EA012800B1

EA012800B1 - Применение белков в качестве деэмульгаторов

Info

Publication number: EA012800B1
Application number: EA200702156A
Authority: EA
Inventors: Дитмар Поссельт; Вернер Шмитт; Маркус Гуцманн; Клаудиус Корманн; Матиас Кифер; Клаус Болльшвайлер; Томас Зубовски; Ханс-Георг Лемэр; Марвин Карос; Ульф Баус
Original assignee: Басф Акциенгезелльшафт
Priority date: 2005-04-01
Filing date: 2006-03-29
Publication date: 2009-12-30
Also published as: EA200702157A1; US8535535B2; CA2603374A1; BRPI0608681A2; JP2008534554A; CN101175540B; EA014384B1; US20090282729A1; MX2007011955A; NO20075106L; WO2006103252A2; CA2603374C; CN101175540A; EA200702156A1; EP1868700A2; WO2006103252A3

Abstract

Данное изобретение касается применения по крайней мере одного белка, в частности одного гидрофобина или по крайней мере одного его производного, для улучшения разделения фаз в составах, содержащих по меньшей мере две жидкие фазы, способа разделения по меньшей мере двух жидких фаз в составе, содержащем по меньшей мере две жидкие фазы, а также композиций, содержащих по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей, по меньшей мере, из горючего, топлива, сырой нефти или растворов полимеров, растворимых в воде или в масле, и по меньшей мере одного белка, в частности гидрофобина или его производного.

Description

Данное изобретение касается также описанного ранее способа, причем по меньшей мере один гидрофобин или его производное применяются в количестве от 0,0001 до 1000 ррт относительно всего со

- 9 012800 става. Предпочтительные количества для соответствующих систем уже были названы.

Способ согласно изобретению может включать дополнительные этапы, например, такие, которые улучшают разделение фаз или разрушение эмульсий. При этом речь может идти, например, о повышении температуры или о центрифугировании. Такого рода этап может выполняться до добавления по меньшей мере одного гидрофобина или его производного во время этого действия или после него.

В соответствии со следующей формой исполнения данное изобретение касается поэтому описанного ранее способа, причем способ включает повышение температуры состава, содержащего не менее двух жидких фаз, до или после добавления по меньшей мере одного гидрофобина или по меньшей мере одного его производного.

Согласно изобретению могут добавляться гидрофобины или их производные, например, к композициям, содержащим горючее или топливо. При контакте композиции с водой это обеспечивает быстрое расслоение смеси и предотвращает образование эмульсий. Образование эмульсий, например, в складских резервуарах сделало бы необходимыми дорогостоящие операции по очистке композиции.

В такой же степени полезно добавлять гидрофобины или их производные к сырой нефти, чтобы предотвратить, например, образование эмульсии.

При этом композиция, содержащая горючее или топливо, в рамках данного изобретения может содержать другие добавки, которые обычно содержатся в такого рода композициях.

Подходящие добавки названы, например, в патенте \¥О 2004/087808.

Данное изобретение касается поэтому также композиции, содержащей по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из горючего, топлива, сырой нефти или растворов полимеров в воде или в масле, и по крайней мере одного гидрофобина или его производного.

Количество применяемого гидрофобина или его производного можно варьировать в зависимости от других добавок, пока не будет обеспечено улучшение разделения фаз при контакте композиции с водой.

Согласно изобретению количество применяемого гидрофобина или его производного лежит преимущественно в области между 0,0001 и 1000 ррт, предпочтительно от 0,001 до 500 ррт, особенно предпочтительно от 0,01 до 100 ррт.

Поэтому данное изобретение касается также описанной ранее композиции, причем гидрофобин или его производное содержится в композиции в количестве от 0,0001 до 1000 ррт по отношению ко всей композиции.

Если для композиции речь идет о смеси, содержащей сырую нефть, то количество добавляемого к такой композиции гидрофобина или его производного составляет, как правило, от 1 до 1000 ррт, предпочтительно от 10 до 800 ррт, особенно предпочтительно от 10 до 500 ррт.

Если для композиции речь идет о смеси, содержащей горючее или топливо, то количество добавляемого к такой композиции гидрофобина или его производного составляет, как правило, от 0,001 до 0,5 ррт, предпочтительно от 0,005 до 0,3 ррт, особенно предпочтительно от 0,01 до 0,2 ррт.

Поэтому настоящее изобретение в соответствии со следующей формой исполнения касается описанной ранее композиции, причем композиция содержит по крайней мере одно горючее или топливо, и в композиции содержится гидрофобин или его производное в количестве от 0,001 до 0,5 ррт относительно всей композиции.

В рамках данного изобретения под топливом понимаются, например, легкие, средние или тяжелые мазуты.

В рамках данного изобретения под горючим понимаются, например, автомобильные бензины, дизельное или газотурбинное топливо. Особенно предпочтительно речь идет о бензинах.

Горючее может содержать дополнительные присадки. Обычные присадки в основном известны специалисту. Подходящие присадки и растворители названы, например, в патенте \¥О 2004/087808.

Например, согласно изобретению пригодными в качестве дополнительных компонентов являются присадки с моющим действием и/или препятствующие износу седла клапана (называемые в дальнейшем моющие присадки). Такая моющая присадка содержит по крайней мере один гидрофобный углеводородный остаток со среднечисленным молекулярным весом Мп от 85 до 20000 г/моль и по крайней мере одну полярную группировку, выбранную из:

(a) моно- или полиаминогрупп с атомами азота до 6, причем по крайней мере один атом азота имеет свойства основания;

(b) нитрогрупп, в некоторых случаях в комбинации с гидроксильными группами;

(c) гидроксильных групп в комбинации с моно- или полиаминогруппами, причем по крайней мере один атом азота имеет свойства основания;

(б) карбоксильных групп или их солей щелочных или щелочно-земельных металлов;

(е) сульфогрупп или их солей щелочных или щелочно-земельных металлов;

(ί) полиокси-С₂-С₄-алкиловых группировок, которые оканчиваются гидроксильными группами, моно- или полиаминогруппами, причем по крайней мере один атом азота имеет свойства основания, или карбаматными группами;

(д) групп эфиров карбоновой кислоты;

(11) группировок, производных от ангидрида янтарной кислоты, с гидрокси-, и/или амино-, и/или

- 10 012800 амидо-, и/или имидогруппами; и/или (ί) группировок, полученных реакцией обмена Манниха замещенных фенолов с альдегидами и моно- или полиаминами.

Гидрофобный углеводородный остаток в упомянутых выше моющих присадках, предназначенный для достаточной растворимости в горючем, имеет среднечисленный молекулярный вес (Мп) от 800 до 20000, в особенности от 113 до 10000, лучше всего от 300 до 5000. В качестве типичного гидрофобного углеводородного остатка, в особенности в соединении с полярными группировками (а), (с), (Ь) и (ί), рассматриваются полипропиленовый остаток, полибутениловый остаток и полиизобутениловый остаток с Мп=300-5000, особенно 500-2500, лучше всего 700-2300.

В качестве примеров указанных выше групп моющих присадок можно назвать следующие.

Присадки, содержащие моно- или полиаминогруппы (а), являются преимущественно полиалкенмоно- или полиалкенполиаминами на основе полипропена или обычного (т. е. с двойными связями, расположенными преимущественно не на конце) полибутена или полиизобутена с Мп от 300 до 5000 г/моль. При изготовлении присадок на основе полибутена или полиизобутена с преимущественной срединной двойной связью (в большинстве случаев в бета- или гамма-позиции) предлагается способ хлорирования с последующим аминированием или окисление двойной связи кислородом воздуха или озоном до карбонилкарбоксилсоединения с последующием аминированием при восстанавливающих (гидрирующих) условиях. Для аминирования здесь могут использоваться амины, например аммиак, моноамины или полиамины, как диметиламинопропиламин, этилендиамин, диэтилентриамин, триэтилентетрамин или тетраэтиленпентамин. Соответствующие присадки на основе полипропена описаны, в частности, в патенте \\'О 94/24231.

Следующие предпочтительные присадки, содержащие моноаминогруппы (а), являются продуктами гидрирования продуктов реакции обмена из полиизобутенов со средней степенью полимеризации Р=5100 с оксидами азота или смесями из оксидов азота и кислорода, как это, в частности, описано в патенте \О 97/03946.

Следующие предпочтительные присадки, содержащие моноаминогруппы (а), являются соединениями, полученными из полиизобутенэпоксидов реакцией обмена с аминами и с последующей дегидратацией и восстановлением аминоспиртов, как это, в частности, описано в патенте ΌΕ-А 19620262.

Присадки, содержащие нитрогруппы (Ь), в некоторых случаях в комбинации с гидроксилгруппами являются преимущественно продуктами реакции обмена из полиизобутенов средней степени полимеризации Р=5-100 или 10-100 с оксидами азота или смесями из оксидов азота и кислорода, как это, в частности, описано в патентах \О 96/03367 и \О 96/03479. Эти продукты обмена представляют собой, как правило, смеси из чистых нитрополиизобутенов (например, альфа-, бета-динитрополиизобутены) и смешанных гидроксинитрополиизобутенов (например, альфа-нитро-бета-гидроксиполиизобутены).

Присадки, содержащие нитрогруппы (Ь) в комбинации с моно- или полиаминогруппами (с), являются, в основном, продуктами обмена полиизобутенэпоксидов, полученных из полиизобутенов преимущественно с концевыми двойными связями и Мп=300-5000, с аммиаком, моно- или полиаминами, как это, в частности, описано в патенте ЕР-А 0476485.

Присадки, содержащие карбоксильные группы или их соли щелочных или щелочно-земельных металлов (б), являются преимущественно сополимерами С₂-С₄₀-олефинов с малеиновым ангидридом общей молярной массой от 500 до 20000, карбоксильные группы которых полностью или частично превращаются в соли щелочных или щелочно-земельных металлов, а остаток карбоксильных групп реагирует со спиртами или аминами. Такие присадки известны, в частности, из ЕР-А 0307815. Такого рода присадки служат, в основном, для предотвращения износа седла клапана и могут, как описано в \ О 87/01126, с пользой использоваться в комбинации с обычными топливными присадками, как поли(изо)бутенамины или полиэфирамины.

Присадки, содержащие сульфогруппы или их соли щелочных или щелочно-земельных металлов (е), являются преимущественно солями щелочных или щелочно-земельных металлов алкилового эфира сульфоянтарной кислоты, как это, в частности, описано в патенте ЕР-А 0639632.

Такого рода присадки служат, в основном, для предотвращения износа седла клапана и могут с пользой использоваться в комбинации с обычными топливными присадками, как поли(изо)бутенамины или полиэфирамины.

Присадки, содержащие полиокси-С2-С4-алкиловые группировки, являются преимущественно полиэфирами или полиэфираминами, которые можно получить путем реакции обмена С2-С60-алканолов, С6С30-алкандиолов, моно- или ди-С2-С30-алкиламинов, С1-С30-алкилциклогексанолов или С1-С30алкилфенолов с 1-30 моль этиленоксида, и/или пропиленоксида, и/или бутиленоксида на каждую гидроксильную группу или аминогруппу и, в случае полиэфираминов путем последующего восстановительного аминирования аммиаком, моноаминами или полиаминами. Такого рода продукты описаны, в частности, в патентах ЕР-А 0310875, ЕР-А 0356725, ЕР-А 0700985 и И8 4877416. В случае полиэфиров такие продукты удовлетворяют также свойствам масла-носителя. Типичными примерами этому являются тридеканол- или изотридеканолбутоксилаты, изононилфенолбутоксилаты, а также полиизобутенолбутоксилаты и -пропоксилаты и соответствующие продукты реакции обмена с аммиаком.

- 11 012800

Присадки, содержащие группы эфиров карбоновой кислоты (д), являются преимущественно сложными эфирами из моно-, ди- или трикарбоновых кислот с длинноцепочечными алканолами или полиолами, в особенности со средней вязкостью 2 мм²/с при 100°С, как описано, в частности, в патенте ΌΕ-Ά 3838918. В качестве моно-, ди- или трикарбоновых кислот могут использоваться алифатические или ароматические кислоты, в качестве сложных эфиров оксикислоты или многоатомных спиртов, прежде всего, пригодны длинноцепные представители, например, с 6-24 атомами углерода. Типичными представителями сложных эфиров являются адипинаты, фталаты, изофталаты, терефталаты и тримеллитаты изооктанола, изононанола, изодеканола и изотридеканола. Такого рода продукты удовлетворяют также свойствам масла-носителя.

Присадки, содержащие группировки, производные от ангидрида янтарной кислоты, с гидрокси-, и/или амино-, и/или амидо-, и/или имидогруппами (11). являются преимущественно соответствующими производными ангидрида полиизобутенил-янтарной кислоты, которые получаются реакцией обмена нормального или высокоактивного полиизобутена с Мп=300-5000 с ангидридом малеиновой кислоты при нагревании или через хлорированный полиизобутен. Особый интерес представляют также производные с алифатическими полиаминами, как этилендиамин, диэтилентриамин, триэтилентетрамин. Такого типа топливные присадки описаны, в частности, в патенте И8 4849572.

Присадки, содержащие группировки, полученные реакцией обмена Манниха замещенных фенолов с альдегидами и моно- или полиаминами (ί), являются преимущественно продуктами реакций обмена полиизобутензамещенных фенолов с формальдегидом и моно- или полиаминами, например этилендиамином, диэтилентриамином, триэтилентетрамином, тетраэтиленпентамином или диметиламинопропиламином. Полиизобутенилзамещенные фенолы могут получаться из нормального или высокоактивного полиизобутена с Мп=300-5000. Такого типа «полиизобутеновые основания Манниха» описаны, в частности, в патенте ЕР-А 0831141.

Для более точного определения отдельных приведенных топливных присадок здесь сделаны ссылки на публикации названных выше современных трудов.

Названные присадки применяются в количествах, которые определяются специалистом как пригодные для конкретного использования.

Кроме того, композиции согласно изобретению могут комбинироваться и с другими обычными компонентами и добавками. Здесь следует указать масла-носители без выраженного моющего действия.

Подходящими минеральными маслами-носителями являются получаемые при нефтепереработке фракции, например, брайтсток или базовые масла с вязкостью, например, класса 8Ν 500-2000; а также ароматические углеводороды, парафиновые углеводороды и алкоксиалканолы. Согласно изобретению пригодна также фракция, известная как «гидрокрекинговое масло» (йубгосгаск οίΐ) и получаемая при рафинировании минерального масла (этап вакуумной дистилляции с температурой кипения от 360 до 500°С, получение из каталитически гидрогенизированного и изомеризованного при высоком давлении, а также депарафинированного натурального минерального масла). Также пригодны смеси названных выше масел-носителей.

Примеры применимых согласно изобретению синтетических масел-носителей можно выбрать из полиолефинов (полиальфаолефин или полиинтерналолефин), сложных полиэфиров, (поли)алкоксилатов, простых полиэфиров, алифатических аминов простых полиэфиров, инициированных алкилфенолом простых полиэфиров, аминов инициированных алкилфенолом простых полиэфиров и эфиры карбоновых кислот с длинноцепочечными алканолами.

Примерами для подходящего полиолефина являются полимеризаты олефина с Мп=400-1800, прежде всего на основе полибутена или полиизобутена (гидрированного или не гидрированного).

Примерами подходящих простых полиэфиров или аминов простых полиэфиров предпочтительно являются соединения, содержащие группировки полиокси-С2-С4-алкиленов, которые получаются реакцией обмена С₂-С₆₀-алканолов, С₆-С₃₀-алкандиолов, моно- или ди-С1-С₃₀-алкиламинов, С1-С₃₀алкилциклогексанолов или С1-С₃₀-алкилфенолов с 1-30 моль этиленоксида и/или пропиленоксида и/или бутиленоксида на каждую гидроксильную или аминогруппу, а в случае аминов простых полиэфиров путем последующего восстановительного аминирования аммиаком, моноаминами или полиаминами. Такие продукты описаны, в частности, в патентах ЕР-А 0310875, ЕР-А 0356725, ЕР-А 0700985 и и8 4877416. Например, в качестве аминов простых полиэфиров могут применяться поли-С₂-С₆алкиленоксидамины или их функциональные производные. Типичными примерами этому являются тридеканол- или изотридеканолбутоксилаты, изононилфенолбутоксилаты, полиизобутенолбутоксилаты и -пропоксилаты, а также соответствующие продукты реакции обмена с аммиаком.

Примерами эфиров карбоновой кислоты с длинноцепными алканолами являются, в частности, сложные эфиры из моно-, ди- или трикарбоновых кислот с длинноцепными алканолами или полиолами, что описано, в частности, в патенте ΌΕ-А 3838918. В качестве моно-, ди- или трикарбоновых кислот могут использоваться алифатические или ароматические кислоты, в качестве сложных эфиров оксикислот пригодны, в первую очередь, длинноцепочечные представители, например с от 6 до 24 атомов углерода. Типичными представителями сложных эфиров являются адипаты, фталаты, изофталаты, терефталаты и

- 12 012800 тримеллитаты изооктанола, изононанола, изодеканола и изотридеканола, как, например, ди(н- или изотридецил)фталат.

Другие пригодные системы масел-носителей описаны, например, в патентах ΌΕ-Λ 3826608, ΌΕ-Λ 4142241, ΌΕ-А 4309074, ЕР-А 0452328 и ЕР-А 0548617.

Примерами наиболее подходящих синтетических масел-носителей являются инициированные спиртами простые полиэфиры с 5-35 или, например, 5-30 фрагментами С₃-С₆-алкиленоксидов, выбранных, например, из группы фрагментов пропиленоксида, η-бутиленоксида и ί-бутиленоксида или их смесей. Неограниченными примерами подходящих спиртов инициации являются длинноцепочечные спирты или фенолы, замещенные длинноцепочечными алкилами, причем длинноцепочечный алкильный остаток стоит за неразветвленным или разветвленным С6-С18-алкильным остатком.

В качестве предпочтительных примеров следует назвать тридеканол и нонилфенол.

Другими пригодными синтетическими маслами-носителями являются алкоксилированные алкилфенолы, которые описаны в патенте ΌΕ-А 10102913.6.

Названные масла-присадки применяются в количествах, которые определяются специалистом как пригодные для конкретного использования.

Следующими общеупотребительными добавками являются ингибиторы коррозии, например, на основе склонных к образованию пленок солей аммония органических карбоновых кислот или гетероароматических соединений для защиты от коррозии цветных металлов; антиокислители или стабилизаторы, например, на основе таких аминов, как р-фенилендиамин, дициклогексиламин или их производных, или таких производных фенола, как 2,4-ди-трет-бутилфенол, или пропионовые кислоты 3,5-ди-трет-бутил-4гидроксифенила; другие употребительные деэмульгаторы; антистатические средства; органические соединения с атомом металла, как ферроцен; метилциклопентадиенилмангантрикарбонил; такие присадки, повышающие смазывающую способность, как определенные кислоты жирного ряда, алкениловый эфир янтарной кислоты, бис-(гидроксиалкил)амины жирного ряда, гидроксиацетамиды или касторовое масло; а также красители (маркеры). В некоторых случаях используются также амины для уменьшения рНпоказателя горючего.

Названные моющие присадки с полярными группировками (а)-(1) добавляются к горючему обычно в количестве от 10 до 5000 ррт по весу, в особенности от 50 до 1000 ррт по весу. Другие названные компоненты добавляются в принятых для них количествах.

В качестве горючего или топлива пригодны все известные специалисту марки, например топливо для карбюраторных двигателей, марки которого описаны, например, в υΐΐιηαηη'κ Егоус^е^ оГ ΙηάυκίΓίαΙ СЬет1к1гу, 5.АиГ1. 1990, В;-тб А16, 8. 719ГГ. Подходящими типами топлива согласно изобретению являются также дизельное топливо, керосин и реактивное топливо.

Особенно пригодно топливо для карбюраторных двигателей с максимальным содержанием ароматических соединений 60 об.%, например не более 43 об.%, и максимальным содержанием серы 2000 ррт по весу, например не более 150 ррт по весу.

Содержание ароматических соединений в топливе для карбюраторных двигателей составляет, к примеру, 10-50 или 30-43 об.%, в особенности 32-40 об.%. Содержание серы в топливе для карбюраторных двигателей составляет, к примеру, 2-500 или 5-150 ррт по весу или от 10 до 100 ррт по весу.

Кроме того, подходящее топливо для карбюраторных двигателей может содержать олефины в количестве до 50 об.%, например от 6 до 21 об.%, в особенности 7-18 об.%; бензол в количестве до 5 об.%, например 0,5-1,0 об.%, в особенности 0,6-0,9 об.%, и/или серу в количестве до 25 вес.%, например до 10 вес.% или 1,0-2,7 вес.%, в особенности от 1,2 до 2,0 вес.%.

В частности, можно назвать такие сорта топлива для карбюраторных двигателей, которые одновременно содержат максимум 38 об.% ароматических соединений, максимум 21 об.% олефинов, максимум 50 ррт по весу серы, максимум 1,0 об.% бензола и кислород от 1,0 до 2,7 вес.%.

Содержание спиртов и эфиров в топливе для карбюраторных двигателей может варьироваться в широком диапазоне. Например, типичные максимальные содержания составляют для метанола 15 об.%, для этилового спирта - 65 об.%, для изопропилового спирта - 20 об.%, для третичного бутилового спирта - 15 об.%, для изобутилового спирта - 20 об.% и для эфиров с 5 или более атомами углерода в молекуле - 30 об.%.

Давление пара летом над подходящим согласно изобретению топливом для карбюраторных двигателей составляет обычно не более 70 кПа, особенно 60 кПа (соответственно при 37°С).

Определенное по исследовательскому методу октановое число (ΚΟΖ) топлива для карбюраторных двигателей составляет, как правило, 75-105. Принятый диапазон для соответствующего октанового числа, определенного по моторному методу (ΜΟΖ), равен от 65 до 95.

Названные спецификации определяются обычными способами (ΌΙΝ ΕΝ 228). Более подробно изобретение объясняется на примерах.

Примеры

Пример 1. Подготовительные работы для клонирования νααά-ΗίΚί/νααΕ-ΗίΚί,.

С помощью олигонуклеотидов На1570 и На1571 (На1 572/На1 573) была выполнена полимеразная цепная реакция. В качестве матрицы ДНК была использована геномная ДНК бактерии ВасШик киЬШЕ.

- 13 012800

Полученный фрагмент ПЦР содержит кодирующую последовательность гена уааИ/уааЕ из ВасШиз зиЬΐί1Ϊ8 и на концах по одной рестрикционной нуклеазе Ναοί и Вд111. Фрагмент ПЦР очищали и разрезали с помощью рестрикционных эндонуклеаз Νεοί и Вд111. Этот фрагмент ДНК использовали как вставку, и клонировали в ранее линеаризированный с помощью рестрикционных эндонуклеаз Νεοί и Вд111 вектор рЦЕ60 фирмы Ц1адеп. Созданные таким образом векторы рЦЕ60УАА0#2/рЦЕ60УааЕ#5 могут применяться для экспрессии белков, состоящих из УААИ::Н18₆ или УААЕ::Н18₆.

На1570: дсдсдссса1ддс1сааасадд1ас1да

На1571: дсада1с1ссадссдсдйсйдса1ас

На1572: ддсса1дддайаасаа1адд1д1ас1адд

На1573: дсада1сйасаад1дссййдсйа1айсс

Пример 2. Клонирование уаай-гидрофобина Эе\\А-НЦ,

С помощью олигонуклеотидов КаМ 416 и КаМ 417 осуществляли цепную реакцию полимеразы. В качестве исходного образца ДНК использовали геномную ДНК плесневого грибка АзрегдШиз шби1ап8. Полученный фрагмент ПЦР содержал кодирующую последовательность гена гидрофобина йе\\А и Νконцевое место расщепления фактора Ха протеиназы. Фрагмент ПЦР очищали и разрезали с помощью рестрикционной эндонуклеазы ВатН1. Этот фрагмент ДНК использовали как вставку и клонировали в ранее линеаризированный с помощью рестрикционной эндонуклеазы Вд111 вектор рЦЕ60УААИ#2.

Созданный таким образом вектор #508 может применяться для экспрессии слитого белка, состоящего из УААИ::Ха::бетеА::Н18₆.

КаМ416: ССАССССАТСАСССАТСССТСАСССТТССТАССАСССС

КаМ417: ССССТАССТАСТССАТССАТТСААССССССАТСААСТТСТСССТСТСССС

Пример 3. Клонирование уаай-гидрофобина РойА-НЦ,

Клонирование плазмиды #513 осуществляется аналогично плазмиде #508 при использовании олигонуклеотидов КаМ 434 и КаМ 435.

КаМ434: ССТААССССАТССАТТСААССССССАТСААСТТСТССАТТССТСС

КаМ43 5: ССААТ0666АТСС6А66АТ66А6ССАА660

Пример 4. Клонирование уаай-гидрофобина ВА8Е1-Н15₆.

Клонирование плазмиды #507 осуществляется аналогично плазмиде #508 при использовании олигонуклеотидов КаМ 417 и КаМ 418.

В качестве исходной ДНК использовали искусственно синтезированную последовательность ДНКгидрофобин ВА8Е1 (см. дополнение, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 11 и 12).

КаМ417: ССС0ТА6СТА6Т66АТССАТТ6АА66СС6САТ6АА6ТТСТСС6ТСТСС0С

КаМ418: СТ6ССАТТСА6666АТСССАТАТ66А66А666А6АСА0

Пример 5. Клонирование уаай-гидрофобина ВА8Е2-Н15₆.

Клонирование плазмиды #506 осуществляется аналогично плазмиде #508 при использовании олигонуклеотидов КаМ 417 и КаМ 418.

В качестве исходной ДНК использовалась искусственно синтезированная последовательность ДНКгидрофобин ВА8Р2 (см. приложение, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 13 и 14).

КаМ418: СТ6ССАТТСА6666АТСССАТАТ66А66А666А6АСА0

Пример 6. Клонирование уаай-гидрофобина 8С3-НЦ,.

Клонирование плазмиды #526 осуществляется аналогично плазмиде #508 при использовании олигонуклеотидов КаМ 464 и КаМ 465.

В качестве исходной ДНК использовалась кДНК 8с11ухор11у11шт соттипе (см. приложение, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 9 и 10).

КаМ464: С6ТТАА66АТСС6А66АТ6ТТ6АТ66666Т0С

КаМ465: 6СТААСА0АТСТАТ6ТТС6ССС6ТСТСССС6ТС0Т

Пример 7. Ферментация рекомбинантного штамма Е.сой уаай-гидрофобин Эе\\А-Н|8₆.

Инокуляция 3 мл жидкой ЬВ-среды с экспримирующим штаммом Е.сой уаай-гидрофобин Эе\\АН18₆ в сосуде Грайнера на 15 мл. Инкубация 8 ч при 37°С на мешалке с 200 об/мин. По две колбы Эрленмейера емкостью 1 л с дефлектором и 250 мл ЬВ-среды (+100 мкг/мл ампициллина) засевали 1 мл соответствующей предварительной культуры и инкубировали 9 ч при 37°С на качалке с 200 об/мин.

13,5 л ЬВ-среды (+100 мкг/мл ампициллина) засевали в 20 л ферментере 0,5 л предварительной культуры (ΟΌ_600ηιη 1:10 измерено по сравнению с Н₂О). При ОЭ_60пт ~3,5 добавление 140 мл 100 мМ 1РТО. Через 3 ч ферментер охлаждали до 10°С и ферментативный бульон центрифугировали. Клеточный осадок использовали для последующей очистки.

Пример 8. Очистка рекомбинантного гидрофобин-слитого белка.

(Очистка гидрофобин-слитого белка, который содержит С-концевую Н18₆-метку).

100 г клеточного осадка (100-500 мг гидрофобина) вместе с 50 мМ натрийфосфатного буфера, рН 7,5 доводили до 200 мл и ресуспендировали. Суспензию обрабатывали с помощью ийгаФггах Тур Т25 Цапке ипй Кипке1; 1КА-ЬаЬойесйшк) в течение 10 мин и затем инкубировали в течение 1 ч при комнат

- 14 012800 ной температуре с 500 единицами бензоназы (Мегск, ЭагтйаШ; Вей.-№. 1.01697.0001) для расщепления нуклеиновых кислот. Перед переведением клеток в удобное для переработки состояние фильтровали с помощью стеклянного фильтрующего элемента (Р1). Для перевода клеток в удобное для переработки состояние и для разрезания остаточных геномных ДНК осуществляли две операции по гомогенизации при 1,500 бар (М|сгоПшШхег М-110ЕН; МкгойшШск Согр.). Гомогенизат центрифугировали (8огуа11 ПС5В, С8Л-Во1ог, сосуд для центрифуги емкостью 250 мл, 60 мин, 4°С, 12.000 об/мин, 23.000 д), жидкость сверху поставили на лед, а осадок после центрифугирования ресуспендировали в 100 мл натрийфосфатного буфера, рН 7,5. Центрифугирование и ресуспендирование повторяли трижды, причем натрийфосфатный буфер при третьем повторе содержал 1% 8Ό8 (=додецилсульфат натрия). После ресуспендирования перемешивали 1 ч и осуществляли заключительное центрифугирование (8огуа11 К.С-5В, С8Л-По1ог. сосуд для центрифуги емкостью 250 мл, 60 мин, 4°С, 12.000 об/мин, 23.000 д). В соответствии с 8Ό8РЛСЕ-аиализом гидрофобин после заключительного центрифугирования содержится в жидкости (фиг. 1). Опыты показали, что гидрофобин, по-видимому, содержится в форме телец включений в соответствующих клетках Е.сой. 50 мл жидкости, содержащей гидрофобин, наносили на колонку с 50 мл никель-сефарозы высокого качества 17-5268-02 (Лтегайат), которая приведена к равновесию с помощью 50 мМ буфера Тп5-С1 рН 8,0. Колонку промывали 50 мМ буфера Тп5-С1 рН 8,0 и гидрофобин элюировали затем с помощью 50 мМ буфера Тгщ-С1 рН 8,0, содержащего 200 мМ имидазола. Для удаления имидазола раствор подвергали диализу против 50 мМ буфера Тп5-С1 рН 8,0.

На фиг. 1 показана очистка полученного гидрофобина.

След А: нанесенный на колонку слой никель-сефарозы (1:10 разбавление).

След В: протекание=элюат стадии промывки.

Следы С-Е: ΘΌ 280 максимумы фракций элюирования (АР1, АР2, АР3).

След Е отображает нанесенный маркер.

Гидрофобин на фиг. 1 имеет молекулярный вес около 53 кД. Более мелкие полосы представляют отчасти продукты разложения гидрофобина.

Пример 9. Технологические испытания; характеристика гидрофобина с помощью изменения краевого угла капли воды на стекле.

Субстрат:

стекло (оконное стекло, ЗиййеиЬсйе С1а§, Маппйепп).

Использовали очищенный в соответствии с примером 8 гидрофобин.

Концентрация гидрофобина в растворе: 100 мкг/мл, раствор содержит еще 50 мМ натрийацетатного буфера, а также 0,1% полиоксиэтилен(20)-сорбит-монолаурата (Тюееп® 20), величина рН раствора: 4.

Погружение стеклянной пластинки в этот раствор на ночь (температура 80°С).

После чего покрытая гидрофобином стеклянная пластинка извлекается из раствора и промывается дистиллированной водой.

После этого инкубация 10 мин/80°С/1% раствор 8Ό8 (=додецилсульфата натрия) в дистиллированной воде.

Повторное промывание в дистиллированной воде.

Образцы сушили на воздухе и определяли краевой угол (в градусах) между каплей воды в 5 мкл и обработанной стеклянной поверхностью при комнатной температуре.

Измерение краевого угла осуществляли на приборе Эа1ар11у51с5 Соп1ас1 Апд1е 8у51ет ОСА 15+, 8оП\уаге 8СА 20.2.0. (ЫоуетЬег 2002). Измерение происходило в соответствии с данными изготовителя.

Необработанное стекло давало краевой угол 30±5°.

Стеклянная пластинка, покрытая гидрофобином в соответствии с примером 8 (уаай-йе^А-Ы8₆), давала краевой угол 75±5°.

Увеличение краевого угла: 45°.

Пример 10.

Применение концентрата гидрофобина (уаай-Ха-йе^А-Нщ₆) в качестве присадки к горючему. Принцип исследования.

Современное горючее содержит обычно ряд различных присадок (так называемый пакет присадок). Если на этапе изготовления или эксплуатации в горючее попадет вода, то эти присадки могут проявить эмульгирующее действие и привести к образованию нежелательной эмульсии из горючего и воды. Для предотвращения этого эффекта к горючему добавляются деэмульгаторы.

Испытания деэмульгатора проводились с концентратом гидрофобина согласно примеру 8 (8ЕО ΙΌ N0: 19 и 20).

Концентрат гидрофобина разбавлялся этиловым спиртом и добавлялся к стандартному в Европе высокосортному топливу (согласно стандарту ΕΝ 228), в котором уже содержалось 725 мг/кг специального эффективного пакета присадок А. Этот пакет присадок состоит из полиизобутенамина Кегосот Р1ВА, смесей масел-носителей, растворителя, ингибитора коррозии и модификатора трения.

Приготовлялись пробы топлива с гидрофобином в количествах 0,01, 0,03, 0,05, 0,07, 0,14 и 0,28 мг/кг. В качестве сравнительного образца (10-Υ1) служило топливо с пакетом присадок А без гид

- 15 012800 рофобина. В следующем сравнительном испытании (10-У2) использовался принятый в торговле деэмульгатор Ό на основе фенольных полимеров (АЭХ 606, фирмы БиЬпхо1) в количестве 1,45 мг/кг.

С каждой пробой топлива были проведены эмульсионные тесты согласно стандарту ОГИ 51415. Для этого интенсивно перемешивались по 80 мл топлива и 20 мл воды. Затем наблюдался процесс расслоения смеси в зависимости от времени. Результаты оценивались на основании заданных в стандарте норм, причем 1 оценивалось очень хорошее расслоение, а большими цифрами - худшее расслоение. Детали приведены в указанном стандарте ЭШ.

В табл. 1 представлены результаты испытаний. Приведены оценки слоев фазового разделения после 1, 5, 30 и 60 мин. Как правило, результат 1 или 1Ь получался после 5 мин.

Таблица 1

№		1 мин.	5 мин.	30 мин.	60 мин.
10 - V1 (сравнение)	А	4	4	2	1Ъ
10 - У2 (сравнение)	А + 1,45 мг/кг О	1Ь	1	1	1
10- 1	А + 0,01 мг/кг Н.	1Ъ	1	1	1
10-2	А + 0,03 мг/кг Н.	1Ь	1	1	1
10-3	А + 0,05 мг/кг Н.	1Ь	1	1	1
10-4	А + 0,07 мг/кг Н.	1Ь	1	1	1
10-5	А + 0,14 мг/кг Н.	1Ь	1	1	1
10-6	А + 0,28 мг/кг Н.	1	1	1	1

Комментарии.

Без добавки деэмульгатора наблюдается лишь очень медленное разрушение эмульсии. Оценка 4 неприемлема, речь идет о стабильной эмульсии.

Гидрофобины уже в крайне малых количествах оказывают очень хорошее деэмульгирующее действие. Всего 0,01 ррт гидрофобина в течение 1 мин приводит к приемлемому результату. Такой же эффект, как с 0,07 мг/кг гидрофобина, получается при добавлении к топливу 1,45 мг/кг принятого в торговле деэмульгатора на основе фенольных полимеров. При применении гидрофобина достаточно 1/20 количества традиционного деэмульгатора для получения такого же эффекта.

Сравнительный пример 11. Применение других белков в качестве присадки к топливу.

Аналогично примеру 10 исследовались белки, кроме гидрофобина, для применения в горючем.

Испытания проводились с бычьим сывороточным альбумином (БСА) и казеином. Эти белки доступны в торговой сети. Далее использовался уааб согласно 8ЕО ΙΌ N0 15 и 16, поскольку это партнер слияния, не связанный самостоятельно с гидрофобином.

Соответствующий белок в концентрации 0,07 мг/кг добавлялся к высококачественному топливу торговой марки (согласно ЕN 228), которое уже содержало упомянутый выше пакет присадок А. Для сопоставления служило топливо только с пакетом присадок А без белка.

Тестирование эмульсий выполнялось согласно стандарту ЭШ 51415, как описано выше. Результаты испытаний приведены в табл. 2.

Таблица 2

Применяемые белки способствовали разрушению эмульсии, но скорость деэмульгирования была ниже, чем при применении гидрофобинов.

Пример 12. Применение концентрата гидрофобина (Уааб-Ха-бечА-Н1з₆) в качестве деэмульгатора для сырой нефти.

Испытания проводились с концентратом гидрофобина согласно примеру 8 (8Е0 ΙΌ N0: 19 и 20).

- 16 012800

Для испытаний к 50 мл сырой нефти (пробы от АО ^1п1ег8Йа11, зонд 301; содержание остаточной воды после добавления обычных деэмульгаторов около 3%) добавлялся концентрат гидрофобина в разных количествах. Концентрация гидрофобина в сырой нефти составляла 1, 10 и 40 ррт. После гомогенизации смеси центрифугировались в течение 10 мин при 2000 об/мин. Результаты испытаний воспроизведены в табл. 3.

Таблица 3

При добавлении 10 и 40 ррт концентрата гидрофобина образуется подавляющая часть свободной водной фазы.

Пример 13. Применение концентрата гидрофобина (Уааб-Ха-бе\\'Л-Н|5₆) согласно примеру 8 для разделения полимеров на фракции.

Испытания проводились с концентратом гидрофобина согласно примеру 8 (8ΕΟ Ш N0: 19 и 20).

В два химических стакана помещалось по 150 г полиакриловой кислоты в виде ее натриевой соли (8ока1ап® СР 10 8; молекулярный вес 4000 г/моль, согласно ΌΕ 19950941 А1), затем в каждый добавлялось по 75 г изопропанола. Перемешивание в течение 5 мин, затем добавлялось по 146 г изопропанола и воды (в соотношении 1:1) и смесь перемешивалась в течение 5 мин.

В химический стакан А добавлялись 50 ррт гидрофобина (1,64 м, 11,3 мг/мл) и в течение 5 мин смесь перемешивалась. Гидрофобин образовывал белые слизи в прозрачном растворе, которые спустя 5 мин полностью растворялись. В оба химических стакана добавлялось по 19,75 г 50%-ной №1ОН и смесь перемешивалась в течение 15 мин.

С гидрофобином раствор сразу же приобретал молочный цвет, без добавки гидрофобина раствор становился очень мутным. После 15 мин перемешивания содержимое стаканов пропускалось через делительную воронку емкостью 500 мл, встряхивалось и проводилось наблюдение, как долго длилось разделение фаз.

В пробе с гидрофобином четкое разделение фаз наблюдалось через 10 мин, без добавки гидрофобина сначала образовывался пенный «промежуточный слой», но четкого разделения фаз не наблюдалось. Без добавки гидрофобина четкая граница между фазами образовывалась лишь по прошествии 40 мин.

Продолжительность процесса разделения до появления четкой границы между фазами:

с гидрофобином: 12 мин, без гидрофобина: 40 мин.

Пример 14. Сравнительный пример 15. Применение слитого гидрофобина (Уааб-Ха-бе\\'Л-Н|5₆) и бычьего сывороточного альбумина (БСА) в качестве деэмульгатора для эмульсии масло-в-воде при 55°С.

Исследования проводились с концентратом гидрофобина согласно примеру 8 (8ΕΟ Ш N0: 19 и 20) и с доступным в продаже раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА).

Проверка способности деэмульгирования осуществлялась следующим образом: в качестве масла использовалось масло для гидросистем.

мл дистиллированной воды вливалось в мерный цилиндр емкостью 100 мл и добавлялся соответствующий белок в количестве 5 ррт относительно воды или 2,5 ррт относительно всего состава. Затем добавлялись 40 мл гидрофобина и система нагревалась в водяной бане до температуры 55°С. Время термообработки составляло 20 мин. После перемешивания в течение 5 мин при 1500 об/мин образовывалась эмульсия масла и воды. Таким образом, масло эмульгировало в водную фазу. Затем наблюдалось разделение фаз. Результаты отображают количество вновь отделенной водной фазы в мл.

В одной серии испытаний использовался водный раствор обоих белков без изменения. Результаты представлены на диаграмме 1 (фиг. 2).

Во второй серии испытаний рН раствора обоих белков сначала доводился до рН 1 при комнатной температуре с добавлением НС1 и выдерживался 24 ч при рН 1. Затем с помощью №1ОН показатель рН вновь устанавливался равным 7. Результаты представлены на диаграмме 2 (фиг. 3).

Комментарии.

Скорость деэмульгирования эмульсии масло-в-воде при добавлении БСА лишь незначительно выше по сравнению с пробой без деэмульгатора. При добавлении гидрофобина наблюдается четкое ускорение деэмульгирования.

- 17 012800

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Применение по меньшей мере одного гидрофобина для улучшения разделения фаз в составах, содержащих по меньшей мере две жидкие фазы.
2. Применение по п.1, причем по меньшей мере один гидрофобин является слитым гидрофобином.
3. Применение по п.2, отличающееся тем, что для слитого гидрофобина речь идет по крайней мере об одном выбранном из группы (ЗЕЦ ГО N0: 20), (ЗЕЦ ГО N0: 22) или (ЗЕЦ ГО N0: 24) гидрофобине.
4. Применение по одному из пп.1-3, причем состав, содержащий по меньшей мере две жидкие фазы, выбран из группы, состоящей из составов, содержащих масло и воду;

составов, содержащих горючее или топливо и воду;

реакционных смесей, содержащих по меньшей мере две жидкие фазы.
5. Применение по одному из пп.1-4, причем используется по крайней мере один гидрофобин в количестве от 0,0001 до 1000 ррт относительно всего состава.
6. Способ разделения по крайней мере двух жидких фаз в составе, содержащем по крайней мере две жидкие фазы, включающий добавление к составу по крайней мере одного гидрофобина.
7. Способ по п.6, причем используется по крайней мере один гидрофобин в количестве от 0,0001 до 1000 ррт относительно всего состава.
8. Композиция, содержащая по крайней мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из горючих, топлив или растворимых в воде или в масле полимерных растворов, и по меньшей мере одного гидрофобина, причем гидрофобин содержится в композиции в количестве от 0,0001 до 1000 ррт относительно всей композиции.
9. Композиция по п.8, причем композиция содержит, по крайней мере, топливо или горючее, и гидрофобин содержится в композиции в количестве от 0,001 до 0,5 ррт относительно всей композиции.
10. Композиция по одному из пп.8 или 9, причем белок является слитым гидрофобином.

- 18 012800

Диаграмма 1. Сравнение гидрофобина (Н*белок А) и бычьего сывороточного

Диаграмма 2. Сравнение гидрофобина (Н*белок А) и бычьего сывороточного альбумина, перед испытанием пробы выдерживались 24 ч при рН 1