KR100778219B1 - 교배형 특이적 유전자에 의해 조절되는 반수체 제조용형질전환 효모 균주의 제조 - Google Patents

교배형 특이적 유전자에 의해 조절되는 반수체 제조용형질전환 효모 균주의 제조 Download PDF

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Abstract

본 발명은 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터, 마커 유전자 및 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 터미네이터를 포함하는 DNA 절편이 염색체 상에 삽입된 반수체 제조용 형질전환 효모 균주 및 상기 반수체 제조용 형질전환 효모 균주의 제조방법을 제공한다. 본 발명은 또한 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터, 제1마커 유전자 및 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 터미네이터를 포함하는 DNA 절편이 염색체 상에 삽입된 반수체 제조용 형질전환 효모 균주를 그와 대립되는 교배형을 가지며, 제2마커 유전자를 갖는 반수체 또는 이배체 효모 균주와 교배시키고; 교배를 통해 생성된 균주를 사멸세포 염색제를 포함하고 제1마커 유전자 및 제2마커 유전자의 발현 여부를 확인할 수 있는 선발 배지에서 배양하고; 배양에 의해 형성된 콜로니 중 특정 교배형의 반수체 효모 균주를 선별하는 것을 포함하는 반수체 형질전환 효모 균주의 제조방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 유전자의 기능 연구 및 다양한 물질의 탐색을 가능하게 하는 약물 스크리닝 시스템에서 유용하게 이용될 수 있는 특정 교배형을 가지는 반수체 효모를 손쉽게 제조할 수 있는 시스템을 제공한다.

Description

교배형 특이적 유전자에 의해 조절되는 반수체 제조용 형질전환 효모 균주의 제조{Construction of a transformed yeast strain regulated by mating type-specific gene for generation of haploid}
도 1의 A는 교배형 특이적으로 발현되는 효모 염색체 상의 mfm1과 map2 유전자의 프로모터와 터미네이터를 증폭시키기 위한 프라이머의 위치 및 NAT 유전자의 개방해독판독틀(open reading frame)을 증폭시키기 위한 프라이머의 위치, 그리고 상기 프라이머를 이용하여 각 유전자 단편을 증폭하기 위한 1차 PCR 반응의 모식도이며, 도 1의 B는 상기 세 개의 유전자 단편을 모두 포함하는 DNA 단편을 증폭하기 위한 2차 PCR 반응의 모식도이다.
도 2의 a는 도 1에서 증폭한 NAT 유전자(레인 1), mfm1 터미네이터(레인 2), mfm1 프로모터(레인 3), map2 터미네이터(레인 4), map2 프로모터(레인 5), mfm1 프로모터와 터미네이터 및 NAT 유전자를 포함하는 DNA 절편(레인 6) 및 map2 프로모터와 터미네이터 및 NAT 유전자를 포함하는 DNA 절편(레인 7)을 나타낸 PCR 전기영동 사진이며, 도 2의 b는 상기 레인 1, 2 및 3의 단편들이 결합되면 mfm1 프로모터와 터미네이터 및 NAT 유전자를 포함하는 DNA 절편(레인 6)이 생성되며, 상기 레인 1, 4 및 5의 단편들이 결합되면 map2 프로모터와 터미네이터 및 NAT 유전자를 포함하는 DNA 절편(레인 7)이 생성됨을 도여주는 도식이다.
도 3의 A는 M-교배형 특이 유전자 mfm1의 프로모터, 터미네이터 및 NAT 유전자를 가진 DNA 절편이 염색체상의 mfm1 유전자와 교체되어 h- 교배형 이배체 또는 반수체 mfm1-NAT+분열효모를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이고, 도 3의 B는 P-교배형 특이 유전자 map2의 프로모터, 터미네이터 및 NAT 유전자를 가진 DNA조각이 염색체상의 map2 유전자 바깥의 유전자를 인식하지 않는 부위에 삽입되어 h+교배형 이배체 또는 반수체 map2-NAT+ 분열효모를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다. 상기 모식도에는 각각의 DNA 절편을 증폭할 수 있는 프라이머의 서열번호가 기재되어 있다.
도 4는 도 3에서 제조한 h-교배형 mfm1-NAT+ 분열효모와 h+교배형 map2-NAT+ 분열효모의 실제 염색체상에 NAT 유전자가 제 위치에 삽입되었는지를 확인하는 콜로니 PCR에 사용되는 프라이머의 증폭 위치 및 프라이머의 서열번호를 나타낸 모식도(윗 그림)와, h-교배형 mfm1-NAT+ 효모(중간 그림) 및 h+교배형 map2-NAT+ 효모(아래 그림)에 NAT 유전자가 삽입되었는지 콜로니 PCR 반응으로 확인한 전기영동 결과를 보여준다. 중간 그림에서 왼쪽의 레인 1 내지 레인 6은 서열번호 15 및 서열번호 18로 기재되는 프라이머를 이용한 콜로니 PCR 결과이고, 오른쪽의 레인 1 내지 레인 6은 서열번호 15 및 서열번호 17로 기재되는 프라이머를 이용한 콜로니 PCR 결과이며, 아래 그림에서 왼쪽의 레인 1 내지 레인 6은 서열번호 16 및 서열번호 17로 기재되는 프라이머를 이용한 콜로니 PCR 결과이고, 오른쪽의 레인 1 내지 레인 6은 서열번호 16 및 서열번호 18로 기재되는 프라이머를 이용한 콜로니 PCR 결과이다.
도 5는 본 발명에서 제조한 h-교배형 mfm1-NAT+ 및 h+교배형map2-NAT+ 분열효모를 이용하여 실제 반수체 균주의 교배형을 빠르고 체계적으로 확인하는 과정을 나타낸 모식도 및 상기 과정을 통해 반수체 분열효모의 교배형을 확인한 프록신 B 염색 결과를 보여준다.
본 발명은 마커 유전자가 교배형 특이적으로 발현되는 반수체 제조용 형질전환 효모 균주와 그의 제조방법, 및 상기 반수체 제조용 형질전환 효모 균주를 이용한 교배형 특이적 반수체 효모 균주의 제조방법을 제공한다.
고등생물 돌연변이체를 이용한 기존의 약물 스크리닝 시스템은 복잡하고 장시간이 요구되는 경우가 많았다. 이러한 단점을 보완하기 위해 보다 신속하고 용이하게 약물을 스크리닝할 수 있는 방법이 연구되었으며, 그 한 가지 예로 고등생물과 유사한 작용 기작을 가진 효모 균주 스크리닝 시스템이 이용되고 있다.
효모 중에서도 특히 분열효모(fission yeast)는 세포분화, 분열, 세포신호전달 및 대사 등의 중요한 분자생물학적 시스템이 모든 진핵생물에 있어 거의 동일하게 유지되고 있어 진핵생물 중 가장 하위에 위치하고 있으면서도 그들의 유전학적 이용 가능성은 매우 크며, 분열효모에서 실행되는 여러 가지 신호전달 시스템은 고등생물에서도 충분히 활용될 수 있다.
예를 들면, 출아효모의 경우 그들의 센트로미어와 관련된 어떠한 보존된 단 백질 군도 검증되지 않았지만 분열효모의 센트로미어는 고등동물의 것과 유사한 구조를 가지며 또한 유사한 조절 작용이 있다. 이는 센트로미어와 결합하는 미세관(microtubule)에서 더 확연한 차이를 보이는데, 출아효모의 경우 하나의 미세관이 센트로미어에 결합하여 염색체를 분리시키는데 비해 분열효모를 비롯한 고등 동물은 여러 개의 다발(bundle)로 된 미세관이 동시에 결합하여 염색체를 분열시키는 매우 세밀하고 복잡한 기작을 보인다.
또 다른 예로 세포신호 전달 과정에 있어서 분열효모는 G 단백질을 활용하는 서브유닛(subunit)을 고등생물과 같은 것으로 사용한다. 즉, 고등생물은 신호전달 과정에 α 서브유닛을 사용하는데, 출아효모는 β 서브유닛을 사용하는 반면, 분열효모는 고등생물과 같은 α 서브유닛을 사용한다. 그 외 많은 신호전달 과정에서 분열 효모는 고등생물과 더 많은 유사성을 가지며 같은 종류의 단백질을 이용함이 밝혀졌다.
따라서, 출아효모에 비해 분열효모는 그 분자생물학적 작용기작이 고등생물에 훨씬 가깝기 때문에 분열효모 스크리닝 시스템을 만들게 되면 그 이용범위가 고등생물에까지 이어질 수 있는 많은 가능성을 가지고 있다.
현재 분열효모의 모든 유전자에 대한 돌연변이 균주 제작이 이루어지고 있으며, 그의 유용성을 높이기 위해 동일한 유전자에 대한 여러 형태의 균주 제작이 이루어지고 있다. 예를 들어, 제작 가능한 돌연변이 분열효모로는 이배체(diploid cell), M-교배형 반수체(pheromone M-mating type haploid cell) 및 P-교배형 반수체(pheromone P-mating type haploid cell)가 있다.
반수체 분열효모 균주는 신호전달 경로의 상하관계에 있는 다른 유전자를 확인하는데 필수적이며, 어떤 유전자의 합성 치사 돌연변이(synthetic lethal mutant)를 찾아내거나 인간 유전자의 분열효모 유전자 기능과의 동일성을 연구하는데도 필요하며, 또한 그 유전자가 세포내에서 필수적인 역할을 하는지 아닌지를 알아내는 수단이 될 수 있다.
기존에 알려져 있는 반수체 균주 제작 과정은 교배형의 구별이 되지 않고, 이를 구별하기 위해 매우 많은 시간을 요구하며, 때때로 이배체와 반수체가 제작과정에서 분리되지 않는 경우도 종종 발생한다. 지금까지 반수체 균주를 만들기 위해서는 교배 후 다시 반대 교배형 균주를 이용하여 일일이 그들의 교배형을 확인해야만 하는 번거로움이 있고, 또한 반수체와 이배체의 구별이 쉽지 않다는 단점이 있었다. 따라서, 대량으로 이배체 균주를 반수체로 만들거나 반수체 균주를 다른 교배형으로 바꾸기 위해서는 좀 더 체계적이고, 쉬우면서 빠르게 진행할 수 있는 시스템이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 교배형에 따라 선택적으로 발현되는 유전자가 형질도입된 반수체 제조용 형질전환 효모 균주를 제조하고, 이 반수체 제조용 형질전환 효모균주를 대량으로 신속하게 증식시키고, 생성된 균주 중 반수체 효모 균주만을 효율적으로 선별함으로써 유전자간 상호 작용 및 항암제와 같은 유용 약물을 비롯한 다양한 물질을 손쉽고 확실하게 탐색하기 위해 이용할 수 있는 반수체 형질전환 효모 균주의 제조 방법을 완성하였다.
본 발명의 목적은 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터, 마커 유전자 및 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 터미네이터를 포함하는 DNA 절편이 염색체 상에 삽입된 반수체 제조용 형질전환 효모 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 반수체 제조용 형질전환 효모 균주의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터, 제1마커 유전자 및 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 터미네이터를 포함하는 DNA 절편이 염색체 상에 삽입된 형질전환 효모 균주를 그와 대립되는 교배형을 가지며, 제2마커 유전자를 갖는 반수체 또는 이배체 효모 균주와 교배시키고; 교배를 통해 생성된 균주를 사멸세포 염색제를 포함하고 제1마커 유전자 및 제2마커 유전자의 발현 여부를 확인할 수 있는 선발 배지에서 배양하고; 배양에 의해 형성된 콜로니 중 교배형 특이 반수체 효모 균주를 선별하는 것을 포함하는 반수체 제조용 형질전환 효모 균주의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터, 마커 유전자 및 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 터미네이터를 포함하는 DNA 절편이 염색체 상에 삽입된 반수체 제조용 형질전환 효모 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터, 제1마커 유전자 및 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 터미네이터를 클로닝하는 단계;
2) 단계 1에서 클로닝한 프로모터, 제1마커 유전자 및 터미네이터가 순서대로 연결된 DNA 절편을 제조하는 단계;
3) 단계 2에서 제조한 DNA 절편을 효모 균주에 형질도입하는 단계; 및
4) 단계 3을 거친 효모 균주를 제1마커 유전자에 대한 선발 배지에서 배양하여 형질전환된 효모 균주를 선별하는 단계
를 포함하는 반수체 제조용 형질전환 효모 균주의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한
교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터, 제1마커 유전자 및 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 터미네이터를 포함하는 DNA 절편이 염색체 상에 삽입된 반수체 제조용 형질전환 효모 균주를 그와 대립되는 교배형을 가지며, 제2마커 유전자를 갖는 반수체 또는 이배체 효모 균주와 교배시키고;
교배를 통해 생성된 균주를 사멸세포 염색제를 포함하고 제1마커 유전자 및 제2마커 유전자의 발현 여부를 확인할 수 있는 선발 배지에서 배양하고;
배양에 의해 형성된 콜로니 중 특정 교배형의 반수체 효모 균주를 선별하는 것을 포함하는 반수체 형질전환 효모 균주의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터, 마커 유전자 및 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 터미네이터를 포함하는 DNA 절편이 염색체 상에 삽입된 반수체 제조용 형질전환 효모 균주를 제공한다.
본 발명의 반수체 제조용 형질전환 효모 균주를 제조하기 위해 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) 및 캔디다 알비칸(Candida Albicans)으로 구성된 군으로부터 선택되는 효모 균주가 이용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 분열 효모인 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe)를 이용한다.
본 발명에 있어서, 교배형 특이적으로 발현되는 유전자라 함은 효모의 교배형 중 하나의 교배형에 대해서만 특이적으로 발현되는 유전자를 말한다. 예를 들어, 분열 효모에 있어서 M-교배형(h-교배형) 특이적 발현 유전자는 M-교배형 세포에서만 특이적으로 발현되며, P-교배형(h+교배형) 특이적 발현 유전자는 P-교배형 세포에서만 특이적으로 발현되는 것을 말한다.
따라서, 반수체 제조용 형질전환 효모 균주의 제조시 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터와 터미네이터를 이용하면 상기 프로모터와 터미네이터에 의해 발현이 조절되는 유전자는 하나의 교배형에 대해서만 특이적으로 발현되므로, 항생제 내성 유전자와 같이 형질 전환된 균주만을 선별할 수 있도록 해 주는 마커 유전자를 상기 프로모터와 터미네이터 사이에 삽입하면 마커 유전자의 삽입 여부에 따라 선별을 가능하게 해 주는 선발 배지에서 배양할 경우 얻고자 하는 교배형을 선택적으로 선별해 낼 수 있게 된다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 반수체 제조용 형질전환 효모 균주를 제조 하기 위해 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)를 사용하고, 교배형 특이적으로 발현되는 유전자로서 mfm1 유전자 또는 map2 유전자를 이용한다. mfm1 유전자와 map2 유전자는 스키조사카로마이세스 폼베에서만 발현되는 교배형 특이적 발현 유전자로서, mfm1 유전자는 페로몬 M을 암호화하는 유전자로 M-교배형 세포에서만 특이적으로 발현되고, map2 유전자는 페로몬 P를 암호화하는 유전자로 P-교배형 세포에서만 특이적으로 발현된다. 상기 유전자는 모두 성적 분화(sexual differentiation)에 관련되며, 세포의 모양변화와 G1 기에 세포가 성장을 멈추도록 하는데 관여한다.
따라서, 본 발명의 반수체 제조용 형질전환 효모 균주에 있어서, 상기 교배형 특이적으로 발현되는 유전자는 mfm1 유전자 또는 map2 유전자일 수 있다. 상기 mfm1 유전자는 서열번호 19의 염기서열을 가질 수 있으며, map2 유전자는 서열번호 20의 염기서열을 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 반수체 제조용 형질전환 효모 균주의 제조에 있어서 사용되는 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터는 mfm1 유전자의 프로모터 또는 map2 유전자의 프로모터일 수 있으며, 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 터미네이터는 또한 mfm1 유전자의 터미네이터 또는 map2 유전자의 터미네이터일 수 있다. 상기 mfm1 유전자의 프로모터는 서열번호 22의 염기서열을 가질 수 있으며, map2 유전자의 프로모터는 서열번호 23의 염기서열을 가질 수 있다. mfm1 유전자의 터미네이터는 서열번호 24의 염기서열을 가질 수 있으며, map2 유전자의 터미네이터는 서열번호 25의 염기서열을 가질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 마커 유전자는 항생제 내성 유전자(dominant drug resistance gene) 또는 영양요구 마커 유전자(auxotrophic marker gene)일 수 있다.
상기 항생제 내성 유전자는 노르세오트리신(Nourseothricin, NAT), 제네티신(Geneticin, G418), 지오신(Zeocin) 및 하이그로마이신 B(Hygromycin B)등으로 구성된 군으로부터 선택되는 항생제에 대한 내성물질을 코딩하는 유전자일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 항생제 내성 유전자는 서열번호 21의 염기서열을 갖는 NAT(Nourseothricin acetyl transferase) 유전자이다.
또한, 상기 영양요구 마커 유전자는 Ade6, Ura4, Leu2, His3 및 Trp1 등으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 교배형 특이적으로 발현되는 서열번호 22의 염기서열을 갖는 mfm1 프로모터와 서열번호 24의 염기서열을 갖는 mfm1 터미네이터 및 항생제 내성 유전자로서 서열번호 21의 염기서열을 갖는 NAT(Nourseothricin acetyl transferase) 유전자를 포함하는 DNA 절편이 염색체에 삽입된 반수체 제조용 형질전환 분열효모를 제조하였으며, 상기 제조된 형질전환 분열효모 중 유전적으로 좀 더 안정된 반수체인 균주를 'h-/mfm1-NAT+'라 명명한 뒤, 한국생명공학연구원 유전자은행에 2003년 2월 27일자로 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10603BP).
본 발명의 일 실시예에서는 또한 교배형 특이적으로 발현되는 서열번호 23의 염기서열을 갖는 map2 프로모터와 서열번호 25의 염기서열을 갖는 map2 터미네이터 및 서열번호 21의 염기서열을 갖는 NAT(Nourseothricin acetyl transferase) 유전자를 포함하는 DNA 절편이 염색체에 삽입된 반수체 제조용 형질전환 분열효모를 제조하였으며, 상기 형질전환 분열효모 중 유전적으로 좀 더 안정된 반수체인 균주를 'h+/map2-NAT+'라 명명한 뒤, 한국생명공학연구원 유전자은행에 2003년 2월 27일자로 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10604BP).
또한, 본 발명은
1) 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터, 제1마커 유전자 및 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 터미네이터를 클로닝하는 단계;
2) 단계 1에서 클로닝한 프로모터, 제1마커 유전자 및 터미네이터가 순서대로 연결된 DNA 절편을 제조하는 단계;
3) 단계 2에서 제조한 DNA 절편을 효모 균주에 형질도입하는 단계; 및
4) 단계 3을 거친 효모 균주를 제1마커 유전자에 대한 선발 배지에서 배양하여 형질전환된 효모 균주를 선별하는 단계
를 포함하는 반수체 제조용 형질전환 효모 균주의 제조방법을 제공한다.
상기 단계 1 및 단계 2는 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터와 터미네이터 및 형질전환 여부를 확인해 주는 마커 유전자를 포함하는 DNA 절편을 효모 균주의 염색체 상에 도입하기 위한 형질전환의 준비단계에 해당한다.
상기 단계 1은 마커 유전자가 교배형 특이적으로만 발현되도록 해 주는 프로모터 및 터미네이터와 형질전환 여부를 확인해 주는 마커 유전자를 각각 적당한 프 라이머를 이용하여 증폭시키는 단계에 해당한다.
상기 단계 2는 이렇게 증폭된 프로모터, 마커 유전자 및 터미네이터를 순서대로 연결시켜 형질도입에 사용하는 DNA 절편을 제작하는 단계에 해당한다.
상기 단계 3은 상기 DNA 절편을 효모 균주의 염색체 상에 도입하는 형질전환 단계이다. 단계 1 내지 단계 2를 통해 제조한 DNA 절편은 양 말단이 효모 균주의 염색체에 있는 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터와 터미네이터를 양 말단에 포함하도록 제조한 것이므로, 이것이 효모 균주의 염색체에 존재하는 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터 및 터미네이터 서열과 상동성 재조합됨으로써 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 개방해독판독틀(open reading frame) 대신에 마커 유전자의 개방해독판독틀로 교체된다. 예컨대, 교배형 특이적으로 발현되는 유전자로서 mfm1 또는 map2 유전자를 이용하고, 마커 유전자로서 항생제 내성 유전자 NAT를 이용하는 경우, 상기 DNA 절편은 분열효모의 염색체에 있는 mfm1 또는 map2 유전자의 프로모터와 터미네이터를 양 말단에 포함하도록 제조한 것이므로, 이것이 분열효모의 염색체에 존재하는 mfm1 또는 map2 유전자의 프로모터 및 터미네이터 서열과 상동성 재조합됨으로써 mfm1 또는 map2 유전자의 개방해독판독틀 대신에 항생제 내성 유전자 NAT의 개방해독판독틀로 교체된다.
상기 단계 4는 단계 3을 거친 균주를 선발 배지(selection medium)에서 배양하여 형질전환된 균주를 선별하는 단계에 해당한다. 예컨대, 마커 유전자로서 항생제 내성 유전자를 이용하는 경우 항생제를 포함하는 배지를 선발 배지로 하여 단계 3을 거친 균주를 배양하면 상기 DNA 절편이 삽입된 균주만이 생존하게 되므로 형질전환된 효모 균주를 쉽게 선별해 낼 수 있다. 항생제에 내성을 가지고 생존한 효모 균주는 그 삽입된 프로모터의 종류에 따라 어떠한 교배형에 해당하는 효모인지 쉽게 결정할 수 있다.
또한, 단계 4에서 효모 균주의 배양 시에는 96웰 플레이트에서 배양할 수 있다. 96웰 플레이트에서 배양하는 경우 대량으로 반수체 효모를 쉽게 제조하고 선별해 낼 수 있다.
본 발명은 또한
1)　교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터, 제1마커 유전자 및 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 터미네이터를 포함하는 DNA 절편이 염색체 상에 삽입된 반수체 제조용 형질전환 효모 균주를 그와 대립되는 교배형을 가지며, 제2마커 유전자를 갖는 반수체 또는 이배체 효모 균주와 교배시키고;
2）교배를 통해 생성된 균주를 사멸세포 염색제를 포함하고 제1마커 유전자 및 제2마커 유전자의 발현 여부를 확인할 수 있는 선발 배지에서 배양하고;
3）배양에 의해 형성된 콜로니 중 특정 교배형의 반수체 효모 균주를 선별하는 것을 포함하는 반수체 형질전환 효모 균주의 제조방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 1의 교배에 사용되는 반수체 제조용 형질전환 효모 균주는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 방법은 앞서 제작한 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터, 마커 유전자 및 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 터미네이터를 포함하는 DNA 절편이 염색체 상에 삽입된 반수체 제조용 형질전환 효모 균주를 이용함으로서 보다 신속하게 또한 효율적으로 교배형 특이 반수체를 선별해 낼 수 있는 방법을 제공함으로써 다량의 반수체 효모 균주를 쉽게 제조할 수 있도록 한다.
즉， 상기 방법은 앞서 제작된 반수체 제조용 형질전환 효모 균주 중 하나의 교배형을 선택하고, 이 형질전환 효모 균주를 그와 대립되는 교배형을 갖는 반수체 또는 이배체 효모 균주와 교배시켜, 교배를 통해 제2마커 유전자가 삽입되어 제1마커 유전자와 제2마커 유전자를 동시에 갖는 반수체 효모 균주만을 선발 배지를 통해 선별해 낼 수 있으므로, 교배에 의해 이배체 효모나 다른 교배형의 반수체가 혼재하는 상태에서도 특정 교배형의 반수체 효모 균주만을 쉽게 선별해 낼 수 있다.
상기 단계 1에서, 제2마커 유전자는 단계 1의 반수체 제조용 형질전환 효모 균주의 염색체 상에 삽입된 제1마커 유전자와는 다른 것을 선택한다. 제2마커 유전자는 교배를 통해 제1마커 유전자만을 갖는 형질전환 효모 균주에 도입되게 되므로, 제1마커 유전자 및 제2마커 유전자에 대한 선발 배지에서 배양할 경우 이들 두 가지 마커 유전자를 동시에 갖는 반수체 효모 균주만을 선별해 낼 수 있게 된다. 제1마커 유전자와 마찬가지로 제2마커 유전자는 항생제 내성 유전자(dominant drug resistance gene) 또는 영양요구 마커 유전자(auxotrophic marker gene) 유전자일 수 있다.
상기 항생제 내성 유전자는 노르세오트리신(Nourseothricin), 제네티신(Geneticin), 지오신(Zeocin) 및 하이그로마이신 B(Hygromycin B) 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 항생제에 대한 내성물질을 코딩하는 유전자일 수 있다.
또한, 상기 영양요구 마커 유전자는 Ade6, Ura4, Leu2, His3 및 Trp1 등으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 제2마커 유전자는 하이그로마이신 B에 대한 내성물질을 코딩하는 항생제 내성 유전자로서 Hygromycin B 저항 유전자 (Hyg)가 이용될 수 있다. Hyg 유전자는 서열번호 28의 염기서열을 가질 수 있다.
단계 2의 선발 배지는 제1마커 유전자 및 제2마커 유전자의 발현 여부를 확인할 수 있는 선발 배지로서, 추가로 사멸 세포 염색제를 포함한다. 따라서 단계 2의 선발 배지에서 배양하는 경우, 교배에 사용된 제1마커 유전자만을 갖는 반수체 제조용 형질전환 효모 균주와는 다른 교배형을 갖는 반수체나 이배체 효모 균주는 선택되지 않고, 또한 교배에 사용된 제1마커 유전자만을 갖는 반수체 제조용 형질전환 효모 균주는 제2마커 유전자를 갖지 아니하므로 선택되지 않으며, 제1마커 유전자 및 제2마커 유전자를 가지나 이배체인 균주는 반수체에 비해 빠르게 사멸하므로 사멸 세포 염색체에 의해 짙게 염색되게 되므로, 단계 3에서는 생존 콜로니 중 사멸 세포 염색제에 의해 염색되지 아니한 콜로니만을 선별해 내면 된다.
본 발명의 일실시예에서는 M-교배형 세포인 h- 교배형 mfm1-NAT+ 분열효모를 제2마커 유전자로서 항생제 내성 유전자 Hyg를 갖는 P-교배형 이배체 분열효모와 교배시킨 후 하이그로마이신 B (Hygromycin B), 노르세오트리신(Nourseothricin)과 플록신 B 염료가 들어간 고체배지에 깔아 생성되는 콜로니들의 색깔을 확인함으로써 반수체 M-교배형 분열효모를 선별한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 교배형 특이적 유전자의 프로모터와 터미네이터 및 항생제 내성 NAT 유전자를 포함하는 DNA 절편이 삽입된 반수체 제조용 형질전환 효모 균주의 제조
(1) 교배형 특이적 발현 유전자의 프로모터와 터미네이터 및 항생제 내성 NAT 유전자를 포함하는 DNA 절편의 제작를 위한 프라이머의 작성
교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터와 터미네이터 및 항생제 내성 NAT 유전자를 포함하는 DNA 절편의 제작을 위해, 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe)의 M-교배형(pheromone M-mating type)에서 선택적으로 발현되는 유전자인 서열번호 19의 염기서열을 가지는 mfm1 유전자와 P-교배형(pheromone P-mating type)에서 선택적으로 발현되는 유전자인 서열번호 20의 염기서열을 가지는 map2 유전자를 선택하였다.
다음으로 상기 각각의 유전자의 프로모터와 터미네이터를 증폭하기 위해 정방향 및 역방향 프라이머를 작성하였다. 또한, 항생제 내성 유전자인 서열번호 21의 염기서열을 갖는 NAT(Nourseothricin acetyl trnasferase) 유전자를 증폭시키기 위해 정방향 및 역방향 프라이머를 작성하였다(표 1 및 도 1).
서열번호 증폭 부위
1 mfm1 프로모터의 정방향
2 mfm1 프로모터의 역방향
3 mfm1 터미네이터의 정방향
4 mfm1 터미네이터의 역방향
5 NAT 유전자의 정방향
6 NAT 유전자의 역방향
7 map2 프로모터의 정방향
8 map2 프로모터의 역방향
9 map2 터미네이터의 정방향
10 map2 터미네이터의 역방향
11 h+ 교배형 map2-NAT 균주 제조를 위한 염색체 내부 결합부위 N 말단의 정방향
12 h+ 교배형 map2-NAT 균주 제조를 위한 염색체 내부 결합부위 N 말단의 역방향
13 h+ 교배형 map2-NAT 균주 제조를 위한 염색체 내부 결합부위 C 말단의 정방향
14 h+ 교배형 map2-NAT 균주 제조를 위한 염색체 내부 결합부위 C 말단의 역방향
(2) 교배형 특이적 유전자의 프로모터와 터미네이터 및 항생제 내성 NAT 유전자의 증폭
다음으로 분열효모 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)로부터 염색체를 분리하였다. 상기 분리된 염색체 DNA 200 ng을 PCR 반응의 주형으로 사용하고, 상기 표 1에 있는 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하였다. PCR 증폭은 94℃에서 5분 동안 열 변성(denaturation)하고, 94℃에서 1분 동안 열 변성 반응, 48 내지 60℃에서 90초 동안 프라이머 결합반응(annealing), 72℃에서 45초 동안 길이연장 반응(extension)을 3회 수행하고, 94℃에서 45초 동안 열변성 반응, 48 내지 60℃에서 45초 동안 프라이머 결합반응, 72℃에서 45초 동안 길이연장 반응을 12회 수행한 뒤, 72℃에서 5분 동안 최종 길이연장 반응을 수행하였다(1차 PCR). PCR 반응 후 증폭된 산물을 전기영동하였다. 그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 NAT 유전자(레인 1), 서열번호 24의 염기서열을 갖는 mfm1 터미네이터(레인 2), 서열번호 22의 염기서열을 갖는 mfm1 프로모터(레인 3), 서열번호 25의 염기서열을 갖는 map2 터미네이터(레인 4), 서열번호 23의 염기서열을 갖는 map2 프로모터(레인 5) 증폭산물을 얻을 수 있었다(도 2의 a).
(3) 교배형 특이적 유전자의 프로모터와 터미네이터 및 항생제 내성 NAT 유전자를 포함하는 DNA 절편의 제작
다음으로, 상기 증폭된 mfm1 유전자의 프로모터와 터미네이터 및 NAT 유전자 산물을 정제하여 각각 100 ng씩 혼합하고, 서열번호 1 및 서열번호 4로 기재되는 프라이머를 사용하여 블락(block) PCR 반응을 수행하였으며, map2 유전자의 프로모터와 터미네이터 및 NAT 유전자 산물을 각각 100 ng씩 혼합하여 서열번호 7 및 서열번호 10로 기재되는 프라이머를 사용하여 블락 PCR 반응을 수행하였다(2차 PCR, 도 3). map2 의 경우 서열번호 7과 서열번호 10을 이용하여 만들어진 유전자 산물을 정제한 후 염색체 내부 결합부위 N-말단(서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열로 기재되는 프라이머 이용)과 C-말단 부위(서열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열로 기재되는 프라이머 이용)의 유전자 산물을 이용한 블락 PCR을 한 번 더 수행하였다(도 3의 B). 이는 map2 유전자가 교배에 필수적인 유전자여서 map2 유전자를 NAT 유전자로 대체시 그 결과된 균주가 교배에 이상을 보임으로서 map2 유전자를 보존하면서 map2 프로모터와 터미네이터, NAT 유전자를 포함하는 유전자 산물을 염색체 상에 삽입시키기 위한 방법이다. 여기에 사용된 염색체 결합부위는 N-말단은 서열번호 26의 염기서열을 가지며 C-말단은 서열번호 27의 염기서열을 가진다. 블락 PCR 반응은 94℃에서 1분 동안 열변성하고, 48 내지 60℃에서 90초 동안 프라이머 결합하며, 72℃에서 3분 동안 길이 연장하는 반응을 20 내지 25회 수행하였다.
블락 PCR 반응후 증폭된 산물을 전기영동한 결과, 도 2의 레인 6 및 레인 7과 같은 증폭산물을 얻을 수 있었다.
(4) DNA 절편의 삽입을 통한 형질 전환 및 형질 전환된 균주의 확인
상기 (3)의 과정을 통해 제작된 DNA 절편을 반수체와 이배체 분열효모에 형질 전환시켰다. 우선 분열효모를 배지에서 키운 후 원심분리하여 0.1 M 리튬 클로라이드(lithium chloride) 용액에 현탁시켰다. 이 세포를 다시 원심분리하여 원래의 세포분량의 1/100 정도의 0.1 M 리튬 클로라이드에 현탁시키고 그 중 100 ㎕의 세포에 형질전환 시키고자 하는 상기 DNA 절편을 각각 1 ㎍ 넣고 30분간 30℃에서 배양하였다. 40% PEG (polyethylene glycol) 용액 290 ㎕를 넣어 잘 섞어 준 후 다시 30분간 30℃에서 배양하고 42℃에서 15분간 열 충격(heat shock)을 가하였다. 이 세포를 얼음에서 식힌 후 YEPD 배지(Yeast Extract 5g/l, Peptone 5g/l, Dextrose 30g/l)를 넣어 1시간 동안 배양한 후 노르세오트리신(Nourseothricin)이 들어 있는 YEPD 고체 배지에 도말하여 2 내지 3일간 30℃에서 배양하였다. 배양 후 NAT 항생제에 대해 저항성이 있는 콜로니(colony)를 확보하였으며, 이 콜로니를 일부 채취하여 테스트 튜브(test tube)에 넣고 말린 후 다시 물에 현탁시켜 콜로니 PCR을 실시하였다. 콜로니 PCR 수행시 서열번호 15 내지 서열번호 18로 기재되는 프라이머를 이용하였다. 서열번호 15로 기재되는 프라이머는 mfm1 프로모터의 상위 유전자 부위를 증폭하기 위한 프라이머이고, 서열번호 16으로 기재되는 프라이머는 map2 프로모터의 상위 유전자 부위를 증폭하기 위한 프라이머이며, 서열번호 17로 기재되는 프라이머는 NAT 유전자 내부를 증폭하기 위한 프라이머이며, 서열번호 18로 기재되는 프라이머는 NAT 유전자 말단 부분을 증폭하기 위한 프라이머이다(도 4의 윗 그림). 콜로니 PCR 반응은 94℃에서 10분 동안 열변성하고, 94℃에서 1분 동안 열변성 반응, 54℃에서 90초 동안 프라이머 결합 반응, 72℃에서 1분 동안 길이연장 반응을 5회 수행하고, 94℃에서 1분 동안 열변성 반응, 54℃에서 45초 동안 프라이머 결합 반응, 72℃에서 1분 동안 길이연장 반응을 25회 수행한 뒤 72℃에서 5분 동안 최종 길이연장 반응을 수행하였다.
그 결과, mfm1 유전자의 프로모터와 터미네이터 및 NAT 유전자를 포함하는 DNA 절편으로 형질전환시킨 균주의 콜로니를 이용한 PCR 반응에서는 형질전환 균주 1, 2, 3번에서 NAT 유전자가 삽입되었음을 확인하였고, map2 유전자의 프로모터와 터미네이터 및 NAT 유전자를 포함하는 DNA 절편으로 형질전환시킨 균주의 콜로니를 이용한 PCR 반응에서는 모든 형질전환 균주에서 NAT 유전자가 삽입되었음을 확인하였다(도 4의 아래 그림). 이를 통해 mfm1 유전자의 프로모터와 터미네이터 및 NAT 유전자를 포함하는 분열효모 중 반수체 형질전환체를 'h-/mfm1-NAT+', map2 유전자의 프로모터와 터미네이터 및 NAT 유전자를 포함하는 분열효모 중 반수체 형질전환체를 'h+/map2-NAT+'라 명명하고, 이를 각각 2003년 2월 27일자로 한국생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호: h-/mfm1-NAT+ ; KCTC 10603BP, h+/map2-NAT+ ; KCTC 10604BP).
<실시예 2> 반수체 제조용 형질전환 효모 균주와 반수체 또는 이배체 효모 균주의 교배를 통한 특정 교배형 반수체 효모 균주의 제조
앞서 실시예 1에서 제작한 반수체 형질전환 효모 균주 h- 교배형mfm1-NAT+와 h+교배형 map2-NAT+ 균주를 이와는 각기 다른 교배형을 갖는 반수체 또는 이배체 효모 균주와 교배시켜 신속하게 다량의 특정 교배형의 반수체 효모 균주를 생성시키고, 이들을 다른 교배형 반수체나 이배체 효모 균주로부터 효율적으로 선별해 내었다.
우선 형질전환체 h- 교배형 mfm1-NAT+ 균주를 Hyg 마커가 있는 h+/h+ SP286 이배체 균주[(Volume 272, Number 32, Issue of August 8, 1997 pp. 19993-20002, J. Biological Chemistry. A Novel Protein, Psp1, Essential for Cell Cycle Progression of Schizosaccharomyces pombe Is Phosphorylated by Cdc2-Cdc13 upon Entry into G0-like Stationary Phase of Cell Growth, Young-Joo Jang , Misun Won , Kyung-Sook Chung , Dong-Uk Kim , Kwang-Lae Hoe , Chankyu Park and Hyang-Sook Yoo) 다르게는 h+ ED668(reference 동일) 사용가능] 96개와 각각 잘 섞어 96웰 플레이트의 각 웰에 접종한 뒤 2 내지 3일간 30℃에서 배양함으로서 교배(mating)시켰다. 상기 교배된 세포를 SCE 완충액(1.2 M 솔비톨/ 50 mM 시트레이트 포스페이트/ 10 mM EDTA)에 현탁시켜 용해효소(lysing enzyme) 20 Unit와 라이티카제(lyticase) 20 ㎍을 섞어 30℃에서 2일간 보관함으로서 포자를 제외한 다른 세포들을 제거하였다. 이들 남은 포자를 잘 분리시켜 다른 96웰 플레이트에 1대 4의 비율로 희석하여 8번의 희석을 실시하였다. 희석된 포자용액 각각 10 ㎕씩을 하이그로마이신 B(Hygromycin B), 노르세오트리신(Nourseothricin), 프록신(phroxine) B 염료가 들어 있는 배지에 떨어드려 포자가 자랄 수 있도록 30℃에서 배양하였다(도 5). 이 실험에 사용된 h-교배형 mfm1-NAT+ 균주는 NAT 유전자가 M-교배형 세포에서만 발현되도록 형질전환된 상태이므로 NAT 항생제를 포함하는 이 배지에서는 M-타입 교배 세포만이 자랄 수 있게 된다. 또한, 배양배지에 하이그로마이신 B(Hygromycin B)이 포함되면 처음 사용한 반수체 또는 이배체가 가지고 있는 Hyg 유전자에 의해 돌연변이된 유전자를 반드시 가져야만 세포가 생존하여 자랄 수 있기 때문에 Hyg 돌연변이 유전자를 가지며 동시에 M-교배형 세포만이 이 배지에서 자랄 수 있게 된다.
그 결과, M-교배형을 가지는 h- 반수체, h-/h- 이배체 및 h-/h+ 혼성체가 콜로니를 형성하였다. 이배체와 반수체를 구별하기 위해서 프록신 B 염료를 사용하였는데 이배체인 h-/h-와 h-/h+ 혼성체는 빨간색 콜로니를 형성하였고 h- 반수체는 밝은 분홍색 콜로니를 형성하였다. 따라서, 이배체와 반수체의 구별이 가능하였다(도 5). 상기 실험을 h+교배형 map2-NAT+ 균주를 가지고도 동일하게 시행하였으며 상기와 유사한 결과를 얻을 수 있었다. 이들의 교배형과 반수체성은 모두 다시 한 번 현미경으로 관찰하였으며, 다른 교배형 균주와 교잡함으로서 확인하였다.
본 발명에 의해 제조된 반수체 제조용 형질전환 효모 균주를 이용하면 그와 대립되는 교배형을 갖는 반수체 또는 이배체 효모 균주와의 교배를 통해 신속하게 다량의 특정 교배형의 반수체 효모 균주를 쉽게 얻을 수 있으며, 교배를 통해 제2마커 유전자가 삽입되어 제1마커 유전자와 제2마커 유전자를 동시에 갖는 반수체 효모 균주만을 선발 배지를 통해 선별해 낼 수 있으므로, 효모 증식을 위한 교배에 의해 이배체 효모 및 다른 교배형의 반수체가 가 혼재하는 상태에서도 특정 교배형의 반수체 효모 균주만을 효율적이고도 쉽게 선별해 낼 수 있다.
따라서, 본 발명은 유전자의 기능 연구 및 다양한 물질의 탐색을 가능하게 하는 약물 스크리닝 시스템에서 유용하게 이용될 수 있는 반수체 효모를 손쉽게 제조할 수 있는 시스템을 제공한다.
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Claims (12)

  1. 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터, 마커 유전자 및 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 터미네이터를 포함하는 DNA 절편이 염색체 상에 삽입된 반수체 제조용 형질전환 효모 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 효모 균주가 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) 및 캔디다 알비칸(Candida Albicans)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 반수체 제조용 형질전환 효모 균주.
  3. 제2항에 있어서, 상기 효모 균주가 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)인 반수체 제조용 형질전환 효모 균주.
  4. 제3항에 있어서, 서열번호 19의 염기서열을 갖는 mfm1 유전자 또는 서열번호 20의 염기서열을 갖는 map2 유전자를 교배형 특이적으로 발현되는 유전자로 갖는 것을 특징으로 하는 반수체 제조용 형질전환 효모 균주.
  5. 제3항에 있어서, 서열번호 22로 기재되는 mfm1 프로모터 또는 서열번호 23으로 기재되는 map2 프로모터를 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터로 갖 는 것을 특징으로 하는 반수체 제조용 형질전환 효모 균주.
  6. 제3항에 있어서, 서열번호 24로 기재되는 mfm1 터미네이터 또는 서열번호 25로 기재되는 map2 터미네이터를 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 터미네이터로 갖는 것을 특징으로 하는 반수체 제조용 형질전환 효모 균주.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 노르세오트리신(Nourseothricin), 제네티신(Geneticin 또는 G418), 지오신(Zoecin) 및 하이그로마이신 B(Hygromycin B)로 구성된 군으로부터 선택되는 항생제에 대한 내성물질을 코딩하는 항생제 내성 유전자를 마커 유전자로 갖는 것을 특징으로 하는 반수체 제조용 형질전환 효모 균주.
  8. 제7항에 있어서, 항생제 내성 유전자는 서열번호 21의 염기서열을 갖는 NAT(Nourseothricin acetyl transferase) 유전자인 것을 특징으로 하는 반수체 제조용 형질전환 효모 균주.
  9. 서열번호 22의 염기서열을 갖는 mfm1 유전자의 프로모터, 서열번호 21의 염기서열을 갖는 NAT(Nourseothricin acetyl transferase) 유전자 및 서열번호 24로 기재되는 mfm1 유전자의 터미네이터를 포함하는 DNA 절편이 염색체에 삽입된 형질전환 분열 효모 h- 교배형 mfm1-NAT+(수탁번호: KCTC 10603BP).
  10. 서열번호 23의 염기서열을 갖는 map2 유전자의 프로모터, 서열번호 21의 염기서열을 갖는 NAT(Nourseothricin acetyl transferase) 유전자 및 서열번호 25의 염기서열을 갖는 map2 유전자의 터미네이터를 포함하는 DNA 절편이 염색체에 삽입된 형질전환 분열효모 h+교배형 map2-NAT+(수탁번호: KCTC 10604BP).
  11. 1) 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터, 제1마커 유전자 및 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 터미네이터를 클로닝하는 단계;
    2) 단계 1에서 클로닝한 프로모터, 제1마커 유전자 및 터미네이터가 순서대로 연결된 DNA 절편을 제조하는 단계;
    3) 단계 2에서 제조한 DNA 절편을 효모 균주에 형질도입하는 단계; 및
    4) 단계 3을 거친 효모 균주를 제1마커 유전자에 대한 선발 배지에서 배양하여 형질전환된 효모 균주를 선별하는 단계
    를 포함하는 반수체 제조용 형질전환 효모 균주의 제조방법.
  12. 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터, 제1마커 유전자 및 교배형 특이적으로 발현되는 유전자의 터미네이터를 포함하는 DNA 절편이 염색체 상에 삽입된 반수체 제조용 형질전환 효모 균주를 그와 대립되는 교배형을 가지며, 제2마커 유전자를 갖는 반수체 또는 이배체 효모 균주와 교배시키고;
    교배를 통해 생성된 균주를 사멸세포 염색제를 포함하고 제1마커 유전자 및 제2마커 유전자의 발현 여부를 확인할 수 있는 선발 배지에서 배양하고;
    배양에 의해 형성된 콜로니 중 특정 교배형의 반수체 효모 균주를 선별하는 것을 포함하는 반수체 형질전환 효모 균주의 제조방법.
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