EA009443B1 - Получение рекомбинантных генов в saccharomyces cerevisiae - Google Patents

Abstract

Данное изобретение относится к способам получения и обнаружения рекомбинантных ДНК-последовательностей в Saccharomycescerevisiaeи плазмидам и клеткам Saccharomycescerevisiaeиспользуемым для проведения способов по изобретению.

Description

Настоящее изобретение в целом относится к способам получения и обнаружения рекомбинантных последовательностей ДНК в Бассйаготусск ссгсуШас, к плазмидам и клеткам 8. ссгсуШас, используемым для проведения способов изобретения.

Последовательности ДНК, к которым относятся эти способы, включают в себя кодирующие или не кодирующие белок последовательности; они могут также состоять из более крупных непрерывных сегментов, которые содержат более одной кодирующей последовательности, с некодирующими последовательностями интронов, таких как интроны, которые могут принадлежать к пути биосинтеза.

Микробное и ферментативное получение таких веществ, как ферменты и другие белки, является важной с экономической точки зрения темой. Ферменты являются биокаталитически активными белками, не только ответственными за метаболизм природных соединений и организмов, но также используемыми для промышленного производства природных и неприродных соединений. Ферменты или соединения, продуцируемые при помощи ферментов, могут быть использованы для получения лекарственных средств, косметических средств, пищевых продуктов и т.д. Однако промышленное применение ферментов в значительной степени затруднено из-за их специфичности в отношении мишени и специфических условий, при которых они могут функционировать. Другие белки имеют терапевтические применения в области здравоохранения и ветеринарии. Важные классы важных для медицины белков включают в себя цитокины и факторы роста.

Белки, ферменты и пути метаболизма с новыми или улучшенными функциями и свойствами могут быть получены либо поиском среди в значительной степени неизвестных природных разновидностей, либо улучшением известных в настоящее время природных белков или ферментов. Последний подход может быть более подходящим для создания свойств, на которые вряд ли были направлены природные эволюционные процессы.

Одним из многообещающих подходов создания таких новых желательных свойств и реконструкции ферментов, других белков, некодирующих последовательностей или путей метаболизма является направленная молекулярная эволюция. Обычно такая прямая эволюция ДНК-последовательностей достигалась с помощью способов, таких как сайт-направленный мутагенез, сайт-направленный множественный мутагенез или кассетный мутагенез, случайный мутагенез и ПЦР с ошибающейся полимеразой. Недавно большое внимание привлекли подходы перетасовки генов для оптимизации тонкой настройки свойств ферментов или белков. Благодаря этим направленным эволюционным способам могут быть получены ферменты, которые могут улучшать существующую технологию, продуцировать новые продукты и расширять способности синтетической химии.

Существует ряд различных способов мутагенеза, таких как случайный мутагенез, сайтнаправленный мутагенез, кассетный мутагенез с использованием олигонуклеотидов или точковый мутагенез с использованием ПЦР с ошибающейся полимеразой. Случайный мутегенз, например, влечет за собой получение большого количества случайным образом распределенных мутаций в виде замены нуклеотидов в клонируемых ДНК-фрагментах в результате обработки химическими веществами, такими как азотистая кислота, гидразин и т.д. ПЦР с ошибающейся полимеразой была разработана для введения случайных точковых мутаций в клонированные гены. Модификации, которые уменьшают точность ПЦРреакции, включают в себя увеличение концентрации МдС1₂, добавление МпС1₂ или изменение относительных концентраций четырех 6ΝΤΡ.

Эти обычно используемые способы мутагенеза сконцентрированы на оптимизации индивидуальных генов, имеющих дискретные и селектируемые фенотипы. Обычная стратегия заключается в клонировании гена, идентификации дискретной функции этого гена, установлении анализа, при помощи которого он может контролироваться, мутирование выбранных положений в этом гене и отбор вариантов этого гена для улучшения известной функции гена. Затем вариант, имеющий улучшенную функцию, может быть экспрессирован в желаемом типе клеток. Повторяемые циклы способов мутагенеза могут проводиться для получения желаемых свойств фермента.

Каждый из этих общепринятых подходов имеет свой подход для поиска последовательностей. Стратегии, используемые в описанных выше способах поиска последовательностей, очень различны. Проведение поиска в насыщающем сайт-направленном мутагенезе включает в себя процесс помещения каждой возможной пермутации в интересующий сайт. Для белка эта процедура заключается в замене аминокислоты в интересующем сайте на 19 других аминокислот и поиск в полученной библиотеке улучшенных мутантов. На основе расстояния последовательности это означает, что очень малый район был подвергнут очень тщательному поиску. В сравнении с этим, при кассетном мутагенезе происходит встраивание случайной пептидной последовательности в конкретный район белка, обеспечивая менее тщательную выборку (отбор проб) большего, определенного района расстояния последовательности. ПЦР с ошибающейся полимеразой включает в себя повторяемое копирование последовательности с введением низкого, но существенного количества ошибок. В этом случае достигается редкая выборка менее определенного района расстояния последовательности. В каждой из этих стратегий наилучший мутант, полученный в каждом раунде отбора, используют для инициации следующего раунда.

Однако обычные подходы мутагенеза для эволюции новых свойств ферментов имеют ряд недостатков. Во-первых, они применимы только к генам или последовательностям, которые были клонированы и

- 1 009443 функционально охарактеризованы. Во-вторых, эти подходы можно использовать в отношении генов, которые имеют дискретную функцию. Таким образом, множественные гены, которые вместе придают единый фенотип, обычно не могут быть оптимизированы таким образом. Наконец, с помощью этих подходов можно исследовать только очень ограниченное количество из общего числа пермутации, даже для единственного гена. Ввиду этих недостатков общепринятые подходы мутагенеза являются недостаточными для улучшения клеточных геномов в отношении многих полезных свойств. Например, для улучшения способности клетки экспрессировать белок могут требоваться изменения эффективности транскрипции, модификаций трансляции и посттрансляционных модификаций, секреции или протеолитической деградации продукта гена. Таким образом, может быть необходимой модификация дополнительных генов, играющих роль в одном или нескольких клеточных механизмах, для экспрессии белка с новыми свойствами. Попытки индивидуальной оптимизации всех этих генов, имеющих такую функцию, были бы фактически невозможной задачей.

Большинство проблем, связанных с общепринятыми подходами мутагенеза, могут быть преодолены подходами перетасовки генов. Перетасовка генов влечет за собой случайным образом рекомбинирующиеся различные последовательности функциональных генов, делая возможным молекулярное смешивание природно сходных или случайным образом мутированных генов. Перетасовку ДНК или генов, или вариации этих способов, использовали для улучшения активности, стабильности, укладки и свойств узнавания ферментов. В сравнении с общепринятыми подходами мутагенеза с перетасовкой генов, вероятность получения мутантов с улучшенным фенотипом является значимо более высокой. Перетасовка генов фундаментально отличается от общепринятых стратегий тем, что она рекомбинирует благоприятные мутации комбинаторным образом. Таким образом, с помощью перетасовки ДНК можно производить поиск гораздо больших районов расстояния последовательности гораздо более разреженно и со смещением в сторону продуцирования функциональных последовательностей. Таким образом, она позволяет сохранять более полезные мутации из каждого раунда отбора в следующем раунде, так как позволяет вносить информацию последовательности из более чем одного источника. В то время как общепринятые стратегии позволяют также фиксировать отрицательные мутации, это не происходит для подходов с перетасовкой генов. Таким образом, неудивительно, что стратегии перетасовки генов дают гораздо более поразительные результаты.

Подходы перетасовки ДНК или генов основаны на событиях рекомбинации между районами с определенной гомологией или между сегментами идентичности. Ключевым организмом, используемым в экспериментах для испытания генетической рекомбинации в эукариотах, были почкующиеся дрожжи 8ассйатотусс8 сстсуШас. Преимуществом исследования этих процессов в простом одноклеточном организме является легкость манипуляции ДНК-последовательностями и возможность исследования специфических событий рекомбинации, индуцируемых синхронно в большой доле клеток. Кроме того, на протяжении нескольких последних десятилетий были накоплены знания как в отношении технологии ферментации, так и в отношении основной генетики этого организма, который является в настоящее время наиболее изученным эукариотическим организмом на молекулярном уровне. Вследствие своей непатогенной природы, способности секреции и возможности гликозилирования 8. сстсуШас является предпочтительным организмом-хозяином для клонирования генов и экспрессии генов. Таким образом, технической проблемой, лежащей в основе данного изобретения, является получение способов и средств для получения рекомбинантных мозаичных генов 8ассйаготусс5 сстсуШас.

Настоящее изобретение решает эту основную техническую проблему благодаря способу получения и обнаружения рекомбинантных ДНК-последовательностей в 8ассйаготусс5 сстсуШас, предусматривающего стадии:

a) получения первых диплоидных клеток 8ассйатотусс8 сстсуШас, несущих в определенном локусе генома первую рекомбинационную кассету, содержащую первую, подлежащую рекомбинации ДНКпоследовательность, которая фланкирована по меньшей мере первой и второй маркерными последовательностями, и в аллельном положении вторую рекомбинационную кассету, содержащую вторую рекомбинируемую ДНК-последовательность, которая фланкирована по меньшей мере третьей и четвертой маркерными последовательностями,

b) индукции споруляции первых диплоидных клеток, полученных в а), и

c) выделения гаплоидных клеток, содержащих рекомбинационные кассеты, в которых первые рекомбинированные ДНК-последовательности фланкированы первой и четвертой маркерными последовательностями, и гаплоидных клеток, содержащих рекомбинационные кассеты, в которых вторые рекомбинированные ДНК-последовательности фланкированы второй и третьей маркерными последовательностями.

Настоящее изобретение относится к системе, основанной на дрожжах для скрининга событий рекомбинации между по меньшей мере двумя дивергентными ДНК-последовательностями. Эта система основана на половом репродуктивном цикле Бассйатотусск сстсуШас, который чередует гаплоидную фазу и диплоидную фазу. В первой стадии способа изобретения получают диплоидные клетки 8. ссгсуШас, которые являются гетерозиготными в отношении этих субстратов рекомбинации. Подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности интегрируют в геном этих диплоидных клеток 8. сстсуШас в

- 2 009443 аллельных положениях. Каждую подлежащую рекомбинации ДНК-последовательность интегрируют в форме рекомбинационной кассеты, которая содержит, наряду с этой ДНК-последовательностью, по меньшей мере две маркерные последовательности, которые фланкируют эту ДНК-последовательность, посредством чего эти две рекомбинационные кассеты содержат по меньшей мере четыре различные маркерные последовательности.

Затем полученные таким образом гетерозиготные диплоидные клетки выращивают в условиях, которые индуцируют процессы мейоза и спорообразование. Мейоз обычно отличается повышенными частотами генетической рекомбинации, которая инициируется через образование и последующую репарацию двухцепочечных разрывов (Ό8Β), индуцированных в профазе I мейоза. Таким образом, дрожжевые мейотические клетки представляют особенный интерес, так как они испытывают высокие уровни рекомбинации как результат индукции Ό8Β по всему геному. Таким образом, продукты первого раунда мейоза, которыми являются четыре гаплоидные клетки или споры для каждого события мейоза, продуцируемые родительской диплоидной клеткой, могут содержать рекомбинированные ДНК-последовательности вследствие рекомбинации двух дивергированных ДНК-последовательностей.

Рекомбинация двух дивергентных ДНК-последовательностей во время мейоза может также приводить к обмену фланкирующих маркерных последовательностей. Таким образом, этот способ обеспечивает быструю и простую идентификацию рекомбинированных ДНК-последовательностей посредством отбора индивидуальных клеток или молекул, в которых имел место обмен маркерных последовательностей, фланкирующих субстрат рекомбинации. Таким образом, рекомбинанты, полученные после первого раунда мейоза, отличаются тем, что они содержат и/или экспрессируют по меньшей мере первую маркерную последовательность первой рекомбинационной кассеты и по меньшей мере одну маркерную последовательность второй рекомбинационной кассеты. В частности, рекомбинантные споры могут содержать первую маркерную последовательность первой рекомбинационной кассеты и четвертую маркерную последовательность второй рекомбинационной кассеты или вторую маркерную последовательность первой рекомбинационной кассеты и третью маркерную последовательность второй рекомбинационной кассеты, посредством чего оба типа рекомбинантных спор, наряду с этой различной комбинацией маркеров, содержат также различные рекомбинантные ДНК-последовательности. Оба типа спор, содержащие рекомбинантные последовательности, можно легко отобрать и отличить друг от друга в условиях, которые обеспечивают отбор в отношении новых рекомбинантных конфигураций маркеров, получаемых рекомбинацией во время мейоза.

Способ по изобретению может проводиться либо в клетках дикого типа, либо в дефектных по репарации ошибочных спариваний клетках 8. есгсуыас. Процессы, при помощи которых происходит репарация поврежденной ДНК, и механизмы генетической рекомбинации тесно связаны, и известно, что аппарат репарации ошибочного спаривания оказывает ингибирующие действия на частоту рекомбинации между дивергентными последовательностями, т.е. гомологичной рекомбинации. Таким образом, мутации системы репарации ошибочного спаривания в значительной степени усиливают общую частоту событий рекомбинации в дрожжах. С другой стороны, известно, что клетки 8. есгсуыас дикого типа имеют зависимый от репарации ошибочного спаривания механизм рекомбинации, который основан на отдаленно находящихся ошибочных спариваниях в двух субстратах рекомбинации. В зависимости от подлежащих рекомбинации ДНК-последовательностей, либо клетки дикого типа, либо дефектные по репарации ошибочных спариваний клетки 8. есгсуыас могут быть использованы для получения рекомбинированных последовательностей.

Преимущества способа по изобретению заключаются в том, что способ является итеративным (повторяющимся), т.е. возможны дополнительные раунды рекомбинации. Продукты первого раунда мейоза, т.е. гаплоидные клетки противоположных типов спаривания, которые содержат различным образом рекомбинированные ДНК-последовательности, спаривают опять для получения диплоидных клеток, которые являются гетерозиготными в отношении рекомбинированных ДНК-последовательностей. В полученных таким образом диплоидных клетках опять индуцируют мейоз, посредством чего рекомбинированные ДНК-последовательности еще раз рекомбинируются, приводя опять к обмену двух маркеров, фланкирующих каждый из субстратов рекомбинации. Новые гаплоидные рекомбинанты, полученные после второго мейоза, могут быть теперь легко идентифицированы по совместной экспрессии либо маркерных генов, которые фланкировали первую ДНК-последовательность в исходной рекомбинационной кассете, либо маркерных генов, которые фланкировали вторую ДНК-последовательность в исходной второй рекомбинационной кассете.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления изобретения гаплоидные клетки, содержащие рекомбинантную кассету с первыми рекомбинированными ДНК-последовательностями, полученными в первом раунде способа по изобретению, спаривают с гаплоидными клетками, содержащими рекомбинационные кассеты со вторыми рекомбинированными ДНК-последовательностями, полученными в первом раунде способа по изобретению, для получения вторых диплоидных клеток. В полученной таким образом второй диплоидной клетке индуцируют споруляцию, что приводит к получению гаплоидных клеток. В следующих стадиях выделяют гаплоидные клетки, содержащие рекомбинационные кассеты, в которых третьи рекомбинированные ДНК-последовательности фланкированы по меньшей мере

- 3 009443 первой и второй маркерными последовательностями, и гаплоидные клетки, содержащие рекомбинационные кассеты, в которых четвертые рекомбинированные ДНК-последовательности фланкированы по меньшей мере третьей и четвертой маркерными последовательностями.

Дополнительные рекомбинированные ДНК-последовательности могут быть получены, если гаплоидные клетки, содержащие третью и четвертую рекомбинированные ДНК-последовательности, подвергать одному или нескольким дополнительным циклам спаривания и мейоза/споруляции. После каждого раунда рекомбинации рекомбинанты либо идентифицируют по совместному присутствию по меньшей мере одной маркерной последовательности, которая фланкирует первый субстрат рекомбинации, и по меньшей мере одной маркерной последовательности, которая фланкирует второй субстрат рекомбинации, либо по совместному присутствию двух маркеров, которые фланкируют первую или вторую ДНКпоследовательность в исходных субстратах рекомбинации.

Таким образом, предпочтительным признаком способа является то, что он является повторяющимся: рекомбинантное гаплоидное потомство отбирают индивидуально или в массе и спаривают одно с другим, полученные диплоиды снова спорулируют, и их споры-потомство подвергают соответствующим условиям отбора для идентификации новых событий рекомбинации. С использованием способа по изобретению можно легко получить большую библиотеку рекомбинированных, мутированных последовательностей, и затем могут быть идентифицированы варианты, которые приобрели желаемую функцию, с использованием подходящей системы отбора или скрининга.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения первую диплоидную клетку 8. сетеу151ае получают одновременной или последовательной трансформацией диплоидной клетки 8. сегеу151ае ДНК-молекулой, содержащей первую рекомбинационную кассету, и ДНК-молекулой, содержащей вторую рекомбинационную кассету, и, необязательно, интеграцией этих двух рекомбинационных кассет в аллельные положения природных хромосом генома 8. сегеуыае. Используемыми ДНКмолекулами могут быть, например, дрожжевые искусственные хромосомы (УЛС). УЛС отличаются тем, что они являются линейными ДНК-молекулами, которые содержат все последовательности, необходимые для стабильного сохранения в клетке дрожжей, такие как центромера, сайт инициации репликации ДНК и теломеры, а также селектируемые маркеры дрожжей. После введения в клетку дрожжей УЛС ведут себя аналогично природным хромосомам и, следовательно, могут рассматриваться как часть генома дрожжей. В контексте данного изобретения термин «геном» включает в себя в целом все наследственные компоненты, присутствующие в клетке, которые стабильно сохраняются и наследуются. В случае использования УЛС в качестве ДНК-молекул для введения первой и второй рекомбинационных кассет в диплоидные клетки 8. сетеу151ае, необязательно интегрировать эти две рекомбинационные кассеты в аллельные положения в природных хромосомах. В случае, когда рекомбинационные кассеты вводят в природные хромосомы, можно использовать клонирующий вектор, например, плазмиду, из которого может быть высвобожден фрагмент, несущий рекомбинационную кассету. Предпочтительно, две соответствующие маркерные последовательности этих двух рекомбинационных кассет фланкированы нацеливающими последовательностями, которые являются гомологичными определенному локусу генома 5. ββΓβνΑίαβ. Альтернативно, может использоваться ДНК-молекула, которая не содержит сайта инициации репликации. В этом случае ДНК-молекулы должны быть способны интегрироваться в компонент генома и, следовательно, содержать нацеливающие последовательности, которые являются гомологичными определенному локусу генома 8. сетеу151ае.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения первые диплоидные клетки 8. сетеу151ае получают слиянием гаплоидных клеток, несущих в локусе их генома первую рекомбинационную кассету, с гаплоидными клетками 8. сетеуШае, несущими в аллельном положении их генома вторую рекомбинационную кассету.

Еще в одном варианте осуществления изобретения первые диплоидные клетки 8. сегеуыае получают спариванием гаплоидных клеток, несущих в локусе их генома первую рекомбинационную кассету, с гаплоидными клетками 8. сегеуыае типа противоположного спаривания, несущими в аллельном положении их генома вторую рекомбинационную кассету.

В контексте данного изобретения термины спаривание и слияние обозначают либо преднамеренную, либо случайную комбинацию двух гаплоидных клеток, содержащих различные рекомбинационные кассеты. Преднамеренное спаривание или слияние двух гаплоидных клеток имеет место, когда две выбранные и/или выделенные гаплоидные клетки противоположного типа спаривания с желаемыми свойствами приводят в контакт в условиях, стимулирующих спаривание или слияние, соответственно. Эти две гаплоидные клетки могут быть получены из одной и той же библиотеки клеток, которые, например, содержат ДНК-последовательности, подлежащие рекомбинации, или уже рекомбинированные ДНКпоследовательности, или из различных библиотек клеток, которые, например, содержат ДНКпоследовательности, подлежащие рекомбинации, или уже рекомбинированные ДНКпоследовательности.

Случайное спаривание или слияние двух гаплоидных клеток может происходить, когда множество различных гаплоидных клеток приводят в контакт в условиях, стимулирующих спаривание или слияние, соответственно. Это множество гаплоидных клеток может быть получено из одной и той же библиотеки

- 4 009443 клеток, которые, например, содержат ДНК-последовательности, подлежащие рекомбинации, или уже рекомбинированные ДНК-последовательности, или из различных библиотек клеток, которые, например, содержат ДНК-последовательности, подлежащие рекомбинации, или уже рекомбинированные ДНКпоследовательности.

Преимущества способа по изобретению для получения и обнаружения рекомбинированных ДНКпоследовательностей заключаются в том, что могут быть рекомбинированы более чем две дивергентные последовательности. Если, например, должны быть рекомбинированы четыре дивергентные ДНКпоследовательности, то в первой стадии данного способа могут быть генерированы два набора (две популяции) диплоидных клеток 5. сегесыае. Например, первый набор диплоидных клеток может быть получен спариванием или слиянием гаплоидных клеток, содержащих первую и вторую подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности, а второй набор диплоидных клеток может быть генерирован спариванием или слиянием гаплоидных клеток, содержащих третью и четвертую подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности. После споруляции этих двух наборов диплоидных клеток гаплоидные клетки, полученные из первого набора диплоидных клеток, которые содержат рекомбинированные ДНКпоследовательности вследствие рекомбинации между первой и второй ДНК-последовательностями, спаривают с подходящими гаплоидными клетками, полученными из второго набора диплоидных клеток, которые содержат рекомбинированные ДНК-последовательности вследствие рекомбинации между третьей и четвертой ДНК-последовательностями. Продуктами этого спаривания являются диплоидные клетки, которые после споруляции дают гаплоидные клетки, несущие рекомбинированные ДНКпоследовательности, которые содержат районы первой ДНК-последовательности, второй ДНКпоследовательности, третьей ДНК-последовательности и четвертой ДНК-последовательности. Если, например, должны быть рекомбинированы три дивергентные ДНК-последовательности, в первой стадии данного способа генерируют диплоидные клетки 8. есгсуыас. например, спариванием или слиянием гаплоидных клеток, содержащих первую и вторую подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности. После споруляции этих диплоидных клеток, полученные таким образом гаплоидные клетки, которые содержат рекомбинированные ДНК-последовательности вследствие рекомбинации между первой и второй ДНК-последовательностями, могут быть слиты или спарены с гаплоидными клетками, содержащими третью, подлежащую рекомбинации ДНК-последовательность. Продуктами этого спаривания являются диплоидные клетки, которые после споруляции дают гаплоидные клетки, несущие рекомбинированные ДНК-последовательности, которые содержат районы первой ДНК-последовательности, второй ДНКпоследовательности и третьей ДНК-последовательности. Таким путем могут быть также рекомбинированы пять, шесть или более дивергентных ДНК-последовательностей.

В предпочтительном варианте осуществления гаплоидные клетки 8. сегеуыае,. несущие первую или вторую рекомбинационную кассету, получают:

a) встраиванием первой, подлежащей рекомбинации ДНК-последовательности между первой и второй маркерными последовательностями, расположенными смежно на первом клонирующем векторе, и встраиванием второй, подлежащей рекомбинации ДНК-последовательности между третьей и четвертой маркерными последовательностями, расположенными смежно на втором клонирующем векторе, посредством чего соответствующие две маркерные последовательности фланкированы нацеливающими последовательностями, которые гомологичны определенному локусу генома 8. есгсуыас,

b) вырезанием из клонирующих векторов, полученных в а), первой рекомбинационной кассеты и второй рекомбинационной кассеты с фланкирующими нацеливающими последовательностями, соответственно, посредством чего каждый вырезанный фрагмент содержит подлежащую рекомбинации ДНКпоследовательность, которая фланкирована соответствующими двумя маркерными последовательностями и нацеливающими последовательностями,

c) трансформацией вырезанных фрагментов, полученных в Ь), по отдельности в диплоидные клетки 8. ссгсуыас, посредством чего нацеливающие последовательности направляют интеграцию этих кассет в тот локус, в отношении которого они являются гомологичными, для получения диплоидных клеток, гетерозиготных в отношении первой кассеты или второй кассеты,

й) индуцированием по отдельности споруляции гетерозиготных диплоидных клеток, полученных в с), и

е) выделением гаплоидных клеток, содержащих первую кассету, фланкированную первой и второй маркерными последовательностями, и отдельно гаплоидных клеток, содержащих вторую кассету, фланкированную третьей и четвертой маркерными последовательностями.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения соответствующие две маркерные последовательности в первом и втором клонирующих векторах фланкированы нацеливающими последовательностями, которые гомологичны локусу ΒυΌ31-ΗΟΜ1 на хромосоме III генома 8. сегесыае и которые направляют интеграцию вырезанных кассет в этот локус.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения клонирующим вектором, используемым для клонирования рекомбинационных кассет, является плазмида. «Плазмида» обозначает внехромосомный элемент, который может автономно реплицироваться. Эта плазмида физически не связана с геномом

- 5 009443 клетки, в которой она содержится. Большинство плазмид является двухцепочечными кольцевыми молекулами ДНК. В другом варианте осуществления клонирующим вектором является УЛС.

В частности, предпочтительным является использование в качестве первого клонирующего вектора, в котором клонируют первую рекомбинационную кассету, плазмиды ρΜΧΥ9. Плазмида ρΜΧΥ9 содержит маркерный ген ϋΚΑ3 и маркерный ген СЛЫ1. В этой плазмиде эти два маркерных гена расположены смежно. Между этими двумя маркерными генами размещено несколько сайтов рестрикции, в частности, сайты рестрикции для рестриктаз 8та1, ХЬа1, ВдШ и Рас1 для встраивания подлежащей рекомбинации ДНК-последовательности. Эти две маркерные последовательности фланкированы нацеливающими последовательностями, гомологичными локусу ВиЭ31-НСМ1 на хромосоме III генома 8. ссгсуыас.

Кроме того, предпочтительным является использование в качестве второго клонирующего вектора, в котором клонируют вторую рекомбинационную кассету, плазмиды ρΜΧΥ12. Плазмида ρΜΧΥ12 содержит маркерный ген ТКР1 и маркерный ген СΥΗ2. В этой плазмиде эти два маркерных гена расположены смежно. Между этими двумя маркерными генами размещено несколько сайтов рестрикции, в частности, сайты рестрикции для рестриктаз 8ρеI, 8та1 и Рас1 для встраивания подлежащей рекомбинации ДНК-последовательности. Эти две маркерные последовательности фланкированы нацеливающими последовательностями, гомологичными локусу ВиО31-НСМ1 на хромосоме III генома 8. ссгсиыас.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения диплоидные клетки, используемые для трансформации вырезанной рекомбинационной кассеты, являются ауксотрофными в отношении по меньшей мере двух питательных факторов и устойчивыми по меньшей мере к двум антибиотикам. Предпочтительно, эти диплоидные клетки являются гомозиготными в отношении аллеля ига3-1 и аллеля йр11, что делает эти клетки ауксотрофными в отношении урацила и триптофана, соответственно. Кроме того, предпочтительно, чтобы диплоидные клетки, используемые для трансформации, были гомозиготными в отношении аллеля сап1-100 и аллеля су112В. что делает их устойчивыми к канаванину и циклогексимиду, соответственно.

В частности, предпочтительным является использование для трансформации диплоидных клеток штамма 8. ссгсиыас ΜΧΥ47, которые являются гомозиготными в отношении аллелей ига3-1, йр1-1, сап1-100 и су112В и гетерозиготными в отношении мутации т8Й2::ΚаηΜX. При использовании для трансформации диплоидных клеток штамма ΜΧΥ47 с вырезанными первым или вторым фрагментами, несущими рекомбинационные кассеты и их фланкирующие нацеливающие последовательности, полученные трансформанты могут быть индуцированы для споруляции с получением гаплоида дикого типа или т8Й2-сегрегантов, которые несут соответствующую рекомбинационную кассету.

Согласно изобретению может быть предпочтительным использование клеток 8. ссгсуыас, которые имеют функциональную систему репарации ошибочных спариваний, для способа данного изобретения. Система репарации ошибочных спариваний относится к наиболее сильным факторам избегания мутаций вследствие ошибок ДНК-полимеразы при репликации. Репарация ошибочных спариваний усиливает также генетическую стабильность исправлением точности генетической рекомбинации. Таким образом, известно, что аппарат репарации ошибочного спаривания оказывает некоторое ингибирующее действие на рекомбинацию между дивергентными последовательностями. Однако в нормальном диплоиде 8. сегеуыас был обнаружен другой аспект репарации ошибочных спариваний, названный рекомбинацией, зависимой от репарации ошибочного спаривания (Вогй апб НаЬег, 8с1епсе, 237 (1987), 1459-1465). Считается, что репарация ошибочного спаривания отдаленно размещенных ошибочных спариваний, например, в дивергентных последовательностях, приводит к новым двухцепочечным разрывам, которые могут, в свою очередь, стимулировать второй раунд (зависимой от репарации ошибочных оснований) рекомбинации. В некоторых обстоятельствах, в частности, когда известно, что два используемых субстрата рекомбинации имеют отдаленно помещенные различия оснований, полезно, следовательно, использовать клетки 8. сегеуыае с функциональной системой репарации ошибочных спариваний для проведения способа данного изобретения.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения используют клетки 8. сегеуШае, которые являются дефектными в отношении системы репарации ошибочных спариваний. В 8. сегеуыае было идентифицировано несколько генов, продукты которых имеют гомологию с бактериальными белками репарации ошибочного спаривания, в том числе шесть гомологов белка Μπΐ8, т.е. ΜδΜ, Μ§Η2ρ, Μ§Η3ρ, Μ§Η4, Μδ1ι5 и Μ§Η6ρ, и четыре гомолога белка ΜπίΤ, т.е. ΜδΜρ, Μ1Η2ρ, Μ11ι3ρ и Рт§1. Известно, что, в частности, гены ΡΜ81 и Μ8Η2 устанавливают барьер рекомбинации дивергентных последовательностей. Таким образом, в мутантах Ш5112 и ριπδ1 мейотическая рекомбинация между дивергентными последовательностями является увеличенной относительно частоты рекомбинации в клетках дикого типа.

В контексте данного изобретения термин «дефектные в отношении системы репарации ошибочного спаривания» означает, что система репарации ошибочного спаривания (ΜΜΚ) клетки является транзиторно (временно) или перманентно нарушенной. Недостаточность ΜΜΚ клетки или организма может быть получена любой стратегией, которая транзиторно или перманентно нарушает репарацию ошибочного спаривания, а том числе, но не только, мутацией одного или нескольких генов, участвующих в репарации ошибочных спариваний, обработкой агентом, таким как УФ-свет, который приводит к глобаль

- 6 009443 ному нарушению ММК, обработкой агентом, таким как 2-аминопурин или гетеродуплекс, содержащий избыточное количество ошибочных спариваний, для транзиторного насыщения и инактивации системы ММК и индуцируемой экспрессии или репрессии одного или нескольких генов, участвующих в репарации ошибочных спариваний, например, посредством регулируемых промоторов, которые могут делать возможной временную инактивацию, т.е. во время мейоза, но не во время вегетативного роста.

В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения недостаточность репарации ошибочных спариваний клетки 8. сетеу181ае обусловлена мутацией по меньшей мере одного гена, участвующего в ММК. В предпочтительном варианте осуществления клетки 8. сетеуШае являются дефектными в отношении гена М8Н2. Предпочтительно, диплоидные клетки являются гомозиготными в отношении аллеля 1115112, в котором кодирующие последовательности М8Н2 заменены конструкцией КапМХ.

В контексте настоящего изобретения термин «рекомбинационная кассета» относится к ДНКпоследовательности, содержащей по меньшей мере один субстрат рекомбинации или одну подлежащую рекомбинации ДНК-последовательность, которая фланкирована по меньшей мере двумя различными маркерными последовательностями. Первая и вторая рекомбинационные кассеты различаются подлежащими рекомбинации ДНК-последовательностями и фланкирующими маркерными последовательностями, так что любая пара рекомбинационных кассет содержит различные подлежащие рекомбинации ДНКпоследовательности и по меньшей мере четыре различные фланкирующие маркерные последовательности.

В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения как первую, так и вторую рекомбинационные кассеты получают встраиванием соответствующих подлежащих рекомбинации ДНКпоследовательностей между двумя маркерными последовательностями, которые расположены смежно на клонирующем векторе и которые, в свою очередь, окружены нацеливающими последовательностями, которые гомологичны определенному локусу генома 8. сетеуШае. Таким образом, эти нацеливающие последовательности могут направлять интеграцию вырезанного фрагмента, содержащего рекомбинационную кассету, в этот определенный локус. Встраивание подлежащей рекомбинации ДНК между этими двумя маркерными последовательностями предпочтительно выполняют способами генной инженерии. В предпочтительном варианте осуществления изобретения эти две маркерные последовательности в клонирующем векторе фланкированы нацеливающими последовательностями, которые являются гомологичными локусу ВИП31-НСМ1 на хромосоме III генома 8. сетеуШае. Таким образом, нацеливающие последовательности направляют интеграцию вырезанных фрагментов, содержащих рекомбинационные кассеты, в этот локус.

В контексте настоящего изобретения термины «подлежащие рекомбинации ДНКпоследовательности» и «субстрат рекомбинации» обозначают любые две ДНК-последовательности, которые могут быть рекомбинированными в результате мейотических процессов рекомбинации, посредством чего рекомбинация между этими последовательностями может быть обусловлена гомологичной или негомологичной рекомбинацией.

События нескольких типов гомологичной рекомбинации отличаются спариванием оснований поврежденной нити ДНК с гомологичным партнером, где степень взаимодействия может включать в себя сотни почти точно спаренных пар оснований. Термин «гомология» обозначает степень идентичности, существующую между последовательностями двух молекул нуклеиновых кислот. В противоположность этому, логически неправильная или негомологичная рекомбинация отличается соединением концов ДНК, которые не имеют или имеют лишь несколько комплементарных пар оснований. В дрожжах события негомологичной репарации и рекомбинации происходят при значимо более низких частотах, чем события гомологичной рекомбинации.

Первая и вторая подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности являются дивергентными последовательностями, т.е. последовательностями, которые не являются идентичными, но обнаруживают определенную степень гомологии. Это означает, что эти подлежащие рекомбинации ДНКпоследовательности являются последовательностями, которые имеют по меньшей мере один или несколько гомологичных районов, которые могут быть очень короткими. Эти гомологичные районы должны содержать по меньшей мере 5-10 нуклеотидов, предпочтительно более чем 20 нуклеотидов 23 нуклеотида, более предпочтительно более чем 30-40 нуклеотидов и, наиболее предпочтительно более чем 50 нуклеотидов. В предпочтительном варианте осуществления изобретения первая и вторая подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности отличаются (т.е. имеют дивергенцию) по меньшей мере на один нуклеотид, в частности, на более чем 0,1%, предпочтительно на более чем 5% - более чем 50%. Это означает, что первая и вторая подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности также отличаются на 55, 60, 65%, или даже более.

Субстраты рекомбинации или подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности могут быть природными или синтетическими. Таким образом, подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности могут быть получены из любого природного источника, в том числе вирусов, бактерий, грибов, в том числе 8. сетеуШае, животных, растений и людей. В предпочтительном варианте осуществления изобретения первая и вторая подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности получены из организмов, отличных от 8. сетеуШае.

- 7 009443

В предпочтительном варианте осуществления изобретения подлежащие рекомбинации ДНКпоследовательности являются кодирующими белок последовательностями, например последовательностями, кодирующими ферменты, которые могут быть использованы для промышленного получения природных и неприродных соединений. Ферменты или соединения, получаемые с использованием ферментов, могут быть использованы для получения лекарственных средств, косметических средств, пищевых продуктов и т.д. Кодирующие белок последовательности могут быть также последовательностями, которые кодируют белки, имеющие терапевтические применения в области здравоохранения человека и животных. Важные классы важных для медицины белков включают в себя цитокины и факторы роста. Рекомбинация кодирующих белок последовательностей делает возможным получение новых мутированных последовательностей, которые кодируют белки с измененными, предпочтительно улучшенными функциями и/или новыми приобретенными функциями. Таким путем можно, например, достигать улучшений термостабильности белка, изменять субстратную специфичность белка, улучшать его активность, разработать новые каталитические сайты и/или домены слияния из двух различных ферментов. Кодирующие белок подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности могут включать в себя последовательности различных видов, которые кодируют одни и те же или сходные белки, которые имеют в их природном окружении сходные или идентичные функции. Кодирующие белок подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности могут включать в себя последовательности одного и того же семейства белков или ферментов. Кодирующие белок подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности могут быть также последовательностями, которые кодируют белки с различными функциями, например последовательностями, которые кодируют ферменты, катализирующие различные стадии конкретного метаболического пути. В предпочтительном варианте осуществления изобретения первая и вторая подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности выбраны из группы последовательностей генов Оха суперсемейства В-лактамаз.

В другом предпочтительном варианте осуществления данного изобретения подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности являются некодирующими последовательностями, такими как последовательности, которые, например, участвуют в их природном клеточном окружении в регуляции экспрессии кодирующей белок последовательности. Примеры некодирующих последовательностей включают в себя, но не ограничиваются ими, последовательности промоторов, последовательности, содержащие сайты связывания рибосом, последовательности интронов, последовательности полиаденилирования и т. д. Посредством рекомбинации таких некодирующих последовательностей можно получить мутированные последовательности, которые в клеточном окружении приводят к измененной регуляции клеточного процесса, - например, измененной экспрессии гена.

В соответствии с настоящим изобретением субстрат рекомбинации или подлежащая рекомбинации ДНК-последовательность может, конечно, содержать кодирующую более чем один белок, последовательность и/или более чем одну некодирующую последовательность. Например, субстрат рекомбинации может содержать одну кодирующую белок последовательность плюс одну некодирующую последовательность или комбинацию различных кодирующих белок последовательностей и различных некодирующих последовательностей. В другом варианте осуществления данного изобретения подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности могут, следовательно, состоять из одной или нескольких цепей кодирующих последовательностей с интронами и/или фланкирующими некодирующими последовательностями. Это означает, что подлежащая рекомбинации ДНК-последовательность может быть, например, последовательностью гена с регуляторными последовательностями на ее 5'-конце и/или нетранслируемым З'-районом или последовательностью гена млекопитающего с экзон-интронной структурой. Еще в одном варианте осуществления изобретения подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности могут состоять из более крупных непрерывных отрезков, которые содержат более чем единственную кодирующую последовательность, с некодирующими последовательностями интронов, например, таких, которые могут относиться к биосинтетическому пути или оперону. Подлежащие рекомбинации ДНКпоследовательности могут быть последовательностями, которые уже испытали одно или несколько событий рекомбинации, например, событий гомологичной и/или негомологичной рекомбинации.

Субстраты рекомбинации могут содержать немутированные ДНК-последовательности дикого типа и/или мутированные ДНК-последовательности. В предпочтительном варианте осуществления можно, следовательно, рекомбинировать последовательности дикого типа с уже существующими мутированными последовательностями для развития новых мутированных последовательностей.

В контексте изобретения термин «маркерные последовательности» относится к уникальным ДНКпоследовательностям, которые расположены слева или справа от субстрата рекомбинации или уже рекомбинированной ДНК-последовательности в клетках 8аеейаготуеек еегеуыае. Присутствие маркерной последовательности на той же самой ДНК-молекуле, что и субстрат рекомбинации или уже рекомбинированная ДНК-последовательность, предпочтительно в сочетании с другой маркерной последовательностью, расположенной на другой стороне от субстрата рекомбинации, позволяет распознать субстрат рекомбинации или уже рекомбинированную ДНК-последовательность и произвести ее отбор молекулярными или генетическими способами. Таким образом, в одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения должны быть одна или несколько маркерных последовательностей слева от каждого

- 8 009443 субстрата рекомбинации и одна или несколько маркерных последовательностей справа от каждого субстрата рекомбинации, так что в клетке, гетерозиготной в отношении двух различных субстратов рекомбинации, имеются вместе по меньшей мере четыре различные маркерные последовательности. Это расположение делает возможным отбор кроссоверов, включающих в себя субстраты рекомбинации. Также возможно проведение дополнительных раундов рекомбинации повторяющимся образом. В другом предпочтительном варианте осуществления данного изобретения более чем один маркер может быть расположен на каждой стороне субстрата рекомбинации. Например, для увеличения строгости отбора могут быть введены дополнительные маркеры.

Маркерные последовательности могут содержать кодирующие белок или некодирующие ДНКпоследовательности. В предпочтительном варианте осуществления изобретения кодирующие белок маркерные последовательности выбраны из группы, состоящей из маркеров питания, пигментных маркеров, маркеров устойчивости к антибиотикам и последовательностей, которые кодируют различные субъединицы фермента, которые функционируют только в том случае, если обе субъединицы или большее количество субъединиц экспрессируются в одной и той же клетке. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления данного изобретения молекулярные некодирующие маркерные последовательности включают в себя, но не ограничиваются ими, сайты узнавания праймеров, т. е. последовательности, с которыми отжигаются праймеры ПЦР и которые делают возможной амплификацию рекомбинантов, экзон-интронные сочленения (границы сплайсинга), промоторные последовательности, находящиеся 3' (справа) регуляторные последовательности гена или сайты рестрикционных ферментов.

«Маркер питания» обозначает маркерную последовательность, которая кодирует продукт гена, который может компенсировать ауксотрофию организма или клетки и, следовательно, может сообщать прототрофию ауксотрофному организму или ауксотрофной клетке. В контексте изобретения термин «ауксотрофия» означает, что организм или клетки должны расти в среде, содержащей необходимый питательный элемент, который не может быть синтезирован самим ауксотрофным организмом. Продукт гена маркера питания стимулирует синтез этого необходимого питательного элемента в ауксотрофной клетке. Таким образом, после экспрессии гена маркера питания не требуется добавления этого необходимого питательного элемента к среде, в которой выращивают этот организм или эту клетку, так как эти организм или клетка стали прототрофными.

«Пигментный маркер» является маркерным геном, причем продукт этого гена участвует в синтезе пигмента, который после экспрессии будет окрашивать клетку, в которой экспрессируется этот пигментный маркер. Клетка без пигментного маркера не синтезирует этот пигмент и, следовательно, является неокрашенной. Таким образом, пигментный маркер делает возможным быстрое фенотипическое обнаружение клетки, содержащей пигментный маркер.

«Маркер устойчивости к антибиотику» является маркерным геном, причем продукт этого гена после экспрессии сообщает клетке, в которой имеет место экспрессия этого маркерного гена устойчивости к антибиотику, способность расти в присутствии конкретного антибиотика при конкретной концентрации, тогда как клетка без маркера устойчивости к антибиотику не имеет такой способности.

«Маркер чувствительности к антибиотику» обозначает маркерный ген, причем продукт этого гена разрушает после экспрессии способность клетки расти в присутствии конкретного антибиотика при конкретной концентрации.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения каждый из генных продуктов первой и третьей маркерных последовательностей может компенсировать ауксотрофию клетки 8. ссгссыас. Предпочтительно первой маркерной последовательностью является ϋΚΑ3, генный продукт которой может придавать прототрофию в отношении урацила ауксотрофной в отношении урацила клетке 8. ссгссыас. Предпочтительно, третьей маркерной последовательностью является ТКР1, генный продукт которой может придавать прототрофию в отношении триптофана ауксотрофной в отношении триптофана клетке 8. ссгссЫас.

В другом предпочтительном варианте осуществления данного изобретения генные продукты второй и четвертой маркерных последовательностей придают чувствительность к антибиотику клетке 8. ссгссЫас, которая является устойчивой к этому антибиотику. Предпочтительно второй маркерной последовательностью является ί.ΆΝ1, генный продукт которой придает устойчивость к канаванину клетке 8. ссгссыас чувствительность к канаванину. Предпочтительно, четвертой маркерной последовательностью является СУН2, генный продукт которой придает устойчивость к циклогексимиду клетке 8. сегесыас чувствительность к циклогексимиду.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения маркерные последовательности содержат сайты отжига для праймеров ПЦР. Предпочтительно, первая, вторая, третья и четвертая маркерные последовательности узнаются праймерами ΚΝ811, ΚΝ828, ΚΝ816 и ΚΝ829.

В предпочтительном варианте осуществления способа изобретения гаплоидные клетки, содержащие рекомбинационные кассеты с первой, второй, третьей или четвертой рекомбинированными ДНКпоследовательностями, могут быть идентифицированы способами ПЦР для обнаружения присутствия соответствующей комбинации маркеров.

- 9 009443

В другом предпочтительном варианте осуществления способа изобретения гаплоидные клетки, содержащие рекомбинационные кассеты с первой, второй, третьей или четвертой рекомбинированными ДНК-последовательностями, идентифицируют высевом этих гаплоидных клеток на среды, которые отбирают на присутствие на одной и той же ДНК-молекуле соответствующей комбинации маркеров. Это означает, что гаплоидные клетки, содержащие первые рекомбинированные ДНК-последовательности, высевают на среду, которая отбирает на присутствие первой и четвертой маркерных последовательностей. Гаплоидные клетки, содержащие вторые рекомбинированные ДНК-последовательности, высевают на среду, которая отбирает на присутствие второй и третьей маркерных последовательностей. Гаплоидные клетки, содержащие третьи рекомбинированные ДНК-последовательности, высевают на среду, которая отбирает на присутствие первой и второй маркерных последовательностей. Гаплоидные клетки, содержащие четвертые рекомбинированные ДНК-последовательности, высевают на среду, которая отбирает на присутствие третьей и четвертой маркерных последовательностей.

Другой аспект данного изобретения относится к способу получения новых белков, ферментов, метаболических путей и некодирующих последовательностей с новыми или улучшенными функциями и свойствами, посредством которого известные кодирующие белок последовательности или известные некодирующие последовательности подвергают одному или нескольким раундам рекомбинации с использованием способа данного изобретения для генерирования и обнаружения рекомбинантных ДНКпоследовательностей в 8. сетеуШае.

Другой аспект данного изобретения относится к плазмиде ρΜΧΥ9. Плазмида рМХУ9 содержит маркерный ген ΗΚΑ.3 и маркерный ген ί.ΆΝ1. которые расположены рядом. Между этими двумя маркерными генами помещают полилинкерную последовательность, содержащую несколько сайтов рестрикции для встраивания подлежащей рекомбинации ДНК-последовательности. Эти два маркера фланкированы нацеливающими последовательностями, гомологичными локусу ВиЭ31-НСМ1 на хромосоме III генома 8. сегеуыае. Эта полилинкерная последовательность между двумя маркерными генами содержит сайты рестрикции для рестриктаз 8та1, ХЬа1, ВдШ и Рас1.

Другой аспект данного изобретения относится к плазмиде ρΜΧΥ12. Плазмида ρΜΧΥ12 содержит маркерный ген ТКР1 и маркерный ген СΥΗ2, которые расположены смежно. Между этими двумя маркерными генами помещают полилинкерную последовательность, содержащую несколько сайтов рестрикции для встраивания подлежащей рекомбинации ДНК-последовательности. Эти два маркера фланкированы нацеливающими последовательностями, гомологичными локусу ВиЭ31-НСМ1 на хромосоме III генома 8. ссгсгыас. Эта полилинкерная последовательность между двумя маркерными генами содержит сайты рестрикции для рестриктаз 8РСЕ 8таI и Рас!

Настоящее изобретение относится также к штамму 8. ссгсгыас ΜΧΥ47, отличающемуся тем, что его диплоидные клетки являются гомозиготными в отношении аллелей игаЗ-1, Ιτρ1-1, сап1-100 и суй2Р и гетерозиготными в отношении мутации т8Й2::КапМХ.

Данное изобретение относится также к штамму Е. сой 1М101, содержащему плазмиду ρΜΧΥ9, и к штамму Е. сой ЭН5а, содержащему плазмиду ρΜΧΥ12.

Плазмиды ρΜΧΥ9 и ρΜΧΥ12, и штамм 8ассйатотусе5 ссгсуыас ΜΧΥ47 были депонированы 3 января 2005 г. в 88ΜΖ (Эеиксйе 8атт1ипд йг Μ^к^оо^даη^8теη ипб 2е11кийигеп СтЬН, Μа8сйе^оάе^теед 1Ь, 38124 Вгаипзсйтеегд, Сегтапу) под номерами доступа Ό8Μ 17010, Ό8Μ 17011 и Ό8Μ 17026, соответственно.

Другой аспект изобретения относится к набору, который может быть использован для осуществления способа по изобретению для получения и обнаружения рекомбинированных ДНКпоследовательностей в 8ассйаготусе§ сегеуыае. В первом варианте осуществления этот набор содержит по меньшей мере первый контейнер, который содержит клетки штамма 8. сетеуШае ΜΧΥ47, второй контейнер, который содержит клетки штамма Е. сой ΙΜ101, несущие плазмиду ρΜΧΥ9, и третий контейнер, содержащий клетки штамма Е. сой ΌΗ5 □ , несущие плазмиду ρΜΧΥ12.

Во втором варианте осуществления этот набор содержит по меньшей мере первый контейнер, содержащий клетки штамма 8. сетеуШае ΜΧΥ47, второй контейнер, содержащий ДНК плазмиды ρΜΧΥ9, и третий контейнер, содержащий ДНК плазмиды ρΜΧΥ12.

Изобретение проиллюстрировано следующим списком последовательностей, фигурами и примером.

На фиг. 1 показана схема отбора рекомбинантов на определенных средах. Диплоидные родительские клетки, гетерозиготные в отношении рекомбинационных кассет - здесь, субстрат рекомбинации А, фланкированный генами ϋΚΑ3 и СЛЮ, и субстрат рекомбинации В, фланкированный генами ТКР1 и СУН2 - индуцируются для подвергания мейозу. Споры высевают на среду, лишенную урацила и содержащую канаванин (-ϋΚΑ+Сап), и на среду, лишенную триптофана и содержащую циклокесимид (ТКР+Суй), для отбора рекомбинантных клеток 3 и 4, в которых имел место кроссинговер с участием субстратов рекомбинации А и В, показанный как (+). Родительские диплоиды и нерекомбинантные гаплоиды 1 и 2 не могут расти ни на одной из этих сред, что показано как (-). Последующий раунд мейоза может использовать рекомбинанты 3 и 4 для конструирования нового диплоида, который при споруляции дает новые рекомбинантные клетки, несущие те же самые фланкирующие маркерные конфигурации, что

- 10 009443 и конфигурации, показанные в клетках 1 и 2. Колонии рекомбинантных спор с этими конфигурациями могут быть отобраны на среде, лишенной урацила и содержащей циклогексимид (-ита+Суй), и на среде, лишенной триптофана и содержащей канаванин (-Тгр+Сап), соответственно.

На фиг. 2 показаны плазмиды ρΜΧΥ9 и ρΜΧΥ12 (сверху), которые являются векторами, использованными для нацеливания рекомбинационных кассет на локус ВиО21-НСМ1 на хромосоме III генома дрожжей. Обе плазмиды несут последовательности, гомологичные этому локусу (показанную как 5' и 3'), которые фланкируют маркеры υΚΑ3 и СЛЫ1 (ρΜΧΥ9) или маркеры ТКР1 и СΥН2 (ρΜΧΥ12). Короткая последовательность, несущая сайты рестрикции, которые делает возможным клонирование субстратов рекомбинации, расположена между каждой парой маркерных последовательностей. Внизу показана интеграция рекомбинационных кассет в локус Βϋϋ21-^Μ1. Производное ρΜΧΥ9, несущее субстрат рекомбинации А, расщепляют ΝοΐΙ для высвобождения рекомбинационной кассеты, фланкированной 5'- и 3'-нацеливающими последовательностями, и продукты трансформации трансформируют в клетки ΜΧΥ47. Ита+ производные, которые содержат точно нацеленный инсерт, идентифицируют для последующего использования в конструировании штаммов, гетерозиготных в отношении рекомбинационных кассет. Рекомбинационные кассеты, несущие маркеры ТКР1 и СΥН2, конструируют сходным образом в ρΜΧΥ12 и трансформируют в ΜΧΥ47 с последующим отбором на прототрофию в отношении триптофана.

На фиг. 3 показана частота рекомбинации между генами Оха как функция идентичности последовательности в штаммах дикого типа и шкй2. Сверху дается среднее ± стандартное отклонение (п) независимых экспериментов. Внизу - представление в виде графиков этих данных. Использовали следующие штаммы: ΜΧΥ60, ΜΧΥ62, ΜΧΥ64, ΜΧΥ66, ΜΧΥ99 и ΜΧΥ102.

На фиг. 4 показан эффект гиперрекомбинации шкй2. Отношение ткй2/^Г рассчитывали для каждого независимого эксперимента (общее число = п) для пар штаммов с конкретным процентом гомологии Оха и для каждого условия отбора, и показаны среднее ± стандартное отклонение этих суммированных величин. Эти данные представлены в виде диаграммы ниже. Использовали следующие пары штаммов: ΜΧΥ60 и ΜΧΥ62, ΜΧΥ64 и ΜΧΥ66, ΜΧΥ99 и ΜΧΥ102.

На фиг. 5 показан ПЦР-анализ рекомбинации последовательностей Оха, имеющих 78% гомологию. Колонии спор получали из диплоидов дикого типа (ΜΧΥ99) и тхй2 (ΜΧΥ102) отбором на среде, лишенной урацила и содержащей канаванин, или на среде, лишенной триптофана и содержащей циклогексимид. ПЦР колоний выполняли на отобранных колониях спор, которые обнаруживали фенотипы, согласующиеся с фенотипами, ожидаемыми для рекомбинантов-кроссоверов. Сверху две реакции проводили для каждого дикого типа и кандидата 1И5111 Ита+СапК, одного - со специфической для родителя парой праймеров (ΚΝ816 + ΚΝ828, продукты показаны в первой из каждой пары дорожек для каждого кандидата), и другого - с рекомбинант-специфической парой праймеров (ΚΝ816 + ΚΝ829, вторая дорожка). Внизу аналогичные реакции проводили для каждого дикого типа и кандидата 1115112 Ττρ+СуйК, одного со специфической для родителя парой праймеров (ΚΝ811 + ΚΝ829, первая дорожка), и другого - с рекомбинант-специфической парой праймеров (ΚΝ811 + ΚΝ828, вторая дорожка). Контрольные реакции проводили на подходящих матрицах геномной ДНК, содержащей известные конфигурации фланкирующих маркерных последовательностей, либо родительских (Р), либо рекомбинантных (К). (-) контроль без ДНК.

На фиг. 6 показана частота рекомбинации для рекомбинации второго раунда. Гаплоиды дикого типа и 1115112. полученные после первого раунда рекомбинации с ΜΧΥ64 и ΜΧΥ66, спаривали для получения диплоидов дикого типа (ΜΧΥ81, ΜΧΥ82 и ΜΧΥ83) и 1115112 (ΜΧΥ86, ΜΧΥ87 и ΜΧΥ88) с мозаичными рекомбинационными кассетами Оха7-0ха11. Диплоиды дикого типа (ΜΧΥ90) и 1115112 (ΜΧΥ92), гомозиготные в отношении субстрата рекомбинации Оха11, конструировали также из рекомбинантного потомства ΜΧΥ60 и ΜΧΥ62. Все диплоиды спорулировали и споры высевали на среды для отбора на рекомбинанты ига+СапК и Ττρ+СуйК.

Список последовательностей содержит следующие последовательности:

8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:1 и 2 представляют последовательности праймеров Μ8Η2ΠΡ и Μ8Η2ΌΝ, соответственно, для амплификации Μ8Η2.

8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:3-8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:6 представляют последовательности праймеров Μ8Η2Α1, Μ8Η2Α2, Μ8Η2Α3 и Μ8Η2Α4, соответственно, которые являются Μ§Н2-специфическими аналитическими праймерами.

8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:7 и 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:8 представляют последовательности праймеров Κ2ΚΑΝΜΧ и Κ3ΚΑΝΜΧ, соответственно, которые являются ΚаηΜX-специфическими аналитическими праймерами.

8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:9 и 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:10 представляют последовательности праймеров ЬЕШиР и ГЕШЭН соответственно, которые используют для амплификации ЬЕи2.

8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:11 и 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:12 представляют последовательности праймеров ΗΙ83ΠΡ и ΗΙ83ΌΝ, соответственно, которые используют для амплификации ΗΙ83.

8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:13 и 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:14 представляют последовательности праймеров ΚΝ81 и ΚΝ82, соответственно, которые используют для амплификации 3'- нацеливающей последовательности.

- 11 009443

8ЕЦ ΙΌ ΝΘ:15-8ΕΟ ΙΌ N0:17 представляют последовательности праймеров ΚΝ83, ΚΝ84 и ΚΝ86, соответственно, которые используют для амплификации 5'- нацеливающей последовательности.

8ЕЦ ΙΌ N0:18 и 8ЕЦ ΙΌ N0:19 представляют последовательности праймеров ΚΝ87 и ΚΝ88, соответственно, которые используют для амплификации Оха7.

8ЕЦ ΙΌ Ν0:20 и 8ЕЦ ΙΌ Ν0:21 представляют последовательности праймеров ΚΝ89 и ΚΝ810, соответственно, которые используют для амплификации 0ха11.

8ЕЦ Ш Ν0:22 представляет последовательность праймера ΚΝ812, который является правым (бо\\'П51гсат) аналитическим праймером ΒυΌ31.

8ЕЦ ΙΌ Ν0:23 представляет последовательность праймера ΚΝ813, который является левым (ирМгсаш) аналитическим праймером ΒυΌ31.

8ЕЦ ΙΌ Ν0:24 представляет последовательность праймера ΚΝ814, который является ТКР1специфическим аналитическим праймером.

8ЕЦ ΙΌ Ν0:25 представляет последовательность праймера ΚΝ815, который является иКА3специфическим аналитическим праймером.

8ЕЦ ΙΌ Ν0:26 и 8ЕЦ ΙΌ Ν0:27 представляют последовательности праймеров ΚΝ817 и ΚΝ818, соответственно, которые используют для амплификации СУН2.

8ЕЦ ΙΌ Ν0:28 представляет последовательность праймера ΚΝ830, который является ТКР1специфическим прямым праймером, используемым в качестве праймера секвенирования.

8ЕЦ ΙΌ Ν0:29 представляет последовательность праймера ΚΝ831, который является ί.ΆΝ1специфическим обратным праймером, используемым в качестве праймера секвенирования.

8ЕЦ ΙΌ Ν0:30 представляет последовательность праймера ΚΝ833, который является СУН2специфическим обратным праймером, используемым в качестве праймера секвенирования.

8ЕЦ ΙΌ Ν0:31 и 8ЕЦ ΙΌ Ν0:32 представляют последовательности праймеров ΚΝ836 и ΚΝ837, соответственно, которые используют для амплификации Оха5.

8ЕЦ ΙΌ Ν0:33 представляет последовательность праймера ΚΝ838, который является иКА3специфическим прямым праймером, используемым в качестве праймера секвенирования.

Пример. Генерирование мозаичных генов в мутантах с репарацией ошибочных спариваний 8ассйаготусек есгсуыас

1. Материалы и способы

1.1. Среды

Стандартную богатую среду ΎΡΌ (Βίο101) использовали для рутинного выращивания, и синтетическую недостаточную среду (Βίο101) использовали для мониторинга генетических маркеров и для отбора рекомбинантов. Для споруляции клетки предварительно культивировали в течение ночи в 8Р8 (50 мМ фталат калия, рН 5,0, 0,5% дрожжевой экстракт (Όί&ο), 1% бактопептон (Όί&ο), 0,17% дрожжевое азотистое основание, 1% ацетат калия, 0,5% сульфат аммония) плюс требуемые питательные добавки, промывали и инкубировали при встряхивании в течение двух дней. Все манипуляции проводили при 30°С. Для анализа тетрад сумки расщепляли В-глюкуронидазой Не11х ротайа (81дта) и препарировали с использованием микроскопа ΝίΕοη Есйрке Е400, оборудованного микроманипулятором ΊΌΜ400 (М1сго У1бео Шкйитеий, Ечс.). Другие генетические способы проводили, как описано ЛикиЬе1 е! а1. Сиггеи! Рго!осок ίη Мо1еси1аг Βίο1οβν (1998), 1ойи \Убеу апб 8оик, Шс., Νον Уогк. Все трансформации дрожжей выполняли с использованием Ь1Лс-способа в соответствии с АдаГер е! а1., Тесйтса1 Τίρκ 0и-йие (ййр://йо.йеиб8.сот).

1.2. Штаммы дрожжей

Все штаммы дрожжей, использованные или созданные в данном исследовании, перечислены в таблице 1 и таблице 2. Все штаммы дрожжей являются изогенными производными легко спорулирующего фенотипа \У303. Диплоид ΜΧΥ47, который служит в качестве хозяина для трансформации рекомбинационными кассетами, конструировали с использованием трансформации и генетических скрещиваний следующим образом. Гаплоид Ό184-1Β (подарок 8. СаидоГГ, СЕА, Егаисе) трансформировали фрагментом ЬЕи2 (полученным препаративной ПЦР штамма ^303 υ474 с парой праймеров БЕШиР/ЕЕШОН которые находятся в списке последовательностей, с получением Ьеи+ гаплоида ΜΧΥ13. Гаплоид Ό1841Β (подарок 8. Саид1оГГ, СЕА, Егаисе) трансформировали фрагментом ΗΙ83 (полученным препаративной ПЦР 0ΡΌ4369-25Ό с парой праймеров ΗΙ83υΕ/ΗΙ83ΌΝ), с получением Ηίκ+ гаплоида ΜΧΥ25. Гаплоиды ΜΧΥ18 и ΜΧΥ22 являются рецессивными циклогексимид-устойчивыми (Суй2К) производными Ό184-1Β и О184-1С, соответственно, отобранными на 10 мкг/мл циклогексимиде; присутствие мутаций, картирующихся в локусе СΥН2, которые придают устойчивость к циклогексимиду, подтверждали секвенированием (два различных нуклеотидных изменения, приводящие к замене глутамина 38 на лизин) и анализом расщепления. ΜΧΥ18 и ΜΧΥ25 скрещивали с получением диплоида ΜΧΥ29; ΜΧΥ13 и ΜΧΥ22 скрещивали с получением диплоида ΜΧΥ33. Гаплоидные сегреганты ΜΧΥ29-6Ό и ΜXΥ33-8С скрещивали с получением ΜΧΥ38, который является гетерозиготным в отношении маркеров 1еи2-3, 112 и 11153-11, 15, и гомозиготным в отношении мутации суйК. ΜΧΥ38 трансформировали кассетой т8Й2::ΚаиΜX, амплифицированной при помощи ПЦР из ΚΒΤ348 (подарок К. Βοήκ, Бшуегкйу оГ Беюек1ег) с праймерами Μ8Η№ и Μ8ΗΌΝ, с получением ΜΧΥ47. Трансформанты отбирали на 200 мкг/мл С418 Циуйгодеи) и подтверждали с использованием ПЦР колоний (см. ниже) с праймерами Μ8Η2Α1,

- 12 009443

М8Н2Л3 и М8Н2Л4 и анализа тетрад, т.е. анализа четырех спор, для подтверждения расщепления маркеров.

Таблица 1. Гаплоидные штаммы дрожжей

Название	Генотип	Источник или дериватизация
Ц184-1В	а игаЗ-1 ϋχρί-ΐ №53-11, 15 1еи2-3, 112 ас!е2-1
О184-1С	а1рк& игаЗ-1 ΖτρΙ-1 са№-100 №зЗ-	5.Оапд1о££

	12, 15 1еи2-3, 112 аде2-1
1)4 7 4	а1рЬа игаЗ-1 ίιρί-ΐ сап1-100 ЬгвЗ- 11, 25 ас!е2-1	5.Сапд1о££
ΟΚΌ4369-25Ό
ΜΧΥ13	а игаЗ~1 Сгр1-1 сап!-100 51=3-11, 15 а<5е2-1	О184-1В, трансформированный ПЦР^продуктом ЬЕ02
ΜΧΥ18	а игаЗ-1 £гр1-1 сап1-100 СуЬ2Кг ЫзЗ-11, 15 1ец2-3, 112 ас1е2-1	Производное суйК Э184-1В
ΜΧΥ22	а1рЬа игаЗ-1 сап1-10О суЛЗЯ й1зЗ-22, 15 2еи2-3, 112 ас/е2-1	Производное суПВ Ц184-1В
ΜΧΥ25	а1рЛа игаЗ~1 Сгр1-1 сал!-100 1еи2- 3, 112 βάβ2-1	В184-1В, тр а нсформирова нный ПЦР-продуктом Н153
ΜΧΥ29-6Ώ	а1рВа игаЗ-1 Сгр1-1 сап!-100 суЬ2Р 1еи2-3, 112 а<Зе2-1	ΜΧΥ29 сегрегант
МХУЗЗ-8С	а игаЗ-1 £гр!-1 сап1-100 сук2К №зЗ-11, 15 а6е2-1	ΜΧΥ33 сегрегант
ΜΧΥ50-3ϋ	а1р6а шзл2; : КапМХ ила 3-2 Сгр1-1 су525. сап!-100 1еи2-3, 112 ас!е2-1 В'313 31::иРАЗ-САЯ!	ΜΧΥ50 сегрегант
ΜΧΥ50-7ϋ	а1р&а игаЗ-1 ΐρρ-1-Ι суЬ2В сап1- 100 ЫзЗ-11, 15 аде2-2 ВЗОЗ!: :'ЗЕАЗСА111	ΜΧΥ50 сегрегант
ΜΧΥ51-2Β	аЗрАа тз!12::КапМХ игаЗ-1 1гр1-1 су62В сап1-100 ЫвЗ-11,15 а<5е2~1 8'3031:: иКАЗ-0ха7-САЫ1	ΜΧΥ51 сегрегант
МХУ51-10С	а1рЬа игаЗ-1 Сгр1-1 суА2Р. сап!-100 1еи2-3, 112 ас!е2-1 3'3031: :иКАЗ- Оха 7-САМ1	ΜΧΥ51 сегрегант
ΜΧΥ52-2Α	а1р6а п>зЬ2:: КапМХ игаЗ-1 ΐτρ.1-1 су52Р. сап1-100 ЫзЗ-11,15 а0е2-1 3'0031:: иПАЗ-ОхаН-САЫ!	ΜΧΥ52 сегрегант
ΜΧΥ52-7Ο	а!р6а игаЗ-1 £гр1-1 суЛ2И сап1-100 1еи2-3, 112 а<1е2-1 В'3031 .· :ϋΚΑ3- Оха11-СА111	ΜΧΥ52 сегрегант
МХУ53-11С	а игаЗ-1 1гр1-1 суВЗК сап1-100 1еи2-3, 112 аРе2-1 ВШ131: :ТНР1- СУН2	ΜΧΥ53 сегрегант
ΜΧΥ53-11Ο	а тзЬ2::КапМХ игаЗ-1 Сгр1~1 сап1- 100 суВ2В ЫзЗ-11,25 ас!е2-2 ВШХ32 : ; ТКР1-СУН2	ΜΧΥ53 сегрегант

- 13 009443

МХУ55-1С	а теЬ2::КапМХ игаЗ-1 Ьгр1-1 Сап1- 100 суЪ2К ЫзЗ-11,15 ас!е2-1 ЕЕО31: ; ТКР1 -Оха 11-СУН2	ΜΧΥ55 сегрегант
ΜΧΥ55-2Β	а игаЗ-1 Ъгр1-1 сап1-100 су/2Р. ЫвЗ-11,15 а<1е2-1 Βυΰ31::ΤΚΡ1- 0ха11-СУН2	ΜΧΥ55 сегрегант
ΜΧΥ55-13Ο	а ::КапМХ игаЗ-1 Сгр1-1 сап1- 100 суп2Р. 1еи2-3, 112 аде2-1 ВОО31: : ТР.1-1 -Оха 11 -СУН2	ΜΧΥ55 сегрегант
ΜΧΥ79-3Β	а1рЬа игаЗ-1 ΐτρΙ-1 сап1-100 ~уг,2Р ЫзЗ-11,15 1еи2-3, 112 βάβ2- 1 ВиР31: :иКАЗ-Оха5-САН1	ΜΧΥ7 9 сегрегант
ΜΧΥ79-9Α	а1р&а игаЗ-1 £гр1-1 сап1-100 су/12В 1еи2-3, 112 ас1$2-1 ΒϋΏ31: : УКАЗ - Оха 5 - САШ	ΜΧΥ7 9 сегрегант
ЙВТ348	аЗрЬа тз&2::КапМХ игаЗ-1 1уз2-д	К.Вогбв

Таблица 2. Диплоидные штаммы дрожжей

Название	Генотип	Источник или дериватизация
ΜΧΥ29	а/а1рЬа игаЗ-1/ Сгр1-1/ суЕ2К/С/Н2 сап1-100/ Ы.зЗ-11, 15/ΗΙ53 1еи2-3, 112/ ас!е2-1/	ΜΧΥ18 х ΜΧΥ25
ΜΧΥ33	а/а!р!1а игаЗ-1/ 1гр1-1/ суЪ2К/СУН2 сап1-100/ ЫвЗ-11, 15/ 1еи2-3, 112/ΕΕΊ2 а0е2-1/	ΜΧΥ22 х ΜΧΥ13
ΜΧΥ38	а/а1рЕа игаЗ-1/ Сгр1-1/ су/2Р./ сап1-100/ МзЗ-11, 15/Н133 1еи23, 112/ЕЕЕ2 а<1е2~1/	МХУЗЗ-8С х ΜΧΥ29-6Ο
ΜΧΥ47	а/а1р8а тз/12: КапМХ/МЗН2 игаЗ-1/ Сгр1-1/ суЪ2Я/ СаП1-1ОО/ ЫаЗ- 11, 15/ΗΙ53 1еи2~3, 112/ЕЕ02 а<3е2- 1/	ΜΧΥ38, трансформированный продуктом ПЦР шзН2:;КапМХ
ΜΧΥ50	а/з1рпа тзЬ2;: КапМХ/М5Н2 игаЗ-1/ Сгр1~1/ суЬ2В/ сап1-100/ ЫзЗ11, 15/ΗΙ33 1еи2-3, 112/ЬЕУ2 аде2-	ΜΧΥ47, трансформированный МоМ-расщепленной

- 14 009443

	1 / ВООЗ!: : МАЗ-САЯ! /ΒυΩ31	рМХУЭ
ΜΧΥ51	а/а1рЬа тз312::КапМХ/МЗН2 илаЗ-!/ 1гр1-1/ СуЬ2Н/ СЭП1-100/ ЫяЗ- 11, 15/ΗΙ53 1еи2-3, 112/ЪЕи2 ас1е2- 1 / ВВ031 :: СКАЗ-Оха 7-САЯ1 /ВИГ, 31	ΜΧΥ47, трансформированный ΝοΐΙ-расщепленной ρΜΧΥ13
ΜΧΥ52	а/а1рЬа тзк2::КапМХ/МЗН2 игаЗ/ Сгр1~1/ су'п2В./ сап1-100/ ЫзЗ11, 15/ΗΙ33 1еи2-3, 112/ЬЕи2 аЗс-21 / ΒϋΟ31: : 'МАЗ-Оха! 1 -САМ1 /ВиО31	ΜΧΥ47, трансформированный Νοΐ1’расщепленной ρΜΧΥ14
ΜΧΥ53	а/а1р!1а шз!12: :КапМХ/МЗН2 игаЗ-1/ I. гр1-1/ су112К/ сап1-100/ Ъ1зЗ- II, 15/ΗΙΒ3 1еи2-3, 112/ΕΕ02 а0е22/ ВООЗ! : : ТНР1 -С¥Н2/В0Е31	ΜΧΥ47, трансформированный Νοί1-расщелленмой ρΜΧΥ12
ΜΧΥ55	а/а1рАа шзЬ2::КапМХ/ ΜΞΗ2 игаЗ1/ Сгр1-1/ суп2К/ сап1-100/” 11153-11, 15/ΗΙ53 16112-3, 112/:,3332 а<Зе2-1/ ВОРЗ!:: ТКР1-0ха11СУН2/ВиО31	ΜΧΥ47, трансформированный ΝοΐΙ-расщепленной рМХУ22
ΜΧΥ57	а/а1рХа :тп2;; КапМХ/ игаЗ-1/ Сгр1-1/ суА2К/ сап1-100/ п!зЗ11, 15/ΗΙ33 1еи2-3, 112/ЕЕи2 а0е21/ ВТО31: : ΪΡ.Ρ1 -СУН2/ВиЕ31: : ЗР.АЗ0ΑΝ1	ΜΧΥ50-3Ο X ΜΧΥ53- 110
ΜΧΥ5 9	а/а1рАа игаЗ-1/ Сер1-1/ суЪЗВ/ сап1-100/ ЫзЗ-11, 15/ΗΙ33 1еи23, 112/ίΕυ2 а<1е2-1/ ВОО31: :ТКР1СУН2/ВиР31: : ОЕАЗ-САМ!	ΜΧΥ50-70 х ΜΧΥ53- 11С
ΜΧΥ60	а/а1рЬа игаЗ-1/ £гр1-1/ суА2Я/ сап1-100/ ЫзЗ-11, 15/ΒΙΞ3 1еи23, 112/ЬЕиг ас1е2-1/ В1Ю31: :ТКР1Оха11-СУН2/ВОО31: : МАЗ-Оха 11-0ΑΝ1	ΜΧΥ52-7Ρ х ΜΧΥ55-2Β
ΜΧΥ62	а/а1р!1а т$!12: :КапМХ/ игаЗ-1/ 1гр1-1/ су!12К/ сап1-100/ ίιί$311, 15/ΗΙ33 1еи2~3, 112/ЕЕВ2 а<3е21/ В0031: :ТВР1-0ха11- сунг/виоз! .·иялз-охаи-саш	ΜΧΥ52-2Α х МХУ55-1С
ΜΧΥ64	а/а1рЪа игаЗ-1/ Сгр1~1/“ сузЗР:/ СЗП1-100/ ЫеЗ-11, 15/ΗΙ33 1еи23, 112/ЬЕиг а<Зе2-1/ ВиО31: : МАЗОха 7-ΟΑΝ1/ΒΰΟ31: : ТРР1 -Оха11-СУН2	МХУ51-10С х ΜΧΥ35- 2В
ΜΧΥ66	а/а1рЬа тзЬ2: :КапМХ/ игаЗ-1/ £гр1-1/ су^2И/ сап1-100/ №зЗ-	ΜΧΥ51-2Β х ΜΧΥ55- 13Р

- 15 009443

	11, 15/Н153 1еи2-3, 112/ЬЕи2 аде2- 1/ ВЦО31:: ТКР1 -Оха 11 - 0ΪΗ2/ΒυΩ31::СЕАЗ-Оха7-САЯ1
ΜΧΥ79	а/а1р6а тз62::КапМХ/МЗН2 цгаЗ-1/ Ζζρ1-1/ су 62 В./' сап1-100/ Н1зЗ11, 15/ΗΙ53 1еи2-3, 112/1ЕО2 аде21/ В11О31:: СКАЗ-ОхаЗ-САЫ1/ВСО31	ΜΧΥ47, тра ненормированный Νοΐΐ-растепленной рМХУ24
ΜΧΥ99	а/а!рка игаЗ-1/ £гр1-1/ суА2В/ сап1-100/ №зЗ-11, 15/ 1еи2-3, 112/ЕЕО2 а Л=2 -1 / ; СЖАЗ - 0ха5--ΟΑΝ1/Βυϋ31:: ТКР1 -ОхаИ-СДШ	ΜΧΥ79-3Β χ ΜΧΥ55-2Β
ΜΧΥ102	а/а1рНа тзЬ2::КапМХ/ игаЗ-1/ 6гр1-1/ су62В/ сап!-100/сап1 ЫзЗ-11, 15/ΗΙ53 1еи2-3, 112/ЕЕО2 аде2-1/ ВИС31: :ОПАЗ-Оха5- ΟΑΝ1 /ΒϋΡ31: : ТВР1 -Оха 11 -САШ	ΜΧΥ79-9Α х МХ¥55-1С

1.3. Конструирование плазмид

Бактериальные штаммы ХЬ1-В1ие МЕР' (ДшсгА)183 (тсгСВ-Й5б8МВ-шгг)173 епбА1 5ирЕ44 1Ы-1 гесА1 дугА96 ге1А1 1ас [Р' ргоАВ 1ас^чИДМ15 Тп10 (Те1^г) I и 1М110 (гр§Ь [81г^г] 11п 1еи 11ιί-1 1асУ да1К да1Т ага 1опА Кх баш бсш 5ирЕ44 Δ [1ас-ргоАВ] [Р^г 1гаЭ36 ргоАВ 1ас1^чИДМ15]) использовали в качестве хозяев для клонирования. Для конструирования плазмид использовали стандартные способы (Ли5иЬе1 е1 а1.). Все плазмиды, использованные или созданные в данном исследовании, находятся в списке в табл. 3. Рестрикционные ферменты (рестриктазы), ДНК-лигазу Т4 и другие ферменты, использованные в клонировании, покупали из Ие\у Епд1апб В1о1аЬ§. ДНК-фрагменты и плазмиды очищали с использованием наборов, поставляемых Ц1адеп и МасЬегеу-Иаде1.

Последовательности слева («5'-мишень»), соответствующие локусу ВиЭ31. амплифицировали препаративной ПЦР из геномной ДНК ^303 с парой праймеров ΚΝ83/ΚΝ84 и клонировали в виде Крп1/ХЬо1-фрагмента в Крп1/ХЬо1-расщепленную рК811(+) (81га1адепе) с получением рМХУ1; нацеливающие последовательности справа (3'-мишень) амплифицировали подобным образом с парой праймеров <N81/<N82 и клонировали в виде ХЬа1/Ио11-фрагмента в ХЬа1/Иоб-расщепленную рК811(+) (81га1адепе) с получением рМХУ2. Маркер ТЕР1 вырезали из р1Н53 (подарок Е. Вогй) в виде Вд1П/ЕсоК1-фрагмента и лигировали с ВашШ/ЕсоШ-расщепленной рМХУ1 с получением рМХУ3, и маркер ИВА3 вырезали из Хйо1/Ншб111-расщепленной рЕЕЭ316 (подарок Е. Вогй) и лигировали с Хйо1/Нтб111-расщепленной рМХУ1 с получением рМХУ4. Маркер САИ1 выделяли из рЕЕЭ316 в виде 8ша1-фрагмента и лигировали с Нра1-расщепленной рМХУ2 с получением рМХУ5. 5'-нацеливающие последовательности в рМХУ3 и рМХУ4 заменяли последовательностями, повторно амплифицированными из геномной ДНК, с парой праймеров ΕΝ84/ΕΝ86 и лигировали в виде Крп1/ХЬо1-фрагментов в соответствующие Крп1/ХЬо1-расщепленные плазмиды с получением рМХУ7 и рМХУ6. Эту стадию предпринимали для коррекции отсутствия из праймера <N83 сайтов рестрикции, требующихся в более поздних фазах клонирования. Крп1/8ша1-фрагмент рМХУ6, содержащий 5'-мишень и маркер ЦЕА3, лигировали с Крп1/8ша1-расщепленной рМХУ5 с получением вектора рМХУ9 рекомбинационной кассеты иЕА3-САИ1. Крп1/8ре1-фрагмент рМХУ7, содержащий 5'-мишень и маркер ТЕР1, лигировали с Крп1/8ре1-расщепленной рМХУ2 с получением рМХУ11. Наконец, маркер СУН2 амплифицировали препаративной ПЦР из геномной ДНК ^303 с парой праймеров КИ817/КИ818, расщепляли ВашН1 и Руи1 и лигировали с Вд111/Рас1-расщепленной рМХУ11 с получением вектора рМХУ12 рекомбинационной кассеты ТКР1-СУН2. Все плазмидные конструкции вводили в бактериальных хозяев электропорацией и подтверждали рестрикционным анализом, и рМХУ9, и рМХУ12 дополнительно подтверждали секвенированием всех сочленений клонирования.

Субстраты рекомбинации В-лактамазы амплифицировали препаративной ПЦР из плазмид-хозяев (предоставленных ^. 8с1юепГе1б) с использованием пары праймеров КИ836/КИ837 для Оха5 (номер доступа Х58272), ΕΝ87/ΕΝ88 для Оха7 (номер доступа Х75562)и КИ89/КИ810 для Оха11 (номер доступа Ζ22590). Продукты ПЦР Оха7 и Оха11 расщепляли Рас1 и лигировали со 8ша1/Рас1-расщепленной рМХУ9 с получением рМХУ13 и рМХУ14, соответственно, и продукт ПЦР Оха11 также расщепляли специфически и Рас1 и лигировали со специфически/Рас1-расщепленной рМХУ12 с получением

- 16 009443 ρΜΧΥ22. Продукты ПЦР Оха5 расщепляли ВатН1 и Рас1 и лигировали с Вд111/Рас1-расщепленной ρΜΧΥ9 с получением ρΜΧΥ24. Все конструкции подтверждали рестрикционным анализом.

Таблица 3. Плазмиды

Название	Описание инсерта	Источник
рКЗП ( + )	Исходный вектор	3!гаС.адепе
рКЕО316	Источник СКАЗ и САЫ1	?..Вог!з
рЛНЬЗ	Источник ТВР1	К.ВогГз
ρΜΧΥΙ	5'-мишень	Данное исследование
ρΜΧΥ2	3'-мишень	Данное исследование
ρΜΧΥ3	5'-мишень-ТКР1	Данное исследование
ρΜΧΥ4	5' -мишень-С/РАЗ	Данное исследование
ρΜΧΥ5	САМ1-3'мишень	Данное исследование
ρΜΧΥ6	5'-мишень-УйАЗ	Данное исследование
ρΜΧΥ7	5'-мишень-таИ	Данное исследование
ρΜΧΥΘ	5' -мишень-УКАЗ-САШ-3' мишень	Данное исследование
ρΜΧΥΙΙ	5'-мишень-ТЯР1-3' мишень	Данное исследование
ρΜΧΥ12	5'-мишень-ТЯР1-СУН2-3' мишень	Данное исследование
ρΜΧΥ13	5' -мишень-Ш?АЗ-Ока7- САМ1-3' мишень	Данное исследование
ρΜΧΥ14	5-мишень-СРАЗ-Оха 11- САМ1-3' мишень	Данное исследование
ρΜΧΥ22	5'-мишень-ТКР1-Оха 11- ΟΥΗ2-3' мишень	Данное исследование
ρΜΧΥ24	5' -мишень-[7ЙАЗ-Оха5- САЫ1-3' мишень	Данное исследование

1.4. Отбор и характеристика рекомбинантов

Для рекомбинации первого раунда плазмиды, несущие рекомбинационные кассеты, расщепляли ΝοίΙ, и все продукты расщепления использовали для трансформации ΜΧΥ47. Отбирали прототрофы в отношении урацила (для ρΜXΥ9-производных) или в отношении триптофана (для ρΜΧΥ12производных) и нацеливание на одну из двух хромосомных копий локуса ΒυΌ31-Η0Μ1 введенной конструкции подтверждали с использованием ПЦР колоний с применением праймеров ΚΝ812/ΚΝ813/ΚΝ815 для ЛКЛ3-САМ-производных и праймеров ΚΝ812/ΚΝ813/ΚΝ814 для ТИР1СУН2-производных, которые позволяют амплифицировать фрагменты из интактных и из разрушенных локусов ΒυΌ21-Η0ν1. Трансформированные гетерозиготы спорулировали и проводили анализ тетрад для идентификации гаплоидов дикого типа и 1115112, несущих рекомбинационные кассеты. Подходящие гаплоиды противоположного типа спаривания наносили в виде пятен на чашки ΥΡΌ, давали им расти в течение ночи, смешивали вместе на одной и той же чашке ΥΡΌ и давали спариваться в течение ночи. Чашку для спаривания использовали для перепечатывания колоний на другую чашку (метод отпечатков (реплик)) на среду -Лга, -Ττρ для отбора диплоидов, которые инокулировали на следующий день в виде всей массы в 8Р8 с добавками и культивировали в течение ночи. Эту предварительную культуру откручивали и промывали и эти клетки ресуспендировали в 1% ацетате калия с добавками и инкубировали в течение двух дней.

Спорулированные клетки собирали, определяли их количество и в некоторых случаях препарировали для подтверждения подходящего расщепления всех маркеров. Сумки расщепляли зимолиазой-20Т (ΙΟΝ В1отей1са15) для высвобождения спор, суспензию спор обрабатывали ультразвуком (Вгаизои Μοάе1 250 ЛщЦа1 8ои1йег) и подходящие разведения высевали на ΥΡΌ для определения жизнеспособности клеток, на среду, лишенную урацила, содержащую 60 мкг/мл канаванина (81дта), для отбора рекомбинантов Лга+СапИ и на среду, лишенную триптофана, содержащую 3 мкг/мл циклогексимида (81дта), для отбора рекомбинантов Ττρ+СуЬК. Колонии спор, возникающие на каждой среде, культивировали и подвергали фенотипическим и молекулярным тестам для определения, представляют ли они истинные рекомбинанты. Для фенотипического анализа репрезентативное количество кандидатных рекомбинантов высевали повторно штриховой разводкой на ту же самую среду, использованную для отбора, и затем высевали перепечатыванием колоний на тест-чашки -Лга, -Ττρ, содержащие циклогексимид (10 мкг/мл), канаванин (60 мкг/мл) и чашки для определения типа спаривания.

- 17 009443

Споры высевали также на -Ига-Тгр-среды для определения частоты диплоидов для каждого препарата спор, который во всех случаях содержал менее чем 4% всех жизнеспособных клеток. Для молекулярного анализа тотальную геномную ДНК подвергали аналитической ПЦР (см. ниже) с использованием подходящих пар праймеров, которые специфически амплифицируют исходные или рекомбинантные фрагменты. Частоты рекомбинации для конкретного отбора выражали в виде частоты жизнеспособных клеток на конкретной селективной среде, корректированной на присутствие не-рекомбинантов, дающих ложно-положительный фенотип. В большинстве случаев такие ложно-положительные результаты возникают в результате мутационной инактивации маркера ί.ΆΝ1 или СУН2, как можно предположить на основании аналитической ПЦР.

Для рекомбинации второго раунда подходящие рекомбинанты, полученные из первого раунда рекомбинации, спаривали и отбирали Ига+Тгр+ диплоиды. Далее следовала та же самая процедура споруляции, что и для рекомбинации первого раунда, за исключением того, что споры высевали на ΎΡΌ, на среды, лишенные урацила, содержащие циклогексимид, для отбора рекомбинантов Ига+СуйК и на среды, лишенные триптофана, содержащие канаванин, для отбора рекомбинантов Тгр+СапВ. Кандидатные рекомбинанты аналогичным образом подвергали фенотипическому и молекулярному анализу.

1.5. Молекулярные способы

Геномную ДНК, используемую в качестве матрицы для препаративной или аналитической ПЦР, получали из ночных культур ΎΡΌ стандартной минипреп-процедурой в соответствии с ЛикиЬе1 е1 а1. Препаративную ПЦР фрагментов, используемых в клонировании или для секвенирования, выполняли с Оха-плазмидной ДНК (приблизительно 50 пг) или геномной ДНК дрожжей (приблизительно 0,5 мкг) в качестве матрицы в объемах реакции 50 мкл, содержащих 2,5 Е полимеразы Геркулазы (§1га1адепе), 1х реакционный буфер для Геркулазы, 0,2 мМ каждого из 6ΝΤΡ и 100 нг каждого праймера. Амплификацию проводили следующим образом: 94°С 2 мин; 30 циклов 94°С 10 с, 55°С 30 с, 72°С 30 с; 68°С 10 мин. Модифицированную процедуру ПЦР колоний использовали для подтверждения интеграции рекомбинантных кассет в локусе ΒυΌ31 (кйр://ллл.Гксгс.огд/1аЬк/какп/те1кобк/то1Ь1оте1к/рсг уеак! со1опу.к1т1), с использованием следующих условий амплификации: 95°С 5 мин; 35 циклов 95°С 1 мин, 55°С 1 мин, 68°С 1 мин; 72°С 10 мин. Аналитическую ПЦР для характеристики Оха-инсертов проводили в реакционных объемах 100 мкл, содержащих приблизительно 0,5 мкл геномной ДНК, полученной из кандидатных рекомбинантов и контрольных штаммов, 1,5 Е полимеразы Тад (Воске), 1 х реакционный буфер, 0,2 мМ каждого из бЫТР и 100 нг 100 нг каждого праймера, при тех же самых условиях амплификации, что и для ПЦР колоний, за исключением того, что удлинение проводили при 68°С в течение 2 мин. Все реакции амплификации выполняли с использованием Мак1егсус1ег дгаб1еп! 5331 (ЕррепбогГ).

Для анализа последовательности рекомбинантных Оха-инсертов проводили препаративную ПЦР с парами праймеров ΚΝ816/ΚΝ829 (для рекомбинантов ига+СапВ) или ΚΝ811/ΚΝ828 (для Тгр+СукВ) с последующей очисткой с использованием набора О1адшск РСВ (Ц1адеп). Продукты ПЦР секвенировали с использованием Сепоте Ехргекк (Меу1ап, ЕВ) с праймерами ΚΝ830, ΚΝ831, ΚΝ833 или ΚΝ838, в зависимости от целесообразности. Рекомбинантные последовательности сопоставляли и анализировали с использованием программы С1опе Мападег (8с1 Еб Сеп!га1). Олигонуклеотиды, используемые в ПЦР и секвенировании (таблица 3), покупали из Ргойдо Егапсе.

2. Результаты

2.1. Разработка системы мейотической гомеологичной рекомбинации дрожжей

Была разработана стратегия, которая использует дрожжи 8асскаготусек сегеуШае для стимуляции рекомбинации ш νίνο между дивергированными ДНК-последовательностями. Решающие признаки этой стратегии включают в себя использование мейотических клеток, в которых имеют место высокие уровни рекомбинации по всему геному, и инактивацию системы репарации ошибочных спариваний (ММВ), которая обычно ограничивает рекомбинацию между дивергированными последовательностями. Подлежащие рекомбинации последовательности, т. е. субстраты рекомбинации, вводят в один из двух векторов, который также несет фланкирующие маркерные последовательности таким образом, чтобы создать рекомбинационные кассеты. Эти рекомбинационные кассеты вводят в геном дрожжей, в локусе на хромосоме III (интервал ВиО31-НСМ1), который находится в районе, о котором известно, что он является рекомбинационно активным в мейозе. Диплоиды, гетерозиготные в отношении рекомбинационных кассет, спорулируют, и споры высевают на среды, которые отбирают на клетки со специфическими конфигурациями фланкирующих маркеров, что позволяет проводить отбор рекомбинантов, в которых имел место кроссовер с участием субстратов рекомбинации (фиг. 1).

Были сконструированы два обычных содержащих рекомбинационные кассеты вектора, рМХУ9 и рМХУ12, которые содержат маркеры иВА3 и ί.ΆΝ1 и маркеры ТВР1 и СУН2, соответственно, фланкирующие сайты рестрикции, которые могут быть использованы для введения субстратов рекомбинации (фиг. 2). Маркер иВА3 придает прототрофию в отношении урацила, а маркер ί.ΆΝ1 придает чувствительность к канаванину. В отсутствие этого маркера клетки являются устойчивыми к этому лекарственному средству. Маркер ТВР1 придает прототрофию в отношении триптофана, а маркер СУН2 придает чувствительность к циклогексимиду. В отсутствие этого маркера клетки являются устойчивыми к этому лекарственному средству. Каждая из этих двух рекомбинационных кассет, в свою очередь, фланкирована

- 18 009443 последовательностями, которые делают возможным нацеливание всего инсерта на локус ВиИ31-НСМ1 посредством трансформации компетентных клеток (фиг. 2). Был также сконструирован штамм, который служит в качестве первичного хозяина для трансформации, ΜΧΥ47 (табл. 2). Этот диплоид является гетерозиготным в отношении мутации т5Ь2::КапМХ и является фенотипически диплоидом дикого типа в отношении ММК. Он является также гомозиготным в отношении маркеров игаЗ-1, 1гр 1 -1, сап1-100 и суЬ2К, что делает возможным мониторинг присутствия маркеров рекомбинационной кассеты, и гетерозиготным в отношении маркеров 1153-11,15 и 1си2-3, 112. ΜΧΥ47 трансформируют фрагментами, несшими рекомбинационные кассеты, первичные трансформанты отбирают в виде прототрофов ига+ или Тгр+ (для производных ΜΧΥ9 и ΜΧΥ12, соответственно) и нацеливание подтверждают аналитической ПЦР с использованием праймеров, которые узнают последовательности внутри введенной конструкции и снаружи от нее. Первичные трансформанты спорулируют и тетрады препарируют и высевают перепечатыванием колоний (методом отпечатков (реплик)) для идентификации сегрегантов дикого типа или 1115112. которые несут рекомбинационную кассету. Подходящие гаплоиды спаривают один с другим с получением диплоидов М8Н2/М8Н2 (дикого типа) и т5Ь2/т5Ь2, гетерозиготных в отношении субстратов рекомбинации. В первом раунде мейотической рекомбинации для генерирования рекомбинантов эти диплоиды спорулируют, и свободные споры высевают на среды, лишенные урацила и содержащие канаванин, для отбора на рекомбинанты с иКЛ3-СУН2-конфигурацией фланкирующих маркеров (колонии спор ига+СапК), или на среды, лишенные триптофана и содержащие циклогексимид, для отбора на ТКР1-СЛМ1-конфигурацию (колонии спор Тгр+СуЬК). Исходные диплоиды и нерекомбинантное гаплоидное потомство не могут расти на этих средах. Определяют частоту колоний спор, возникающих на селективных средах, колонии кандидатных рекомбинантных спор характеризуют фенотипически посредством перепечатывания колоний на тест-среды и молекулярно посредством ПЦР с соответствующими парами праймеров, и пробу подтвержденных рекомбинантов отбирают для секвенирования.

Эта стратегия является итеративной (повторяющейся) в том смысле, что клетки, несущие рекомбинантные инсерты, могут быть идентифицированы и подвергнуты дополнительным раундам мейотической рекомбинации для увеличения разнообразия. Во втором раунде спаривают гаплоиды ига+СапК и Тгр+СуЬК и процесс споруляции и отбора повторяют, за исключением того, что новые рекомбинанты отбирают на средах, лишенных урацила и содержащих циклогексимид, для отбора на рекомбинанты с иКЛ3-СЛМ1-конфигурацией фланкирующих маркеров (колонии спор ига+СуЬК), или на средах, лишенных триптофана и содержащих канаванин, для отбора на ТКР1-СУН2-конфигурацию (колонии спор Тгр+СапК). Описанная здесь подробно стратегия может быть также модифицирована для включения дополнительных маркеров для увеличения строгости отбора. Кроме того, рекомбинанты могут также отбираться непосредственно при помощи ПЦР с использованием праймеров, специфических в отношении фланкирующих последовательностей.

2.2. Фенотипический отбор на рекомбинанты между парами генов Оха с варьирующейся дивергенцией последовательностей

Гены, принадлежащие к суперсемейству Оха бета-лактамаз, были выбраны в качестве субстратов для тестирования возможности использования этой системы для отбора рекомбинантов. Рекомбинацию между следующими парами Оха оценивали в генетическом фоне дикого типа и Ш5112: Оха11-Оха11, которые имеют 100% гомологию на протяжении 800 п.н. ОКЕ; Оха7-Оха11, 95%; Оха5-Оха11, 78%. Диплоиды, полученные скрещиваниями между соответствующими гаплоидами, индуцировали для вступления в мейоз. Из мейотических культур получали споры, и серийные разведения высевали на ΥΡΌ для определения жизнеспособности клеток и на среду, лишенную урацила и содержащую канаванин (ига+Сап), и на среду, лишенную триптофана и содержащую циклогексимид (-Тгр+СуЬ), для отбора на рекомбинанты.

2.3. Частоты рекомбинации между генами Оха с варьирующейся гомологией последовательностей

Данные, показанные на фиг. 3, демонстрируют, что в генетическом фоне дикого типа увеличенная гетерология последовательности оказывает сильное ингибирующее действие на рекомбинацию кроссоверов, и что это действие ослабляется, но не устраняется мутацией Ш5112. Обычно мутация Ш5112 вызывает увеличение частоты рекомбинации на приблизительно один порядок величин над рекомбинацией, которую наблюдают для штаммов дикого типа, при двух уровнях тестируемой дивергенции. Однако только инактивация М8Н2 не компенсирует ингибирование рекомбинации между субстратами рекомбинации с более высокими степенями гетерологии. Например, частоты рекомбинации для штамма т512 с инскертами Оха, имеющими 78% гомологию (ΜXΥ102), по меньшей мере в 10 раз (ига+СапК) и в 25 раз (Тгр+СуЬК) ниже частот, обнаруживаемых для штамма дикого типа с инсертами Оха со 100% гомологией (ΜXΥ60), что свидетельствует о том, что факторы, иные, чем М8Н2-зависимая репарация ошибочных спариваний, предотвращает рекомбинацию кроссоверов между более дивергированными последовательностями. Следует отметить, что появление рекомбинантов т5Ь2 при уровне дивергенции 78%, при частотах приблизительно 2-10^-4, свидетельствует о том, что рекомбинация может быть достигнута между даже более дивергентными субстратами.

- 19 009443

2.4. Эффект гиперрекомбинации 1115112

Действие 1П5112 на гомологичную и гомеологичную рекомбинацию определяли количественно расчетом - сначала отношения рекомбинантов 1115112 к рекомбинантам дикого типа для конкретного процента гомологии для конкретного отбора для каждого эксперимента и затем расчетом средних величин и стандартных отклонений группы определенных таким образом отношений. Эти результаты показаны на фиг. 4. Присутствие мутации 1115112 увеличивает частоту гомеологичной рекомбинации для последовательностей 95 и 78% гомологии, и имеется менее выраженное, но все еще определяемое количественно усиление рекомбинации между идентичными на 100% последовательностями. Кроме того, степень усиления при помощи т512 гомеологичной рекомбинации различается для двух отборов: для штаммов с гомеологичными инсертами Оха инактивация М8Н2 увеличивает частоту рекомбинантов Тгр+СуйК в более высокой степени, чем она увеличивает частоту рекомбинантов Ига+СапК. В принципе, частоты обоих типов рекомбинантов (Ига+СапК и Тгр+СуйК) должны быть эквивалентными, но эти числа свидетельствуют о том, что имеются неоднозначности в этой системе, которые провоцируются или усиливаются мутацией 1115112, вместе с вариациями в степени дивергенции последовательности. Эксперименты для испытания относительных влияний инсертов и фланкирующих маркерных последовательностей на типы полученных рекомбинантов показывают, что эта неоднозначность является свойством фланкирующих маркеров, а влияние субстратов рекомбинации в управлении результатами событий мейотической рекомбинации не может быть ответственным за это (данные не показаны).

2.5. ПЦР-анализ отобранных рекомбинантов

Пример ПЦР-анализа, примененного к колониям спор Ига+СапК и Тгр+СуйК, полученных из диплоидов дикого типа и 1115112, содержащих гены Оха 22% дивергенции (МХУ99 и МХУ102, соответственно), показан на фиг. 5. Для каждого штамма анализировали десять колоний спор, которые проявляли каждый рекомбинантный фенотип. Экстракты из каждой колонии использовали в качестве матриц для амплификации с парами праймеров, которые специфически амплифицируют исходные молекулы, и с парами праймеров, которые специфически амплифицируют рекомбинантные молекулы. В каждом случае (в случаях) амплифицировался только предсказанный рекомбинантный инсерт, что свидетельствовало о том, что отобранные колонии спор содержали последовательности, продуцируемые рекомбинацией между исходными субстратами рекомбинации Оха. Эти результаты демонстрируют также, что рекомбинантные молекулы могут быть легко извлечены из спорулированных культур, даже без привлечения стадии генетического отбора. В данном случае сайты узнавания праймеров, локализованные в генах ИКЛ3, СЛЫ1, ТКР1 и СУН2, представляют молекулярные маркерные последовательности, которые фланкируют каждый субстрат рекомбинации.

2.6. Анализ последовательности мейотических гомеологичных рекомбинантов первого раунда: 5% и 22% дивергенция

Мейотические рекомбинанты Оха7-Оха11, произведенные из диплоидов дикого типа и т512 (МХУ64 и МХУ66, соответственно), которые содержат субстраты рекомбинации, имеющие 95% гомологию, которая была достаточной для фенотипических и молекулярных (ПЦР) тестов, амплифицировали с праймерами, специфическими в отношении фланкирующих маркеров, и секвенировали с использованием праймеров, близких к сайтам старта и остановки трансляции. Всего анализировали 55 рекомбинантных последовательностей, полученных из гаплоидного потомства диплоидов Оха7-Оха11: 14 рекомбинантов Ига+СапК и 13 рекомбинантов Тгр+СуйК из МХУ64 и 14 рекомбинантов Ига+СапК и 14 рекомбинантов Тгр+СуйК из МХУ66. Размер секвенированных проб позволяет сделать несколько наблюдений. 1) Как для рекомбинантов дикого типа, так и для рекомбинантов т512 положение, в котором имел место кроссинговер, находится в диапазоне полного кодирующего района, без явного предпочтения в отношении конкретного интервала. Кроссоверы, которые встречались в 5'-районе, были, вероятно, такими же, как и кроссоверы в 3'-районе. Кроме того, для конкретного штамма не было видимого различия в распределении сайтов кроссовера для колоний спор, полученных отбором -Ига+Саи или отбором -Тгр+Суй. 2) Длина непрерывной гомологии в интервале кроссовера также не имела значения: кроссоверы детектировали между двумя близко расположенными полиморфизмами (положения 543-552 для Тгр+СуйК #7, #8 и #13 МХУ66, где положение 1 представляет остаток аденина сайта инициации трансляции АТС), а также между двумя наиболее далеко расположенными один от другого полиморфизмами (положения 163-265, например, Тгр+СуйК #15). 3) Рекомбинантные инсерты Оха, выделенные из обоих генетических фонов дикого типа и т512, содержали полноразмерные рекомбинантные последовательности, потенциально способные кодировать новые функциональные белки Оха. То есть все кроссоверы появлялись таким образом, чтобы сохранить интактную рамку считывания (ОКЕ), без инсерции или делеции нуклеотидов в интервале кроссовера или в любом другом интервале. 4) Хотя структуры большинства рекомбинантных последовательностей согласовались с простым кроссовером между двумя последовательностями Оха в локальных районах гомологии, несколько рекомбинантов, выделенных в генетическом фоне т512, проявляли более высокую сложность. Последовательности, полученные из четырех рекомбинантов (Ига+СапК #16 и #31 МХУ66 и Тгр+СуйК #5 и #9 МХУ66), проявляли более высокую степень мозаицизма (мозаичности), как если бы они были получены из более чем одного события кроссовера. Действительно, анализ двух из этих рекомбинантов был осложнен, так как исследование электрофореграмм вы

- 20 009443 явило присутствие двух перекрывающихся пиков во множественных сайтах в секвенированном районе, причем каждый сайт соответствовал полиморфизму Оха7-Оха11. Это наблюдение указывает на то, что популяция молекул, которые были секвенированы, была гетерогенной, наиболее вероятным объяснением чего является присутствие нерепарированной или частично репарированной гетеродуплексной ДНК, присутствующей в рекомбинантных спорах 11'1512. Эта интерпретация согласуется с известной увеличенной частотой постмейотической сегрегации (РМ8), вызываемой мутацией 11'1512. В этих двух случаях, Ита+СапВ #16 и #31 ΜΧΥ66, один или более репарированных сайтов были фланкированы отрезками нерепарированного гетеродуплекса, что согласуется с демаскировкой активности репарации ошибочных спариваний коротких участков в генетическом фоне т512, как предполагалось Со1с, С1иск апб РаЬге (ЕМВО 1. 19:3408). Несколько других случаев РМ8, не ассоциированных с репарацией ошибочных спариваний коротких участков, наблюдали также для рекомбинантных последовательностей 1115112. что свидетельствует о том, что эта альтернативная система репарации ошибочных спариваний не может быть высокоэффективной в коррекции ошибочных спариваний в гетеродуплексной ДНК. На основании оценки из электрофореграмм последовательности степень некорректированного гетеродуплекса варьировалась от короткого района из приблизительно 50 нуклеотидов до района, почти охватывающего полную ОВР. Доказательство для РМ8 или репарации ошибочных спариваний коротких участков не было обнаружено для рекомбинантных последовательностей дикого типа. В целом, эти открытия предполагают, что степень создаваемого разнообразия является более высокой в мейозе т512, чем в мейозе дикого типа. Мейотические рекомбинанты получали также из диплоидов дикого типа и т512, которые содержат субстраты рекомбинации, имеющие 78% гомологию (ΜXΥ99 и ΜXΥ102, соответственно). В целом, анализировали 24 рекомбинантные последовательности, полученные из рекомбинантного потомства диплоидов Оха5-Оха11: пять рекомбинантов Ита+СапВ и три рекомбинанта Тгр+Су1В из МХ^99 и девять рекомбинантов Ита+СапВ и семь рекомбинантов Тгр+Су1В из ΜXΥ102. Исследование этих последовательностей предполагает несколько тенденций. 1) Рекомбинантные последовательности Оха, полученные как в штамме дикого типа, так и в штамме 1512 отбором на -Тгр+Су1В, обнаруживали кроссоверы в различных положениях на протяжении ОВР, с, возможно, легкой тенденцией в отношении среднего района из 250 п.н. (нуклеотиды 333-573) всей общей области гомологии. В противоположность этому, рекомбинанты, полученные как в штамме дикого типа, так и в штамме 1512 отбором на -ига+СапВ, обнаруживали явно выраженное смещение в положениях кроссоверов: в 3 из 5 последовательностей дикого типа, и в 8 из 9 последовательностей 1512 кроссоверы встречались в пределах последних 80 нуклеотидов района разделяемой гомологии, т. е. в последних 10% ОВР. 2) Интервалы абсолютной гомологии, в которых были идентифицированы кроссоверы, находятся в диапазоне 11-20 нуклеотидов для Тгр+Су1Вотбора, что свидетельствует о предпочтительности в отношении этих относительно более длинных районов идентичности последовательности. В противоположность этому интервалы кроссовера были более короткими для Ига+Саи-отбора, в диапазоне 3-17 нуклеотидов (13 из 14 этих интервалов составляли 13 или менее нуклеотидов). 3) Что касается рекомбинации с участием последовательностей с 95% гомологией, полученные новые последовательности также состояли из интактных ОВР и потенциально кодируют новые белки суперсемейства Оха. 4) Случаи РМ8, согласно оценке электрофореграмм, не были обнаружены для рекомбинантов дикого типа, но очень короткие участки нерепарированного гетеродуплекса были обнаружены для нескольких рекомбинантов т512, в том числе в 3 из 7 Тгр+Су1Врекомбинантов. Эти районы включали в себя максимально 67 нуклеотидов, т.е. были более короткими, чем некоторые из этих районов, наблюдаемых для рекомбинантов Оха7-Оха11. В целом, эти наблюдения свидетельствуют о том, что рекомбинантные последовательности могут быть отобраны от введенных субстратов рекомбинации, с варьированием по меньшей мере на 22%, и что эти последовательности кодируют новые белки.

2.7. Анализ последовательности рекомбинантов Оха7-Оха11 второго раунда

Способность системы дрожжей увеличивать разнообразие итеративным образом исследовали конструированием диплоидов из рекомбинантных гаплоидов Оха7-Оха11, генерированных в первом раунде мейоза, и подверганием этих новых диплоидов второму раунду мейоза. Среди секвенированного Ита+СапВ- и Тгр+Су1В-семейства МХ^64 и МХ^66 были отобраны пары подходящих рекомбинантов с кроссоверами в одном и том же интервале для конструирования новых диплоидов, в которых общий уровень гомологии последовательности был опять равен 95%. Были созданы три диплоида дикого типа (МХ^81, МХ^82 и МХ^83) и три диплоида т512 (МХ^86, МХ^87 и МХ^88). Были сконструированы также контрольные диплоиды дикого типа и т512, содержащие только инсерты последовательности Оха, из подходящего рекомбинантного потомства МХ^60 и ΜΧΥ62, дающие МХ^90 и МХ^92. Эти диплоиды спорулировали и споры помещали на среду, лишенную урацила и содержащую циклогексимид (Ита+Су1), и на среду, лишенную триптофана и содержащую канаванин (-Тгр+Сап), для отбора рекомбинантов второго раунда. Как показано на фиг. 6, частоты колоний спор -Ита+СуйВ и -Тгр+СапВ, наблюдаемые для всех этих штаммов, согласуются с антирекомбинационным действием гена М8Н2. Оба типа колоний были обнаружены среди потомства гомозиготного ΜΧΥ90 дикого типа с частотами, большими, чем 10^-3, в то время как эти частоты уменьшались в 5-10 раз среди потомства диплоидов дикого типа с гетерологией инсерта Оха (МХ^81, МХ^82 и МХ^83). Инактивация гена М8Н2 в диплоидах с дивер

- 21 009443 гентными инсертами Оха (ΜΧΥ86, ΜΧΥ87 и ΜΧΥ88) приводила к 2-6-кратному увеличению частоты колоний спор Ига+СуБК и ΤΓρ+СапК, аналогично уровням, наблюдаемым для диплоида т§Ь2, несущего идентичные инсерты Оха (ΜΧΥ92). Хотя использованные среды отличаются от сред, использованных для отбора рекомбинантов первого раунда, частоты, при которых отбирали рекомбинанты дикого типа и т§Ь2 второго раунда, являются сравнимыми с частотами для рекомбинантов первого раунда.

Колонии спор Ига+СуБК и Тщ+СапК в генетических фонах как дикого типа (ΜΧΥ81 и ΜΧΥ83), так и т§Ь2 (ΜΧΥ86) отбирали для секвенирования. Всего секвенировали 14 инсертов Оха дикого типа и 7 инсертов Оха т§Ь2. В большинстве случаев кроссовер происходил в новом интервале во время рекомбинации второго раунда, опять без видимого смещения в отношении положения или размера интервала: кроссоверы, включающие в себя различные интервалы, были обнаружены на протяжении ОКЕ Оха, и они встречались в таких больших интервалах, как 101 нуклеотид, и в таких малых интервалах, как 5 нуклеотидов. В одном случае (ΤΓρ+СуБК-гаплоид ΜΧΥ83) кроссовер второго раунда встречался в интервале кроссовера первого раунда, восстанавливая посредством этого полную последовательность Оха11. Рекомбинанты, извлеченные из диплоидов т§Ь2, были более разнообразными, чем рекомбинанты, извлеченные из штаммов дикого типа. Для диплоида т§Ь2 ΜΧΥ86 наблюдали несколько колоний спор, проявляющих интенсивную постмейотическую сегрегацию (ΡΜ8) и мозаицизм (мозаичность) последовательности, согласующиеся с образованием длинных участков гетеродуплекса в промежуточном продукте рекомбинации. Кроме того, некоторые ошибочные спаривания были репарированы в этом гетеродуплексном участке, что опять согласуется с активностью репарации ошибочных спариваний в коротких участках. В целом, рекомбинация второго раунда в генетическом фоне т§Ь2 является такой же эффективной, как и рекомбинация первого раунда, как количественно, в отношении генерирования разнообразия последовательностей (например, распределения интервалов кроссовера и встречаемости ΡΜ8), так и качественно, в отношении увеличения общей частоты гомеологичной (с 5% дивергенцией) рекомбинации.

Claims (44)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ получения и обнаружения рекомбинантных ДНК-последовательностей в 8ассНаготусе5 сегеуШае, предусматривающий стадии:

   a) получения первых диплоидных клеток 8ассНаготусе5 сегеуШае, несущих в определенном локусе их генома первую рекомбинационную кассету, содержащую первую, подлежащую рекомбинации ДНКпоследовательность, которая фланкирована, по меньшей мере, первой и второй маркерными последовательностями, и в аллельном положении вторую рекомбинационную кассету, содержащую вторую, подлежащую рекомбинации ДНК-последовательность, которая фланкирована, по меньшей мере, третьей и четвертой маркерными последовательностями,

   b) индукции споруляции первых диплоидных клеток, полученных в а), и

   c) выделения гаплоидных клеток, содержащих рекомбинационные кассеты, в которых первые рекомбинированные ДНК-последовательности фланкированы, по меньшей мере, первой и четвертой маркерными последовательностями, и гаплоидных клеток, содержащих рекомбинационные кассеты, в которых вторые рекомбинированные ДНК-последовательности фланкированы, по меньшей мере, второй и третьей маркерными последовательностями.
2. 2. Способ по п.1, дополнительно предусматривающий стадии:

   a) получения вторых диплоидных клеток спариванием гаплоидных клеток, содержащих первые рекомбинированные ДНК-последовательности, полученные в 1с), с гаплоидными клетками, содержащими вторые рекомбинированные ДНК-последовательности, полученные в 1с),

   b) индукции споруляции вторых диплоидных клеток, полученных в а), и

   c) выделения гаплоидных клеток, содержащих рекомбинационные кассеты, в которых третьи рекомбинированные ДНК-последовательности фланкированы, по меньшей мере, первой и второй маркерными последовательностями, и гаплоидных клеток, содержащих четвертые рекомбинационные кассеты, в которых четвертые рекомбинированные ДНК-последовательности фланкированы, по меньшей мере, третьей и четвертой маркерными последовательностями.
3. 3. Способ по п.1 или 2, в котором дополнительно рекомбинированные ДНК-последовательности получают, подвергая гаплоидные клетки, полученные в 2с), по меньшей мере еще одному циклу спаривания с другими гаплоидными клетками индукции споруляции полученных диплоидных клеток, и выделением гаплоидных клеток с рекомбинированными ДНК-последовательностями на основе молекулярного сцепления между двумя маркерными последовательностями.
4. 4. Способ по любому из пп.1-3, в котором первую диплоидную клетку получают одновременной или последовательной трансформацией диплоидной клетки 8. сегеуыае ДНК-молекулой, содержащей первую рекомбинационную кассету, и ДНК-молекулой, содержащей вторую рекомбинационную кассету, и необязательно предоставлением возможности интеграции этих двух рекомбинационных кассет в аллельные положения генома 8. сегеуыае.
5. 5. Способ по п.4, в котором ДНК-молекулой, содержащей первую или вторую рекомбинационные кассеты, является искусственная хромосома дрожжей (ΥΛΟ).

   - 22 009443
6. 6. Способ по п.4, в котором ДНК-молекулой, содержащей первую или вторую рекомбинационные кассеты, является клонирующий вектор, посредством которого соответствующие две маркерные последовательности фланкированы нацеливающими последовательностями, которые являются гомологичными определенному локусу генома 8. сегеуыае.
7. 7. Способ по любому из пп.1-3, в котором первую диплоидную клетку получают слиянием гаплоидной клетки 8. ссгсуыас. несущей в локусе ее генома первую рекомбинационную кассету, с гаплоидной клеткой 8. сегеу181ае, несущей в аллельном положении вторую рекомбинационную кассету.
8. 8. Способ по любому из пп.1-3, в котором первую диплоидную клетку получают спариванием гаплоидной клетки 8. сегеу181ае, несущей в локусе ее генома первую рекомбинационную кассету, с гаплоидной клеткой 8. сегеу181ае, несущей в аллельном положении вторую рекомбинационную кассету.
9. 9. Способ по п.7 или 8, в котором гаплоидные клетки, несущие первую или вторую рекомбинационную кассету, получают:

   a) встраиванием первой, подлежащей рекомбинации ДНК-последовательности между первой и второй маркерными последовательностями, расположенными смежно на первом клонирующем векторе, и встраиванием второй подлежащей рекомбинации ДНК-последовательности между третьей и четвертой маркерными последовательностями, расположенными смежно на втором клонирующем векторе, посредством чего соответствующие две маркерные последовательности фланкированы нацеливающими последовательностями, которые являются гомологичными определенному локусу генома 8. сегеуЩае,

   b) вырезанием из клонирующих векторов, полученных в а), фрагментов, несущих первую рекомбинационную кассету и вторую рекомбинационную кассету соответственно, посредством чего каждая из этих кассет содержит подлежащую рекомбинации ДНК-последовательность, фланкированную соответствующими двумя маркерными последовательностями, и каждая кассета, в свою очередь, фланкирована нацеливающими последовательностями,

   c) трансформацией фрагментов, несущих эти рекомбинационные кассеты с фланкирующими нацеливающими последовательностями, полученных в Ь), по отдельности в диплоидные клетки 8. сегеу181ае, посредством чего нацеливающие последовательности направляют интеграцию этих кассет в тот локус, в отношении которого они являются гомологичными, для получения диплоидных клеток, гетерозиготных в отношении первой кассеты или второй кассеты,

   й) индукцией по отдельности споруляции гетерозиготных диплоидных клеток, полученных в с), и

   е) выделением гаплоидных клеток, содержащих первую кассету и экспрессирующих первую и вторую маркерные последовательности, и отдельно гаплоидных клеток, содержащих вторую кассету и экспрессирующую третью и четвертую маркерные последовательности.
10. 10. Способ по п.9, в котором первым клонирующим вектором является плазмида ρΜΧΥ9, а вторым клонирующим вектором является плазмида ρΜΧΥ12.
11. 11. Способ по любому из пп.4-6, 9 или 10, в котором диплоидные клетки 8. сегеу181ае, используемые для трансформации, являются ауксотрофными в отношении по меньшей мере двух факторов питания.
12. 12. Способ по п.11, в котором эти диплоидные клетки являются гомозиготными в отношении аллеля ига3-1 и аллеля 1гр1-1, которые делают их ауксотрофными в отношении урацила и триптофана соответственно.
13. 13. Способ по любому из пп.4-6 или 9-12, в котором диплоидные клетки, используемые для трансформации, являются устойчивыми по меньшей мере к двум антибиотикам.
14. 14. Способ по п.13, в котором эти диплоидные клетки являются гомозиготными в отношении аллеля сап1-100 и аллеля суй2К, которые делают их устойчивыми к канаванину и циклогексимиду соответственно.
15. 15. Способ по любому из пп.4-6 или 9-14, в котором для трансформации используют диплоидные клетки штамма 8. сегесыае ΜΧΥ47, которые являются гомозиготными в отношении аллелей ига3-1, 1гр11, сап1-100 и суШЖ и гетерозиготными в отношении мутации т8Й2::КапМХ.
16. 16. Способ по любому из пп.1-15, в котором клетки 8. сегесыае имеют функциональную систему репарации ошибочных спариваний.
17. 17. Способ по любому из пп.1-15, в котором клетки 8. сегесыае временно или перманентно лишены системы репарации ошибочных спариваний.
18. 18. Способ по п.17, в котором временная или перманентная недостаточность системы репарации ошибочных спариваний обусловлена мутацией и/или индуцируемой экспрессией, или репрессией одного или нескольких генов, участвующих в системе репарации ошибочных спариваний, обработкой агентом, который насыщает систему репарации ошибочных спариваний, и обработкой агентом, который глобально ослабляет репарацию ошибочных спариваний.
19. 19. Способ по любому из пп.1-18, в котором первая и вторая рекомбинационные кассеты интегрированы в локус ВИП31-НСМ1 на хромосоме III генома 8. сегеуыае.
20. 20. Способ по любому из пп.1-19, в котором первая и вторая подлежащие рекомбинации ДНКпоследовательности имеют дивергенцию по меньшей мере в одном нуклеотиде.
21. 21. Способ по любому из пп.1-20, в котором первая и вторая подлежащие рекомбинации ДНКпоследовательности получены из организмов, других, чем 8. сегеуЩае, или, в том числе, из 8. сегеуыае.

    - 23 009443
22. 22. Способ по любому из пп.1-21, в котором первая и вторая подлежащие рекомбинации ДНКпоследовательности содержат одну или более некодирующих последовательностей и/или одну или более кодирующих белок последовательностей.
23. 23. Способ по любому из пп.1-22, в котором маркерные последовательности выбраны из группы, состоящей из маркеров питания, пигментных маркеров, маркеров устойчивости к антибиотикам, маркеров чувствительности к антибиотикам, сайтов узнавания праймеров, интрон-экзонных сочленений (границ сплайсинга), последовательностей, кодирующих конкретную субъединицу фермента, промоторных последовательностей, расположенных 3' (справа) регуляторных последовательностей генов и сайтов рестрикционных ферментов.
24. 24. Способ по п.23, в котором первая и третья маркерные последовательности являются маркерами питания, генные продукты которых могут компенсировать ауксотрофию клетки 8. есгсуыас.
25. 25. Способ по п.24, в котором первой маркерной последовательностью является ИКА.3, генный продукт которой может сообщать прототрофию в отношении урацила ауксотрофной в отношении урацила клетке 8. есгсуыас.
26. 26. Способ по п.24, в котором третьей маркерной последовательностью является ТКР1, генный продукт которой может сообщать прототрофию в отношении триптофана ауксотрофной в отношении триптофана клетке 8. есгсуыас.
27. 27. Способ по п.23, в котором вторая и четвертая маркерные последовательности являются маркерами чувствительности к антибиотикам, генные продукты которых могут сообщать чувствительность к антибиотику клетке 8. есгсуыас. которая является устойчивой к этому антибиотику.
28. 28. Способ по п.27, в котором второй маркерной последовательностью является САЫ1, генный продукт которой может сообщать чувствительность к канаванину канаванинустойчивой клетке 8. есгсуыас.
29. 29. Способ по п.27, в котором четвертой маркерной последовательностью является СУН2, генный продукт которой может сообщать чувствительность к циклогексимиду циклогексимид-устойчивой клетке 8. есгсуыас.
30. 30. Способ по любому из пп.1-29, в котором гаплоидные клетки, содержащие рекомбинационные кассеты с первой, второй, третьей или четвертой рекомбинированными ДНК-последовательностями, идентифицируют с использованием способов ПЦР для детектирования присутствия соответствующей комбинации маркеров.
31. 31. Способ по любому из пп.1-29, в котором гаплоидные клетки, содержащие рекомбинационные кассеты с первой, второй, третьей или четвертой рекомбинированными ДНК-последовательностями, идентифицируют высеванием этих гаплоидных клеток на среды, которые отбирают на молекулярное сцепление на одной и той же ДНК-молекуле соответствующей комбинации маркеров.
32. 32. Способ по п.31, в котором гаплоидные клетки, содержащие первые рекомбинированные ДНКпоследовательности, высевают на среду, которая отбирает на молекулярное сцепление на одной и той же ДНК-молекуле первой и четвертой маркерных последовательностей.
33. 33. Способ по п.31, в котором гаплоидные клетки, содержащие вторые рекомбинированные ДНКпоследовательности, высевают на среду, которая отбирает на молекулярное сцепление на одной и той же ДНК-молекуле второй и третьей маркерных последовательностей.
34. 34. Способ по п.31, в котором гаплоидные клетки, содержащие третьи рекомбинированные ДНКпоследовательности, высевают на среду, которая отбирает на молекулярное сцепление на одной и той же ДНК-молекуле первой и второй маркерных последовательностей.
35. 35. Способ по п.31, в котором гаплоидные клетки, содержащие четвертые рекомбинированные ДНК-последовательности, высевают на среду, которая отбирает на молекулярное сцепление на одной и той же ДНК-молекуле третьей и четвертой маркерных последовательностей.
36. 36. Плазмида ρΜΧΥ9, содержащая расположенные рядом маркерный ген ИКА.3 и маркерный ген САИ1, посредством чего эти две маркерные последовательности фланкируют полилинкерную последовательность для встраивания подлежащей рекомбинации ДНК-последовательности и посредством чего эти два маркера фланкированы нацеливающими последовательностями, гомологичными локусу ΒϋΌ31НСМ1 на хромосоме III генома 8. есгсуыас.
37. 37. Плазмида ρΜΧΥ9 по п.36, в которой полилинкерная последовательность содержит сайты для рестрикционных ферментов 8та1, ХЬа1, Рас1 и ВдШ.
38. 38. Плазмида ρΜΧΥ12, содержащая расположенные рядом маркерный ген ТРР1 и маркерный ген СΥН2, посредством чего эти две маркерные последовательности фланкируют полилинкерную последовательность для встраивания подлежащей рекомбинации ДНК-последовательности и посредством чего эти два маркера фланкированы нацеливающими последовательностями, гомологичными локусу ΒϋΌ31НСМ1 на хромосоме III генома 8. есгсуыас.
39. 39. Плазмида ρΜΧΥ12 по п.38, в которой полилинкерная последовательность содержит сайты для рестрикционных ферментов 8таф 8ρеI и Рае!
40. 40. Штамм 8. есгсуыас ΜΧΥ47, отличающийся тем, что его диплоидные клетки являются гомозиготными в отношении аллелей аллелей ига3-1, 1гр1-1, сап1-100 и еу112К и гетерозиготными в отношении мутации 1пД12:4<апМХ.

    - 24 009443
41. 41. Штамм Е. сой ΙΜ101, содержащий плазмиду ρΜΧΥ9.
42. 42. Штамм Е. сой ΌΗ5α, содержащий плазмиду ρΜΧΥ12.
43. 43. Набор, содержащий, по меньшей мере, первый контейнер, который содержит клетки штамма 8. сегеуыае ΜΧΥ47, второй контейнер, который содержит клетки штамма Е. сой ΙΜ101, содержащие плазмиду ρΜΧΥ9, и третий контейнер, содержащий штамм Е. сой ΌΗ5α, содержащий плазмиду ρΜΧΥ12.
44. 44. Набор, содержащий, по меньшей мере, первый контейнер, содержащий клетки штамма 8. сегеуыае ΜΧΥ47, второй контейнер, содержащий ДНК плазмиды ρΜΧΥ9, и третий контейнер, содержащий ДНК плазмиды ρΜΧΥ12.