению эритропоэтина в низкой дозировке для терапии гиперхолестеринемии, сахарного диабета, инсулинорезистентности, опосредованных эндотелием хронических воспалительных заболеваний, эндотелиоза, в том числе, ретикулоэндотелиоза (ретикулеза), атеросклероза, обусловленных старением сердечно-сосудистых заболеваний, ишемических заболеваний конечностей, преэклампсии, болезни Рейно, заболеваний печени, таких как гепатит, цирроз печени, острая или хроническая недостаточность печени, болезней или повреждений костей и хрящей, заболеваний или повреждений слизистой оболочки, в частности, в желудочно-кишечном тракте, болезни Крона, ϋοΐίΐίδ и1сего§а (язвенного колита), индуцированной беременностью гипертонии, хронической или острой почечной недостаточности, в частности, терминальной почечной недостаточности, ограничений функции почек со скоростями гломерулярной фильтрации <80 мл/мин, в частности 30-80 мл/мин, предпочтительно 40-80 мл/мин, микроальбуминурии, протеинурии, повышенных уровней ΆΌΜΆ или ран и их осложнений.

В соответствии с изобретением предусматривается, что эритропоэтин вводят пациенту в терапевтически эффективной дозе, которая является достаточной для лечения состояния вышеуказанного заболевания, в частности заболевания, которое связано с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, или для предупреждения этого состояния, остановки прогрессирования такого заболевания и/или облегчения симптомов такого заболевания. Доза, которая должна вводиться пациенту, зависит от многих факторов, например от возраста, массы тела и пола пациента, тяжести заболевания и т. д.

Дозировка ЕРО в соответствии с изобретением.

В соответствии с изобретением эритропоэтин во всех применениях, способах и композициях согласно настоящему техническому решению предпочтительно используют в малых количествах, которые меньше известных обычно используемых количеств для терапии почечной анемии, причем в контексте настоящего технического решения под малой или низкой дозой или дозировкой, в частности, ίη νίνο, т.е. на пациента, понимают ЕРО-дозы 1-2000, предпочтительно 20-2000 единиц (МЕ; Международных единиц) в неделю, предпочтительно дозы 20-1500 МЕ в неделю, в частности дозы 20-1000 МЕ в неделю, в частности дозы 20-950 МЕ в неделю, в частности дозы 20-900 МЕ в неделю, в частности дозы 20-850 МЕ в неделю, в частности дозы 20-800 МЕ в неделю, в частности дозы 20-750 МЕ в неделю, в частности дозы 20-700 МЕ в неделю, в частности дозы 20-650 МЕ в неделю, в частности дозы 20-600 МЕ в неделю, в частности дозы 20-550 МЕ в неделю, в частности дозы 20-500 МЕ в неделю, в частности дозы 20-450 МЕ в неделю, в частности дозы 20-400 МЕ в неделю, в частности дозы 20-350 МЕ в неделю, в частности дозы 20-300 МЕ в неделю, в частности дозы 20-250 МЕ в неделю, в частности дозы 20-200 МЕ в неделю, в частности дозы 20-150 МЕ в неделю, в зависимости от тяжести заболевания и в зависимости от функции почек. В соответствии с изобретением предусматривается также применение доз 1-450, предпочтительно 1-9 МЕ в неделю. При всех вышеуказанных предусматриваемых по данному изобретению дозах, например 1-2000 единиц (МЕ) в неделю на пациента, в частности, например, 500-2000 МЕ в неделю на пациента, речь идет о субполицитемических дозах, то есть дозах, которые не приводят к повышению показателя гематокрита, в частности по сравнению с показателем гематокрита перед лечением ЕРО, и не приводят к повышению показателя гематокрита более чем на 10%, в частности 5%, предпочтительно 2%. Предусматриваемые в соответствии с изобретением субполицитемические дозы соответствуют недельным дозам приблизительно 1-90 единиц (МЕ) ЕРО/кг массы тела, в частности 1-45, в частности 1-30 МЕ ЕРО/кг массы тела, в частности 1-20 МЕ ЕРО/кг массы тела, в частности 1-15 МЕ ЕРО/кг массы тела, в частности 1-10 МЕ ЕРО/кг массы тела, в частности 1-4 МЕ ЕРО/кг массы тела, или сравнимой недельной дозе

- 11 015350 аранеспа 0,001-0,4 мкг/кг массы тела, 0,001-0,3 мкг/кг массы тела, 0,001-0,25 мкг/кг массы тела, 0,001-0,2 мкг/кг массы тела, 0,001-0,15 мкг/кг массы тела, 0,001-0,1 мкг/кг массы тела, 0,001-0,09 мкг/кг массы тела, 0,001-0,08 мкг/кг массы тела, 0,001-0,07 мкг/кг массы тела, 0,001-0,06 мкг/кг массы тела, 0,001-0,05 мкг/кг массы тела, 0,001-0,04 мкг/кг массы тела, 0,001-0,03 мкг/кг массы тела, 0,001-0,02 мкг/кг массы тела, 0,001-0,01 мкг/кг массы тела, 0,001-0,009 мкг/кг массы тела, 0,001-0,008 мкг/кг массы тела, 0,0010,007 мкг/кг массы тела, 0,001-0,006 мкг/кг массы тела, 0,001-0,005 мкг/кг массы тела, 0,001-0,004 мкг/кг массы тела, 0,001-0,003 мкг/кг массы тела, 0,001-0,002 мкг/кг массы тела. В случае аранеспа речь идет о дважды ПЭГилированном ЕРО.

В соответствии с изобретением особенно предпочтительно эритропоэтин используют во всех применениях, способах и композициях согласно настоящему техническому решению в малых количествах, которые меньше известных обычно используемых количеств для терапии почечной анемии, причем в контексте настоящего технического решения под малой или низкой дозой или дозировкой, в частности, ίη νίνο, т.е. на пациента, понимают ЕРО-дозы 0,001-90, предпочтительно 0,001-50 единиц (МЕ; Международных единиц) на килограмм массы тела в неделю, в частности дозы 0,05-45 МЕ/кг в неделю, в частности дозы 0,05-40 МЕ/кг в неделю, в частности дозы 0,05-35 МЕ/кг в неделю, в частности дозы 0,05-33 МЕ/кг в неделю, в частности дозы 0,05-31 МЕ/кг в неделю, в частности дозы 0,05-29 МЕ/кг в неделю, в частности дозы 0,05-27 МЕ/кг в неделю, в частности дозы 0,05-25 МЕ/кг в неделю, в частности дозы 0,05-23 МЕ/кг в неделю, в частности дозы 0,05-21 МЕ/кг в неделю, в частности дозы 0,05-20 МЕ/кг в неделю, в частности дозы 0,05-19 МЕ/кг в неделю, в частности дозы 0,05-17 МЕ/кг в неделю, в частности дозы 0,05-15 МЕ/кг в неделю, в частности дозы 0,05-13 МЕ/кг в неделю, в частности дозы 0,05-11 МЕ/кг в неделю, в частности дозы 0,05-9 МЕ/кг в неделю, в частности дозы 0,05-7 МЕ/кг в неделю, в частности дозы 0,05-5 МЕ/кг в неделю, в частности дозы 0,05-3 МЕ/кг в неделю, в частности дозы 0,05-1 МЕ/кг в неделю, в зависимости от тяжести заболевания и в зависимости от функции почек. В соответствии с изобретением предусматривается также применение доз 0,001-20, предпочтительно 0,05-10 МЕ/кг в неделю. При всех вышеуказанных предусматриваемых по изобретению дозах, например 0,01-90 единиц (МЕ)/кг в неделю и на пациента, в частности, например, 0,01-50 единиц МЕ/кг в неделю и на пациента, речь идет о субполицитемических дозах, то есть дозах, которые не приводят к повышению показателя гематокрита, в частности по сравнению с показателем гематокрита перед лечением ЕРО, к повышению показателя гематокрита более чем на 10%, в частности 5%, предпочтительно 2%. Предусматриваемые в соответствии с изобретением субполицитемические дозы соответствуют недельным дозам приблизительно 0,001-90 единиц (МЕ) ЕРО/кг массы тела, в частности 0,001-50, в частности 0,001-45 МЕ ЕРО/кг массы тела, в частности 1-15 МЕ ЕРО/кг массы тела, в частности 1-10 МЕ ЕРО/кг массы тела, в частности 1-4 МЕ ЕРО/кг массы тела или сравнимой недельной дозе аранеспа 0,000005-0,45 мкг на килограмм массы тела, 0,00025-0,250 мкг/кг массы тела, 0,00025-0,225 мкг/кг массы тела, 0,00025-0,2 мкг/кг массы тела, 0,000250,175 мкг/кг массы тела, 0,00025-0,165 мкг/кг массы тела, 0,00025-155 мкг/кг массы тела, 0,00025-0,145 мкг/кг мкг/кг мкг/кг мкг/кг мкг/кг речь идет о дважды ПЭГилированном ЕРО. Вышеуказанные малые дозы, например доза 0,001-90 единиц/кг в неделю на пациента, в частности, например, 0,001-50 единиц/кг в неделю на пациента, которая предусматривается для лечения заболеваний или патологических состояний, которые сопутствуют дисфункции эндотелиальных клеток-предшественников, являются очень низкими по сравнению с обычно используемой для терапии почечной анемии начальной дозой 90-150 МЕ/кг массы тела в неделю (как правило начинающейся с 4000-8000 МЕ в неделю, но при неудовлетворительном результате терапии более высокой).

Приведенные дозировки, если не указано иное, являются разовыми дозами, которые должны вводиться один раз в неделю, но могут быть также разделены на несколько отдельных доз в одной неделе, тела, 0,00025-0,135 тела, 0,00025-0,105 тела, 0,00025-0,075 тела, 0,00025-0,045 мкг/кг мкг/кг мкг/кг мкг/кг массы массы массы массы тела, 0,00025-0,125 тела, 0,00025-0,095 тела, 0,00025-0,065 тела, 0,00025-0,035 мкг/кг мкг/кг мкг/кг мкг/кг массы массы массы массы тела, тела, тела, тела,

0,00025-0,115

0,00025-0,085

0,00025-0,055

0,00025-0,025 массы массы массы массы массы тела, 0,00025-0,015 мкг/кг массы тела, 0,00025-0,005 мкг/кг массы тела. В случае аранеспа следовательно, применяться в виде многократного введения доз.

Один особенно предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к применению эритропоэтина в низкой дозировке, определенной в предыдущем разделе как Дозировка ЕРО в соответствии с изобретением, и/или его производных в качестве активного вещества для получения фармацевтической композиции или лекарственного средства для терапии патологических состояний или заболеваний, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников.

В соответствии с изобретением под активным веществом понимают аутогенное (свойственное организму) или чужеродное вещество, которое при контакте с молекулой-мишенью или клеткамимишенями или тканями-мишенями влияет на специфические функции тканей, органов или организмов дифференцированным образом. В соответствии с изобретением эритропоэтин в качестве активного вещества фармацевтической композиции по изобретению при контакте с эндотелиальными клеткамипредшественниками влияет на их поведение пролиферации, дифференцировки и/или миграции в организме человека или животного таким образом, что дисфункции эндотелиальных клеток-предшествен- 12 015350 ников могут компенсироваться, и возникающие вследствие этих дисфункций заболевания могут излечиваться, ослабляться или устраняться, или эти заболевания могут эффективно предотвращаться, а также приводит как к регенерации органов, так и к замедлению прогрессирования ограничений функции в различных органах и системах органов.

В связи с изобретением под фармацевтической композицией или лекарственным средством понимают смесь, которая может быть использована для диагностических, терапевтических и/или профилактических целей, следовательно, стимулирующую или восстанавливающую здоровье человека или животного, которая включает в себя по меньшей мере одно природное или полученное синтетически активное вещество, которое вызывает терапевтическое действие. Фармацевтическая композиция может быть как твердой, так и жидкой смесью. Например, фармацевтическая композиция, включающая в себя активное вещество, может содержать один или несколько фармацевтически приемлемых компонентов. Кроме того, фармацевтическая композиция может включать в себя обычно используемые в данной области дополнительные вещества, например стабилизаторы, средства, облегчающие приготовление, смазывающие вещества, дезинтеграторы, эмульгаторы или другие, обычно используемые для получения фармацевтической композиции вещества.

В соответствии с данным изобретением предусматривается, в частности, применение эритропоэтина, предпочтительно в низкой дозировке, и/или его производного в качестве активного вещества для получения лекарственного средства для терапии гиперхолестеринемии, сахарного диабета, инсулинорезистентности, опосредованных эндотелием хронических воспалительных заболеваний, таких как воспаления сосудов, эндотелиоза, в том числе ретикулоэндотелиоза (ретикулеза), атеросклероза, обусловленных старением сердечно-сосудистых заболеваний, ишемических заболеваний конечностей, болезни Рейно, заболеваний печени, таких как гепатит, цирроз печени, острая или хроническая недостаточность печени, болезней или повреждений костей и хрящей, заболеваний или повреждений слизистой оболочки, в частности, в желудочно-кишечном тракте, болезни Крона, язвенного колита (Со1йк и1сето8а), индуцированной беременностью гипертонии, хронической или острой почечной недостаточности, в частности терминальной почечной недостаточности, ограничений функции почек со скоростями гломерулярной фильтрации <80 мл/мин, в частности, 30, предпочтительно 40-80 мл/мин, микроальбуминурии, протеинурии, повышенных уровней ΆΌΜΆ или ран, а также их осложнений.

Фармацевтическая композиция по изобретению может быть пригодной как для местного, так и для системного введения.

В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения предусматривается, что фармацевтическая композиция используется для парентерального, в частности внутривенного, внутримышечного, внутрикожного или подкожного введения. Предпочтительно содержащее эритропоэтин лекарственное средство находится в форме инъекционного раствора или инфузионного раствора.

В следующем применении предусматривается, что содержащую эритропоэтин фармацевтическую композицию вводят перорально. Например, содержащее эритропоэтин лекарственное средство вводят в жидкой форме применения, такой как раствор, суспензия или эмульсия, или в твердой форме применения, такой как таблетка.

В следующем применении предусматривается, что эта фармацевтическая композиция пригодна для легочного введения или для ингаляции. Таким образом, в соответствии с изобретением предусматривается, что эритропоэтин терапевтически эффективным образом вводят непосредственно в легкие пациента. Эта форма введения эритропоэтина делает возможной быструю передачу дозы эритропоэтина пациенту без необходимости проведения инъекции. При поглощении эритропоэтина через легкие повышенные количества эритропоэтина могут передаваться через легкое в кровоток, что приводит к увеличенным количествам эритропоэтина в кровотоке. В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, в случае поглощаемой через легкое фармацевтической композиции, речь идет о водном или неводном растворе или о сухом порошке. При составлении вводимого легочным путем содержащего эритропоэтин лекарственного средства в форме сухого порошка этот порошок включает в себя предпочтительно содержащие эритропоэтин частицы, причем эти частицы имеют диаметр менее чем 10 мкм, так что это лекарственное средство может достигать также и дистальных областей легкого пациента. В одном особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения предусматривается, что подлежащее легочному введению лекарственное средство составляют в форме аэрозоля.

Один особенно предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к применению эритропоэтина для получения фармацевтической композиции для терапии заболеваний, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, причем эта фармацевтическая композиция, наряду с эритропоэтином в качестве активного вещества, содержит по меньшей мере одно дополнительное активное вещество для стимуляции эндотелиальных клеток-предшественников.

В случае дополнительного активного вещества предпочтительно речь идет об активном веществе, которое, в частности, стимулирует физиологическую мобилизацию эндотелиальных клеток-предшественников из костного мозга или других ниш стволовых клеток. Согласно изобретению в случае дополнительного активного вещества речь может идти также об активном веществе, которое, в частности, стимулирует деление, а также пролиферацию эндотелиальных клеток-предшественников. Однако

- 13 015350 существует также возможность, что это дополнительное активное вещество стимулирует, в частности, поведение дифференцировки и/или поведение миграции эндотелиальных клеток-предшественников. Особенно предпочтительно речь идет в случае дополнительного стимулирующего эндотелиальные клетки-предшественники активного вещества о УЕСЕ, Р1СЕ, СМ-С8Е, ингибиторе НМС-СоА-редуктазы, в частности о статине, таком как симвастатин, мевастатин или аторвастатин, ингибиторе АСЕ, таком как эналаприл, рамиприл или трандолаприл, АТ-1-блокаторе, таком как ирбесартан, лорсартан или олмесаратан, и/или о доноре N0, в частности Ь-аргинине.

В соответствии с изобретением предусматривается также, что по меньшей мере одно дополнительное активное вещество стимулирует особенно дифференцированные эндотелиальные клетки, т.е. их пролиферацию и/или миграцию, но не эндотелиальные клетки-предшественники. Особенно предпочтительно, речь идет при этом о ВЕСЕ (основном факторе роста фибробластов) или ангиогенине.

Следующий вариант осуществления изобретения относится к применению эритропоэтина и/или его производных в качестве активного вещества для получения фармацевтической композиции для стимуляции эндотелиальных клеток-предшественников, в частности для стимуляции мобилизации, пролиферации, дифференцировки в эндотелиальные клетки и/или миграции в направлении васкулогенного или ангиогенного стимула. Кроме того, согласно изобретению предусматривается применение эритропоэтина и/или его производных в качестве активного вещества для получения фармацевтической композиции для стимуляции васкулогенеза и/или образования эндотелия, в частности во взрослом организме человека или животного.

Таким образом, изобретение относится также к фармацевтическим композициям для стимуляции эндотелиальных клеток-предшественников, в частности для стимуляции их мобилизации, пролиферации, дифференцировки в эндотелиальные клетки и/или миграции в направлении васкулогенного или ангиогенного стимула, для стимуляции васкулогенеза и/или образования эндотелия и для лечения заболеваний человека или животного, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников и/или эндотелиальных клеток. В частности, изобретение относится к фармацевтическим композициям или лекарственным средствам, которые включают в себя эритропоэтин в качестве активного вещества и по меньшей мере одно дополнительное активное вещество для стимуляции эндотелиальных клетокпредшественников и/или дифференцированных эндотелиальных клеток. В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к фармацевтическим композициям, которые включают в себя эритропоэтин и по меньшей мере одно дополнительное активное вещество, выбранное из группы, состоящей из УЕСЕ, Р1СЕ, СМ-С8Е, ингибитора НМС-СоА-редуктазы, в частности, статина, такого как симвастатин, мевастатин или аторвастатин, ингибитора АСЕ, такого как эналаприл, рамиприл или трандолаприл, АТ-1-блокатора, такого как ирбесартан, лорсартан или олмесаратан, и/или донора N0, в частности Ь-аргинина, ВЕСЕ и ангиогенина.

Следующий предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к применению эритропоэтина для получения трансплантируемого препарата эндотелиальных клеток. При этом в соответствии с изобретением, в частности, предусматривается, что эндотелиальные клетки получают ίη уйго культивированием эндотелиальных клеток-предшественников в присутствии эритропоэтина и затем трансплантируют в организм-реципиент, в частности организм, который страдает от заболевания, которое связано с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников. Например, мононуклеарные клетки (МNС) могут быть выделены из крови центрифугированием в градиенте плотности и культивированы в подходящих культуральных средах. Способы выделения и культивирования ίη уйго мононуклеарных клеток описаны, например, в АкаВага, 8с1епсе, 275 (1997), 964-967; Э|ттс1сг с1 а1., Т С1ш. Ιηνβδΐ., 108 (2001), 391-397 и Ь^або! е1 а1., 1. С1ш. Втсей., 108 (2001), 399-405. После этого мононуклеарные клетки культивируют дополнительно в присутствии эритропоэтина для стимуляции содержащихся в МNС эндотелиальных клеток-предшественников в отношении их поведения пролиферации и дифференцировки и, в частности, повышения количества дифференцированных прикрепленных эндотелиальных клеток. Согласно изобретению предусматривается, что культивирование МNС происходит в присутствии эритропоэтина и по меньшей мере одного дополнительного вещества, которое стимулирует пролиферацию и дифференцировку эндотелиальных клеток-предшественников.

Особенно предпочтительным в качестве дополнительного активного вещества является УЕСЕ, Р1СЕ, СМ-С8Е, донор N0, такой как Ь-аргинин, АСЕ-ингибитор, такой как эналаприл, рамиприл или трандолаприл, АТ-1-блокатор, такой как ирбесартан, лорсартан или олмесаратан, или ингибитор НМССоА-редуктазы, такой как симвастатин, мевастатин или аторвастатин.

В следующем предпочтительном варианте осуществления предусматривается назначение эритропоэтина в низкой дозировке, приспособленное к его природному циркадному ритму. Эндогенное продуцирование эритропоэтина имеет у человека акрофазу (суточный максимум) под вечер, поэтому эритропоэтин в низкой дозировке должен назначаться предпочтительно в первой половине дня, в частности в период времени от 6:00 до 10:00 для достижения максимального биологического эффекта.

Другие предпочтительные варианты осуществления данного изобретения будут очевидными из зависимых пунктов формулы изобретения.

Настоящее изобретение объясняется более подробно при помощи следующих фигур и примеров.

- 14 015350

Фиг. 1 показывает результаты РАС8-анализа циркулирующих СЭ34+-стволовых клеток (с8С). (АΌ): пробы пациентов; (Е-Р): изотипические контроли. с8С идентифицировали с использованием дополнительной экспрессии СИ34-маркеров (В и Р) с использованием характерной низкой-средней экспрессии СИ45-антигена (С и О) и с использованием характерных свойств светорассеяния (Ό и Н). Абсолютное количество с8С рассчитывали на 100000 моно- и лимфоцитов.

Фиг. 2 показывает результаты количественного определения циркулирующих стволовых клеток при помощи проточной цитометрии. Эта фигура показывает зависимое от времени действие обработки эритропоэтином с использованием гйЕРО (рекомбинантного эритропоэтина человека) после 0, 2, 4, 6 и 8 недель. п=11, показатели соответствуют средним величинам ± стандартное отклонение. Медиана изображена в виде линии. *: р <0,01 в сравнении с 2 неделями; ψ: р <0,05 в сравнении с 4 неделями; #: р <0,05 в сравнении с 8 неделями.

Фиг. 3 показывает количественное определение культивируемых эндотелиальных клеток-предшественников (ЕРС). Эта фигура показывает, что обработка с использованием гйЕРО повышает относительное количество ЕРС. ЕРС выделяли перед обработкой пациентов с почечной недостаточностью гйЕРО, а также спустя 2, 4, 6 и 8 недель после обработки гйЕРО, и характеризовали с использованием их адгезионной способности и обоих маркеров Р1ТС асПЬ-ΌίΙ и ИЕА-1. п=11, показатели соответствуют средним величинам ± стандартное отклонение. Медиана изображена в виде линии. *: р <0,01 в сравнении с периодом перед обработкой; #: р <0,001 в сравнении с периодом перед обработкой.

Фиг. 4 показывает количественное определение культивируемых эндотелиальных клетокпредшественников (ЕРС). Эта фигура показывает, что абсолютное количество ЕРС перед началом гйЕРО-терапии значимо уменьшалось по сравнению со здоровыми соответствующими по возрасту и полу пробандами. Пациенты с почечной анемией обнаруживают, следовательно, явную ЕРС-дисфункцию относительно контрольных субъектов. Спустя 8 недель после начала гйЕРО-терапии в отношении почечной анемии это уменьшенное количество функциональных ЕРС компенсируется. ЕРС выделяли перед обработкой пациентов с почечной анемией гйЕРО, а также спустя 2, 4, 6 и 8 недель после обработки пациентов г11ЕРО. и характеризовали при помощи их адгезионной способности и обоих маркеров Р1ТС асИЕ-ΟίΙ и ИЕА-1. п=11. В качестве примера изображен 8-недельный ход и общие контроли. С одной стороны, абсолютные показатели представлены в виде отдельных значений. Дополнительно представлены диаграммы в виде блоков (90-ый/75-ый/50-ый/25-ый и 10-ый процентили, а также среднее значение). В качестве здоровых контролей служили соответствующие по возрасту и полу пробанды, у которых аналогичным образом выделяли и характеризовали ЕРС (п=11).

Фиг. 5 показывает количественное определение культивируемых эндотелиальных клеток-предшественников (ЕРС) у здоровых молодых пробандов. Эта фигура показывает, что обработка с использованием гйЕРО (30 МЕ эпоэтина бета на кг массы тела в неделю) повышает относительное количество ЕРС. ЕРС выделяли перед обработкой пробандов гйЕРО, а также спустя 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7 недель после обработки пробандов гйЕРО, и характеризовали с использованием их адгезионной способности и обоих маркеров Р1ТС асИЕ-ΟίΙ и ИЕА-1. п=4, показатели соответствуют средним величинам ± стандартное отклонение.

Фиг. 6 показывает количественное определение культивируемых эндотелиальных клеток-предшественников (ЕРС). Репрезентативные фотографии показывают, что абсолютное количество ЕРС у уремических пациентов значимо уменьшается относительно соответствующих по возрасту и полу пробандов (верхний ряд: ш νίνο). Пациенты с ограниченной функцией почек обнаруживают, следовательно, явную ЕРС-дисфункцию относительно контрольных лиц. При совместном культивировании эндотелиальных клеток-предшественников здорового пробанда с сывороткой уремических пациентов способность к дифференцировке его эндотелиальных клеток-предшественников уменьшается (нижний ряд: ш νίίτο). Таким образом, ограниченная почечная функция с происходящей из нее уремией приводит к дисфункции эндотелиальных клеток-предшественников.

Фиг. 7 показывает количественное определение культивируемых эндотелиальных клеток-предшественников (ЕРС) у 46 уремических пациентов с ограниченной функцией почек в сравнении с 46 соответствующими по возрасту и полу пробандами, представленное как диаграммы в виде блоков (90ый/75-ый/50-ый/25-ый и 10-ый процентили, а также среднее значение). При этом количество эндотелиальных клеток-предшественников является значимо уменьшенным у уремических пациентов относительно здоровых пробандов. Пациенты с ограниченной функцией почек обнаруживают, следовательно, явную ЕРС-дисфункцию относительно контрольных лиц.

Фиг. 8 показывает действие эритропоэтина на заживление ран. Эта фигура показывает, что при обработке эритропоэтином стандартизованной раны кожи, которая была нанесена при помощи штампа для тканей, эта рана уже после семи-восьми дней была полностью закрытой, в то время как при обработке физиологическим раствором хлорида натрия (солевым раствором) эта рана лишь после тринадцатичетырнадцати дней была полностью закрытой. Обработка эритропоэтином или физиологическим раствором хлорида натрия начиналась за 7 дней перед нанесением кожной раны. Рекомбинанты эритропоэтина человека вводили один раз в неделю подкожной (к.с.) инъекцией (0,1 мг/кг аранеспа) (на группу п = 5).

- 15 015350

Фиг. 9 показывает, что эритропоэтин уменьшает потерю почечной функции после острого прекращения функционирования почек (острой недостаточности почек). В исследование включали крыс Бргадие-Эает1еу (250-300 г). Этих крыс наркотизировали кетамином (120 мг/кг) и ромпуном (10 мг/кг). Одна из опытных групп получала 0,1 мкг/кг массы тела аранеспа один раз в день перед индукцией острого прекращения функционирования почек. В качестве сравнения использовали группу опытных животных, которым в каждом случае одновременно инъецировали подкожно (к.с.) хлорид натрия. После помещения артериального зажима на правую почечную артерию приток крови в почку прерывался на 45 мин. В это время проводили левостороннюю нефрэктомию. Ложную операцию проводили в дополнительной контрольной группе. При этом открывали брюшную полость, высвобождали левую почечную артерию, однако кровоснабжение не прерывали, и извлекали противолежащую правую почку. Всех животных наркотизировали в течение 60 мин и умерщвляли спустя 24 ч после операции. 45-Минутная ишемия с последующей реперфузией оставшейся правой почки приводила у обработанных хлоридом натрия животных к массивной острой утрате почечной функции. Это отражается в показателе сывороточного креатинина, который спустя 24 ч после ишемии-реперфузии в 7 раз выше, чем этот показатель перед ишемиейреперфузией (р <0,05). В противоположность этому, обработанные аналогом эритропоэтина аранеспом животные показали только четырехкратное повышение показателей сывороточного креатинина после индукции ишемического-реперфузионного повреждения. У левосторонне нефрэктомированных животных с ложной операцией правой почки не происходило повышение ретенционных показателей. Эта фигура показывает концентрацию креатинина в сыворотке ЕРО-обработанных животных (ΙΚ + ЕРО), ЫаС1обработанных животных (ΙΚ) и ложнооперированных животных (8сйет-ОР) перед индуцированным ишемией-реперфузией (1К)-повреждением и спустя 24 ч. Из этой фигуры видно, что сывороточная концентрация креатинина у обработанных аранеспом животных спустя 24 ч после повреждения ишемиейреперфузией почти вдвое меньше, чем в контролях (ЫаСГобработка).

Фиг. 10 показывает кривые выживаемости Каплана-Майера для двух опытных групп после индукции хронической почечной недостаточности, которые обрабатывали аранеспом или ЫаС1. В это исследование включали 8-недельных крыс 8ргадие-Оает1еу. Этих крыс наркотизировали кетамином (120 мг/кг) и ромпуном (10 мг/кг). В день 0 у них извлекали правую почку, которую немедленно после извлечения фиксировали в формалине для гистологического исследования. У левой почки лигировали сегментарные артерии, которые снабжают верхний и нижний полюс почки. Вследствие этого происходит инфаркт почки в соответствующих областях почки, и только средняя треть почки остается функциональной. Один раз в неделю эти крысы получали аранесп (0,1 мкг/кг массы тела) или ЫаС1 подкожной (к.с.) инъекцией. Обработанные аналогом эритропоэтина аранеспом животные обнаруживали значимое преимущество выживания относительно обработанных хлоридом натрия животных (р = 0,027; логарифмический ранговый критерий).

Фиг. 11-18 показывают срезы почек в световом микроскопе спустя 6 недель после индукции хронической почечной недостаточности двух опытных групп, которые были обработаны либо аранеспом, либо ЫаС1, и их кривые выживания Каплана-Майера представлены на фиг. 10.

Фиг. 11 показывает гистологические изменения у одной крысы Бргадие-ОаМеу с хронической почечной недостаточностью в каждом случае после ЫаС1-обработки один раз в неделю, начинающейся сразу же после индукции хронической почечной недостаточности, в период времени 6 недель. Хроническая почечная недостаточность возникает вследствие удаления правой почки и лигирования сегментарных артерий, которые снабжают верхний и нижний полюс почки, левой почки. Эта фигура показывает прегломерулярную артерию средней величины с характерной, подобной луковичной чешуе пролиферацией стенки сосуда при тяжелом гипертензивном повреждении, так называемом злокачественном нефросклерозе с эндартериитом Фара.

Фиг. 12 показывает гистологические изменения у одной крысы Бргадие-ОаМеу с хронической почечной недостаточностью в каждом случае после №1С.'1-обработки один раз в неделю, начинающейся сразу же после индукции хронической почечной недостаточности, в период времени 6 недель. Хроническая почечная недостаточность возникает вследствие удаления правой почки и лигирования сегментарных артерий, которые снабжают верхний и нижний полюс почки, левой почки. Эта фигура показывает активный очаговый сегментарный гломерулосклероз в виде так называемого пролиферативного Р8О8 (клубочек справа). Другой клубочек (слева) показывает ишемический коллапс упаковки петель. В нижней части этого изображения можно видеть небольшой сосуд с тяжелыми повреждениями эндотелия. Наблюдаемые гистологические изменения соответствуют гипертензивному повреждению органа или повреждениям в рамках тяжелой нефропатии после нефрэктомии 5/6.

Фиг. 13 показывает гистологические изменения у одной крысы Бргадие-ОаМеу с хронической почечной недостаточностью в каждом случае после №1С1-обработки один раз в неделю, начинающейся сразу же после индукции хронической почечной недостаточности, в период времени 6 недель. Хроническая почечная недостаточность возникает вследствие удаления правой почки и лигирования сегментарных артерий, которые снабжают верхний и нижний полюс почки, левой почки. Эта фигура показывает почти полный склероз или почти полную деструкцию компенсаторно увеличенного клубочка с явно выраженным гиалинозом или фибриноидным некрозом релевантных афферентных артериол.

- 16 015350

Фиг. 14 показывает гистологические изменения у одной крысы 8ргадие-ОаМеу с хронической почечной недостаточностью в каждом случае после ЫаС1-обработки один раз в неделю, начинающейся сразу же после индукции хронической почечной недостаточности, в период времени 6 недель. Хроническая почечная недостаточность возникает вследствие удаления правой почки и лигирования сегментарных артерий, которые снабжают верхний и нижний полюс почки, левой почки. Эта фигура показывает малую прегломерулярную артерию с характерной, подобной чешуе лука пролиферацией стенки сосуда и некрозом стенки сосуда при тяжелом гипертензивном повреждении, так называемом злокачественном нефросклерозе (сравн. изображение справа). Слева можно видеть подлинную (еще) не поврежденную артериолу.

Фиг. 15 показывает гистологические изменения у одной крысы 8ргадие-ОаМеу с хронической почечной недостаточностью в каждом случае после обработки аранеспом (ЕРО) (0,1 мкг/кг аранеспа) один раз в неделю, начинающейся сразу же после индукции хронической почечной недостаточности, в период времени 6 недель. Хроническая почечная недостаточность возникает вследствие удаления правой почки и лигирования сегментарных артерий, которые снабжают верхний и нижний полюс почки, левой почки. Эта фигура показывает подлинный клубочек с тонким афферентным сосудом. В интерстициальном пространстве канальца не установлено никакого патологического результата.

Фиг. 16 показывает гистологические изменения у одной крысы 8ргадие-ОаМеу с хронической почечной недостаточностью в каждом случае после обработки аранеспом (ЕРО) (0,1 мкг/кг аранеспа) один раз в неделю, начинающейся сразу же после индукции хронической почечной недостаточности, в период времени 6 недель. Хроническая почечная недостаточность возникает вследствие удаления правой почки и лигирования сегментарных артерий, которые снабжают верхний и нижний полюс почки, левой почки. Эта фигура показывает подлинный клубочек с тонким афферентным сосудом (увеличение 630х). В интерстициальном пространстве канальца не установлено никакого патологического результата.

Фиг. 17 показывает гистологические изменения у одной крысы 8ргадие-ОаМеу с хронической почечной недостаточностью в каждом случае после обработки аранеспом (ЕРО) (0,1 мкг/кг аранеспа) один раз в неделю, начинающейся сразу же после индукции хронической почечной недостаточности, в период времени 6 недель. Хроническая почечная недостаточность возникает вследствие удаления правой почки и лигирования сегментарных артерий, которые снабжают верхний и нижний полюс почки, левой почки. Эта фигура показывает подлинный клубочек с тонким афферентным сосудом. В интерстициальном пространстве канальца не установлено никакого патологического результата.

Фиг. 18 показывает гистологические изменения у одной крысы 8ргадие-ОаМеу с хронической почечной недостаточностью в каждом случае после обработки аранеспом (ЕРО) (0,1 мкг/кг аранеспа) один раз в неделю, начинающейся сразу же после индукции хронической почечной недостаточности, в периоде времени 6 недель. Хроническая почечная недостаточность возникает вследствие удаления правой почки и лигирования сегментарных артерий, которые снабжают верхний и нижний полюс почки, левой почки. Эта фигура показывает подлинный клубочек с тонким афферентным сосудом (увеличение 630х). В интерстициальном пространстве канальца не установлено никакого патологического результата.

Фиг. 19 показывает действие ЕРО на процесс заживления раны.

Пример 1. Действие ЕРО у пациентов с почечной анемией.

Исследовали действие эритропоэтина у пациентов с почечной анемией (НЬ <10,5 г/дл) как следствия заболевания почек в конечной стадии (претерминальная почечная недостаточность; клиренс креатинина <35 мл/мин). 11 пациентов обрабатывали на протяжении периода по меньшей мере 8 недель эритропоэтином в недельных дозах в среднем 5000 МЕ гйЕРО (рекомбинантного человеческого эритропоэтина) внутривенно или подкожно. После обработки эритропоэтином исследовали эндотелиальные клетки-предшественники в крови пациентов на протяжении периода 20 недель, причем после 0, 2, 4, 6 и 8 недель эндотелиальные клетки-предшественники анализировали в отношении их количества, а также в отношении их статуса дифференцировки с помощью проточной цитометрии и теста в культуре.

В случае циркулирующих стволовых клеток крови (СРВ8С) речь идет о небольшой популяции клеток, которые экспрессируют как СП34-антиген, так и СО45-антиген. На основе 18НАСЕ-линий наводки был разработан тест для определения количества СРВ8С при помощи проточной цитометрии (8ι.ι11^Γΐηη6 е1 а1., 1. Нета1о1йет., 5 (1996), 213-226). С использованием этого теста определяли как распределение экспрессии ί.Ό34- и СО45-клеток, так и морфологию стволовых клеток. Таким образом определяли как абсолютное количество СРВ8С на мкл, так и процентную долю СРВ8С в общем количестве лейкоцитов.

Фиг. 1 показывает результаты ЕАС8-анализа циркулирующих СО34+-стволовых клеток на основе 18НАСЕ-линий наводки.

Фиг. 2 показывает количество полученных с помощью ЕАС8-анализа СО34+-стволовых клеток на протяжении периода 8 недель.

Тест культуры клеток

Мононуклеарные периферические клетки крови (РВМС) выделяли с помощью центрифугирования в градиенте плотности через фиколл из проб крови человека в соответствии со способом, описанным в Акайага, 8с1спсс, 275 (1997), 964-967. Клетки высевали на культуральные чашки с фибронектином и под

- 17 015350 держивали в базальной среде ЕС. Базальная среда ЕС состоит из базальной среды ЕВМ-2 (Еа. С1опебсб) и ЕСМ-2 ^иоΐ8 (БЕСЕ; СЛ-1000 (гентамицин, амфотерицин-В), ФТС, УЕСЕ, БЕСЕ-В (с гепарином), К31СЕ-1, аскорбиновая кислота, гепарин). После 4-дневного культивирования не прикрепившиеся клетки удаляли промыванием чашки. Оставшиеся прикрепленные клетки обрабатывали трипсином и снова высевали. После этого их культивировали в течение следующих 3 дней. Клетки с эндотелиальным фенотипом идентифицировали по положительному окрашиванию на два различных маркера эндотелиальных клеток в день 7 после выделения. При этом речь идет о Όίΐ-меченом ацетилированном липопротеине низкой плотности (асЬПЬ-ϋΐΙ) и и1ех еигораеи8-Лд1ибп1п-1 (ИЕЛ-1). Результаты этого исследования представлены на фиг. 3.

Эти результаты показывают, что эритропоэтин может мобилизировать эндотелиальные клеткипредшественники и повышать количество циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественников. При этом функциональные дефициты, которые проявляются при определенных патологических состояниях, таких как почечная анемия, компенсируются. Эти результаты представлены на фиг. 4.

С помощью проточной цитометрии было обнаружено, что у пациентов с заболеванием почек в конечной стадии количество циркулирующих СО34+-стволовых клеток соответствует количеству циркулирующих С34+-стволовых клеток в крови здоровых пробандов. После начала обработки эритропоэтином количество СО34+-стволовых клеток в кровотоке повышается значимо более чем на 50%. С использованием теста культуры клеток было определено, что после обработки эритропоэтином количество клеток, которые развивают эндотелиальный фенотип, разительно повышается. В функциональном тесте культуры клеток сильно нарушенная способность эндотелиальных клеток-предшественников повышалась более чем в 3 раза.

Пример 2. Улучшенное заживление ран посредством системного применения гБЕРО.

Мышей ЕУВ/Ν наркотизировали ингаляционной анестезией изофлораном. Волосяной покров задних конечностей удаляли с помощью лосьона для удаления волосяного покрова и дезинфицировали 70% спиртом. С помощью стерильного одноходового штампа для биопсий 4 мм наносили в каждом случае одну кожную рану на правом боку мышей. Противоположная сторона служила в качестве внутреннего контроля. Однократно проводили послеоперационную антибиотическую защиту пенициллином С (20000 единиц/кг). На протяжении всего периода исследования один раз в неделю выполняли подкожные инъекции рекомбинантного аналога эритропоэтина человека аранеспа (0,1 мкг/кг массы тела) на протяжении всего периода исследования. Обработку начинали за семь дней перед пункцией штампом для тканей. Результаты представлены на фиг. 8. Они показывают, что введение ЕРО значительно ускоряет процесс заживления. Фиг. 19 показывает действие эритропоэтина на заживление ран. Эта фигура показывает, что при обработке эритропоэтином в низкой дозировке (20 МЕ ЕРО/кг в неделю) стандартизованной кожной раны, которую у мышей наносили при помощи штампа для тканей, эта рана уже после семи-восьми дней полностью закрывалась, в то время как при обработке этой раны физиологическим раствором хлорида натрия (солевым раствором) раны закрывалась полностью только после тринадцати-четырнадцати дней. Обработка опытных животных эритропоэтином в высокой дозировке (200 МЕ ЕРО/кг в неделю) не обнаруживала никакого ускорения заживления ран в сравнении с контрольной группой. Два обработанных высокой дозой эритропоэтина опытных животных умерли в период наблюдения. Обработка эритропоэтином или физиологическим раствором хлорида натрия начиналась после нанесения кожной раны в день операции. Рекомбинантный эритропоэтин человека вводили один раз в неделю посредством подкожной (б.с.) инъекции (20 МЕ/кг ЕРО или 200 МЕ/кг ЕРО) (на группу η = 5).

Пример 3. Уменьшение прогрессирования хронической почечной недостаточности обработкой эритропоэтином.

Восьминедельных крыс 8ргадие-ОаМеу наркотизировали кетамином (120 мг/кг) и ромпуном (10 мг/кг). В день 0 у крыс удаляли правую почку, которую сразу же после удаления фиксировали для гистологического исследования в формалине. У левой почки лигировали сегментарные артерии, которые снабжают верхний и нижний полюс почки. Вследствие этого происходит инфаркт почки в соответствующих областях почки, причем только средняя треть почки остается функциональной. Один раз в неделю крысы получали аналог эритропоэтина аранесп в дозе 0,1 мкг/кг массы тела), или контрольным животным вводили №-1С1 подкожной (б.с.) инъекцией.

Фиг. 10 показывает кривые выживаемости Каплана-Майера обеих опытных групп. Обработанные аранеспом животные обладали явно улучшенным выживанием по сравнению с обработанными хлоридом натрия контрольными животными.

На фиг. 15-18 показано, что после обработки эритропоэтином ткань почек не проявляет никаких патологических изменений, тогда как после обработки №-1С1 видны тяжелые патологические изменения (сравн. фигуры 8-11). Дополнительные гистологические исследования показали, что у обработанных аранеспом животных можно наблюдать более высокую плотность сосудов (СЭ31), чем у обработанных хлоридом натрия животных (данные не показаны).

Пример 4. Уменьшение прогрессирования острой почечной недостаточности.

Для этих исследований использовали крыс 8ргадие-Эает1еу массой 250-300 г. Одна из опытных групп получала один раз в день перед индукцией острой почечной недостаточности аранесп в дозе 0,1

- 18 015350 мкг/кг массы тела. Крыс наркотизировали кетамином (120 мг/кг) и ромпуном (10 мг/кг). В качестве сравнения использовали группу опытных животных, которым в каждом случае одновременно инъецировали подкожно (к.с.) хлорид натрия. Приток крови в почку прерывали на 45 мин, помещая артериальный зажим на правую почечную артерию. В это время проводили левостороннюю нефрэктомию. В дополнительной контрольной группе проводили ложную операцию. При этом открывали брюшную полость, высвобождали левую почечную артерию, однако кровоснабжение не прерывали, и извлекали противолежащую правую почку. Всех животных наркотизировали в течение периода 60 мин и умерщвляли спустя 24 ч после операции.

45-Минутная ишемия с последующей реперфузией оставшейся правой почки приводила у обработанных хлоридом натрия животных к массивной острой утрате почечной функции. Это нашло отражение в показателе сывороточного креатинина, который повышался в 7 раз. В противоположность этому, обработанные аналогом эритропоэтина аранеспом животные показали только четырехкратное повышение показателей сывороточного креатинина после индукции ишемического-реперфузионного повреждения. У левосторонне нефрэктомированных животных с ложной операцией правой почки не происходило повышение ретенционных показателей. Эти результаты представлены на фиг. 9.

Пример 5. Уменьшенная способность дифференцировки эндотелиальных клеток-предшественников у пациентов с ограниченной функцией почек.

У 46 уремических пациентов, а также у 46 соответствующих по возрасту и полу здоровых контрольных пробандов анализировали статус дифференцировки эндотелиальных клеток-предшественников с использованием теста в культуре. При этом неожиданным образом было установлено, что количество эндотелиальных клеток-предшественников в этом анализе дифференцировки у уремических пациентов является значимо уменьшенным (фиг. 7). При выделении мононуклеарных клеток здорового пробанда и культивировании их в присутствии сыворотки уремического пациента способность дифференцировки этих клеток в эндотелиальные клетки-предшественники уменьшается аналогичным образом (фиг. 6).

Пример 6. Стимуляция способности к дифференцировке эндотелиальных клеток-предшественников у здоровых пробандов.

здоровых молодых мужчин обрабатывали на протяжении периода 8 недель 30 ΜΕ эпоэтина бета на килограмм массы тела один раз в неделю. При этом способность к дифференцировке эндотелиальных клеток-предшественников в этом тесте в культуре определяли перед обработкой пробандов гЬЕРО, а также еженедельно после 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7 недель после обработки пробандов гЬЕРО с использованием их адгезионной способности и обоих маркеров асИЬ и ИЕЛ. При этом наблюдали относительное повышение ЕРС более чем на 50%.

Claims

1. Применение эритропоэтина и/или производных для получения фармацевтической композиции, содержащей дозу 1-90 МЕ/кг массы тела в неделю, для профилактики или лечения пациентов-людей или пациентов-животных: а) по меньшей мере с одной дисфункцией эндотелиальных клетокпредшественников, Ь) по меньшей мере с одним сердечно-сосудистым фактором риска, таким как гипертония, гиперхолестеринемия, повышенные показатели Асимметричного Диметиларгинина (ΑΌΜΑ), повышенная инсулинорезистентность или гипергомоцистеинемия, и с) по меньшей мере с одним повреждением конечного органа, а именно гипертрофией левого желудочка, микроальбуминурией, когнитивной дисфункцией, увеличением толщины интимы-медии в сонной артерии (Α. сагобк) или скоростью гломерулярной фильтрации 30-80 мл/мин, причем фармацевтическая композиция предназначена для предупреждения, уменьшения или замедления повреждения ткани почек или для регенерации поврежденной ткани почек.

2. Применение эритропоэтина и/или производных для получения фармацевтической композиции, содержащей дозу 1-90 МЕ/кг массы тела в неделю, для профилактики или лечения пациентов-людей или пациентов-животных: а) по меньшей мере с одной дисфункцией эндотелиальных клетокпредшественников, Ь) по меньшей мере с одним сердечно-сосудистым фактором риска, таким как гипертония, гиперхолестеринемия, повышенные показатели Асимметричного Диметиларгинина (ΑΌΜΑ), повышенная инсулинорезистентность или гипергомоцистеинемия, и с) по меньшей мере с одним повреждением конечного органа, а именно гипертрофией левого желудочка, микроальбуминурией, когнитивной дисфункцией, увеличением толщины интимы-медии в сонной артерии (Α. сагобк) или скоростью гломерулярной фильтрации 30-80 мл/мин, причем фармацевтическая композиция предназначена для заживления ран.

3. Применение по п.1 или 2, в котором фармацевтическая композиция служит для стимуляции физиологической мобилизации эндотелиальных клеток-предшественников, пролиферации эндотелиальных клеток-предшественников, дифференцировки эндотелиальных клеток-предшественников в эндотелиальные клетки и/или миграции эндотелиальных клеток-предшественников в направлении ангиогенного или васкулогенного стимула.

4. Применение по одному из пп.1-3, в котором способность дифференцирующихся эндотелиальных

- 19 015350 клеток-предшественников к адгезии повышается.

5. Применение по одному из пп.1-4, в котором стимуляция эндотелиальных клеток- предшественников приводит к образованию эндотелиальной ткани.

6. Применение по одному из пп.1-5, в котором стимуляция эндотелиальных клеток- предшественников приводит к образованию новых кровеносных сосудов.

7. Применение по п.6, в котором дисфункция эндотелиальных клеток-предшественников состоит в их нарушенной способности к пролиферации, их нарушенной способности к дифференцировке в эндотелиальные клетки, их нарушенной способности к адгезии и/или их нарушенной способности к миграции в направлении васкулогенного или ангиогенного стимула.

8. Применение по п.6 или 7, в котором дисфункция эндотелиальных клеток-предшественников ухудшает или предотвращает образование эндотелиальной ткани и/или кровеносных сосудов.

9. Применение по одному из пп.6-8, в котором дисфункция эндотелиальных клетокпредшественников является патогенно обусловленной.

10. Применение по п.1, в котором эритропоэтин вводят пациенту в дозе 1-45 единиц в неделю.

11. Применение по одному из пп.1-10, в котором эта фармацевтическая композиция пригодна как для парентерального, в частности внутривенного, внутримышечного, внутрикожного или подкожного, так и местного введения.

12. Применение по п.11, в котором эта фармацевтическая композиция представлена в виде инъекционного или инфузионного раствора.

13. Применение по одному из пп.1-10, в котором эта фармацевтическая композиция пригодна для легочного введения.

14. Применение по п.13, в котором эта фармацевтическая композиция представлена в виде водного раствора, неводного раствора или в виде порошка.

15. Применение по п.13 или 14, в котором эта фармацевтическая композиция представлена в форме аэрозольного препарата.

16. Применение по одному из пп.1-15, в котором эта фармацевтическая композиция пригодна для перорального введения.

17. Применение по п.16, в котором эта фармацевтическая композиция представлена в виде раствора, суспензии, эмульсии или таблетки.

18. Применение по одному из пп.1-17, в котором эта фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере одно дополнительное активное вещество для стимуляции эндотелиальных клетокпредшественников.

19. Применение по п.18, в котором в случае дополнительного активного вещества речь идет о УЕСЕ, Р1СЕ, СМ-С8Е, ингибиторе АСЕ (ангиотензинпревращающего фермента), блокаторе АТ-1, ингибиторе НМС-СоА-редуктазы (гидроксиметилглутарил-СоА-редуктазы) и/или доноре NО.

20. Применение по п.19, в котором ингибитором НМС-СоА-редуктазы является статин, такой как симвастатин, мевастатин или аторвастатин, ингибитором АСЕ является такое активное вещество, как эналаприл, рамиприл или трандолаприл, и/или блокатором АТ-1 является такое активное вещество, как ирбесартан, лорсартан или олмесаратан.

21. Применение по одному из пп.1-20, в котором эритропоэтин является эритропоэтином человека или животного.

22. Применение по п.21, в котором эритропоэтин является производным, аналогом, модификацией или мутеином эритропоэтина.

23. Применение по п.21 или 22, в котором эритропоэтин выделен из мочи человека, мочи или плазмы страдающих от апластической анемии пациентов, культур ткани раковых клеток почек человека, лимфобластных клеток, обнаруживающих способность к образованию эритропоэтина человека, или полученной клеточным слиянием гибридомной культуры, содержащей клеточную линию человека или животного.

24. Применение по п.21 или 22, в котором эритропоэтин является эритропоэтином, созданным с использованием способов рекомбинации ДНК.

25. Применение эритропоэтина по пп.1-24 для получения фармацевтической композиции, для профилактики или лечения заболеваний, причем эритропоэтин или/и фармацевтическая композиция пригодны и предназначены для утреннего применения для организма человека или животного в период времени 6.00-10.00.