JP3537487B2 - ムラサキイガイ接着蛋白質遺伝子 - Google Patents
ムラサキイガイ接着蛋白質遺伝子Info
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Description
できる接着剤の原料となるペプチドを組換えDNA技術
を用いて製造するために用いる遺伝子DNAに関する。
接着蛋白質をコードするDNAを組み込んだ組換え体D
NAを含む微生物や培養細胞を培養液中で培養し、該培
養物中に蓄積される該ポリペプチドを採集することによ
り、得られる該ペプチドは、接着剤の原料として広い用
途で利用されることが期待される。
様々な種類のものが開発されている。そのうちの多くの
ものは一旦乾燥条件下で接着してしまえば湿潤環境にお
かれてもその強度を維持できる。しかし、湿潤な条件下
や水中で接着を開始した場合、有効な強度に達すること
ができる接着剤は存在しなかった。
するために接着蛋白質を合成して自己を基物に接着させ
ることができる。この接着蛋白質には大まかには2種類
あり(Rzepecki, L.M., Hansen, K.M. and Waite, J.H.
Biological Bulletin 183:123-137, 1992)、両者の協
調作用により強固な接着が実現されることが想像され
る。一方の蛋白質(以降、第1蛋白質と称する)は主と
して数十個のAla-Lys-Pro-Ser-Tyr-Pro-Pro-Thr-Tyr-Ly
s という10アミノ酸の繰り返しにより構成される蛋白質
で、配列中のProおよびTyr残基はしばしば修飾されてそ
れぞれHydroxyprolineおよびDopa残基に変換されている
ことが知られており、Dopaのキノン架橋が接着に関与す
ることが推測されている(J.H.Wait, Int.J.Adhesion a
nd Adhesives, 7:9-14, 1987)。この蛋白質のcDNA
についてはすでに明らかにされ、その一部の配列を用い
て、微生物に作らせる方法がすでに報告されている(特
開平1-104180号公報)。もう一方の蛋白質(以降、第2
蛋白質と称する)はCys残基をその組成中に含む蛋白質
で、Cys残基のジスルフィド結合により、硬化する蛋白
質であると想像されるが、ムラサキイガイ足中に多量に
含まれることが知られているにもかかわらず、そのポリ
ペプチドの配列は一部の断片ペプチドのアミノ酸配列以
外は明らかにされていなかった。
の手法を用いてムラサキイガイ接着蛋白質の第2蛋白質
を生産すべく、その生産に係る遺伝子を提供することを
目的とする。
質の第2蛋白質の配列を得るために、日本産のムラサキ
イガイより前記第2蛋白質をコードするcDNAを単離
した。日本産のムラサキイガイ(Mytilus galloprovinc
ialis)はチレニアイガイとも呼ばれる地中海系の種で
ある(Wilkins et al.Biol.J.Linnean Soc.,20:365-37
4,1983)。研究の結果、日本産ムラサキイガイの足から
抽出したmRNAから作成したcDNAライブラリーか
ら、6個のCys残基を一定の規則に基づいて含む32〜
34のアミノ酸残基からなるモチーフを、4〜9アミノ
酸残基のスペーサー領域を挟んで繰り返す構造から主と
して構成され、すでに知られているムラサキイガイ接着
蛋白質の第2蛋白質の断片配列と相同性のある配列を持
つcDNAを単離することに成功し、さらにその塩基配
列を決定して本発明を完成した。
れるアミノ酸配列をコードするムラサキイガイ接着蛋白
質遺伝子である。この遺伝子のDNA配列としては、配
列番号1で表される塩基配列を例示することができる。
リス(Mytilus edulis)又はミチルス・ガロプロヴィンシ
アリス(Mytilus galloprovincialis) を起源とし、塩基
配列の長さが1.5Kbであり、配列番号3、4、又は5で
表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする
ムラサキイガイ接着蛋白質遺伝子である。
遺伝子を取得するための材料としては、日本産のムラサ
キイガイ(Mytilus galloprovincialis)を用いるのが
好ましいが、その他のムラサキイガイ、例えば、ミチル
ス・エドゥリス(Mytilus edulis)等を用いることもでき
る。本発明遺伝子は以下の手順で得ることができる。ま
ずムラサキイガイの足をチオシアン酸グアニジン等によ
り可溶化し、フェノール/クロロホルムによる抽出を行
い、イソプロパノールにより沈殿させることにより全R
NAを得ることができる。全RNAを得る方法はこの方
法に限定されるものではなく、LiCl沈殿法や塩化セ
シウム溶液に重層して遠心することによっても得られ
る。全RNAから、オリゴdTセルロースカラムを用い
てポリアデニル酸鎖を有するRNA(ポリA−RNA)
を調製する。このポリA−RNAを鋳型として逆転写酵
素を用いて2本鎖DNAを調製する。この2本鎖DNA
の合成はS1ヌクレアーゼ法やオカヤマ−バーグ法によ
り行ない得るが、市販のcDNA合成キットを用いて合
成することも可能である。次いで、得られたcDNAを
適当なベクターに挿入し、このベクターを適当な宿主に
導入して増幅させるとともに目的のDNAを持つクロー
ンを選択する。ベクターはλファージ由来の各種ベクタ
ーたとえばλgt10やλZAPIIなど、あるいはp
BR322等のプラスミドベクターを用いることができ
る。目的クローンの選択にはすでに知られているムラサ
キイガイ接着蛋白質の第2蛋白質の部分配列の一部に相
当するオリゴヌクレオチドを合成してプローブとして用
い、これに強く結合するクローンを選択すればよい。配
列の決定はサンガー法やマキサム−ギルバート法等の一
般的な方法によって決定できる。以上の手順により翻訳
開始コドンから終止コドン、さらにポリアデニル酸鎖付
加シグナルを含む第2蛋白質cDNAの全長を単離する
ことができる。
し、微生物や培養細胞に導入して発現させることによ
り、当該ペプチドを大量調製することが可能である。こ
の際、当該DNAはシグナル部分を含むため、当該ペプ
チドを宿主細胞外に分泌させることができる。また、シ
グナル部分を除去して適当なベクターに組み込んで用い
ることにより細胞内で生産させることも可能である。
の作製 岩手県宮古市宮古湾で採集した殻長3−5cmのムラサ
キイガイ12個体の足をチオシアン酸グアニジン、クエ
ン酸ナトリウム、N−ラウリルザルコシン酸ナトリウ
ム、β−メルカプトエタノール等の溶液中で組織を機械
的に破砕し、フェノールおよびクロロホルムによる抽出
を行なって蛋白質等を除去したのち、イソプロパノール
を加えて沈殿させることにより全RNAを抽出し、オリ
ゴdTセルロースカラムに導通してポリアデニル酸鎖を
有するRNA(ポリA−RNA)を調製した。この操作
により約2μgのポリA−RNAが得られた。次にこの
ポリA−RNAを鋳型として逆転写酵素を用いて2本鎖
cDNAを調製した。この操作はアマシャム社のcDN
A合成キットを用いて添付のプロトコールにしたがって
行なった。ついで得られた2本鎖DNAにEcoRIア
ダプターを付加し、ファージベクターλgt10(アマ
シャム〔Amersham〕社製)に挿入した。この操作は、ア
マシャム社のcDNA合成システムを用いて添付のプロ
トコールにしたがって行なった。挿入の完了したファー
ジベクターは同キットに添付のインビトロパッケージン
グ溶液を用いて組換えDNAをファージ内に封入させ
た。封入の完了した組換えファージは、大腸菌NM51
4株(アマシャム〔Amersham〕社製)に感染させ、増幅
した。
組換えファージの選択 実施例1で得られた組換えファージを増幅させ、得られ
た5万個のプラークをナイロンメンブレン ハイボンド
N上に固定した。ついでムラサキイガイ第2接着蛋白質
の断片ペプチド配列の一部の相補鎖に相当するオリゴヌ
クレオチドプロープTA(T,C)AA(C,T)GA
CGACGACおよびTA(T,C)AA(C,T)G
ATGATGATをミリジェンサイクロンDNA合成機
により合成し、それぞれα32P−ATPによる端末ラベ
ルにより標識して、プラークハイブリダイゼーションを
行なった。その結果、プローブTA(T,C)AA
(C,T)GACGACGACでスクリーニングした2
0000クローンより、100個以上のプローブと結合
するプラークが得られた。これらのうち10個のプラー
クを任意に選び、挿入されているcDNAの長さをアガ
ロース電気泳動により調べて、最も長い挿入断片をもつ
ものについてファージベクターから制限酵素EcoRI
を用いて挿入断片を切り出し、プラスミドベクターpBlu
escriptIISK(+)(ストラタジーン〔Stratagene〕社製)
に挿入した。このプラスミドベクターをE.coli-Mgfp2-2
-7に導入した。E.coli-Mgfp2-2-7は、工業技術院生命工
学工業技術研究所に寄託番号FERM P-14288として寄託さ
れている(寄託日:平成6年4月21日)。
定 実施例2で得られた挿入断片の配列をアプライドバイオ
システムズ社製373ADNAシーケンサーおよびシー
ケンシングキットを用いてDNA配列を決定した。その
結果、この挿入断片が接着蛋白質の全長を含むDNA配
列であることが判明した。得られた接着蛋白質遺伝子
は、配列番号1に示す通り、翻訳開始コドンから翻訳終
了コドンまで473アミノ酸配列をコードする全長15
15bpの配列であり、473アミノ酸のうち最上流か
ら17残基がシグナルペプチド、続く31残基が非繰り
返し領域であり、その下流に6個のCys残基を一定の規
則に基づいて含む32−34個のアミノ酸残基からなる
モチーフ、すなわち配列番号3、4又は5で表されるア
ミノ酸配列を4−9アミノ酸残基のスペーサー領域を挟
んで繰り返す繰り返し領域、さらに下流には13アミノ
酸残基の非繰り返し領域が存在した。翻訳終了コドンの
下流側の非翻訳領域にはポリアデニル酸鎖付加シグナル
ATTAAAが存在し、そのさらに下流にポリアデニル
酸鎖が存在した。
子を提供する。本発明の遺伝子から作られる蛋白質は、
接着剤の原料として極めて有用である。
is) 配列
is) 配列
is) 配列
is) 配列
is) 配列
Claims (3)
- 【請求項1】 配列番号2で表されるアミノ酸配列をコ
ードするムラサキイガイ接着蛋白質遺伝子。 - 【請求項2】 DNA配列が配列番号1で表される請求
項1記載のムラサキイガイ接着蛋白質遺伝子。 - 【請求項3】 ミチルス・ガロプロヴィンシアリス( My
tilus galloprovincialis )を起源とし、塩基配列の長
さが1.5kbであり、配列番号4で表されるアミノ酸配列
を含むポリペプチドをコードするムラサキイガイ接着蛋
白質遺伝子。
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JP09026694A JP3537487B2 (ja) | 1994-04-27 | 1994-04-27 | ムラサキイガイ接着蛋白質遺伝子 |
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JPH07289261A JPH07289261A (ja) | 1995-11-07 |
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-
1994
- 1994-04-27 JP JP09026694A patent/JP3537487B2/ja not_active Expired - Fee Related
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Biol. Bull., 186(3), pp349−355, 1994 |
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EP1776463A4 (en) * | 2004-08-09 | 2008-12-24 | Battelle Energy Alliance Llc | CLONING AND EXPRESSION OF THE RECOMBINANT ADHESION PROTEIN MEFP-2 FROM THE MUSSEL MYTILUS EDULIS |
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