EA013864B1

EA013864B1 - Способ повышения антимикробной активности цефалоспориновых антибиотиков

Info

Publication number: EA013864B1
Application number: EA200801886A
Authority: EA
Inventors: Константин Валентинович ГАЙДУЛЬ; Александр Валерьевич ДУШКИН
Original assignee: Лимонова, Анастасия Викторовна
Priority date: 2008-08-29
Filing date: 2008-08-29
Publication date: 2010-08-30
Also published as: EA200801886A1

Abstract

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности. Заявляемый способ повышения антибактериальной активности цефалоспориновых антибиотиков путем их механической обработки позволяет повысить их антибактериальную активность не менее чем в 2 раза за счет обогащения промышленно выпускаемых антибиотиков биологически активными энантиомерами. Для этого порошкообразную субстанцию цефалоспориновых антибиотиков обрабатывают интенсивными ударно-истирающими воздействиями в шаровых мельницах, контролируя изменения удельного угла оптического вращения, измеряемое по стандартной методике на длине волны 589 нм, которое должно составлять не менее 2°.

Description

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности к способу повышения базовой антибактериальной активности антибиотиков цефалоспоринового ряда и создания высокоэффективных лекарственных средств.

Антибиотики цефалоспоринового ряда широко применяются в современной медицинской практике для лечения инфекционно-воспалительных заболеваний.

Цефалоспорины относятся к бета-лактамным антибиотикам, в основе их химического строения лежит 7-аминоцефалоспорановая кислота (7-АЦК) [1] (фиг. 1). В медицине применяют полусинтетические цефалоспориновые антибиотики, отличающиеся природой заместителей В и В'.

СООЫа

Фиг. 1

Со структурно-химической точки зрения цефалоспорины представляют собой довольно сложные большие молекулы, которые могут иметь изомерные формы, различающиеся по биологической активности.

На фиг. 2, приведена структура Δ³ изомера цефемного ядра цефалоспориновых антибиотиков. Однако возможно изменение положения двойной связи (см. фиг. 3). Такие структуры называются Δ² изоме рами.

Фиг. 2

СООИа

Фиг. 3

Антимикробную активность проявляют именно Δ³ изомеры, в то время как Δ² изомеры неактивны [2].

Другим видом изомерии цефалоспориновых антибиотиков, оказывающих влияние на их биологическую активность, является геометрическая син- и антиизомерия положения Ν-оксимной группы =Ν-Ο-Β в боковой цепи, присоединенной по положению 7 цефемового ядра. Это показано на примере структур антибиотиков 3-го поколения. Син- конфигурация изображена на фиг. 4, а антиконфигурация на фиг. 5.

Фиг. 4 ко.

N

СООЫа

Фиг. 5

Применительно к наиболее популярным цефалоспориновым антибиотикам такой тип изомерии возможен для цефотаксима, цефуроксима, цефтазидима, цефепима и цефтриаксона. На примере цефотаксима проведено сравнение антибактериальной активности син- и антиизомеров [3-6]. Показано, что активность син- изомера против бета-лактамаз-продуцирующих граммположительных бактерий в 80 раз

- 1 013864 выше, чем антиизомера.

Известен способ изомеризации цефотаксима [7] и цефуроксима [8] путем УФ облучения их водных растворов. В результате облучения образуется определенное фотостационарное соотношение между сини антиизомерами. Тем самым, если исходным состоянием антибиотика является малоактивный изомер (анти-), в результате облучения образуется смесь син-и антиизмеров, обладающая повышенной антимикробной активностью. Эти исследования взаимных переходов между биологически активной и неактивной формами под действием физического фактора - УФ облучения - являются аналогами настоящего изобретения.

Недостатком известного способа является необходимость перевода антибиотиков в жидкую фазу. Учитывая, что в растворе происходит их постепенное разложение [9], для хранения облученных антибиотиков необходимо их выделение в сухом виде. Это значительно усложняет промышленную реализацию описанного способа изомеризации.

Известен способ обогащения биологически активным геометрическим изомером цис-7-амино-3[(Е)-2-(4-метил-5-тиазолин)винил]-3-цефем-4-карбоновой кислоты, описанный в [10], что также является аналогом нашего изобретения. Он заключается в получении в водном растворе ее аммониевой соли и последующем ее осаждении. При этом цис- и транс-изомеры осаждаются в разной степени и осадок обогащается преимущественно цис-изомером, обладающими повышенной активностью к граммотрицательным бактериям.

Недостаток данного способа связан с переводом исходной субстанции антибиотика в водный раствор с последующим выделением сухого продукта. Кроме того, он применим только для конкретного антибиотика - 7-амино-3-[(Е)-2-(4-метил-5-тиазолин)винил]-3-цефем-4-карбоновой кислоты и не известен для других цефалоспоринов.

Еще одним видом изомерии является оптическая изомерия, обусловленная диссеметрическим строением молекул цефалоспоринов [11]. Так, независимо от природы заместителей, в самом цефемовом ядре цефалоспоринов имеются два оптически активных центра - ассиметрические четвертичные атомы углерода в положениях 6 и 7, см. фиг. 1. Вследствие этого все цефалоспориновые антибиотики обладают оптической активностью - хиральностью. Введение различных заместителей В и В' усложняет пространственное строение молекул и делает возможным существование дополнительных оптически активных конфигураций. У большинства лекарственных препаратов существует тесная взаимосвязь между пространственной структурой и фармакологической активностью, то есть стереоспецифичность действия. Многие синтетические лекарственные препараты существуют в виде смеси двух, а часто и большего числа пространственных изомеров, отличающихся своим биологическим действием. Ранее теоретических расчетов оптической активности для цефалоспоринов не проводилось, а для большинства цефалоспоринов не установлена абсолютная конфигурация молекул. Это делает невозможным построение правдоподобных молекулярных моделей, которые были бы полезны хотя бы для качественного представления возможных стереохимически/оптически активных конфигураций. В этой ситуации вероятно существование множества оптически изомерных состояний молекул цефалоспоринов - их энантиомерных форм. В литературе отсутствуют данные о биологической/антимикробной активности отдельных энантиомеров цефалоспоринов, а также их смесей.

Общепринятые методы контроля качества субстанций цефалоспоринов основаны на ВЭЖХ [12] с использованием ахиральных фаз и не чувствительны к энантиомерному составу. Единственной характеристикой, чувствительной к соотношению энантиомеров, является показатель удельного оптического вращения [α], измеряемый в растворах исследуемых веществ на специальных приборах - поляриметрах. Однако этот показатель допускает варьирование в довольно широких пределах [12] (например, для цефазолина от -10 до -24°) или вообще не используется в фармакопейных стандартах качества. В то же время для энантиомерно чистых соединений (например, аскорбиновая и винная кислоты, аспартам) точность задания [α] составляет не хуже ±1°. На основе этого можно предположить, что энантиомерный состав промышленных цефалоспориновых антибиотиков является непостоянной величиной и зависит от условий конкретной используемой технологии их синтеза. Это предположение объясняет экспериментально наблюдаемые различия в антимикробной активности субстанций цефалоспоринов от разных производителей [13]. Данные о влиянии оптической изомеризации на антимикробную активность цефалоспориновых антибиотиков отсутствуют.

Однако для органических веществ широко известны процессы оптической изомеризации, проходящие в растворах, под действием различных химических и физических факторов [11]. Недостатком, затрудняющим их промышленное применение, является необходимость перевода веществ в жидкую фазу (растворения) и последующим выделением из раствора в виде сухой стабильной в хранении субстанции.

Наиболее близким техническим решением, выбранным за прототип настоящего изобретения, является описанный в [14] механохимический процесс оптической изомеризации (рацемизации) фенилаланина. Для этого смесь Ό- или Ь-оптических изомеров фенилаланина и порошка неорганического материала (тальк, каолин, окись кремния, алюминия или магния), взятых в весовом соотношении 1:10 в сухом виде подвергают механической обработке в шаровой мельнице. Анализ обработанной смеси свидетельствует

- 2 013864 о рацемизации (изомеризации) исходного фенилаланина. В отсутствии неорганических порошков процесс рацемизации не проходит.

Недостатком данного технического решения является необходимость использования вышеуказанных неорганических добавок, так как для дальнейшего практического применения необходимо выделение чистого органического вещества - применительно к цели настоящего изобретения -антибиотика. Такая очистка возможна только с участием жидкофазных стадий, например растворения, фильтрации/осаждения от неорганических материалов и сушки. Эти неизбежные технологические операции значительно усложняют промышленную реализацию описанного способа изомеризации.

Задачей настоящего изобретения является повышение антимикробной активности цефалоспориновых антибиотиков за счет изменения энантиомерного состава промышленно производимых субстанций.

Поставленная задача решается благодаря тому, что в заявляемом способе повышения антибактериальной активности цефалоспориновых антибиотиков путем оптической изомеризации, сухую лекарственную субстанцию подвергают ударно-истирающему воздействию, при этом процесс обработки проводят до изменения удельного угла оптического вращения антибиотика, измеряемого по стандартной методике на длине волны 589 нм не менее чем на 2° от исходной величины и ударно-истирающее воздействие антибиотика проводят в шаровых мельницах при комнатной температуре.

Стереоизомеризация (переход из одной энантиомерной формы в другую) осуществляется в настоящем изобретении путем механической обработке сухих субстанций цефалоспориновых антибиотиков (без каких-либо добавок) ударно истирающими воздействиями, реализующимися в различного рода мельницах. Степень изменений энантиомерного состава количественно контролируется измерением удельного угла оптического вращения на длине волны 589 нм.

В основу изобретения положено обнаруженное нами явление повышения антимикробной активности цефалоспориновых антибиотиков после обработки их сухих субстанций ударно-истирающими воздействиями, проводимой в шаровых мельницах. При этом изменение антимикробной активности происходит только в том случае, когда изменяется угол удельного оптического вращения антибиотика не менее чем на 2° по сравнению с исходным значением. Остальные показатели качества фармакопейной субстанции остаются в допустимых стандартами качества пределах.

Антимикробная активность исходных, а также механически обработанных цефалоспориновых антибиотиков определялась в специальных микробиологических тестах согласно рекомендациям [15]. Изучали минимальную подавляющую концентрацию антибиотиков методом серийных разведений в агаре (Мие11ег Ηίηΐοη 2 Адаг, Вюшепеих).

Использовались музейные референтные штаммы микроорганизмов: Е. сой АТСС 25922, 8. аигеик АТСС 29213, 8. рпеишошае АТСС 49619 и Р. аетидшока АТТСС 27853, а также микроорганизмы, не обладающие приобретённой резистентностью, выделенные от пациентов Новосибирской областной клинической больницы: 8а1топе11а еШетййй, К1еЬк1е11а рпеишошае и 8. аигеик крр. (СЫ).

Исследовались субстанции следующих антибиотиков-цефалоспоринов: цефуроксим, цефотаксим, цефтриаксон, цефтазидим, цефепим (производства нескольких фирм - ВатФаГатша, Италия; Напш1 Еше Сйеш., Ю. Корея; Отсй Сйеш., Индия; НатЬш Рйатш. Отоир, Китай).

Механическая обработка антибиотиков проводилась в шаровых мельницах при комнатной температуре в течение нескольких часов. Изменение содержания основного вещества, определялась с помощью ВЭЖХ по методикам [12] и не превышала 5%. При более длительной и интенсивной обработке в мельницах происходит значительное химическое разложение антибиотиков, что исключает возможность их дальнейшего использования. В качестве аппаратов для механической обработки могут использоваться преимущественно шаровые валковые, планетарные, вибрационные, виброцентробежные и т. д. мельницы, обладающие ударно-истирающим воздействием. Возможно использование мелющих тел, отличных от шаров, например, стрежней. Процесс масштабируется от шаровых лабораторных мельниц с загрузкой в несколько грамм до проточных виброцентробежных мельниц с производительностью до 100 кг/ч и более [16]. Отсутствуют специальные требования к контролю влажности помещений, так как вещества обрабатываются в герметичном внутреннем объеме мельниц. Во всех случаях процесс проводится фактически в одну стадию, не требует участия жидких фаз, дорогостоящего оборудования и прост в реализации. Конкретные параметры технологических процессов зависят от физико-химических и физико-механических свойств используемых компонентов.

Угол удельного оптического вращения измеряется в водных растворах цефалоспориновых антибиотиков при концентрации 2-4 вес.% на стандартных поляриметрах (в нашем случае Ро1ААг 3005, производства Великобритании) на длине волны λ = 589,44 нм. При механической обработке может происходить изменение оптической активности [α] в значительных пределах - по абсолютной величине до 15° (в случае цефепима) и по относительным изменениям - до 66% (в случае цефтазидима). Минимальное изменение [α], при котором наблюдается повышение антибактериальной активности, составляет 2,0° (для цефотаксима). В случае изменений [α] менее 2°, повышения или понижения антимикробной активности цефалоспоринов не наблюдается. Кроме того, такие небольшие изменения [α] находятся в пределах ошибки его определения. Важно, что цефалоспориновые антибиотики разных производителей проявляют

- 3 013864 различную способность к оптической изомеризации и, соответственно, к возможности модификации их антимикробных свойств. Очевидно, это связано с отличиями в энантиомерном составе промышленных субстанций, который определяется используемой технологией производства.

В отношении механизма изменений оптической активности необходимо иметь в виду, что в молекулах цефалоспоринов имеется несколько оптически активных центров. Путем рацемических превращений даже одного из них осуществляются переходы между различными энантиомерами, сопровождающиеся изменением суммарного показателя удельного оптического вращения исследуемых веществ. Именно это явление мы наблюдаем при механохимической обработке ряда цефалоспориновых антибиотиков. Это предположение также согласуется с изменением биологической (антимикробной) активности. Таким образом, наши эксперименты показывают, что механохимическое воздействие «обогащает» промышленно произведенные субстанции цефалоспоринов биологически активными энантиомерами.

Этот факт является неожиданным техническим результатом, не следующим из известного уровня техники. Эффективность способа демонстрируется повышением антимикробной активности субстанций цефалоспориновых антибиотиков, обработанных ударно-истирающими воздействиями в шаровой мельнице.

В прототипе настоящего изобретения [14] описана оптическая изомеризация фенилаланина в условиях механохимических воздействий. Этот процесс проходил в присутствии неорганических наполнителей, активная поверхность которых катализирует стереохимические переходы.

Обнаруженное нами явление изменения удельного угла оптического вращения цефалоспоринов - их оптическая изомеризация - при обработке субстанций ударно-истирающими механическими воздействиями без специальных добавок отвечает критерию новизны для данного конкретного ряда антибиотиков.

Таким образом, разработанный способ оптической изомеризации в промышленно получаемых субстанциях цефалоспоринов путем механической обработки субстанций антибиотиков ударноистирающими воздействиями обеспечивает получение следующих технических результатов:

повышение удельной антимикробной активности цефалоспориновых антибиотиков не менее, чем в 2 раза;

создание низко затратного и безотходного способа производства субстанций повышенной антимикробной активности.

Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Цефуроксим.

При механической обработке в шаровой мельнице ВМ-1 (объем барабана 0,5 л, загрузка обрабатываемого вещества 20 г, загрузка мелющих тел - 15 стальных шаров диаметром 12 мм) в течение 2 ч, угол удельного вращения поляризации [α] изменяется от 61,2 до 82,2°. Содержание основного вещества, определенное анализом ВЭЖХ после механической обработки составляет 98,6%. Антимикробная активность механически обработанного цефуроксима против Е. соП. 8а1топе11а еп1епбб1к и К1еЬк1е11а рпеитошае увеличивается в 2 раза.

Пример 2. Цефотаксим.

При механической обработке в шаровой мельнице ВМ-1 в течение 3 ч угол удельного вращения поляризации [α] изменяется от 63,2 до 76,2°. Содержание основного вещества, определенное анализом ВЭЖХ после механической обработки составляет 96,4%. Антимикробная активность механически обработанного цефотаксима против 8. аигеик, 8. аигеик крр. (ΟΝ), Е. соП и К1еЬк1е11а рпеитошае увеличивается в 2 раза.

Пример 3. Цефтриаксон.

При механической обработке в шаровой мельнице ВМ-1 в течение 2 ч угол удельного вращения поляризации [α] изменяется от -118,1 до -124,2°. Содержание основного вещества, определенное анализом ВЭЖХ, после механической обработки составляет 98,8%. Антимикробная активность механически обработанного цефтриаксона против 8. аигеик, 8. аигеик крр. (ΟΝ), 8. рпеитошае, Е. со11 и К1еЬк1е11а рпеитошае увеличивается в 2 раза.

Пример 4. Цефтазидим.

При механической обработке в шаровой мельнице ВМ-1 в течение 2 ч угол удельного вращения поляризации [α] изменяется от -17,8° до -6,0°. Содержание основного вещества, определенное анализом ВЭЖХ после механической обработки составляет 95,4%. Антимикробная активность механически обработанного цефтазидима против 8. аигеик, 8. рпеитошае, Р. аегидшока, Е. соП и К1еЬк1е11а рпеитошае увеличивается в 2 раза.

Пример 5. Цефепим.

При механической обработке в шаровой мельнице ВМ-1 в течение 2 ч угол удельного вращения поляризации [α] изменяется от -35,3 до -50,3°. Содержание основного вещества, определенное анализом ВЭЖХ, после механической обработки, составляет 95,6%. Антимикробная активность механически обработанного цефепима против 8. аигеик, 8. аигеик крр. (ΟΝ), Р. аегидшока, Е. со11 и 8а1топе11а еп(ег111П1к увеличивается в 2 раза.

- 4 013864

Таким образом, приведенные примеры подтверждают формулу изобретения.

Литература

1. М.Д. Машковский. Лекарственные средства. Харьков: Торсинг, 1998, том 1, 560 с., том 2, 592 с.

2. Интернет сайт химической энциклопедии Ййр://тетете.хишик.ги/епсук1ореб1а /2/5146.111т1

3. Υ.Α. СкаЬЬей. АТ Ьи1х. АпбтютоЫа1 Адепк апб СйешоШегару. Νον. 1978, 749.

4. Ό. Мйеттап, Υ. №сйатотеЙ2, Апбт1сгоЫа1 Адепк апб СйетоИетару, РеЬ.,1980, 115.

5. Υ.Α. СйаЬЬей, АТ ки!/, №υν Ргекке Меб., 1981 РеЬ 26, 10(8), 541.

6. 6. Ьаитеп!, Р. Питал!, 1-М. Ртете, Ό. К1еш, Тт.бйиукеп, Вюскет.Е, 1984, 218,933.

7. Ьегпег Ό.Α., Воппекопб 6., РаЬге Н., Мапбгои В., 8. бе ВиосйЬегд М., 1. Ркагт 8ск 1988,77(8), 699.

8. М. 1отю, М. №со1е11к Рагтасо (8а), 1986, 41(10), 801.

9. Н. РаЬге, Н. 1Ьгок, Ό. Ьегпег, 1. Ркатт.8а., 1994, 83(4), 553.

10. Патент США, 8ерата!юп ок серка1о§ропп кошеге И8 6,235,897.

.Э. Илиел, С. Вален, М. Дойл. Основы органической стереохимии. Пер. с англ.- М., Бином, 2007, 703 с.

12. Ипйеб 8(а(е Ркаттасорое1а, И8Р 26 - ΝΡ-21, 1апиату 2003 (СЭ^егаюп).

13. Э.Я. Фисталь, В.В. Солошенко, Г.Е. Самойленко, И.И. Сперанский, М.В. Лобачева, Е.Г. Тимошенко, Институт неотложной и восстановительной хирургии им. В.К. Гусака, АМН Украины, г. Донецк, «Сравнение эффективности цефоперазона разных производителей в комплексном лечении ожоговых больных», \\л\лу.11еа1111-иа.огд/агПс1е/11еа1111/2188.1111п1

14. 1КЕКААА А., НАУАКААА 8. МескапоскепиЧгу ок отдашс ор!юа1 котега. //81Ьепап 1. ок Скет18йу. - 1991. - N 5. - Р. 19-24.

15. №1копа1 Соттй!ее ког С1шюа1 ЬаЬога!огу 8!апбатб5, 2003, Αрр^ονеб к!апбагб М7-А6. Ме!кобк ког ббибоп апбт1стоЫа1 киксербЬййу 1ек1к ког Ьас!ейа Ла! дго\х аегоЫса11у. 6¹¹' еб. ΝίΧΤΑ Ааупе.

16. А. В. Душкин. Возможности механохимической технологии органического синтеза и получения новых материалов // Химия в интересах устойчивого развития. 2004. Т. 12, №3, с. 251-274.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ повышения антибактериальной активности цефалоспориновых антибиотиков путем оптической изомеризации, отличающийся тем, что сухую лекарственную субстанцию подвергают ударноистирающему воздействию, при этом процесс обработки проводят до изменения удельного угла оптического вращения антибиотика, измеряемого по стандартной методике на длине волны 589 нм не менее чем на 2° от исходной величины.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что ударно-истирающее воздействие антибиотика проводят в шаровых мельницах при комнатной температуре.

Евразийская патентная организация, ЕАПВ

Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2