CN108486158B - 基于酵母细胞的基因检测标准品的构建方法及其试剂盒 - Google Patents

基于酵母细胞的基因检测标准品的构建方法及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于酵母细胞的基因检测标准品的构建方法及其试剂盒，首次开创性地采用了酵母细胞作为遗传背景，将待检测的目的基因，例如人体细胞突变基因，通过同源重组的方式整合到酵母细胞的基因组中，由此获得的重组酵母细胞可以在针对目的基因的遗传检测中作为阳性对照的标准品。

Description

基于酵母细胞的基因检测标准品的构建方法及其试剂盒
技术领域
本发明涉及一种基于酵母细胞的基因检测标准品的构建方法及其试剂盒，属于分子生物学技术领域。
背景技术
在临床的遗传诊断中，基因检测的精确性是十分重要的。以产前检查为例，假阳性的结果会错误的指导患者终止正常的胚胎，假阴性的结果会导致对患病婴儿的乐观预期和错误诊断。在临床上，遗传检测往往是指导形成诊疗方案的基础。越来越多的人利用遗传检测来获得个体在人群中易感几率，从而采取有效的疾病预防措施，包括介入诊疗手段和生活方式的改变等。
为了确保遗传检测结果的可靠性和准确性，每个实验必须具备作为阳性对照和阴性对照的遗传参考物质。
目前较常用的遗传检测标准品有如下几种：
病人样本；
肿瘤组织样本(手术切除/穿刺组织，***固定/石蜡包埋/冰冻切片/新鲜样本等)血液样本(循环肿瘤细胞、游离的肿瘤细胞基因组)；
含遗传突变的细胞系；
各种遗传病、肿瘤等永生化细胞系；
细胞遗传改造(整合***、定点突变、基因敲除)；
其他细胞背景的基因敲入；
质粒样品&PCR产物：含突变位点及附近序列的重组质粒或PCR产物；
合成DNA样品；
上述各种类型的遗传检测标准品均有其自身的优势和局限性。例如，临床病人样本存在样本获取不便、样品珍贵、均一性不佳、无法大量制备标准品等缺陷；获得遗传病细胞系往往通过病人细胞永生化，且永生化细胞株遗传特性难以长期保持；含肿瘤突变细胞系建株困难且不稳定，含遗传突变细胞系构建过程繁琐，需要复杂的筛选过程同时细胞系价格昂贵，培养条件要求较高；质粒样品构建简单快速，但体系中质粒拷贝数高，稀释和模拟基因组DNA及进行较低突变百分率标准品的混合时会造成很大的误差、易污染。
因此，构建新的基因检测标准品体系是本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本发明一方面提供了一种基因检测标准品的构建方法，所述构建方法包含将待检测的目的基因序列通过同源重组的方式***到酵母细胞的基因组中获得含有所述目的基因序列的重组酵母细胞；所述重组酵母细胞在针对所述目的基因的检测中用作阳性对照标准品。
优选的，所述构建方法至少包括构建同源重组模板的步骤，以及将所述同源重组模板转化所述酵母细胞的步骤；所述同源重组模板包含上游同源修复臂和下游同源修复臂，以及位于所述上游同源修复臂与下游同源修复臂之间的所述目的基因序列；所述同源重组模板中的上游同源修复臂和下游同源修复臂靶向所述酵母细胞的营养缺陷型标记基因。
优选的，所述构建方法还包括基于基因编辑***来构建靶向所述酵母细胞的营养缺陷型标记基因的基因编辑质粒的步骤；并且，将所述同源重组模板与所述基因编辑质粒一同转化所述酵母细胞，获得在所述酵母细胞的营养缺陷型标记基因中***了所述目的基因序列的重组酵母细胞。
优选的，在所述基于基因编辑***来构建靶向所述酵母细胞的营养缺陷型标记基因的基因编辑质粒的步骤中：所述基因编辑***为CRISPR/Cas9基因编辑***，所述酵母细胞为酿酒酵母，所述营养缺陷型标记基因为URA3基因；其中，所述基因编辑质粒靶向所述酿酒酵母基因URA3并使其DNA双链断裂的位点为编辑位点；
在所述构建同源重组模板的步骤中：首先基于CRISPR/Cas9基因编辑***构建同源重组载体，所述同源重组载体含有靶向所述编辑位点的上游同源修复臂和下游同源修复臂；再将所述目的基因序列通过限制性酶切的分子克隆方法连入到所述同源重组载体中、且位于所述上游同源修复臂与下游同源修复臂之间；最后，再通过限制性酶切的方法获得含有所述上游同源修复臂、所述目的基因序列和所述下游同源修复臂的线性化的同源重组模板；
在将获得的所述基因编辑质粒与所述线性化的同源重组模板一同转化酿酒酵母细胞，获得在URA3基因中***了所述目的基因序列的重组酿酒酵母细胞；
所述构建基因编辑质粒的步骤与所述构建同源重组模板的步骤各自独立完成，不分先后。
优选的，在所述构建基因编辑质粒的步骤中，将靶向酿酒酵母基因URA3的gRNA通过限制性酶切的分子克隆方法连接到酵母-大肠杆菌穿梭型载体中，获得所述基因编辑质粒；所述靶向酿酒酵母基因URA3的gRNA的序列如SEQ ID No.1所示。
优选的，在所述构建基因编辑质粒的步骤中，扩增所述gRNA的引物对序列如SEQID No.2和SEQ ID No.3所示；所述酵母-大肠杆菌穿梭型载体为p425-Sap-TEF1p-Cas9-CYC1t-2xSap载体；将SapI酶切过的p425-Sap-TEF1p-Cas9-CYC1t-2xSap载体与所述gRNA连接，将获得的连接产物转化大肠杆菌，选取经鉴定的阳性克隆进行扩增培养，经质粒提取和纯化操作获得所述基因编辑质粒。
优选的，在所述构建同源重组模板的步骤中，基于如SEQ ID No.4所示的URA3基因序列中第351-373位的上游序列设计所述上游同源修复臂，基于于如SEQ ID No.4所示的URA3基因序列中第351-373位的下游序列设计所述下游同源修复臂。
优选的，所述上游同源修复臂的序列如SEQ ID No.5所示；所述下游同源修复臂的序列如SEQ ID No.6所示。
优选的，在所述构建同源重组模板的步骤中，首先将所述上游同源修复臂和所述下游同源修复臂通过限制性酶切的分子克隆方法分别连入pBluescript载体的多克隆位点区域的EcoRV和NotI酶切位点；再将所述目的基因序列通过限制性酶切的分子克隆方法连入到所述EcoRV和NotI酶切位点之间的任意一个酶切位点；最后再通过限制性酶切的方法获得含有所述上游同源修复臂、所述目的基因序列和所述下游同源修复臂的线性化的同源重组模板；
其中，用于扩增所述上游同源修复臂的引物对序列如SEQ ID No.7所示和SEQ IDNo.8所示；用于扩增所述下游同源修复臂的引物对序列如SEQ IDNo.9所示和SEQ ID No.10所示。
优选的，在所述转化步骤中，使用醋酸锂法转化酿酒酵母细胞W303-1A。
本发明另一方面还提供了一种构建基因检测标准品的试剂盒，所述试剂盒包含：基于CRISPR/Cas9基因编辑***构建的靶向酿酒酵母基因URA3的基因编辑质粒、基于CRISPR/Cas9基因编辑***构建的同源重组载体以及酿酒酵母细胞系，其中，其中，所述基因编辑质粒靶向所述酿酒酵母基因URA3并使其DNA双链断裂的位点为编辑位点，所述同源重组载体含有靶向所述编辑位点的上游同源修复臂和下游同源修复臂。
优选的，所述基因编辑质粒是靶向酿酒酵母基因URA3的gRNA连接到酵母-大肠杆菌穿梭型载体p425-Sap-TEF1p-Cas9-CYC1t-2xSap中的SapI酶切位点的连接产物，所述靶向酿酒酵母基因URA3的gRNA的序列如SEQ IDNo.1所示；所述同源重组载体含有靶向所述编辑位点的上游同源修复臂和下游同源修复臂，其中，所述上游同源修复臂的序列如SEQ IDNo.5所示；所述下游同源修复臂的序列如SEQ ID No.6所示；所述酿酒酵母细胞系为酿酒酵母细胞W303-1A。
本发明的基因检测标准品的构建方法及其试剂盒，首次开创性地采用了酵母细胞作为遗传背景，将待检测的目的基因(例如，人体细胞突变基因)通过同源重组的方式整合到酵母细胞的基因组中，由此获得的重组酵母细胞可以在针对目的基因的检测中作为阳性对照的标准品。与现有技术的标准品相比，本发明的构建方法一方面避免了诸如质粒或合成DNA等现有标准品存在的易污染、保存时间短、无法精确定量的缺陷，另一方面与现有的作为标准品的含遗传突变的细胞系相比，省去了复杂的细胞系构建，降低了成本，但同样地可以获得明确的突变和拷贝数，DNA提取、扩增和检测方便；再一方面，与现有的作为标准品的永生化细胞系和遗传改造细胞系相比，具有同源重组效率高，基因组单拷贝，培养简便快捷等优势。再者，酵母细胞培养过程以及DNA提取过程也都简单易行，并可通过原生质体化的过程将细胞去壁，提高与人体细胞形态和标准品使用操作的一致性。此外，酵母细胞可以容纳较大片段的外源DNA，大片段的缺失、重复甚至染色体数目变异的基因检测标准品都可以以其为遗传背景进行改造和使用。
附图说明
图1为pBluescript载体的酶切位点图谱；
图2为实施例1获得的阳性克隆(转化后的酿酒酵母细胞)的PCR鉴定结果。
具体实施方式
以下将结合附图所示的具体实施方式对本发明进行详细描述。但这些实施方式并不限制本发明，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的结构、方法、或功能上的变换均包含在本发明的保护范围内。
现在将参考附图更全面地描述示例实施方式。然而，示例实施方式能够以多种形式实施，且不应被理解为限于在此阐述的实施方式；相反，提供这些实施方式使得本发明将全面和完整，并将示例实施方式的构思全面地传达给本领域的技术人员。
下面实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社)或按照产品说明书进行。
在本发明的一个具体实施方案中，发明人一方面提供了一种基于酵母细胞的基因检测标准品的构建方法，该构建方法包含将待检测的目的基因序列通过同源重组的方式***到酵母细胞的基因组中获得含有所述目的基因序列的重组酵母细胞；所述重组酵母细胞在针对所述目的基因的检测中用作阳性对照标准品。
关于上述本发明的方案，发明人首次开创性地采用了酵母细胞作为遗传背景，将待检测的目的基因(人体细胞突变基因)通过同源重组的方式整合到酵母细胞的基因组中，由此获得的重组酵母细胞可以在针对目的基因的检测中作为阳性对照的标准品。
虽然在分子生物学领域，酵母细胞被广泛地应用，但是具体到遗传诊断的细分领域中，从未将酵母细胞用作构建遗传检测的标准品的载体。
除直接采用临床病人的样本以外，现有技术中公开了一些的标准品的构建方法，但构建含遗传突变细胞系的过程非常复杂，并且人体基因组的双拷贝特性使得存在杂合突变的可能性，构建质粒的标准品虽然简单快速，但体系中的质粒拷贝数很高，稀释和模拟基因组DNA以及进行较低突变百分率标准品的混合时容易造成误差和污染。
发明人经过大量的研究，意外地发现，酵母细胞非常适合作为遗传检测的标准品载体，单倍体的酵母细胞为经过基因重组后可以直接获得纯合突变个体，特别是，单倍体的野生型酵母细胞与导入了目标基因的重组酵母细胞以不同比例混合后可以通过计数的方式获得比例精确的标准品；酵母细胞经原生质体化后保存在高渗溶液中，与人体细胞为背景的标准品拥有类似的无细胞壁的形态，可以制成基因组DNA、细胞悬液、FFPE块及切片、细胞涂片等形式，满足多种标准品形式的实际需要。
再者，酵母细胞可以容纳较大片段的外源DNA，基因重组的操作更便捷；另外酵母细胞的培养过程以及DNA提取过程也都简单易行。
在本发明的一个优选实施方案中，所述构建方法至少包括构建同源重组模板的步骤，以及将所述同源重组模板转化所述酵母细胞的步骤；所述同源重组模板包含上游同源修复臂和下游同源修复臂，以及位于所述上游同源修复臂与下游同源修复臂之间的所述目的基因序列；所述上游同源修复臂和下游同源修复臂靶向所述酵母细胞的营养缺陷型标记基因。
“关于酵母细胞的营养缺陷型标记基因”的解释如下：酵母基因组中的某些基因被破坏后，酵母细胞丧失合成某些生活必需物质的能力，不能在基本培养基上生长，必须在培养基中补充相应的营养物质才能正常生长。这些基因都可以作为酵母基因操作中的筛选标记。例如，酵母细胞的营养缺陷型标记基因有TRP1、Leu2、His3(分别为色氨酸、亮氨酸和组氨酸的合成缺陷型标记基因)，URA3(尿嘧啶合成缺陷型标记基因)、SUP4(赭石突变抑制基因)等。
在本发明的一个更优选实施方案中，所述构建方法还包括基于基因编辑***来构建靶向所述酵母细胞的营养缺陷型标记基因的基因编辑质粒的步骤；并且，将所述同源重组模板与所述基因编辑质粒一同转化所述酵母细胞，获得在所述酵母细胞的营养缺陷型标记基因中***了所述目的基因序列的重组酵母细胞。
关于“基因编辑”，是指对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。关于基因编辑的工具/***的选择，除了目前热门的CRISPR/Cas***以外，还有锌指核酸酶(ZFNs)，转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)等。ZFNs和TALENs均是通过蛋白质的DNA结合域和FokI切割结构域形成二聚体来切割靶基因。但两种基因编辑工具与CRISPR/Cas***相比，效率较低。CRISPR/Cas***只需设计针对靶基因序列互补的RNA以及向宿主细胞中导入编码Cas9蛋白的基因即可。CRISPR/Cas***对靶序列的识别是RNA与DNA的碱基配对过程，对靶基因序列的识别更为精确，识别位点多样化，这大大提高了基因操作的效率。
在本方案中，在转化酵母细胞时，构建的基因编辑质粒靶向所述酵母细胞的营养缺陷型标记基因并使其DNA双链断裂，这样可以大大提高同源重组的效率。
在本发明的一个具体实施方案中，在所述基于基因编辑***来构建靶向所述酵母细胞的营养缺陷型标记基因的基因编辑质粒的步骤中：所述基因编辑***为CRISPR/Cas9基因编辑***，所述酵母细胞为酿酒酵母，所述营养缺陷型标记基因为URA3基因；其中，所述基因编辑质粒靶向所述酿酒酵母基因URA3并使其DNA双链断裂的位点为编辑位点；
在所述构建同源重组模板的步骤中：首先基于CRISPR/Cas9基因编辑***构建同源重组载体，所述同源重组载体含有靶向所述编辑位点的上游同源修复臂和下游同源修复臂；再将所述目的基因序列通过限制性酶切的分子克隆方法连入到所述同源重组载体中、且位于所述上游同源修复臂与下游同源修复臂之间；最后，再通过限制性酶切的方法获得含有所述上游同源修复臂、所述目的基因序列和所述下游同源修复臂的线性化的同源重组模板；
在将获得的所述基因编辑质粒与所述线性化的同源重组模板一同转化酿酒酵母细胞，获得在URA3基因中***了所述目的基因序列的重组酿酒酵母细胞；
所述构建基因编辑质粒的步骤与所述构建同源重组模板的步骤各自独立完成，不分先后。
在上述具体实施方案中，选择了易于获得且操作简便的酿酒酵母细胞，并将“酿酒酵母基因URA3”作为靶点，其中，URA3为编码乳清苷-5磷酸脱羧酶的基因，乳清苷-5磷酸脱羧酶是酵母RNA嘧啶核苷酸合成过程中的一个关键酶。如果乳清苷-5磷酸脱羧酶失活，酵母就无法生长，表现为尿苷或尿嘧啶营养缺陷及5-FOA耐酸表型。因此，URA3基因在酵母菌分子遗传学研究被广泛的用于营养缺陷筛选标记。只要在培养基中补充尿苷或尿嘧啶，酵母即可正常生长；敲除URA3基因、向其中***外源片段不会影响酵母的正常生长，因此，发明人选择URA3基因作为外源序列***的安全位点。
关于酵母细胞的基因重组，在本发明的具体实施方案中采用CRISPR/Cas9基因编辑***，具体来说，CRISPR/Cas9基因编辑***可以高效的介导定点DNA双链断裂，通常会激活细胞内的非同源末端连接机制(NHEJ)修复，并随之引入非目的性的***、缺失以及其他的突变，这一原理广泛的用于基因敲除。而DNA双链断裂也同样会被同源重组机制修复，当我们引入单链或双链的重组模板时，就可以特异性的***目标序列。
在本发明的一个优选实施方案中，在所述构建基因编辑质粒的步骤中，将靶向酿酒酵母基因URA3的gRNA通过限制性酶切的分子克隆方法连接到酵母-大肠杆菌穿梭型载体中，获得所述基因编辑质粒；所述靶向酿酒酵母基因URA3的gRNA的序列如SEQ ID No.1所示。
关于靶向酿酒酵母基因URA3的gRNA的序列的设计，发明人基于http://crispr.dbcls.jp/网站设计了数条可能适合靶向酿酒酵母基因URA3的gRNA的序列，并依次将其退火连接到酵母-大肠杆菌穿梭型载体中，再将构建成功的质粒转化酵母细胞，取单克隆通过测序验证其编辑效率；发明人经过大量的验证试验，发现当所述靶向酿酒酵母基因URA3的gRNA的序列如SEQ ID No.1所示时，编辑效率最高。
在本发明的一个更优选的实施方案中，在所述构建基因编辑质粒的步骤中，扩增所述gRNA的引物对序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示；所述酵母-大肠杆菌穿梭型载体为p425-Sap-TEF1p-Cas9-CYC1t-2xSap载体；将SapI酶切过的p425-Sap-TEF1p-Cas9-CYC1t-2xSap载体与所述gRNA连接，将获得的连接产物转化大肠杆菌，选取经鉴定的阳性克隆进行扩增培养，经质粒提取和纯化操作获得所述基因编辑质粒。
在本发明的另一个更优选的实施方案中，在所述构建同源重组模板的步骤中，基于如SEQ ID No.4所示的URA3基因序列中第351-373位的上游序列设计所述上游同源修复臂，基于于如SEQ ID No.4所示的URA3基因序列中第351-373位的下游序列设计所述下游同源修复臂。
具体来说，当所述靶向酿酒酵母基因URA3的gRNA的序列如SEQ ID No.1所示时，经连接到酵母-大肠杆菌穿梭型载体并转化到酵母细胞之后验证，酵母细胞的URA3基因的351-373位随机的出现DNA双链断裂；由此，发明人基于如SEQ ID No.4所示的URA3基因序列中第351-373位上游的序列设计所述上游同源修复臂，基于于如SEQ ID No.4所示的URA3基因序列中第351-373位下游的序列设计所述下游同源修复臂。
更优选的，经过发明人的设计以及实验验证，所述上游同源修复臂的序列如SEQID No.5所示；所述下游同源修复臂的序列如SEQ ID No.6所示。
更优选的，在所述构建同源重组模板的步骤中，首先将所述上游同源修复臂和所述下游同源修复臂通过限制性酶切的分子克隆方法分别连入pBluescript载体的多克隆位点区域的EcoRV和NotI酶切位点；再将所述目的基因序列通过限制性酶切的分子克隆方法连入到所述EcoRV和NotI酶切位点之间的任意一个酶切位点；最后再通过限制性酶切的方法获得含有所述上游同源修复臂、所述目的基因序列和所述下游同源修复臂的线性化的同源重组模板；其中，用于扩增所述上游同源修复臂的引物对序列如SEQ ID No.7所示和SEQID No.8所示；用于扩增所述下游同源修复臂的引物对序列如SEQ ID No.9所示和SEQ IDNo.10所示。
最后，关于待***的目的基因序列的获得，通过扩增目的基因序列(例如，扩增确定含有待检测的突变基因的DNA序列或扩增定点突变PCR获得的含有待检测的突变基因的DNA序列。在扩增待***的目的基因时可选择EcoRI、XmaI、SmaI、BamHI、XbaI等酶切位点，在扩增引物两端加上合适的酶切位点和保护碱基，将扩增好的片段通过酶切连接到上述的同源重组载体中。
在本发明的一个优选实施方案中，在所述转化步骤中，使用醋酸锂法转化酿酒酵母细胞W303-1A。
在本发明的一个具体实施方案中，发明人还一方面提供了一种构建基因检测标准品的试剂盒，所述试剂盒包含：基于CRISPR/Cas9基因编辑***构建的靶向酿酒酵母基因URA3的基因编辑质粒、基于CRISPR/Cas9基因编辑***构建的同源重组载体以及酿酒酵母细胞系，其中，其中，所述基因编辑质粒靶向所述酿酒酵母基因URA3并使其DNA双链断裂的位点为编辑位点，所述同源重组载体含有靶向所述编辑位点的上游同源修复臂和下游同源修复臂。
在本发明的一个优选实施方案中，所述基因编辑质粒是靶向酿酒酵母基因URA3的gRNA连接到酵母-大肠杆菌穿梭型载体p425-Sap-TEF1p-Cas9-CYC1t-2xSap中的SapI酶切位点的连接产物，所述靶向酿酒酵母基因URA3的gRNA的序列如SEQ ID No.1所示；所述同源重组载体含有靶向所述编辑位点的上游同源修复臂和下游同源修复臂，其中，所述上游同源修复臂的序列如SEQ ID No.5所示；所述下游同源修复臂的序列如SEQ ID No.6所示；所述酿酒酵母细胞系为酿酒酵母细胞W303-1A。
在上述方案中，试剂盒是与上述构建方法配套的，具体来说，试剂盒中包含已经构建好的基因编辑质粒、已经构建好的同源重组载体以及待转化的酿酒酵母细胞系；用户购买了该试剂盒之后，只需要将待检测的目的基因序列通过限制性酶切的方法连接到同源重组载体中(且位于上游同源修复臂和下游同源修复臂之间)，再通过限制性酶切的方法获得线性化的同源重组模板即可，最后将含有目的基因序列的线性化同源重组模板和现成的基因编辑质粒一同转化酿酒酵母细胞系，以获得含有目的基因序列的重组酵母细胞，该重组酵母细胞在针对目的基因的检测中用作阳性对照标准品。
实施例1
下面以“人非小细胞肺癌的重要相关基因突变c.35G>C(以下简称G12A突变)为例，构建用于检测G12A突变的酵母细胞标准品(阳性标准品)。
步骤(a)：基于CRISPR/Cas9基因编辑***构建靶向酿酒酵母基因URA3的基因编辑质粒；
在步骤(a)中，发明人选择酵母-大肠杆菌穿梭型载体，具体的，选择p425-Sap-TEF1p-Cas9-CYC1t-2xSap载体(市售)；
在步骤(a)中，发明人设计了靶向酿酒酵母基因URA3的gRNA的序列，具体的，gRNA的序列为：cattacgaatgcacacggtgtgg(如SEQ ID No.1所示)；根据该gRNA序列设计两条反向互补的引物(另外，具体在本实施例中，为能够和p425-Sap-TEF1p-Cas9-CYC1t-2xSap载体的SapI酶切缺口匹配，将引物两端补齐)，引物序列如下：
正向序列(F)：5’—atccattacgaatgcacacggtg—3’(如SEQ ID No.2所示)；
反向序列(R)：5’—aaccaccgtgtgcattcgtaatg—3’(如SEQ ID No.3所示)；
其中，正向序列的5’端的划线部分“atc”和反向序列的5’端的划线部分“aac”为补齐部分。
将两条反向互补的引物通过退火结合，退火体系共20μl，其中含：10xNEBbuffer 2μl，100μM F/R各5μl；95℃5min后缓慢将至室温。
将SapI酶切过的p425-Sap-TEF1p-Cas9-CYC1t-2xSap载体与退火产物连接(连接体系共10μl，其中含：10xT4ligase buffer 1μl，酶切载体50ng，退火产物1μl)转化大肠杆菌DH5α(市售，购自天根生化科技(北京)有限公司)货号CB101)，鉴定和获取阳性克隆；试剂盒(市售，购自Axygen公司公司，35715KA1产品型号)提取质粒。
将构建成功的质粒通过LiAc法转化酿酒酵母W303-1A，取单克隆通过测序验证；经验证，通过本实施例步骤(a)获取的质粒转化酿酒酵母W303-1A后，在基因URA3的第351-373位(基于如SEQ ID No.4所示的URA3基因序列中第351-373位)随机的造成DNA双链断裂；由此鉴定本实施例步骤(a)获取的质粒为“靶向酿酒酵母基因URA3的基因编辑质粒”。
步骤(b)：制备同源重组模板；
首先，基于CRISPR/Cas9基因编辑***构建同源重组载体；
(b-1)：发明人设计基于Cas9***的靶向编辑位点的同源臂；如上所述，步骤(a)获取的靶向酿酒酵母基因URA3的基因编辑质粒的编辑位点位于基因URA3序列的第351-373位，因此，发明人基于第351-373位的上游的序列设计上游同源修复臂，基于第351-373位的下游的序列设计下游同源修复臂。
设计出来的上游同源修复臂的序列如SEQ ID No.5所示(134bp)，下游同源修复臂的序列如SEQ ID No.6所示(141bp)。
(b-2)：发明人在上述编辑位点的上下游隔150bp附近，用Premier5软件设计引物，经验证采用的引物如下：用于扩增上游同源修复臂的引物对序列如SEQ ID No.7所示(正向序列)和SEQ ID No.8所示(反向序列)；用于扩增下游同源修复臂的引物对序列如SEQ IDNo.9所示(正向序列)和SEQ ID No.10所示(反向序列)。
通过PCR扩增得到上下游同源修复臂，具体的：
PCR体系：50μl PCR体系中含10×KOD buffer 5μl，25mM MgSO4 3μl，2mM dNTPs 5μl，10μM上下游引物各1μl，Kod-Plus-Neo 1μl，含URA3基因序列的质粒模板5-10ng；其中，采用KOD-Plus-Neo PCR高保真酶，购自TOYOBO公司，货号为KOD-40；
PCR条件：94℃预变性2min，三步法扩增，其中98℃变性10s，58℃退火30s，68℃延伸50s，40个循环后延伸68℃延伸5min，4℃保持。
PCR产物电泳检测后用Axygen公司的凝胶回收试剂盒AP-GX-250回收。
(b-3)：将上游同源修复臂和下游同源修复臂通过限制性酶切的分子克隆方法分别连入pBluescript载体的多克隆位点区域的EcoRV和NotI酶切位点(pBluescript载体的酶切位点图谱参见图1)，获得含有靶向编辑位点的上游同源修复臂和下游同源修复臂的同源重组载体。
具体操作如下：
pBluescript载体是市售的，购自优宝生物公司，产品型号VT1892。
酶切：pBluescript载体用EcoRV限制酶酶切(BioLab，货号R0195V，按照说明书方法使用)；50μl酶切体系中含10×NEB buffer3.1 5μl，EcoRV酶1μl，pBluescript载体1μg，37℃反应2h；再将酶切后的pBluescript载体用Axygen公司的凝胶回收试剂盒AP-GX-250回收。
连接：将上述(b-2)步骤中凝胶回收的上游同源修复臂片段与上述EcoRV限制酶酶切后的pBluescript载体使用BioLab公司的T4DNA连接酶(货号M0202)，连接步骤按照T4DNA连接酶的说明书操作——10μl连接体系中含10×T4连接酶buffer 1μl，EcoRV酶切后的pBluescript载体50ng(20-200ng/μl)，试剂盒回收的上游同源修复臂片段30ng(50-100ng/μl)，T4连接酶1μl，ddH2O补齐；室温连接2h；
验证：将上述连接产物转化大肠杆菌感受态细胞(DH5α，天根生化科技有限公司，货号CB101)，在LB平板培养12-16h后挑取白色克隆，通过一代测序验证连接正确的克隆。
酶切：将上述连接了上游同源修复臂的载体用NotI限制酶切(BioLab，货号R0189V，按照说明书方法使用)，50μl酶切体系中含10×NEB buffer3.15μl，NotI酶1μl，连接了上游同源修复臂的pBluescript载体1μg，37℃反应2h。酶切后的载体用Axygen公司的凝胶回收试剂盒AP-GX-250回收。
连接：将上述(b-2)步骤中凝胶回收的下游同源修复臂片段与上述NotI限制酶酶切后的载体使用上海近岸科技有限公司，
Figure BDA0001496842460000131
PCR一步定向克隆试剂盒(无缝克隆)(NR001)，按照说明书方法使用，将下游同源修复臂片段连入NotI限制酶酶切的载体。
验证：将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞(DH5α，天根生化科技有限公司，货号CB101)，挑单克隆通过一代测序验证连接正确的克隆，即获得同源重组载体(待***目的基因序列的同源重组框架载体)。
(b-4)：然后，再将待***的目的基因序列通过限制性酶切的分子克隆方法连入到上述获得的同源重组载体中、且位于上游同源修复臂与下游同源修复臂之间，从而获得含有目的基因序列的同源重组载体，具体来说：
关于待***的目的基因，本实施例中选择了上述的G12A突变基因。关于目的基因序列的获得方式可以通过扩增确定含有待检测的突变基因的DNA序列或者扩增定点突变PCR获得的含有待检测的突变基因的DNA序列。
为将待***的目的基因序列连接到同源重组载体中、且位于上游同源修复臂与下游同源修复臂之间，可以选择两个同源修复臂之间的多个酶切位点，参见图1，即位于两个同源修复臂的酶切位点EcoRV和NotI之间的其他酶切位点，例如，可以选择EcoRI、XmaI、SmaI、BamHI、XbaI等酶切位点；选择之后，再在目的基因的扩增引物序列的两端加上合适的保护碱基。
在本实施例中，选择了EcoRI&XbaI酶切位点，将目的基因序列连接到同源重组载体中的EcoRI&XbaI酶切位点所使用的扩增引物序列如下：
正向序列：5’CGGAATTCACGGAGTCTTGCTCTATCGC 3’(如SEQ ID No.11所示)；
反向序列：
5’GCTCTAGAACCTTCAAGGTGTCTTACAGGTC 3’(如SEQ ID No.12所示)
具体操作如下：
使用带有酶切位点和保护碱基的引物扩增目的基因序列(使用KOD-Plus-Neo PCR高保真酶，TOYOBO公司，货号KOD-40)，PCR条件：94℃预变性2min，三步法扩增，其中98℃变性10s，58℃退火30s，68℃延伸50s；40个循环后延伸68℃延伸5min；4℃保持。PCR产物电泳检测后用Axygen公司的凝胶回收试剂盒AP-GX-250回收；
将上述(b-3)步骤获得的同源重组载体和上述目的基因序列的PCR产物用EcoRI&XbaI酶切，(BioLab，EcoRI货号R0101V，XbaI货号R0145V，按照说明书方法使用)。50ul酶切体系中含：10×NEB buffer2.1 5μl，EcoRI、XbaI酶各1μl，目的基因序列的PCR产物1μg，37℃反应1-2h。酶切产物电泳检测后用Axygen公司的凝胶回收试剂盒AP-GX-250回收。
将上述试剂盒回收的酶切后的同源重组载体和酶切后的目的基因片段使用BioLab公司的T4DNA连接酶，货号M0202，按照说明书方法使用。10μl连接体系中含10×T4连接酶buffer 1μl，酶切后的同源重组载体50ng(50-200ng/μl)，试剂盒回收的酶切后的目的基因片段30ng(50-100ng/μl)，T4连接酶1μl，ddH2O补齐。室温连接2h。
将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞(DH5α，天根生化科技有限公司，货号CB101)，在LB平板培养12-16h后挑取单克隆，通过一代测序验证连接正确的克隆，即获得含有同源重组模板的质粒。
最后，再通过限制性酶切的方法获得含有上游同源修复臂、目的基因序列和下游同源修复臂的线性化的同源重组模板。如图1，选择EcoRV、NotI外侧任意两个酶切位点对上述获得的“含有同源重组模板的质粒”进行双酶切即可获得线性化的同源重组模板(靶向酿酒酵母基因URA3、且携带目的基因序列的线性化的同源重组模板)
上述的步骤(a)和步骤(b)是分别独立进行，可以不分先后。
步骤(c)：将步骤(a)获得的基因编辑质粒与步骤(b)获得的含有所述目的基因序列的同源重组载体一同转化酿酒酵母细胞，获得在URA3基因中***了所述目的基因序列的重组酿酒酵母细胞；
具体来说，在本实施例中，将上述步骤(a)获得的基因编辑质粒与上述步骤(b)获得的靶向酿酒酵母基因URA3的携带目的基因序列的同源重组载体，采用醋酸锂法转化酿酒酵母细胞W303-1A；具体的转化过程步骤如下：
(c-1)采用YPD液体培养基培养酿酒酵母细胞W303-1A，过夜培养后，12000rpm离心30秒后，弃去上清，取沉淀(酵母细胞)；
其中，YPD液体培养基的主要配方：蛋白胨(peptone)20g/L，酵母提取物(yeastextract)10g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L；
(c-2)用1ml的1×TE/LiAC重悬上述步骤(c-1)获得的沉淀，洗涤，再12000rpm离心30秒后，弃去上清，取沉淀(酵母细胞)；
(c-3)向上述步骤(c-2)获得的酵母细胞沉淀中加上述步骤(a)获得的基因编辑质粒600ng，步骤(b)获得的同源重组模板1μg，Carrier DNA 4μl，1×TE/LiAC 45μl，1×PEG/LiAC 300μl，混合均匀；
(c-4)热激转化；对步骤(c-3)获得的混合物进行热激转化，操作条件：30℃30min，42℃25min，30℃10min；
(c-5)将步骤(c-4)获得的产物离心12000rpm、30秒，弃上清，用100μl的纯水重悬沉淀，然后涂-leu平板(亮氨酸缺陷酵母固体培养基)，并在30℃环境下培养2-3天。附注：-leu平板上生长的是***了基因编辑质粒的菌体，因为本实施例步骤(a)获得的基因编辑质粒上有亮氨酸标签，可以在亮氨酸缺陷酵母培养基上生长。
(c-6)挑取1/3火柴头大小的单克隆，在20μl 0.2％的SDS溶液中混匀，100℃煮沸4min，4℃冷却，再12000rpm离心30秒，取上清液用Taq酶做PCR鉴定。其中PCR鉴定所采用的引物：使用目的基因序列的一条正向引物，和在URA3基因上的反向引物。具体在本实施例中，正向序列：5’aggcctgctgaaaatgactg3’(如SEQ ID No.13所示)，反向序列5’ttagttttgctggccgcatcttc3’(如SEQ ID No.14所示)。
关于PCR体系，共25μl，其中含5×Taq buffer 5μl，Taq酶0.3μl，10μlM正向序列/反向序列各1.25μl，上述上清液0.4μl。
参见图2，为PCR鉴定结果，通过PCR扩增初步验证目的基因***到酵母基因组的目的区域，PCR鉴定结果呈阳性的(阳性条带)，即为目的基因序列成功***了酿酒酵母细胞的URA3基因的酵母细胞克隆(也可通过测序验证***的准确性)，即为构建成功的重组酿酒酵母细胞。图2中DL2000为使用的DNA marker，“+”表示阳性结果，“-”表示阴性结果，NTC为空白对照，1.2kb为目的条带。图2中，8个结果中有7个为阳性结果，为构建成功的重组酿酒酵母细胞。
另外，发明人还将上述PCR鉴定呈阳性的PCR产物送测序公司进行一代测序，用PCR反应的上下游引物进行双向测序，进一步证明了目的基因序列***到了酿酒酵母的URA3基因中。
实施例2：构建基因检测标准品的试剂盒
实施例2的试剂盒主要包含：
1)、上述实施例1的步骤(a)获得的靶向酿酒酵母基因URA3的基因编辑质粒(基于CRISPR/Cas9基因编辑***构建的靶向酿酒酵母基因URA3的基因编辑质粒)，其中，基因编辑质粒靶向所述酿酒酵母基因URA3并使其DNA双链断裂的位点为编辑位点；
2)上述实施例1的步骤(b)中的(b-3)获得的同源重组载体(基于CRISPR/Cas9基因编辑***构建的、含有靶向编辑位点的上游同源修复臂和下游同源修复臂的同源重组载体)；
3)酿酒酵母细胞系；在本实施例中，可以采用酿酒酵母细胞W303-1A。
用户购买了本发明实施例2的试剂盒之后，只需要将扩增好的待检测的目的基因序列通过限制性酶切的方法连接到同源重组载体中(且位于上游同源修复臂和下游同源修复臂之间)，再通过限制性酶切的方法获得线性化的同源重组模板即可，最后将含有目的基因序列的线性化同源重组模板和现成的基因编辑质粒一同转化酿酒酵母细胞系，以获得含有目的基因序列的重组酵母细胞，该重组酵母细胞在针对目的基因的检测中用作阳性对照标准品。
优选的，本实施例的试剂盒中还可以包含将待检测的目的基因序列连接到同源重组载体的连接体系等。优选的，本实施例的试剂盒中还可以包含转化酿酒酵母细胞系的醋酸锂转化体系等。
应用例：关于构建的重组酵母细胞作为基因检测标准品的应用
下面以以“人非小细胞肺癌的重要相关基因突变c.35G>C(以下简称G12A突变)为例，简述G12A突变基因检测的标准品的配制。
阴性标准品：野生型基因组、质粒
阳性标准品：将上述实施例1获得的构建成功的重组酿酒酵母细胞进行原生质体化，将获得的无细胞壁悬液作为阳性标准品。
关于重组酿酒酵母细胞的原生质体化操作如下：将培养好的重组酿酒酵母细胞离心，取上清，沉淀用灭菌后的高渗PB液吹打均匀，每毫升溶液中加入5×107 50U溶壁酶(天根#RT-410-02)，在30℃水浴条件下处理1h，4000rpm离心去上清，换成无溶壁酶的高渗PB液保存细胞悬液。其中，关于高渗PB液的配制：用0.2M的磷酸氢二钠和0.1M的柠檬酸溶液配置成pH＝6.8的PB液，用PB液配制0.8M的KCl高渗PB液。
另注：获得的无细胞壁悬液作为基因检测的阳性标准品，也可以直接用于DNA的提取，也可以制成细胞涂片、蜡块及石蜡切片等。
效果数据
1、对于实施例1获得的构建成功的重组酿酒酵母细胞，通过***目的基因与酵母内参基因的Q-PCR反应，初步验证***的目的基因在酵母细胞中为单拷贝***；
具体来说，使用***目的基因KRAS上的三个引物序列(以下称KRAS引物1、KRAS引物2、KRAS引物3)和酿酒酵母(w303-1a)基因组上的内参基因ACT1进行Q-PCR定量，三次重复试验后，结果如下：
KRAS引物1对应的ct值为15.91；
KRAS引物2对应的ct值为15.73；
KRAS引物3对应的ct值为15.96；
ACT1对应的ct值为15.78；
从上述结果可以看出，***的目的基因与内参基因任意两对其ct值经t-test，p>0.05均无显著差异，由于酿酒酵母(w303-1a)为标准的单倍体酵母，因此可初步证明***的目的基因在酵母中为单拷贝***。
2、***目的基因在酵母中稳定遗传的稳定性验证
将实施例1获得的重组酿酒酵母细胞放在YPD平板上扩增培养，酵母膏悬浮在20％甘油中在-80℃冻存，冻存半年后，采用上述的PCR和一代测序鉴定其基因型未发生变化；
将实施例1获得的重组酿酒酵母细胞放在4℃YPD平板、-20℃环境下保存半年，采用上述的PCR和一代测序鉴定其基因型未发生变化；
将实施例1获得的重组酿酒酵母细胞连续传代20代，连续培养48h，采用上述的PCR和一代测序鉴定其基因型未发生变化。
3、按照本发明方法构建的重组酵母细胞在作为基因检测标准品应用时较难被污染
将现有技术中使用的阳性标准品(质粒标准品)与上述应用例中使用的阳性标准品(实施例1的重组酿酒酵母细胞的无细胞壁悬液)，在相同条件下平行地进行PCR反应；
经检测，现有技术中使用的质粒标准品一般在进行3次或以上时ddH2O为模板的阴性对照会出现假阳性，而本申请应用例中使用的阳性标准品作为PCR模板检测时进行10次及以上也不会出现假阳性污染。
4、按照本发明方法构建的重组酵母细胞在作为基因检测标准品应用时的计数和定量准确性。
根据本发明方法构建的重组酵母细胞可以通过血球计数板、自动计数仪等进行准确的定量，重组酵母细胞的数量即待检测的目的基因的拷贝数，而质粒标准品的拷贝数需要通过浓度测定及拷贝数计算间接获得。因此，根据本发明方法构建的重组酵母细胞，在基因检测应用时，计数的准确性使其更便于拷贝数定量和不同基因型的配比混合。
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海泽因生物科技有限公司
<120> 酿酒酵母细胞的基因
<130> 2017-ZY-1
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 1
cattacgaat gcacacggtg tgg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 2
atccattacg aatgcacacg gtg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 3
aaccaccgtg tgcattcgta atg 23
<210> 4
<211> 804
<212> DNA
<213> 酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 4
atgtcgaaag ctacatataa ggaacgtgct gctactcatc ctagtcctgt tgctgccaag 60
ctatttaata tcatgcacga aaagcaaaca aacttgtgtg cttcattgga tgttcgtacc 120
accaaggaat tactggagtt agttgaagca ttaggtccca aaatttgttt actaaaaaca 180
catgtggata tcttgactga tttttccatg gagggcacag ttaagccgct aaaggcatta 240
tccgccaagt acaatttttt actcttcgaa gacagaaaat ttgctgacat tggtaataca 300
gtcaaattgc agtactctgc gggtgtatac agaatagcag aatgggcaga cattacgaat 360
gcacacggtg tggtgggccc aggtattgtt agcggtttga agcaggcggc ggaagaagta 420
acaaaggaac ctagaggcct tttgatgtta gcagaattgt catgcaaggg ctccctagct 480
actggagaat atactaaggg tactgttgac attgcgaaga gcgacaaaga ttttgttatc 540
ggctttattg ctcaaagaga catgggtgga agagatgaag gttacgattg gttgattatg 600
acacccggtg tgggtttaga tgacaaggga gacgcattgg gtcaacagta tagaaccgtg 660
gatgatgtgg tctctacagg atctgacatt attattgttg gaagaggact atttgcaaag 720
ggaagggatg ctaaggtaga gggtgaacgt tacagaaaag caggctggga agcatatttg 780
agaagatgcg gccagcaaaa ctaa 804
<210> 5
<211> 134
<212> DNA
<213> 酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 5
ggcacagtta agccgctaaa ggcattatcc gccaagtaca attttttact cttcgaagac 60
agaaaatttg ctgacattgg taatacagtc aaattgcagt actctgcggg tgtatacaga 120
atagcagaat gggc 134
<210> 6
<211> 141
<212> DNA
<213> 酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 6
tgtcgctctt cgcaatgtca acagtaccct tagtatattc tccagtagct agggagccct 60
tgcatgacaa ttctgctaac atcaaaaggc ctctaggttc ctttgttact tcttccgccg 120
cctgcttcaa accgctaaca a 141
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 7
ggcacagtta agccgctaaa gg 22
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 8
gcccattctg ctattctgta tacacc 26
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> 酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 9
agttctagag cggccgcttg ttagcggttt gaagcagg 38
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> 酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 10
accgcggtgg cggccgctgt cgctcttcgc aatgtcaa 38
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> 酿酒酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 11
cggaattcac ggagtcttgc tctatcgc 28
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 酿酒酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 12
gctctagaac cttcaaggtg tcttacaggt c 31
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 酿酒酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 13
aggcctgctg aaaatgactg 20
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 酿酒酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 14
ttagttttgc tggccgcatc ttc 23

Claims (9)

1.一种用于遗传诊断的基因检测标准品的构建方法，其特征在于：所述构建方法包含将待检测的目的基因序列通过同源重组的方式***到酵母细胞的基因组中获得含有所述目的基因序列的重组酵母细胞；
所述重组酵母细胞经原生质化处理后，在针对所述目的基因的检测中用作阳性对照标准品；
所述构建方法至少包括构建同源重组模板的步骤，以及将所述同源重组模板转化所述酵母细胞的步骤；
所述同源重组模板包含上游同源修复臂和下游同源修复臂，以及位于所述上游同源修复臂与下游同源修复臂之间的所述目的基因序列；
所述同源重组模板中的上游同源修复臂和下游同源修复臂靶向所述酵母细胞的营养缺陷型标记基因；
所述构建方法还包括基于基因编辑***来构建靶向所述酵母细胞的营养缺陷型标记基因的基因编辑质粒的步骤；并且，
将所述同源重组模板与所述基因编辑质粒一同转化所述酵母细胞，获得在所述酵母细胞的营养缺陷型标记基因中***了所述目的基因序列的重组酵母细胞。
2.如权利要求1所述的基因检测标准品的构建方法，其特征在于：
在所述基于基因编辑***来构建靶向所述酵母细胞的营养缺陷型标记基因的基因编辑质粒的步骤中：所述基因编辑***为CRISPR/Cas9基因编辑***，所述酵母细胞为酿酒酵母，所述营养缺陷型标记基因为URA3基因；其中，所述基因编辑质粒靶向所述酿酒酵母基因URA3并使其DNA双链断裂的位点为编辑位点；
在所述构建同源重组模板的步骤中：首先基于CRISPR/Cas9基因编辑***构建同源重组载体，所述同源重组载体含有靶向所述编辑位点的上游同源修复臂和下游同源修复臂；再将所述目的基因序列通过限制性酶切的分子克隆方法连入到所述同源重组载体中、且位于所述上游同源修复臂与下游同源修复臂之间；最后，再通过限制性酶切的方法获得含有所述上游同源修复臂、所述目的基因序列和所述下游同源修复臂的线性化的同源重组模板；
在将获得的所述基因编辑质粒与所述线性化的同源重组模板一同转化酿酒酵母细胞，获得在URA3基因中***了所述目的基因序列的重组酿酒酵母细胞；
所述构建基因编辑质粒的步骤与所述构建同源重组模板的步骤各自独立完成，不分先后。
3.如权利要求2所述的基因检测标准品的构建方法，其特征在于：
在所述构建基因编辑质粒的步骤中，将靶向酿酒酵母基因URA3的gRNA通过限制性酶切的分子克隆方法连接到酵母-大肠杆菌穿梭型载体中，获得所述基因编辑质粒；
所述靶向酿酒酵母基因URA3的gRNA的序列如SEQ ID No.1所示。
4.如权利要求3所述的基因检测标准品的构建方法，其特征在于：
在所述构建基因编辑质粒的步骤中，扩增所述gRNA的引物对序列如SEQ ID No.2和SEQID No.3所示；所述酵母-大肠杆菌穿梭型载体为p425-Sap-TEF1p-Cas9-CYC1t-2xSap载体；将SapI酶切过的p425-Sap-TEF1p-Cas9-CYC1t-2xSap载体与所述gRNA连接，将获得的连接产物转化大肠杆菌，选取经鉴定的阳性克隆进行扩增培养，经质粒提取和纯化操作获得所述基因编辑质粒。
5.如权利要求3所述的基因检测标准品的构建方法，其特征在于：
在所述构建同源重组模板的步骤中，基于如SEQ ID No.4所示的URA3基因序列中第351-373位的上游序列设计所述上游同源修复臂，基于于如SEQ ID No.4所示的URA3基因序列中第351-373位的下游序列设计所述下游同源修复臂。
6.如权利要求5所述的基因检测标准品的构建方法，其特征在于：
所述上游同源修复臂的序列如SEQ ID No.5所示；所述下游同源修复臂的序列如SEQID No.6所示。
7.如权利要求6所述的基因检测标准品的构建方法，其特征在于：
在所述构建同源重组模板的步骤中，首先将所述上游同源修复臂和所述下游同源修复臂通过限制性酶切的分子克隆方法分别连入pBluescript载体的多克隆位点区域的EcoRV和NotI酶切位点；再将所述目的基因序列通过限制性酶切的分子克隆方法连入到所述EcoRV和NotI酶切位点之间的任意一个酶切位点；最后再通过限制性酶切的方法获得含有所述上游同源修复臂、所述目的基因序列和所述下游同源修复臂的线性化的同源重组模板；
其中，用于扩增所述上游同源修复臂的引物对序列如SEQ ID No.7所示和SEQ ID No.8所示；用于扩增所述下游同源修复臂的引物对序列如SEQ ID No.9所示和SEQ ID No.10所示。
8.如权利要求1至7中任意一项所述的基因检测标准品的构建方法，其特征在于：
在所述转化步骤中，使用醋酸锂法转化酿酒酵母细胞W303-1A。
9.如权利要求1至7中任意一项所述的基因检测标准品的构建方法，其特征在于：
所述原生质化处理的操作过程为：将所述重组酿酒酵母细胞离心，取上清，沉淀用灭菌后的高渗PB液吹打均匀，每毫升溶液中加入5×107 50U溶壁酶，在30℃水浴条件下处理1h，4000rpm离心去上清，换成无溶壁酶的高渗PB液保存获得的细胞悬液；其中，所述高渗PB液的配制方法为：用0.2M的磷酸氢二钠和0.1M的柠檬酸溶液配置成pH＝6.8的PB液，再加入KCl配制成KCl的浓度为0.8M的高渗PB液。
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