ES2353700T3 - Generación de genes recombinantes en saccharomyces cerevisiae. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para generar y detectar secuencias de ADN recombinante en Saccharomyces cerevisiae, que comprende las etapas de: a) generar en primer lugar células diploides de S. cerevisiae que llevan en un locus definido de su genoma una primera casete de recombinación (1) que comprende una primera secuencia de ADN a ser recombinada (A), que está flanqueada al menos por una primera y una segunda secuencias marcadoras y en una posición alélica una segunda casete de recombinación (2) que comprende una segunda secuencia de ADN a ser recombinada (B), que está flanqueada al menos por una tercera y una cuarta secuencias marcadoras, b) inducir la esporulación de las primeras células diploides obtenidas en a) y c) aislar las células haploides que contienen casetes de recombinación (3) en las que las primeras secuencias de ADN recombinadas (A/B) están flanqueadas al menos por la primera y la cuarta secuencias marcadoras, y las células haploides que contienen casetes de recombinación (4) en las que las segundas secuencias de ADN recombinadas (B/A) están flanqueadas al menos por la segunda y la tercera secuencias marcadoras. etapas de:

Description

La presente invención se refiere en general a métodos para generar y detectar secuencias de ADN recombinante en Saccharomyces cerevisiae y a plásmidos y células de S. cerevisiae utilizados para realizar los métodos de la invención.

Las secuencias de ADN para las que estos métodos son relevantes, incluyen secuencias que codifican proteínas y que no codifican proteínas; pueden consistir también en tramos continuos más grandes que contienen más de una única secuencia codificante con intervención de secuencias no codificantes, tales como aquellas que pueden pertenecer a una ruta biosintética.

La producción microbiana y enzimática de sustancias tales como las enzimas y otras proteínas es un tema económico importante. Las enzimas son proteínas biocatalíticamente activas no solamente responsables del metabolismo de los compuestos y organismos naturales, sino utilizadas también para la producción industrial de compuestos naturales y no naturales. Las enzimas o aquellos compuestos producidos por la ayuda de las enzimas se pueden usar para la producción de fármacos, cosméticos, productos alimenticios, etc. Sin embargo, el uso industrial de las enzimas se ha visto dificultado en gran medida por su especificidad de objetivos y las condiciones específicas en que pueden funcionar. Otras proteínas tienen aplicaciones terapéuticas en los campos de la salud humana y animal. Las clases importantes de proteínas importantes en medicina, incluyen las citoquinas y los factores de crecimiento.

Las proteínas, las enzimas, y las rutas con nuevas o mejores funciones y propiedades se pueden obtener o bien buscando entre las especies naturales en gran parte desconocidas o bien mejorando las proteínas o enzimas naturales actualmente conocidas. El último método puede ser más adecuado para crear propiedades para las que los procesos de evolución natural es improbable que hayan sido seleccionados.

Una estrategia prometedora para crear dichas nuevas propiedades deseables y para rediseñar enzimas, otras proteínas, secuencias o rutas no codificantes es mediante la evolución molecular dirigida. Convencionalmente, cuando se ha alcanzado la evolución directa de las secuencias de ADN con técnicas tales como la mutagénesis dirigida al sitio, la mutagénesis de multi-sitios o en casete, la mutagénesis al azar, y la PCR propensa a error (error prone PCR). Recientemente, los métodos de transposiciones genéticas para optimizar o ajustar las propiedades de las enzimas o proteínas han atraído mucho la atención. Estas técnicas evolutivas dirigidas pueden producir enzimas que pueden mejorar la tecnología existente, producir nuevos productos y expandir las capacidades de la química sintética.

Existen una serie de diferentes métodos de mutagénesis, tales como la mutagénesis al azar, la mutagénesis dirigida al sitio, la mutagénesis en casete de oligonucleótidos, o la mutagénesis puntual por PCR propensa a error. La mutagénesis al azar, por ejemplo, implica la generación de un gran número de mutaciones de sustitución de nucleótidos distribuidas al azar, en fragmentos de ADN clonado mediante tratamiento con productos químicos tales como ácido nitroso, hidrazina, etc. Se ha desarrollado la PCR propensa a error para introducir mutaciones puntuales al azar en los genes clonados. Las modificaciones que reducen la fidelidad de la reacción de la PCR incluyen el aumento de la concentración de MgCl2, la adición de MnCl2, o la alteración de las concentraciones relativas de los cuatro dNTPs (desoxirribonucleótidos trifosfato).

Estos métodos tradicionales de mutagénesis se enfocan en la optimización de genes individuales que tienen fenotipos diferenciados y seleccionables. La estrategia general es clonar un gen, identificar una función diferenciada para el gen, establecer un ensayo por el cual se pueda monitorizar ésta, mutar las posiciones seleccionadas en el gen y seleccionar las variantes del gen para mejora de la función conocida del gen. Una variante que haya mejorado la función puede ser expresada después en un tipo de célula deseado. Se pueden llevar a cabo ciclos repetitivos de los métodos de mutagénesis para obtener las propiedades enzimáticas deseables.

Cada uno de estos métodos convencionales tiene una estrategia implícita de búsqueda de secuencia. Las estrategias empleadas en las técnicas anteriores de búsqueda de secuencia son muy diferentes. El llevar a cabo una búsqueda de mutagénesis dirigida al sitio de saturación implica un procedimiento de instalación de toda posible permutación en un sitio de interés. Para una proteína, este procedimiento consiste en reemplazar un aminoácido en un sitio de interés con todos los otros 19 aminoácidos y buscar en el banco resultante los mutantes mejorados. En términos de espacio de secuencia esto significa que una región muy pequeña ha sido examinada muy concienzudamente. En comparación, la mutagénesis de casete inserta una secuencia peptídica al azar en una región específica de una proteína, consiguiendo un muestreo menos concienzudo de una región definida más grande, del espacio de secuencia. La PCR propensa a error implica la copia repetida de una secuencia, con la introducción de un número bajo pero significativo de errores. En este caso, se consigue un muestreo escaso de una región menos definida del espacio de secuencia. En cada una de estas estrategias, el mejor mutante obtenido en cada ciclo de selección se usa para iniciar el siguiente ciclo.

Sin embargo, los métodos tradicionales de mutagénesis para desarrollar nuevas propiedades en las enzimas tienen una serie de limitaciones. En primer lugar, sólo son aplicables a genes o secuencias que hayan sido clonados y caracterizados funcionalmente. En segundo lugar, estos métodos usualmente sólo son aplicables a los genes que tienen una función diferenciada. Por tanto, los genes múltiples que confieren cooperativamente un único fenotipo usualmente no se pueden optimizar de esta manera. Finalmente, estos métodos sólo pueden explorar una serie muy limitada del número total de permutaciones, incluso para un solo gen. A la vista de estas limitaciones, los métodos convencionales de mutagénesis son inadecuados para mejorar los genomas celulares con respecto a muchas propiedades útiles. Por ejemplo, las mejoras en la capacidad de una célula para expresar una proteína podrían requerir alteraciones en la eficiencia transcripcional, modificaciones de traducción y post-traducción, secreción o degradación proteolítica de un producto génico. Por lo tanto podría ser necesario modificar genes adicionales que tienen un papel en uno o más de estos mecanismos celulares con el fin de expresar una proteína con nuevas propiedades. El intento de optimizar individualmente todos los genes que tienen dicha función sería una tarea prácticamente imposible.

La mayor parte de los problemas asociados con los métodos convencionales de mutagénesis se pueden resolver mediante métodos de transposiciones genéticas. La transposición genética implica la recombinación al azar de diferentes secuencias de genes funcionales, haciendo posible la mezcla molecular de genes similares a los naturales o mutados al azar. Las transposiciones de ADN o genéticas, o las variaciones de estas técnicas, se han utilizado para mejorar la actividad, estabilidad, plegamiento, y las propiedades de reconocimiento del sustrato de las enzimas. En comparación con los métodos convencionales de mutagénesis con transposiciones genéticas, la probabilidad de obtener mutantes con fenotipo mejorado es significativamente más alta. La transposición genética es fundamentalmente diferente de las estrategias convencionales porque recombina las mutaciones favorables de manera combinatoria. Por tanto examinará regiones mucho más grandes de espacio de secuencia mucho más extendido y con un sesgo hacia la producción de secuencias funcionales. Permite también que mutaciones más beneficiosas procedentes de cada ciclo de selección sean mantenidas en el siguiente ciclo ya que permite que la información de secuencia sea aportada por más de una fuente. Mientras que las estrategias convencionales permiten también la fijación de mutaciones negativas, este no es el caso para los métodos de transposiciones genéticas. Por lo tanto, no es sorprendente que las estrategias de transposiciones genéticas hayan dado resultados mucho más espectaculares.

Las técnicas de transposición de ADN están descritas por Paluh J L et al: "Mutational Analysis of the Gene for Schizosac Caromyces Pombe RNASE MRP, RNA, MRPL, Using Plasmid Shuffle by Counterselection on Canavanine" Yeast, Chichester, Sussex, GB, vol. 12, no. 14, November 1996 (1996-11), pages 1393-1405 y también por Abecassis V. et al: "High efficiency family shuffling based on multi-step PCR and in vivo DNA recombination in yeast: statistical and functional analysis of a combinatorial library between human cytochrome P450 1A1 and 1A2." Nucleic Acids Research, vol. 28, no.20, 15 October 2000 (2000-10-15), pages E88-E88.

Los métodos de transposiciones de ADN o genéticas se basan en sucesos de recombinación entre regiones con una cierta homología o entre tramos de identidad. Un organismo clave utilizado en los experimentos para examinar la recombinación genética en los eucariotas ha sido la levadura Saccharomyces cerevisiae en germinación. El estudio de estos procesos en un organismo sencillo, unicelular, tiene la ventaja obvia de la facilidad de manipulación de las secuencias de ADN y la posibilidad de estudiar sucesos de recombinación específicos inducidos de forma sincronizada en una gran proporción de células. Además, en las últimas décadas se ha acumulado una gran experiencia tanto en la tecnología de fermentación como en la genética básica de este organismo, que es el eucariota mejor estudiado a nivel molecular. Debido a su carácter no patógeno, su capacidad de secreción y su potencial de glucosilación, el S. cerevisiae es un organismo hospedante preferido para la clonación de genes y la expresión de genes. Por tanto, el problema técnico que subyace en la presente invención es proporcionar métodos y medios para la generación de un mosaico de genes recombinantes en Saccharornyces cerevisiae.

La presente invención resuelve este problema técnico subyacente proporcionando un procedimiento para generar y detectar secuencias de ADN recombinante en Saccharomyces cerevisiae, que comprende las etapas de:

a) generar en primer lugar células diploides de S. cerevisiae que llevan en un locus definido de su genoma una primera casete de recombinación que comprende una primera secuencia de ADN a ser recombinada, que está flanqueada al menos por una primera y una segunda secuencias marcadoras, en una posición alélica una segunda casete de recombinación que comprende una segunda secuencia de ADN a ser recombinada, que está flanqueada al

menos por una tercera y una cuarta secuencias marcadoras,

b) inducir la esporulación de las primeras células diploides obtenidas en a)

y

c) aislar las células haploides que contienen casetes de recombinación en las que

las primeras secuencias recombinadas de ADN están flanqueadas por la

primera y la cuarta secuencias marcadoras, y las células haploides que

contienen casetes de recombinación en las que las segundas secuencias

recombinadas de ADN están flanqueadas por la segunda y la tercera

secuencias marcadoras.

La presente invención proporciona un sistema basado en levaduras para seleccionar los sucesos de recombinación entre al menos dos secuencias de ADN divergentes. El sistema se basa en el ciclo sexual reproductivo de S. cerevisiae, que alterna entre una fase haploide y una fase diploide. En la primera etapa del procedimiento de la invención, se generan células diploides de S. cerevisiae, que son heterocigóticas para estos sustratos de recombinación. Las secuencias de ADN a ser recombinadas se integran en el genoma de las células diploides de S. cerevisiae en posiciones alélicas. Cada secuencia de ADN a ser recombinada se integra en la forma de una casete de recombinación, que comprende además de esta secuencia de ADN al menos dos secuencias marcadoras que flanquean la secuencia de ADN, con lo que las dos casetes de recombinación comprenden al menos cuatro secuencias marcadoras diferentes.

Las células diploides heterocigóticas obtenidas de este modo se cultivan en condiciones que inducen los procesos de meiosis y la formación de esporas. La meiosis se caracteriza generalmente por frecuencias elevadas de recombinación genética, que se inicia mediante la formación y posterior reparación de roturas de la doble hebra (DSBs) inducidas tempranamente en la profase I de la meiosis. Las células meióticas de levadura son por tanto de particular interés porque experimentan altos niveles de recombinación como resultado de la inducción de DSBs en todo el genoma. Así los productos de un primer ciclo de meiosis, que son células haploides o esporas para cada uno de los cuatro sucesos de meiosis producidos por una célula diploide parental, pueden contener secuencias de ADN recombinadas debidas a la recombinación entre las dos secuencias de ADN separadas.

La recombinación entre las dos secuencias de ADN divergentes durante la meiosis puede llevar también a un intercambio de las secuencias marcadoras flanqueadoras. Por tanto, el presente procedimiento permite una identificación rápida y sencilla de las secuencias de ADN recombinadas mediante la selección de células individuales o moléculas en las que ha tenido lugar un intercambio de las secuencias marcadoras que flanquean un sustrato de recombinación. Los recombinantes obtenidos después del primer ciclo de meiosis se caracterizan por tanto porque contienen y/o expresan al menos una secuencia marcadora de la primera casete de recombinación y al menos una secuencia marcadora de la segunda casete de recombinación. En particular, las esporas recombinantes pueden contener la primera secuencia marcadora de la primera casete de recombinación y la cuarta secuencia marcadora de la segunda casete de recombinación o la segunda secuencia marcadora de la primera casete de recombinación y la tercera secuencia marcadora de la segunda casete de recombinación, con lo que ambos tipos de esporas recombinantes contienen además de esta combinación marcadora diferente, también secuencias de ADN recombinante diferentes. Ambos tipos de esporas que contienen secuencias recombinantes se pueden seleccionar fácilmente y distinguir en condiciones que permitan la selección de las nuevas configuraciones marcadoras recombinantes producidas por recombinación durante la meiosis.

El procedimiento de la invención se puede llevar a cabo en células de S. cerevisiae de tipo natural o deficientes en la reparación del apareamiento erróneo. Los procedimientos por los que se repara el ADN dañado y los mecanismos de recombinación genética están íntimamente relacionados, y se sabe que la maquinaria de reparación del apareamiento erróneo tiene efectos inhibidores sobre la frecuencia de recombinación entre secuencias divergentes, esto es recombinación homeóloga. Por lo tanto, las mutaciones del sistema de reparación del apareamiento erróneo potencian mucho la frecuencia total de sucesos de recombinación en las levaduras. Por otra parte, se sabe que las células de S. cerevisiae de tipo natural tienen un mecanismo de recombinación dependiente de la reparación del apareamiento erróneo, que se basa en apareamientos erróneos muy alejados en dos sustratos de recombinación. Dependiendo de las secuencias de ADN a ser recombinadas, se pueden usar células de S. cerevisiae bien de tipo natural o bien deficientes en la reparación del apareamiento erróneo, para obtener secuencias recombinadas.

El procedimiento de la invención tiene la ventaja de que es iterativo, esto es permite ciclos adicionales de recombinación. Los productos del primer ciclo de meiosis, esto es células haploides de tipos opuestos de apareamiento que comprenden diferentes secuencias de ADN recombinadas, se aparean de nuevo para obtener células diploides que son heterocigóticas para las secuencias de ADN recombinadas. Se induce de nuevo la meiosis en las células diploides así obtenidas, con lo que las secuencias de ADN recombinadas se recombinan una vez más, llevando de nuevo a un intercambio de los dos marcadores que flanquean cada sustrato de recombinación. Los nuevos recombinantes haploides obtenidos después de la segunda meiosis se pueden identificar ahora fácilmente mediante la expresión conjunta de los genes marcadores que flanquean la primera secuencia de ADN en la primera casete de recombinación original o de los genes marcadores que flanquean la segunda secuencia de ADN en la segunda casete de recombinación original.

Por lo tanto, en una realización preferida de la invención las células haploides que contienen una casete de recombinación con las primeras secuencias de ADN recombinadas obtenidas en el primer ciclo del procedimiento de la invención se aparean con las células haploides que contienen casetes de recombinación con las segundas secuencias de ADN recombinadas obtenidas en el primer ciclo del procedimiento de la invención con el fin de generar las segundas células diploides. En la segunda célula diploide así obtenida se induce la esporulación, dando como resultado la generación de células haploides. En las siguientes etapas, se aíslan las células haploides que contienen casetes de recombinación en las que las terceras secuencias de ADN recombinadas están flanqueadas al menos por la primera y la segunda secuencias marcadoras y las células haploides que contienen casetes de recombinación en las que las cuartas secuencias de ADN recombinadas están flanqueadas al menos por la tercera y la cuarta secuencias marcadoras.

Se pueden generar secuencias de ADN recombinadas adicionales sometiendo las células haploides que contienen la tercera y cuarta secuencias de ADN recombinadas a uno o más ciclos adicionales de apareamiento y meiosis/esporulación. Después de cada ciclo de recombinación, los recombinantes se identifican por la presencia conjunta de al menos una secuencia marcadora que flanquea el primer sustrato de recombinación y al menos una secuencia marcadora que flanquea el segundo sustrato de recombinación o por la presencia conjunta de los dos marcadores que flanquean la primera o la segunda secuencia de ADN en los sustratos de recombinación de partida.

Por lo tanto, una característica ventajosa del presente procedimiento es que es iterativo: la progenie haploide recombinante se selecciona individualmente o en masa y se aparean unas con otras, los diploides resultantes son esporulados de nuevo, y sus esporas de progenie se someten a condiciones apropiadas de selección para identificar nuevos sucesos de recombinación. Con el procedimiento de la invención se puede generar fácilmente un gran banco de secuencias recombinadas, mutadas, y entonces se pueden identificar las variantes que hayan adquirido una función deseada mediante el uso de un sistema apropiado de selección o cribado.

En una realización preferida de la invención la primera célula diploide de S. cerevisiae se genera transformando simultánea o secuencialmente una célula diploide de S. cerevisiae con una molécula de ADN que comprende la primera casete de recombinación y una molécula de ADN que comprende la segunda casete de recombinación y permitiendo opcionalmente la integración de las dos casetes de recombinación en posiciones alélicas sobre cromosomas naturales del genoma de S. cerevisiae. Las moléculas de ADN utilizadas pueden ser también por ejemplo cromosomas artificiales de levaduras (YAC). Los cromosomas artificiales de levaduras se caracterizan porque son moléculas de ADN lineal que contienen todas las secuencias necesarias para el mantenimiento estable en las células de levaduras, tales como un centrómero, origen de la replicación de ADN y telómeros así como marcadores seleccionables de levaduras. Después de la introducción en una célula de levadura, los cromosomas artificiales de levaduras se comportan de manera similar a los cromosomas naturales y por tanto se pueden considerar como parte del genoma de las levaduras. En el contexto de la presente invención el término "genoma" incluye el conjunto de todos los componentes hereditarios presentes dentro de una célula, que se mantienen de manera estable y que se heredan. En el caso de que se usen cromosomas artificiales de levaduras como moléculas de ADN, para la introducción de la primera y segunda casetes de recombinación en células diploides de S. cerevisiae no es necesario integrar las dos casetes de recombinación en posiciones alélicas en los cromosomas naturales. En el caso en que las casetes de recombinación se introduzcan en cromosomas naturales, es posible usar un vehículo de clonación, por ejemplo un plásmido, a partir del cual se puede liberar un fragmento que lleva las casetes de recombinación. Preferiblemente las dos secuencias marcadoras respectivas de las dos casetes de recombinación están flanqueadas por secuencias de acceso (targeting sequences) que son homólogas para un locus definido del genoma de S. cerevisiae. Alternativamente, se puede usar una molécula de ADN que no contiene un origen de replicación. En este caso las moléculas de ADN deben ser capaces de integrarse en un componente del genoma y contener por tanto secuencias de acceso que son homólogas para un locus definido del genoma de S. cerevisiae.

En otra realización preferida de la invención las primeras células diploides de S. cerevisiae se generan por fusión de células haploides que llevan en un locus de su genoma la primera casete de recombinación con células haploides de S. cerevisiae que llevan en una posición alélica de su genoma la segunda casete de recombinación.

En otra realización preferida más de la invención las primeras células diploides de S. cerevisiae se generan por apareamiento de células haploides que llevan en un locus de su genoma la primera casete de recombinación con células haploides de S. cerevisiae de tipo de apareamiento opuesto que llevan en una posición alélica de su genoma la segunda casete de recombinación.

En el contexto de la presente invención los términos "apareamiento" y "fusión" indican la combinación determinada o la combinación al azar de dos células haploides que contienen diferentes casetes de recombinación. Un apareamiento o fusión determinado de dos células haploides tiene lugar, cuando dos células haploides seleccionadas y/o aisladas de tipo de apareamiento opuesto con propiedades deseadas se ponen en contacto en condiciones que estimulan el apareamiento y la fusión, respectivamente. Las dos células haploides se pueden derivar a partir del mismo banco de células, que por ejemplo contiene secuencias de ADN a ser recombinadas o secuencias de ADN ya recombinadas, o a partir de diferentes bancos de células, que por ejemplo contienen secuencias de ADN a ser recombinadas o secuencias de ADN ya recombinadas.

Un apareamiento o fusión al azar de dos células haploides puede tener lugar, cuando una pluralidad de diferentes células haploides se pone en contacto en condiciones que estimulan el apareamiento y la fusión, respectivamente. La pluralidad de las células haploides se puede derivar a partir del mismo banco de células, que por ejemplo contiene secuencias de ADN a ser recombinadas o secuencias de ADN ya recombinadas, o a partir de diferentes bancos de células, que por ejemplo contienen secuencias de ADN a ser recombinadas o secuencias de ADN ya recombinadas.

El procedimiento de la invención para generar y detectar secuencias de ADN recombinadas tiene la ventaja de que se pueden recombinar más de dos secuencias divergentes. Si, por ejemplo, se van a recombinar cuatro secuencias divergentes de ADN, entonces en la primera etapa del presente procedimiento se pueden generar dos conjuntos diferentes de células diploides de S. cerevisiae. Por ejemplo, se puede generar un primer conjunto de células diploides por apareamiento o fusión de las células haploides que comprenden una primera y una segunda secuencia de ADN a ser recombinada y se puede generar un segundo conjunto de células diploides por apareamiento o fusión de las células haploides que comprenden una tercera y una cuarta secuencia de ADN a ser recombinada. Después de la esporulación de los dos conjuntos de células diploides, las células haploides obtenidas del primer conjunto de células diploides que contiene secuencias de ADN recombinadas debido a la recombinación entre la primera y la segunda secuencia de ADN, se aparean con las células haploides apropiadas obtenidas del segundo conjunto de células diploides que contiene secuencias de ADN recombinadas debido a la recombinación entre la tercera y la cuarta secuencias de ADN. Los productos de este apareamiento son células diploides que después de esporulación dan lugar a las células haploides que llevan secuencias de ADN recombinadas que comprenden regiones de la primera secuencia de ADN, de la segunda secuencia de ADN, de la tercera secuencia de ADN y de la cuarta secuencia de ADN. Si, por ejemplo, se van a recombinar tres secuencias de ADN divergentes, en la primera etapa del presente procedimiento se generan células diploides de S. cerevisiae, por ejemplo, por apareamiento o fusión de las células haploides que comprenden una primera y una segunda secuencias de ADN a ser recombinadas. Después de la esporulación de estas células diploides, las células haploides así obtenidas, que contienen secuencias de ADN recombinadas debido a la recombinación entre la primera y la segunda secuencias de ADN, se pueden fusionar

o aparear con las células haploides que comprenden una tercera secuencia de ADN a ser recombinada. Los productos de este apareamiento son células diploides que después de esporulación dan lugar a las células haploides que llevan secuencias de ADN recombinadas que comprenden regiones de la primera secuencia de ADN, de la segunda secuencia de ADN y de la tercera secuencia de ADN. De esta forma, también se pueden recombinar cinco, seis o más secuencias de ADN divergentes.

En una realización preferida, las células haploides de S. cerevisiae que llevan la primera o segunda casete de recombinación se generan por medio de:

a) insertar la primera secuencia de ADN a ser recombinada entre la primera y la segunda secuencias marcadoras localizadas de forma adyacente sobre un primer vehículo de clonación e insertar la segunda secuencia de ADN a ser recombinada entre la tercera y la cuarta secuencias marcadoras localizadas de forma adyacente sobre un segundo vehículo de clonación, con lo que las dos secuencias marcadoras respectivas son flanqueadas por secuencias de acceso que son homólogas para un locus definido del genoma de S. cerevisiae,

b) escindir de los vehículos de clonación obtenidos en a) la primera casete de recombinación y la segunda casete de recombinación con secuencias de acceso flanqueantes, respectivamente, con lo que cada fragmento escindido comprende la secuencia de ADN a ser recombinada, que está flanqueada por las dos secuencias marcadoras respectivas y por las secuencias de acceso,

c) transformar los fragmentos escindidos obtenidos en b) separadamente en células diploides de S. cerevisiae, con lo que las secuencias de acceso dirigen la integración de las casetes hacia aquel locus para el cual son homólogas, con el fin de obtener células diploides heterocigóticas para la primera casete, o para la segunda casete,

d) inducir por separado la esporulación de las células diploides heterocigóticas obtenidas en c) y

e) aislar las células haploides que contienen la primera casete flanqueada por la primera y la segunda secuencias marcadoras y por separado las células haploides que contienen la segunda casete flanqueada por la tercera y la cuarta secuencias marcadoras.

En una realización preferida de la invención las dos secuencias marcadoras respectivas en el primero o segundo vehículo de clonación están flanqueadas por secuencias de acceso que son homólogas para el locus BUD31-HCM1 sobre el cromosoma III del genoma de S. cerevisiae y que dirigen la integración de las casetes escindidas en dicho locus.

En una realización preferida de la invención el vehículo de clonación usado para clonar las casetes de recombinación es un plásmido. "Plásmido" significa un elemento extracromosómico que se puede replicar de forma autónoma. El plásmido es físicamente diferente del genoma de la célula en el que está contenido. La mayor parte de los plásmidos son moléculas de ADN circular de doble hebra. En otra realización el vehículo de clonación es un cromosoma artificial de levadura (YAC).

En particular se prefiere utilizar como el primer vehículo de clonación, en el que es clonada la primera casete de recombinación, el plásmido pMXY9. El plásmido pMXY9 comprende el gen marcador URA3 y el gen marcador CAN1. En este plásmido los dos genes marcadores están localizados de forma adyacente. Entre los dos genes marcadores se disponen varios sitios de restricción, en particular sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción SmaI, XbaI, BglII y PacI, para insertar una secuencia de ADN a ser recombinada. Las dos secuencias marcadoras están flanqueadas por secuencias de acceso homólogas para el locus BUD31-HCM1 sobre el cromosoma III del genoma de S. cerevisiae.

Además, se prefiere utilizar como el segundo vehículo de clonación, en el que es clonada la segunda casete de recombinación, el plásmido pMXY12. El plásmido pMXY12 comprende el gen marcador TRP1 y el gen marcador CYH2. En este plásmido los dos genes marcadores están localizados de forma adyacente. Entre los dos genes se disponen varios sitios de restricción, en particular sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción SpeI, SmaIy PacI, para insertar una secuencia de ADN a ser recombinada. Las dos secuencias marcadoras están flanqueadas por secuencias de acceso homólogas para el locus BUD31-HCM1 sobre el cromosoma III del genoma de S. cerevisiae.

En una realización preferida de la invención las células diploides usadas para la transformación de la casete de recombinación escindida son auxotróficas al menos para dos factores nutricionales y resistentes al menos a dos antibióticos. Preferiblemente, las células diploides son homocigóticas para el alelo ura3-1 y para el alelo trp1-1, lo que las hace auxotróficas para el uracilo y el triptófano, respectivamente. Además se prefiere que las células diploides usadas para la transformación sean homocigóticas para el alelo can1-100 y para el alelo cyh2R, lo que las hace resistentes a la canavanina y la cicloheximida, respectivamente.

En particular se prefiere que se usen para la transformación las células diploides de la cepa MXY47 de S. cerevisiae, que son homocigóticas para los alelos ura3-1, trp1-1, can1-100 y cyh2R y heterocigóticas para la mutación msh2::KanMX. Cuando se usan células diploides de la cepa MXY47 para la transformación con los fragmentos primero o segundo escindidos que llevan casetes de recombinación y sus secuencias de acceso flanqueantes, entonces los transformantes obtenidos pueden ser esporulados para dar segregantes haploides de tipo natural o de tipo msh2 que llevan la respectiva casete de recombinación.

De acuerdo con la invención, se puede preferir el uso de células de S. cerevisiae que tengan un sistema funcional de reparación del apareamiento erróneo para el procedimiento de la invención. El sistema de reparación del apareamiento erróneo pertenece a los principales contribuidores para evitar las mutaciones debidas a errores de la ADN polimerasa en la replicación. La reparación del apareamiento erróneo promueve también la estabilidad genética corrigiendo la fidelidad de la recombinación genética. Se sabe por tanto que la maquinaria de reparación del apareamiento erróneo tiene algún efecto inhibidor sobre la recombinación entre secuencias separadas. Sin embargo, en un diploide normal de S. cerevisiae se detectó otro aspecto de la reparación del apareamiento erróneo, denominado recombinación dependiente de la reparación del apareamiento erróneo (Borts and Haber, Science, 237 (1987), 1459-1465). Se cree que la reparación del apareamiento erróneo de apareamientos erróneos ampliamente espaciados tales como en las secuencias separadas lleva a nuevas roturas de la doble hebra que pueden estimular a su vez un segundo ciclo de recombinación (dependiente de la reparación del apareamiento erróneo). En ciertas circunstancias, en particular, cuando se sabe que los dos sustratos de recombinación usados tienen diferencias de bases ampliamente espaciadas, es por tanto útil emplear células de S. cerevisiae con un sistema funcional de reparación del apareamiento erróneo para realizar el procedimiento de la invención.

En otra realización preferida de la invención, se usan células de S. cerevisiae que son deficientes en el sistema de reparación del apareamiento erróneo. En S. cerevisiae se han identificado varios genes cuyos productos comparten homología con las proteínas bacterianas de reparación de apareamiento erróneo, incluyendo seis homólogos de la proteína MutS, a saber Msh1, Msh2p, Msh3p, Msh4, Msh5 y Msh6p, y cuatro homólogos de la proteína MutL, esto es Mlh1p, Mlh2p, Mlh3p, y Pms1. Se sabe que en particular los genes PMS1 y MSH2 forman una barrera para la recombinación de secuencias separadas. Por tanto, en los mutantes msh2 y pms1, se aumenta la recombinación meiótica entre secuencias separadas, en relación con la frecuencia de recombinación en las células de tipo natural.

En el contexto de la presente invención, la expresión "deficiente en el sistema de reparación del apareamiento erróneo " significa que el sistema de reparación del apareamiento erróneo (MMR) de una célula está alterado de forma transitoria o permanente. La deficiencia de MMR de una célula o de un organismo se puede lograr mediante cualquier estrategia que altere de forma transitoria o permanente la reparación del apareamiento erróneo incluyendo pero sin limitarse a ellos, una mutación de uno o más genes implicados en la reparación del apareamiento erróneo, el tratamiento con un agente tal como la luz UV, que dé como resultado una alteración global de la MMR, el tratamiento con un agente tal como 2-aminopurina o un heterodúplex que contiene una cantidad excesiva de apareamientos erróneos para saturar e inactivar de forma transitoria el sistema de MMR y la expresión o represión inducibles de uno o más genes implicados en la reparación del apareamiento erróneo, por ejemplo mediante promotores regulables, que podrían permitir la inactivación transitoria, esto es durante la meiosis, pero no durante el crecimiento vegetativo.

En una realización preferida de la invención la deficiencia de reparación del apareamiento erróneo de la célula de S. cerevisiae es debida a una mutación al menos de un gen implicado en la MMR. En una realización preferida las células de S. cerevisiae son deficientes en el gen MSH2. Preferiblemente, las células diploides son homocigóticas para el alelo msh2, en el cual las secuencias que codifican MSH2 están reemplazadas por la construcción KanMX.

En el contexto de la presente invención el término "casete de recombinación" se refiere a una secuencia de ADN que comprende al menos un sustrato de recombinación o una secuencia de ADN a ser recombinada, que está flanqueada al menos por dos secuencias marcadoras diferentes. La primera y la segunda casete de recombinación difieren en las secuencias de ADN a ser recombinadas y en las secuencias marcadoras flanqueantes, de tal modo que cualquier par de casetes de recombinación comprende dos secuencias diferentes de ADN a ser recombinadas y al menos cuatro secuencias marcadoras flanqueantes diferentes.

En una realización preferida de la invención tanto la primera como la segunda casetes de recombinación se generan insertando las respectivas secuencias de ADN a ser recombinadas entre dos secuencias marcadoras que están estrechamente localizadas sobre un vehículo de clonación y que a su vez están rodeadas por secuencias de acceso que son homólogas para un locus definido del genoma de S. cerevisiae. Por lo tanto las secuencias de acceso pueden dirigir la integración de un fragmento escindido que contiene una casete de recombinación en este locus definido. La inserción del ADN a ser recombinado entre las dos secuencias marcadoras se realiza preferentemente por métodos de ingeniería genética. En una realización preferida de la invención las dos secuencias marcadoras en el vehículo de clonación están flanqueadas por secuencias de acceso son homólogas para el locus BUD31HCM1 sobre el cromosoma III del genoma de S. cerevisiae. Por lo tanto, las secuencias de acceso dirigen la integración de los fragmentos escindidos que contienen casetes de recombinación en dicho locus.

En el contexto de la presente invención los términos "secuencias de ADN a ser recombinadas" y "sustrato de recombinación" significan cualquiera de dos secuencias de ADN que se pueden recombinar como resultado de procedimientos de recombinación meiótica, con lo que la recombinación entre estas secuencias puede ser debida a recombinación homóloga o no homóloga.

Los sucesos de recombinación homóloga de varios tipos se caracterizan por el apareamiento de bases de una cadena de ADN dañada con una pareja homóloga, en los que la extensión de la interacción puede implicar cientos de pares de bases perfectamente apareadas. El término "homología" indica el grado de identidad que existe entre la secuencia de dos moléculas de ácido nucleico. En contraste, la recombinación ilegítima o no homóloga se caracteriza por la unión de extremos de ADN que no comparten o que comparten solamente algunos pares de bases complementarias. En las levaduras, los sucesos de reparación y recombinación no homólogos ocurren con frecuencias significativamente menores que los sucesos de recombinación homólogos.

La primera y segunda secuencias de ADN a ser recombinadas son secuencias divergentes, esto es secuencias, que no son idénticas pero presentan un cierto grado de homología. Esto significa, que las secuencias de ADN a ser recombinadas divergen en al menos un nucleótido. Preferiblemente las secuencias de ADN a ser recombinadas son secuencias que comparten al menos una o más regiones homólogas, que pueden ser muy cortas. Las regiones homólogas deben comprender al menos 5-10 nucleótidos, preferiblemente más de 20-30 nucleótidos, más preferiblemente más de 30-40 nucleótidos y lo más preferiblemente más de 50 nucleótidos. En una realización preferida de la invención la primera y la segunda secuencias de ADN a ser recombinadas divergen en al menos un nucleótido, en particular más de 0,1 %, preferiblemente más de 5 % hasta más de 50 %. Esto significa, que la primera y la segunda secuencias de ADN a ser recombinadas pueden divergir también en 55 %, 60 %, 65 % o incluso más.

Los sustratos de recombinación o secuencias de ADN a ser recombinadas pueden tener un origen natural o sintético. Por tanto las secuencias de ADN a ser recombinadas se pueden derivar de cualquier fuente natural incluyendo virus, bacterias, hongos incluyendo S. cerevisiae, animales, plantas y seres humanos. En una realización preferida de la invención la primera y la segunda secuencias de ADN a ser recombinadas se derivan de organismos distintos de S. cerevisiae.

En una realización preferida de la invención, las secuencias de ADN a ser recombinadas son secuencias que codifican proteínas, por ejemplo, secuencias que codifican enzimas, que se pueden usar para la producción industrial de compuestos naturales y no naturales. Las enzimas o aquellos compuestos producidos con ayuda de las enzimas se pueden usar para la producción de fármacos, cosméticos, productos alimenticios, etc. Las secuencias que codifican proteínas pueden ser también secuencias que codifican proteínas que tienen aplicaciones terapéuticas en los campos de la salud humana y animal. Las clases importantes de proteínas importantes en medicina, incluyen las citoquinas y los factores de crecimiento. La recombinación de las secuencias que codifican proteínas permite la generación de nuevas secuencias mutadas que codifican proteínas con funciones alteradas, preferiblemente mejoradas y/o funciones recién adquiridas. De esta forma se puede, por ejemplo, lograr mejoras en la termoestabilidad de una proteína, cambiar la especificidad del sustrato de una proteína, mejorar su actividad, desarrollar nuevos sitios catalíticos y/o fusionar dominios de dos enzimas diferentes. Las secuencias de ADN que codifican proteínas, a ser recombinadas, pueden incluir secuencias de diferentes especies que codifican las mismas proteínas o similares, que en su contexto natural tienen funciones similares

o iguales. Las secuencias de ADN que codifican proteínas, a ser recombinadas, pueden incluir secuencias de la misma familia de proteínas o enzimas. Las secuencias que codifican proteínas, a ser recombinadas, también pueden ser secuencias que codifican proteínas con diferentes funciones, por ejemplo, secuencias que codifican enzimas que catalizan diferentes etapas de una ruta metabólica dada. En una realización preferida de la invención, la primera y la segunda secuencias de ADN a ser recombinadas se seleccionan del grupo de secuencias de genes de la superfamilia Oxa de B-lactamasas.

En otra realización preferida de la invención, las secuencias de ADN a ser recombinadas son secuencias no codificantes tales como secuencias que, por ejemplo, están implicadas dentro de su contexto celular natural en la regulación de la expresión de una secuencia que codifica proteínas. Los ejemplos de secuencias no codificantes incluyen, pero sin limitarse a ellas, secuencias promotoras, secuencias que contienen sitios de unión al ribosoma, secuencias intrón, secuencias de poliadenilación, etc. Por recombinación de dichas secuencias no codificantes se pueden desarrollar secuencias mutadas, que en un entorno celular dan como resultado la alteración de la regulación de un proceso celular, por ejemplo, una alteración de la expresión de un gen.

De acuerdo con la invención, un sustrato de recombinación o secuencia de ADN a ser recombinada puede comprender, por supuesto, más de una secuencia que codifica proteínas y/o más de una secuencia que no codifica. Por ejemplo, un sustrato de recombinación puede comprender una secuencia que codifica proteínas más una secuencia que no codifica o una combinación de diferentes secuencias que codifican proteínas y diferentes secuencias que no codifican. Por lo tanto, en otra realización de la invención, las secuencias de ADN que se van a combinar pueden consistir en uno o más tramos de secuencias codificantes con secuencias no codificantes que se interponen y/o flanquean. Esto significa que la secuencia de ADN a ser recombinada puede ser, por ejemplo, una secuencia génica con secuencias reguladoras en su extremo 5' y/o una región 3' no traducida o una secuencia génica de mamífero con una estructura de exón/intrón. En otra realización más de la invención, las secuencias de ADN a ser recombinadas pueden consistir en tramos continuos más largos que contienen más de una sola secuencia codificante con intervención de secuencias no codificantes, tales como aquellas que pueden pertenecer a una ruta biosintética o un operón. Las secuencias de ADN a ser recombinadas pueden ser secuencias que ya han experimentado uno o más sucesos de recombinación, por ejemplo sucesos de recombinación homóloga y/o no homóloga.

Los sustratos de recombinación pueden comprender secuencias de ADN naturales no mutadas y/o secuencias de ADN mutadas. Por lo tanto, en una realización preferida, se pueden recombinar secuencias naturales con secuencias mutadas ya existentes con el fin de desarrollar nuevas secuencias mutadas.

En el contexto de la presente invención el término "secuencias marcadoras" se refiere a secuencias únicas de ADN que están situadas hacia arriba o hacia abajo de un sustrato de recombinación o de una secuencia de ADN ya recombinada en células de Saccharomyces cerevisiae. La presencia de una secuencia marcadora sobre la misma molécula de ADN como el sustrato de recombinación o la secuencia de ADN ya recombinada, preferiblemente en combinación con otra secuencia marcadora situada en el otro lado del sustrato de recombinación, permite que el sustrato de recombinación o la secuencia de ADN ya recombinada sea reconocido y seleccionado por métodos moleculares o genéticos. Por lo tanto, en una realización preferida de la invención debe haber una o más secuencias marcadoras hacia arriba de cada sustrato de recombinación y una o más secuencias marcadoras hacia abajo de cada sustrato de recombinación, de tal modo que en una célula heterocigótica para dos sustratos de recombinación diferentes, hay al menos cuatro secuencias marcadoras diferentes juntas. Esta disposición permite la selección de cruzamientos que incluyen sustratos de recombinación. Permite también que se lleven a cabo otros ciclos de recombinación de una forma iterativa. En otra realización preferida de la invención se puede situar más de un marcador sobre cada lado del sustrato de recombinación. Por ejemplo, se pueden introducir marcadores adicionales para aumentar la rigurosidad de la selección.

Las secuencias marcadoras pueden comprender secuencias de ADN que codifican o que no codifican proteínas. En una realización preferida de la invención las secuencias marcadoras que codifican las proteínas se seleccionan del grupo que consiste en marcadores nutricionales, marcadores de pigmentos, marcadores de resistencia a antibióticos, marcadores de sensibilidad a antibióticos y secuencias que codifican diferentes subunidades de una enzima, que solamente funciona, si ambas o más subunidades se expresan en la misma célula. En otra realización preferida de la invención las secuencias marcadoras moleculares no codificantes incluyen pero sin limitarse a ellos, sitios de reconocimiento del cebador, esto es secuencias con las que se hibridan los cebadores de la PCR y que permiten una amplificación de zonas límites intrón/exón, secuencias promotoras, secuencias génicas reguladas hacia abajo o sitios de enzimas de restricción, recombinantes.

Un "marcador nutricional" es una secuencia marcadora que codifica un producto génico que puede compensar una auxotrofía de un organismo o célula y de este modo puede conferir prototrofía al organismo o célula auxótrofos. En el contexto de la presente invención el término "auxotrofía" significa que un organismo o célula deben crecer en un medio que contenga un nutriente esencial que no puede ser sintetizado por el propio organismo auxótrofo. El producto génico del gen marcador nutricional promueve la síntesis de este nutriente esencial que falta en la célula auxótrofa. Por lo tanto, tras la expresión de este gen marcador nutricional, no es necesario añadir este nutriente esencial al medio en que crece el organismo o célula, puesto que el organismo o célula han adquirido protrotofía.

Un "marcador de pigmento" es un gen marcador en el que el producto génico está implicado en la síntesis de un pigmento que tras la expresión teñirá la célula en la que se expresa el marcador de pigmento. Una célula sin el marcador de pigmento no sintetiza el pigmento y por lo tanto no se tiñe. Por lo tanto, el marcador de pigmento permite una detección fenotípica rápida de la célula que contiene el marcador de pigmento.

Un "marcador de resistencia a antibiótico" es un gen marcador en el que tras la expresión el producto génico confiere a una célula, en la que tiene lugar la expresión del gen marcador de antibiótico, la capacidad de crecer en presencia de un antibiótico dado a una concentración dada, mientras que una célula sin el marcador de resistencia a antibiótico no puede.

Un "marcador de sensibilidad a antibiótico" es un gen marcador en el que el producto génico tras la expresión destruye la capacidad de la célula para crecer en presencia de un antibiótico dado a una concentración dada.

En una realización preferida de la invención cada uno de los productos génicos de la primera y tercera secuencias marcadoras pueden compensar una auxotrofía de una célula de S. cerevisiae. Preferiblemente, la primera secuencia marcadora es URA3, cuyo producto génico puede conferir prototrofía para el uracilo a una célula de

S. cerevisiae auxotrófica para uracilo. Preferiblemente, la tercera secuencia marcadora es TRP1, cuyo producto génico puede conferir prototrofía para el triptófano a una célula de S. cerevisiae auxotrófica para triptófano.

En otra realización preferida de la invención los productos génicos de la segunda y cuarta secuencias marcadoras confieren sensibilidad a un antibiótico a una célula de S. cerevisiae que es resistente a dicho antibiótico. Preferiblemente, la segunda secuencia marcadora es CAN1, cuyo producto génico puede conferir a una célula de S. cerevisiae resistente a la canavanina, sensibilidad para la canavanina. Preferiblemente, la cuarta secuencia marcadora es CYH2, cuyo producto génico puede conferir a una célula de S. cerevisiae resistente a la cicloheximida, sensibilidad para la cicloheximida.

En otra realización preferida de la invención las secuencias marcadoras comprenden sitios de hibridación para los cebadores de la PCR. Preferiblemente, la primera, la segunda, la tercera y la cuarta secuencias marcadoras se reconocen por los cebadores KNS11, KNS28, KNS16, y KNS29.

En una realización preferida del procedimiento de la invención las células haploides que contienen casetes de recombinación con la primera, la segunda, la tercera o la cuarta secuencias de ADN recombinadas se pueden identificar por procedimientos de PCR con el fin de detectar la presencia de la respectiva combinación marcadora.

En otra realización preferida del procedimiento de la invención las células haploides que contienen casetes de recombinación con la primera, la segunda, la tercera o la cuarta secuencias de ADN recombinadas se identifican poniendo en placas las células haploides en medios que seleccionan la presencia sobre la misma molécula de ADN de la respectiva combinación marcadora. Esto significa que las células haploides que contienen las primeras secuencias de ADN recombinadas se ponen en placas en un medio que selecciona la presencia de la primera y de la cuarta secuencias marcadoras. Las células haploides que contienen las segundas secuencias de ADN recombinadas se ponen en placas en un medio que selecciona la presencia de la segunda y de la tercera secuencias marcadoras. Las células haploides que contienen las terceras secuencias de ADN recombinadas se ponen en placas en un medio que selecciona la presencia de la primera y de la segunda secuencias marcadoras. Las células haploides que contienen las cuartas secuencias de ADN recombinadas se ponen en placas en un medio que selecciona la presencia de la tercera y de la cuarta secuencias marcadoras.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento de generación de nuevas proteínas, enzimas, rutas y secuencias no codificantes con funciones y propiedades nuevas o mejoradas, por el cual las secuencias que se sabe que codifican proteínas o las secuencias que se sabe que no codifican, se someten a uno o más ciclos de recombinación usando el procedimiento de la invención para generar y detectar secuencias de ADN recombinante en S. cerevisiae.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al plásmido pMXY9. El plásmido pMXY9 comprende el gen marcador URA3 y el gen marcador CAN1, que están localizados de forma adyacente. Entre los dos genes marcadores está dispuesta una secuencia con un ligador múltiple, que comprende varios sitios de restricción para insertar una secuencia de ADN a ser recombinada. Los dos marcadores están flanqueados por secuencias de acceso homólogas para el locus BUD31-HCM1 sobre el cromosoma III del genoma de S. cerevisiae. La secuencia con un ligador múltiple entre los dos genes marcadores comprende sitios de restricción para las enzimas de restricción SmaI, Xbal, BglII y PacI.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al plásmido pMXY12. El plásmido pMXY12 comprende el gen marcador TRP1 y el gen marcador CYH2. Entre los dos genes marcadores está dispuesta una secuencia con un ligador múltiple, que comprende varios sitios de restricción para insertar una secuencia de ADN a ser recombinada. Los dos marcadores están flanqueados por secuencias de acceso homólogas para el locus BUD31-HCM1 sobre el cromosoma III del genoma de S. cerevisiae. La secuencia con un ligador múltiple comprende sitios de restricción para las enzimas de restricción SpeI, SmaI y PacI.

La presente invención se refiere también a la cepa MXY47 de S. cerevisiae, caracterizada porque las células diploides de la misma son homocigóticas para los alelos ura3-1, trp1-1, can1-100 y cyh2R y heterocigóticas para la mutación msh2::KanMX.

La presente invención se refiere también a la cepa JM101 de E. coli, que contiene el plásmido pMXY9, y a la cepa DH5a de E. coli, que contiene el plásmido pMXY12.

Los plásmidos pMXY9 y pMXY12 y la cepa MXY47 de Saccharomyces cerevisiae se depositaron el 3 de enero de 2005 en el DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroderweg 1b, 38124 Braunschweig, Germany) con los números de acceso DSM 17010, DSM 17011, y DSM 17026, respectivamente.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit que se puede usar para llevar a cabo el procedimiento de la invención para generar y detectar secuencias de ADN recombinadas en Saccharomyces cerevisiae. En una primera realización el kit comprende al menos un primer recipiente que contiene células de la cepa MXY47 de

S. cerevisiae, un segundo recipiente que contiene células de la cepa JM101 de E. coli que llevan el plásmido pMXY9 y un tercer recipiente que contiene células de la cepa DH5a de E. coli que llevan el plásmido pMXY12.

En una segunda realización el kit comprende al menos un primer recipiente que contiene células de la cepa MXY47 de S. cerevisiae, un segundo recipiente que contiene ADN del plásmido pMXY9 y un tercer recipiente que contiene ADN del plásmido pMXY12.

La presente invención se ilustra mediante la siguiente lista de secuencias, figuras y ejemplos.

La Figura 1 presenta un esquema del sistema de selección para la selección de recombinantes en medios definidos. Las células diploides parentales heterocigóticas para casetes de recombinación -aquí, sustrato de recombinación A, flanqueado por los genes URA3 y CAN1, y sustrato de recombinación B, flanqueado por los genes TRP1 y CYH2 -son inducidas para sufrir meiosis. Las esporas se ponen en placas en un medio que carece de uracilo y que contiene canavanina (-Ura+Can) y en un medio que carece de triptófano y que contiene cicloheximida (-Trp+Cyh) para seleccionar las células recombinantes 3 y 4, en las que ha tenido lugar un cruzamiento que implica los sustratos de recombinación A y B, como se indica por (+). Las diploides parentales y las haploides no recombinantes 1 y 2 no se pueden cultivar en ninguno de estos medios, como se indica por (-). Un ciclo posterior de meiosis puede usar los recombinantes 3 y 4 para construir un nuevo diploide, que cuando es esporulado da nuevas células recombinantes que llevan las mismas configuraciones marcadoras flanqueantes que las presentadas en las células 1 y 2. Las colonias de esporas recombinantes con estas configuraciones se pueden seleccionar en un medio que carece de uracilo y que contiene cicloheximida (-Ura+Cyh), y en un medio que carece de triptófano y que contiene canavanina (-Trp+Can), respectivamente.

La Figura 2 presenta los plásmidos pMXY9 y pMXY12 (anteriores), que son vectores usados para dirigir las casetes de recombinación hacia el locus BUD31-HCM1 sobre el cromosoma III del genoma de levaduras. Ambos plásmidos llevan secuencias homólogas para este locus (indicadas como 5' y 3'), que flanquean los marcadores URA3 y CAN1 (pMXY9) o los marcadores TRP1 y CYH2 (pMXY12). Una secuencia corta que lleva sitios de restricción que tienen en cuenta la clonación de los sustratos de recombinación está situada entre cada par de secuencias marcadoras. Debajo, integración de casetes de recombinación en el locus BUD31-HCM1. Un derivado pMXY9 que lleva sustrato de recombinación A se digiere con NotI para liberar la casete de recombinación flanqueada por las secuencias de acceso 5' y 3' y los productos de digestión se transforman en células MXY47. Los derivados Ura+ que contienen un inserto correctamente señalado se identifican para uso posterior en la construcción de cepas heterocigóticas para casetes de recombinación. Las casetes de recombinación que llevan los marcadores TRP1 y CYH2 se construyen similarmente en pMXY12 y se transforman en MXY47, seguido por selección para la prototrofía para triptófano.

La Figura 3 presenta la frecuencia de recombinación entre genes Oxa como una función de identidad de secuencia en cepas de tipo natural y de tipo msh2. Arriba, se da la media ± desviación típica de (n) experimentos independientes. Abajo, representación gráfica de estos datos. Se usaron las siguientes cepas: MXY60, MXY62, MXY64, MXY66, MXY99, y MXY102.

La Figura 4 presenta el efecto de hiper-recombinación de msh2. Se calculó la relación msh2/natural para cada experimento independiente (número total = n) para pares de cepas con el porcentaje dado de homología Oxa compartida y para cada condición de selección, y se presentan la media ± desviación típica de estos valores sumados. Los datos se representan gráficamente abajo. Se usaron los siguientes pares de cepas: MXY60 y MXY62, MXY64 y MXY66, MXY99 y MXY102.

La Figura 5 presenta un análisis de PCR de recombinación entre secuencias Oxa que comparten 78 % de homología. Las colonias de esporas se derivan de diploides de tipo natural (MXY99) y de tipo msh2 (MXY102) por selección en un medio que carece de uracilo y que contiene canavanina, o en un medio que carece de triptófano y que contiene cicloheximida. Se realizó la PCR de colonias sobre colonias seleccionadas de esporas que presentan fenotipos que concuerdan con los esperados para recombinantes de cruzamiento. Arriba, se llevaron a cabo dos reacciones para cada candidato Ura+CanR de tipo natural y de tipo msh2, una con un par de cebadores específicos parentales (KNS16 + KNS28, productos mostrados en la primera de cada par de pistas para cada candidato), y la otra con un par de cebadores específicos recombinantes (KNS16 + KNS29, segunda pista). Abajo, se llevaron a cabo reacciones similares para cada candidato Trp+CyhR de tipo natural y de tipo msh2, una con un par de cebadores específicos parentales (KNS11 + KNS29, primera pista), y la otra con un par de cebadores específicos recombinantes (KNS11 + KNS28, segunda pista). Se llevaron a cabo reacciones de control sobre plantillas apropiadas de ADN genómico que contienen configuraciones conocidas de secuencias marcadoras flanqueantes, ya sea parental (P) o recombinante (R). (-) sin ADN control.

La Figura 6 presenta las frecuencias de recombinación para el segundo ciclo de recombinación. Los haploides de tipo natural y de tipo msh2 obtenidos después de un primer ciclo de recombinación con MXY64 y MXY66 se aparearon para producir diploides de tipo natural (MXY81, MXY82 y MXY83) y de tipo msh2 (MXY86, MXY87, y MXY88) con un mosaico de casetes de recombinación Oxa7-Oxa11. Se construyeron también los diploides naturales (MXY90) y los diploides msh2 (MXY92) homocigóticos para el sustrato de recombinación Oxa11 a partir de la progenie recombinante de MXY60 y MXY62. Todos los diploides fueron esporulados y las esporas se pusieron en placas en medios para seleccionar los recombinantes Ura+CanR y Trp+CyhR .

El listado de secuencias comprende las siguientes secuencias: SEQ ID No. 1 y 2 muestran las secuencias de los cebadores MSH2UP y MSH2DN, respectivamente, para la amplificación de MSH2. SEQ ID No. 3 a SEQ ID No. 6 muestran las secuencias de los cebadores MSH2A1, MSH2A2, MSH2A3 y MSH2A4, respectivamente, que son cebadores analíticos específicos de MSH2.

SEQ ID No. 7 y SEQ ID No. 8 muestran las secuencias de los cebadores K2KANMX y K3KANMX, respectivamente, que son cebadores analíticos específicos de KanMX. SEQ ID No. 9 y SEQ ID No. 10 muestran las secuencias de los cebadores LEU2UP y LEU2DN, respectivamente, que se usan para la amplificación de LEU2. SEQ ID No. 11 y SEQ ID No. 12 muestran las secuencias de los cebadores HIS3UP y HIS3DN, respectivamente, que se usan para la amplificación de HIS3. SEQ ID No. 13 y SEQ ID No. 14 muestran las secuencias de los cebadores KNS1 y KNS2, respectivamente, que se usan para la amplificación de la secuencia de acceso 3'. SEQ ID No. 15 a SEQ ID No. 17 muestran las secuencias de los cebadores KNS3, KNS4 y KNS6, respectivamente, que se usan para la amplificación de una secuencia de acceso 5'. SEQ ID No. 18 y SEQ ID No. 19 muestran las secuencias de los cebadores KNS7 y KNS8, respectivamente, que se usan para la amplificación de Oxa7. SEQ ID No. 20 y SEQ ID No. 21 muestran las secuencias de los cebadores KNS9 y KNS10, respectivamente, que se usan para la amplificación de Oxa11. SEQ ID No. 22 muestra la secuencia del cebador KNS12, que es un cebador analítico BUD31 hacia abajo. SEQ ID No. 23 muestra la secuencia del cebador KNS13, que es un cebador analítico BUD31 hacia arriba. SEQ ID No. 24 muestra la secuencia del cebador KNS14, que es un cebador analítico específico de TRP1. SEQ ID No. 25 muestra la secuencia del cebador KNS15, que es un cebador analítico específico de URA3. SEQ ID No. 26 y SEQ ID No. 27 muestran las secuencias de los cebadores KNS17 y KNS18, respectivamente, que se usan para la amplificación de CYH2. SEQ ID No. 28 muestra la secuencia del cebador KNS30, que es un cebador directo específico de TRP1 usado como cebador de secuenciación. SEQ ID No. 29 muestra la secuencia del cebador KNS31, que es un cebador inverso específico de CAN1 usado como cebador de secuenciación. SEQ ID No. 30 muestra la secuencia del cebador KNS33, que es un cebador inverso específico de CYH2 usado como cebador de secuenciación. SEQ ID No. 31 y SEQ ID No. 32 muestran las secuencias de los cebadores KNS36 y KNS37, respectivamente, que se usan para la amplificación de Oxa5.

SEQ ID No. 33 muestra la secuencia del cebador KNS38, que es un cebador directo específico de URA3 usado como cebador de secuenciación.

Ejemplo -Generación de genes mosaico en mutantes de reparación del apareamiento erróneo de Saccharomyces cerevisiae

1. Materiales y métodos 1.1 Medios

Se utilizó un medio YPD rico estándar (Bio101) para el cultivo de rutina, y se utilizaron medios sintéticos drop-out (Bio101) para monitorizar los marcadores genéticos y para la selección de recombinantes. Para la esporulación, se precultivaron las células durante la noche en SPS (ftalato de potasio 50 mM, pH 5,0, extracto de levaduras al 0,5 % (Difco), Bactopeptona al 1 % (Difco), base nitrogenada de levaduras al 0,17 %, acetato de potasio al 1 %, sulfato de amonio al 0,5 %) más los suplementos nutricionales requeridos, se lavaron, se resuspendieron en acetato de potasio al 1 % más suplementos y se incubaron con agitación durante dos días. Todas las manipulaciones se realizaron a 30 ºC. Para el análisis de tétradas, se digirieron los asci con Helix pomatia B-glucuronidasa (Sigma) y se diseccionaron utilizando un microscopio Nikon Eclipse E400 provisto de un micromanipulador TDM400 (Micro Video Instruments, Inc.). Se llevaron a cabo otros métodos genéticos como se han descrito por Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (1998), John Wiley and Sons, Inc., New York. Se llevaron a cabo todas las transformaciones de levaduras utilizando el método LiAc según Agatep et al., Technical Tips On-line (http://tto.trends.com).

1.2. Cepas de levaduras

Todas las cepas de levaduras usadas o creadas en este estudio se listan en la Tabla 1 y Tabla 2. Todas las cepas de levaduras son derivados isogénicos de la W303 de origen, fácilmente esporulante. El diploide MXY47, que sirve como un hospedante para la transformación con casetes de recombinación, se construyó mediante transformación y cruzamientos genéticos como sigue. El haploide D184-1B (un presente de S. Gangloff, CEA, France) se transformó con un fragmento LEU2 (obtenido por PCR preparatoria de la cepa U474 de W303 con el par de cebadores LEU2UP/LEU2DN que están listados en el listado de secuencias para dar el haploide Leu+ MXY13. El haploide D184-1C (un presente de S. Gangloff) se transformó con un

fragmento HIS3 (obtenido por PCR preparatoria de ORD4369-25D con el par de cebadores HIS3UP/HIS3DN) para dar el haploide His+ MXY25. Los haploides MXY18 y MXY22 son derivados recesivos resistentes a la cicloheximida (cyh2R) de D184-1B y D184-1C, respectivamente, seleccionados sobre 10 µg/ml de cicloheximida; la 5 presencia de mapas de mutaciones para el locus CYH2 que confieren resistencia a la cicloheximida se confirmó mediante la secuenciación (alteraciones de dos nucleótidos diferentes dan como resultado un cambio de glutamina 38 a lisina) y análisis de segregación. Los MXY18 y MXY25 se cruzaron para obtener el diploide MXY29; los MXY13 y MXY22 se cruzaron para obtener el diploide MXY33. Los segregantes 10 haploides MXY29-6D y MXY33-8C se cruzaron para obtener MXY38, que es heterocigótico para los marcadores leu2-3, 112 y his3-11, 15 y homocigótico para la mutación cyh2R. El MXY38 se transformó con la casete msh2::KanMX amplificada por PCR a partir de RBT348 (un presente de R. Borts, University of Leicester) con los cebadores MSH2UP y MSH2DN para dar MXY47. Se seleccionaron los

15 transformantes sobre G418 a 200 µg/ml (Invitrogen) y se confirmaron mediante PCR de las colonias (véase más adelante) con los cebadores MSH2A1, MSH2A2, MSH2A3 y MSH2A4 y mediante análisis de las tétradas, esto es análisis de las cuatro esporas, para confirmar la segregación de marcadores.

20 Tabla 1. Cepas haploides de levaduras

Nombre

Genotipo Fuente o derivación

D184-1B

a ura3-1 trp1-1 can1-100 his3-11, 15 leu2-3, 112 ade2-1 S. Gangloff

D184-1C

alfa ura3-1 trp1-1 can1-100 hrs3-911,15 leu2-3,112 ade2-1 S. Gangloff

U474

alfa ura3-1 trp1-1 can1-100hrs3-11,15 ade21 S. Gangloff

ORD436925D

MXY13

a ura3-1 trp1-1 can1-100 his3-11,15 ade2-1 D184-1B transformada con el producto de PCR LEU2

MXY18

a ura3 -1 trp1-1 can1-100 cyh2R his3-11, 15 leu2-3, 112 ade2-1 derivado D184-1B cyhR

Nombre

Genotipo Fuente o derivación

MXY22

alfa ura3-1 trp1-1 can1-100 cyh2R his3-11, 15 leu2-3, 112 ade2-1 derivado D184-1C cyhR

MXY25

alfa ura3-1 trp1-1 can1-100 leu2-3, 112 ade2-1 D184-1C transformado con el producto de PCR HIS3

MXY29-6D

alfa ura3-1 trp1-1 can1-100 cyh2R leu2-3, 112 ade2-1 segregante MXY29

MXY33-8C

a ura3-1 trp1-1 can1-100 cyh2R his3-11,15 ade2-1 segregante MXY33

MXY50-3D

alfa msh2::KanMX ura3-1 trp1-1 cyh2R can1-00 leu2-3, 112 ade2-1 BUD31::URA3CAN1 segregante MXY50

MXY50-7D

alfa ura3-1 trp1-1 cyh2R can1-100 his311,15 ade2-1 BUD31::URA3-CAN1 segregante MXY50

MXY51-2B

alfa msh2::KanMX ura3-1 trp1-1 cyh2R can1-100 his3-11, 15 ade2-1 BUD31::URA3-Oxa7-CAN1 segregante MXY51

MXY51-10C

alfa ura3-1 trp1-1 cyh2R can1-100 leu23,112 ade2-1 BUD31::URA3-Oxa7-CAN1 segregante MXY51

MXY52-2A

alfa msh2:KanMX ura3-1 trp1-1 cyh2R can1-100 his3-11, 15 ade2-1 BUD31::URA3-Oxa11-CAN1 segregante MXY52

MXY52-7D

alfa ura3-1 trp1-1 cyh2R can1-100 leu23,112 ade2-1 BUD31::URA3-Oxa11-CAN1 segregante MXY52

MXY53-11C

a ura3-1 trp1-1 cyh2R can1-100 leu2-3,112 ade2-1 BUD31::TRP1-CYH2 segregante MXY53

MXY53-11 D

a msh2::KanMX ura3-1 trp1-1 can1-100 cyh2R his3-11,15 ade2-1 BUD31::TRP1CYH2 segregante MXY53

MXY55-1C

a msh2::KanMX ura3-1 trp1-1 can1-100 cyh2R his3-11,15 ade2-1 BUD31::TRP1Oxa11-CYH2 segregante MXY55

Nombre

Genotipo Fuente o derivación

MXY55-2B

a ura3-1 trp1-1 can1-100 cyh2R his3-11,15 ade2-1 BUD31::TRP1-Oxa11-CYH2 segregante MXY55

MXY55-13D

a msh2::KanMX ura3-1 trp1-1 can1-100 cyh2R leu2-3,112 ade2-1 BUD31::TRP1Oxa11-CYH2 segregante MXY55

MXY79-3B

alfa ura3-1 trp1-1 can1-100 cyh2R his311,15 leu2-3,112 ade2-1 BUD31::URA3Oxa5-CAN1 segregante MXY79

MXY79-9A

alfa msh2::Kan MX ura3-1 trp1-1 can1-100 cyh2R leu 2-3,112 ade2-1 BUD31::URA3Oxa5-CAN1 segregante MXY79

RBT348

alfa msh2::KanMX ura3 cyhR met13-4 lys2d R. Borts

Tabla 2. Cepas diploides de levaduras.

Nombre

Genotipo Fuente o derivación

MXY29

a/alfa ura3-1/" trp1-1/" cyh2R/CYH2 can1100/" his3-11,15/HIS3 leu2-3, 112/" ade2-1/" MXY18 x MXY25

MXY33

a/alfa ura3-1/" trp1-1/" cyh2R/CYH2 can1100/" his3-11,15/" leu2-3,112/LEU2 ade2-1/" MXY22 x MXY13

MXY38

a/alfa ura3-1/" trp1-1/" cyh2R/" can1-100/" his3-11,15/HIS3 leu2-3,112/LEU2 ade2-1/" MXY33-8C x MXY296D

MXY47

a/alfa msh2::KanMX/MSH2 ura3-1/" trp1-1/" cyh2R/" can1-100/" his3-11,15/HIS3 leu2-3, 112/LEU2 ade2-1/" MXY38 transformado con el producto de PCR msh2::KanMX

MXY50

a/alfa msh2::KanMX/MSH2 ura3-1/" trp1-1/" cyh2R/" can1-100/" his3-11,15/HIS3 leu2-3, 112/LEU2 ade2-1/" BUD31::URA3CAN1/BUD31 MXY47 transformado con pMXY9 digerido con Not1

Nombre

Genotipo Fuente o derivación

MXY51

a/alfa msh2::KanMX/MSH2 ura3-1/" trp1-1/" cyh2R/" can1-100/" his3-11,15/HIS3 leu2-3, 112/LEU2 ade2-1/" BUD31::URA3-Oxa7CAN1/BUD31 MXY47 transformado con pMXY13 digerido con Not1

MXY52

a/alfa msh2::KanMX/MSH2 ura3/" trp1-1/" cyh2R/" can1-100/" his3-11,15/HIS3 leu2-3, 112/LEU2 ade2-1/" BUD31::URA3-Oxa11CAN1/BUD31 MXY47 transformado con pMXY14 digerido con Not1

MXY53

a/alfa msh2::KanMX/MSH2 ura3-1/" trp1-1/" cyh2R/" can1-100/" his3-11,15/HIS3 leu2-3, 112/LEU2 ade2-1/" BUD31:: TRP1CYH2/BUD31 MXY47 transformado con pMXY12 digerido con Not1

MXY55

a/alfa msh2::KanMX/" MSH2 ura3-1/" trp1-1/" cyh2R/"can1-100/" his3-11,15/HIS3 /eu2-3, 112/LEU2 ade2-1/" BUD31::TRP1-Oxa11CYH2/BUD31 MXY47 transformado con pMXY22 digerido con Not1

MXY57

a/alfa msh2::KanMX/" ura3-1/" trp1-1/" cyh2R/" can1-100/" his3-11,15/HIS3 leu23,112/LEU2 ade2-1/" BUD31::TRP1CYH2/BUD31::URA3-CAN1 MXY50-3D x MXY5311D

MXY59

a/alfa ura3-1/" trp1-1/" cyh2R/" can1-100/" his3-11,15/HIS3 leu2-3,112/LEU2 ade2-1/" BUD31::TRP1-CYH2/ BUD31::URA3-CAN1 MXY50-7D x MXY5311C

MXY60

a/alfa ura3-1/" trp1-1/" cyh2R/" can1-100/" his3-11,15/HIS3 leu2-3,112/LEU2 ade2-1/" BUD31::TRP1-Oxa11-CYH2/BUD31::URA3Oxa11-CAN1 MXY52-7D x MXY55-2B

MXY62

a/alfa msh2::KanMX/" ura3-1/" trp1-1/" cyh2R/" can1-100/" his3-11,15/HIS3 leu23,112/LEU2 ade2-1/" BUD31::TRP1-Oxa11CYH2/BUD31::URA3-Oxa11-CAN1 MXY52-2A x MXY55-1C

Nombre

Genotipo Fuente o derivación

MXY64

a/alfa ura3-1/" trp1-1/" cyh2R/" can1-100/" his3-11,15/HIS3 leu2-3,112/LEU2 ade2-1/" BUD31::URA3-Oxa7-CAN1/BUD31::TRP1Oxa11-CYH2 MXY51-10C x MXY552B

MXY66

a/alfa msh2::KanMX/" ura3-1/" trp1-1/" cyh2R/" can1-100/" his3-11,15/HIS3 leu23,112/LEU2 ade2-1/" BUD31::TRP1-Oxa11CYH2/BUD31::URA3-Oxa7-CAN1 MXY51-2B x MXY5513D

MXY79

a/alfa msh2::KanMX/MSH2 ura3-1/" trp1-1/" cyh2R/" can1-100/" his3-11,15/HIS3 leu23,112/LEU2 ade2-1/" BUD31::URA3-Oxa5CAN1/BUD31 MXY47 transformado con pMXY24 digerido con Not1

MXY99

a/alfa ura3-1/" trp1-1/" cyh2R/" can1-100/" his3-11,15/" leu2-3,112/LEU2 ade21/" BUD31::URA3-Oxa5-CAN1/BUD31::TRP1Oxa11-CAN1 MXY79-3B x MXY55-2B

MXY102

a/alfa msh2::KanMX/" ura3-1/" trp1-1/" cyh2R/" can1-100/can1 his3-11,15/HIS3 leu23,112/LEU2 ade2-1/" BUD31::URA3-Oxa5CAN1/BUD31::TRP1-Oxa11-CAN1 MXY79-9A x MXY55-1C

1.3 Construcción de plásmidos Se utilizaron las cepas bacterianas XL1-Blue MRF'(�mcrA)183(mcrCBhsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac [F' proAB lac/qZ�M15

5 Tn10 (Tetr)]) y JM110 (rpsL [Strr] thr leu thi-1 lacY galK galt ara tonA tsx dam dcm supE44 �[lac-proAB] [F' traD36 proAB laclqZ�M15]) como hospedantes para clonación. Se utilizaron métodos estándar para la construcción de plásmidos (Ausubel et al.). Todos los plásmidos utilizados o creados en este estudio se listan en la Tabla 3. Las enzimas de restricción, T4 ADN-ligasa y otras enzimas usadas en clonación se

10 compraron de New England BioLabs. Los fragmentos de ADN y los plásmidos se purificaron usando kits suministrados por Qiagen y Macherey-Nagel.

Las secuencias aguas arriba ("dirección 5' ") que corresponden al locus BUD31 se amplificaron mediante PCR preparatoria a partir de ADN genómico de W303 con el par de cebadores KNS3/KNS4 y se clonaron como un fragmento Kpn1/Xho1 en pKSII(+) digerido por Kpn1/Xho1 (Stratagene) para crear pMXY1; las secuencias de acceso aguas abajo ("dirección 3' ") se amplificaron similarmente con el par de cebadores KNS1/KNS2 y se clonaron como un fragmento Xba1/Not1 en pKSII(+) digerido por Xba1/Not1 (Stratagene) para crear pMXY2. El marcador TRP1 se escindió de pJH53 (un presente de R. Borts) como un fragmento BglII/EcoRI y se ligó a pMXY1 digerido por BamHI/EcoRI para crear pMXY3, y el marcador URA3 se escindió de pRED316 digerido por XhoI/HinDIII (un presente de R. Borts) y se ligó a pMXY1 digerido por XhoI/HinDIII para crear pMXY4. El marcador CAN1 se aisló de pRED316 como un fragmento Sma1 y se ligó a pMXY2 digerido por Hpa1 para crear pMXY5. Las secuencias de acceso 5' en pMXY3 y pMXY4 se reemplazaron con secuencias reamplificadas a partir del ADN genómico con el par de cebadores KNS4/KNS6 y se ligaron como fragmentos Kpn1/Xho1 a los respectivos plásmidos digeridos con Kpn1/Xho1 para producir pMXY7 y pMXY6. Esta etapa se realizó para corregir la ausencia en el cebador KNS3 de los sitios de restricción requeridos en las últimas fases de clonación. El fragmento KpnI-SmaI de pMXY6 que contiene la dirección 5' y el marcador URA3 se ligaron a pMXY5 digerido con KpnI/SmaI para producir el vector pMXY9 de la casete de recombinación URA3-CAN1. El fragmento KpnI/SpeI de pMXY7 que contiene la dirección 5' y el marcador TRP1 se ligaron a pMXY2 digerido con KpnI/SpeI para producir pMXY11. Finalmente, se amplificó el marcador CYH2 mediante PCR preparatoria a partir del ADN genómico de W303 con el par de cebadores KNS17/KNS18, se digirió con BamHI y PvuI, y se ligó a pMXY11 digerido con BglII/PacI para crear el vector pMXY12 de la casete de recombinación TRP1CYH2. Todas las construcciones de plásmidos se introdujeron en hospedantes bacterianos por electroporación y se verificaron por análisis de restricción, y pMXY9 y pMXY12 se verificaron además por secuenciación de todas las uniones de clonación.

Los sustratos de recombinación de B-lactamasa se amplificaron por PCR preparatoria a partir de plásmidos hospedantes (proporcionados por W. Schoenfeld) utilizando los pares de cebadores KNS36/KNS37 para Oxa5 (acceso X58272), KNS7/KNS8 para Oxa7 (acceso X75562), y KNS9/KNS10 para Oxa11 (acceso Z22590). Los productos de PCR Oxa7 y Oxa11 se digirieron con PacI y se ligaron a pMXY9 digerido con SmaI/PacI para crear pMXY13 y pMXY14, respectivamente, y el producto de PCR Oxa11 se digirió también con Spel y PacI y se ligó a pMXY12 digerido con SpeI/PacI para crear pMXY22. Los productos de PCR Oxa5 se digirieron con BamHI y PacI y se ligaron a pMXY9 digerido con BglII/PacI para crear pMXY24. Todas las construcciones se verificaron por análisis de restricción.

Tabla 3. Plásmidos

Nombre

Descripción o inserto Fuente

pKSII (+)

Vector parental Stratagene

pRED316

Fuente URA3 y CAN1 R. Borts

pJH53

Fuente TRP1 R. Borts

pMXY1

dirección 5' Este trabajo

pMXY2

dirección 3' Este trabajo

pMXY3

dirección 5'-TRP1 Este trabajo

pMXY4

dirección 5'-URA3 Este trabajo

pMXY5

CAN1-dirección 3' Este trabajo

pMXY6

dirección 5'-URA3 Este trabajo

pMXY7

dirección 5'-TRP1 Este trabajo

pMXY9

dirección 5'-URA3-CAN1-dirección 3' Este trabajo

pMXY11

dirección 5'-TRP1-dirección 3' Este trabajo

pMXY12

dirección 5'-TRP1-CYH2-dirección 3' Este trabajo

pMXY13

dirección 5'-URA3-Oxa7-CAN1-dirección 3' Este trabajo

pMXY14

dirección 5'-URA3-Oxa11-CAN1-dirección 3' Este trabajo

pMXY22

dirección 5'-TRP1-Oxa11-CYH2-dirección 3' Este trabajo

pMXY24

dirección 5'-URA3-Oxa5-CAN1-dirección 3' Este trabajo

1.4 Selección recombinante y caracterización Para el primer ciclo de recombinación, los plásmidos que llevan casetes de recombinación se digirieron con Not1 y los productos de la digestión total se usaron

10 para transformar MXY47. Se seleccionaron prototrofos para el uracilo (para los derivados pMXY9) o para el triptófano (para los derivados pMXY12), y la selección de una de las dos copias cromosómicas del locus BUD31-HCM1 mediante la construcción introducida se confirmó por la PCR de las colonias utilizando los cebadores KNS12/KNS13/KNS15 para los derivados URA3-CAN1 y los cebadores KNS12/KNS13/KNS14 para los derivados TRP1-CYH2, lo que permite que sean amplificados fragmentos procedentes de los loci BUD31-HCM1 intactos y de los deteriorados. Los heterozigotos transformados se esporularon y se realizó el análisis de las tétradas para identificar los haploides de tipo natural o de tipo msh2 que llevan casetes de recombinación. Los haploides apropiados de tipo de apareamiento opuesto se sometieron a réplica en placa YPD, se dejaron crecer durante la noche, se mezclaron juntos en la misma placa YPD y se dejaron aparear durante la noche. La placa de apareamiento fue sometida a réplica en placa en medio -Ura-Trp para seleccionar diploides, que fueron inoculados al día siguiente a granel en SPS más suplementos y cultivados durante la noche. El precultivo se centrifugó y se lavó, y las células se resuspendieron en acetato de K al 1 % más suplementos y se incubaron durante dos días.

Se recolectaron las células esporuladas, se cuantificaron, y en algunos casos se diseccionaron para confirmar la segregación apropiada de todos los marcadores. Se digirieron los asci con zimoliasa-20T (ICN Biomedicals) para liberar las esporas, se sonicó la suspensión de esporas (Branson Model 250 Digital Sonifier), y se pusieron en placas de YPD diluciones apropiadas para determinar la viabilidad de las células, en medios sin uracilo que contienen 60 ug/ml de canavanina (Sigma) para seleccionar los recombinantes Ura+CanR, y en medios sin triptófano que contienen 3 ug/ml de cicloheximida (Sigma) para seleccionar los recombinantes Trp+CyhR. Se contaron las colonias de esporas que surgen en cada medio y se sometieron a ensayos fenotípicos y moleculares para determinar si representan o no verdaderos recombinantes. Para el análisis fenotípico, un número representativo de recombinantes candidatos se reextendió en el mismo medio usado para la selección y después se sometieron a réplica en placa para -Ura, -Trp, cicloheximida (10 µg/ml), canavanina (60 µg/ml), y placas de ensayo de tipo apareamiento.

Las esporas se pusieron también en placas sobre medios -Ura-Trp para determinar la frecuencia de diploides por cada preparación de esporas, que en todos los casos fue inferior al 4 % del total de células viables. Para el análisis molecular, el ADN genómico total se sometió a PCR analítica (véase más adelante) usando pares de cebadores apropiados que amplifican específicamente fragmentos parentales o recombinantes. Las frecuencias de recombinación para una selección dada se expresan como la frecuencia de células viables sobre un medio de selección dado, corregida en cuanto a la presencia de no recombinantes que presenten un falso fenotipo positivo. En la mayor parte de los casos, dichos falsos positivos surgen por inactivación mutacional del marcador CAN1 o CYH2, como se da a entender por la PCR analítica.

Para el segundo ciclo de recombinación, se aparearon los recombinantes apropiados derivados del primer ciclo de recombinación y se seleccionaron diploides Ura+Trp+. Se siguió el mismo procedimiento de esporulación que para el primer ciclo de recombinación, excepto que las esporas se pusieron en placas de YPD, en medios sin uracilo que contienen cicloheximida para seleccionar los recombinantes Ura+CyhR, y en medios sin triptófano que contienen canavanina para seleccionar los recombinantes Trp+CanR. Los recombinantes candidatos se sometieron de forma similar a análisis fenotípico y molecular.

1.5 Métodos moleculares

El ADN genómico usado como plantilla para la PCR preparatoria o analítica se preparó a partir de cultivos YPD durante la noche mediante un procedimiento estándar miniprep de acuerdo con Ausubel et al. La PCR preparatoria de los fragmentos usados en la clonación o para la secuenciación se realizó con el ADN plasmídico Oxa (aproximadamente 50 pg) o el ADN genómico de levaduras (aproximadamente 0,5 µg) como una plantilla en reacciones de 50 µl que contienen 2,5 U de polimerasa Herculasa (Stratagene), 1x tampón de reacción de Herculasa, concentración 0,2 mM de cada dNTP y 100 ng de cada cebador. Se realizó la amplificación como sigue: 94 º C 2 min; 30 ciclos de 94 ºC 10 s, 55 ºC 30 s, 72 ºC 30 s; 68 ºC 10 min. Se empleó un procedimiento modificado de PCR de colonias para confirmar la integración de casetes de recombinación en el locus BUD31 (http://www.fhcrc.org/labs/hahn/methods/mol bio meth/pcr yeast colony.html), con las siguientes condiciones de amplificación: 95 ºC 5 min; 35 ciclos de 95 ºC 1 min, 55 ºC 1 min, 68 ºC 1 min; 72 ºC 10 min. Se llevó a cabo la PCR analítica para caracterizar los insertos Oxa en volúmenes de reacción de 100 µl que contienen aproximadamente 0,5 µg de ADN genómico preparado a partir de recombinantes candidatos y cepas de control, 1,5 U de polimerasa Taq (Roche), 1 x de tampón de reacción, concentración 0,2 mM de cada dNTP y 100 ng de cada cebador, con las mismas condiciones de amplificación que para la PCR de colonias, excepto que la extensión se realizó a 68 ºC durante 2 min. Todas las reacciones de amplificación se llevaron a cabo con un Mastercycler gradiente 5331 (Eppendorf).

Para el análisis de secuencias de los insertos recombinantes Oxa, se realizó la PCR preparatoria con los pares de cebadores KNS16/KNS29 (para los recombinantes Ura+CanR) o KNS11/KNS28 (para Trp+CyhR), seguida por purificación con el kit de PCR Qiaquick (Qiagen). Los productos de la PCR fueron secuenciados por Genome Express (Meylan, FR) con los cebadores KNS30, KNS31, KNS33 o KNS38, según fue apropiado. Se alinearon las secuencias recombinantes y se analizaron utilizando Clone Manager software (Sci Ed Central). Los oligonucleótidos usados en la PCR y en la secuenciación (Tabla 3) se adquirieron de Proligo France.

2. Resultados 2.1 Desarrollo de un sistema de recombinación homeóloga meiótica de levaduras

Se ha desarrollado una estrategia que hace uso de la levadura Saccharomyces cerevisiae para promocionar la recombinación in vivo entre secuencias de ADN separadas. Las características físicas de la estrategia incluyen el uso de células meióticas, en las que tienen lugar altos niveles de recombinación amplia de genoma, y la inactivación del sistema de reparación del apareamiento erróneo (MMR), que normalmente restringe la recombinación entre secuencias separadas. Las secuencias a ser recombinadas, esto es los sustratos de recombinación, se introducen en uno de los dos vectores que también lleva secuencias marcadoras flanqueantes, para crear de este modo casetes de recombinación. Se introducen las casetes de recombinación en el genoma de las levaduras, en un locus sobre el cromosoma III (el intervalo BUD31-HCM1), que está en una región que se sabe que es recombinacionalmente activa en la meiosis. Los diploides heterocigóticos para casetes de recombinación forman esporas, y las esporas se ponen en placas en medios que seleccionan las células con configuraciones específicas de marcadores flanqueantes, con lo que permiten la selección de recombinantes en los que ha tenido lugar un cruzamiento que implica sustratos de recombinación (Figura 1).

Se construyeron dos vectores generales de casete de recombinación, pMXY9 y pMXY12, que contienen los marcadores URA3 y CAN1, y los marcadores TRP1 y CYH2, respectivamente, que flanquean los sitios de restricción que se pueden usar para la introducción de sustratos de recombinación (Figura 2). El marcador URA3 confiere prototrofía para el uracilo, y el marcador CAN1 confiere sensibilidad para la canavanina. En ausencia de este marcador, las células son resistentes al fármaco. El marcador TRP1 confiere prototrofía para el triptófano y el marcador CYH2 confiere sensibilidad para la cicloheximida. En ausencia de este marcador, las células son resistentes al fármaco. Cada una de las dos casetes de recombinación está flanqueada a su vez por secuencias que permiten dirigir el inserto completo hacia el locus BUD31-HCM1 mediante la transformación de células competentes (Figura 2). Se construyó también una cepa que sirve como hospedante primario para la transformación, MXY47 (Tabla 2). Este diploide es heterocigótico para la mutación msh2::KanMX, y es de tipo fenotípicamente natural con respecto a la MMR. Es también homocigótico para los marcadores ura3-1, trp1-1, can1-100 y cyh2R, lo que permite la presencia de marcadores de la casete de recombinación a ser monitorizados, y heterocigótico para los marcadores his3-11,15 y leu2-3,112. La MXY47 se transforma con fragmentos que llevan casetes de recombinación, se seleccionan los transformantes primarios como prototrofos Ura+ o Trp+ (para los derivados MXY9 y MXY12, respectivamente), y el objetivo se confirma por PCR analítica utilizando cebadores que reconocen las secuencias internas y externas para la construcción introducida. Los transformantes primarios forman esporas, y se diseccionan las tétradas y se someten a la técnica de réplica en placa para identificar segregantes de tipo natural o de tipo msh2 que llevan la casete de recombinación. Los haploides adecuados se aparean uno con otro para generar diploides MSH2/MSH2 (tipo natural) y msh2/msh2 heterocigóticos para los sustratos de recombinación. En un primer ciclo de recombinación meiótica para generar recombinantes, estos diploides forman esporas, y las esporas libres se ponen en placas en medios que carecen de uracilo y que contienen canavanina para seleccionar los recombinantes con la configuración URA3-CYH2 de marcadores flanqueantes (colonias de esporas Ura+CanR), o en medios que carecen de triptófano y que contienen cicloheximida para seleccionar la configuración TRP1-CAN1 (colonias de esporas Trp+CyhR). Los diploides parentales y la progenie de haploides no recombinantes no pueden crecer en estos medios. Se determina la frecuencia de colonias de esporas que surgen en medios selectivos, las colonias de esporas recombinantes candidatos se caracterizan fenotípicamente por el método de réplica en placa sobre medios de ensayo y molecularmente por la PCR con pares apropiados de cebadores, y se selecciona para secuenciación una muestra de los recombinantes confirmados.

La estrategia es iterativa porque las células que llevan insertos recombinantes se pueden identificar y someter a ciclos adicionales de recombinación meiótica para aumentar la diversidad. En un segundo ciclo, los haploides Ura+CanR y Trp+CyhR se aparean, y el procedimiento de esporulación y selección se repite, excepto que se seleccionan nuevos recombinantes en medios que carecen de uracilo y que contienen cicloheximida, para seleccionar recombinantes con la configuración URA3-CAN1 de marcadores flanqueantes (colonias de esporas Ura+CyhR), o en medios que carecen de triptófano y que contienen canavanina para seleccionar la configuración TRP1CYH2 (colonias de esporas Trp+CanR). La estrategia detallada en esta memoria se puede modificar también para incluir marcadores adicionales para aumentar la rigurosidad de la selección. Además, también se pueden seleccionar directamente recombinantes mediante la PCR usando cebadores específicos para las secuencias flanqueantes.

2.2 Selección fenotípica para recombinación entre pares de genes Oxa de divergencia de secuencia variable

Los genes que pertenecen a la superfamilia Oxa de beta-lactamasas se escogieron como sustratos para ensayar la viabilidad del sistema para la selección de recombinantes. Se evaluó la recombinación entre los siguientes pares Oxa en los fondos de tipo natural y de tipo msh2: Oxa11-Oxa11, que comparten el 100 % de homología a lo largo de los 800 bp de ORF; Oxa7-Oxa11, 95 %; Oxa5-Oxa11, 78 %. Los diploides generados por cruzamientos entre haploides apropiados fueron inducidos para entrar en meiosis. Se prepararon esporas a partir de cultivos meióticos, y diluciones seriadas se pusieron en placas de YPD para determinar la viabilidad de las células y en medio que carece de uracilo y que contiene canavanina (-Ura+Can) y en medio que carece de triptófano y que contiene cicloheximida (-Trp+Cyh) para seleccionar los recombinantes.

2.3 Frecuencias de recombinación entre genes Oxa de homología de secuencia variable

Los datos mostrados en la Figura 3 demuestran que en el fondo de tipo natural, el aumento de la heterología de secuencia tiene un fuerte efecto inhibidor sobre la recombinación de entrecruzamiento, y que este efecto es aliviado pero no abolido por la mutación msh2. En general, la mutación msh2 causa un aumento en la frecuencia de recombinación de aproximadamente un orden de magnitud por encima del observado para las cepas de tipo natural en los dos niveles de divergencia ensayados. Sin embargo, la inactivación de MSH2 solo no compensa completamente la inhibición de la recombinación entre sustratos de recombinación con más altos grados de heterología. Por ejemplo, las frecuencias de recombinación para una cepa msh2 con insertos Oxa que comparten 78 % de homología (MXY102) están al menos 10 veces (Ura+CanR) y 25 veces (Trp+CyhR) por debajo de las encontradas para una cepa de tipo natural con insertos Oxa de 100 % de homología (MXY60), lo que indica que hay otros factores aparte de la reparación del apareamiento erróneo dependiente de MSH2 que previenen la recombinación de cruzamiento entre secuencias con mayor divergencia. Es de notar que la apariencia de los recombinantes msh2 al nivel del 78 % de divergencia, a frecuencias de aproximadamente 2 x 10-4, indica que se puede conseguir la recombinación incluso entre sustratos aún más divergentes.

2.4 El efecto de hiper-recombinación de msh2

El efecto de msh2 sobre la recombinación homóloga y homeóloga se cuantificó calculando en primer lugar la relación de recombinantes msh2 a recombinantes de tipo natural para un porcentaje dado de homología para una selección dada para cada experimento, y calculando después las medias y las desviaciones típicas del conjunto de relaciones determinadas de este modo. Los datos se muestran en la Figura 4. La presencia de la mutación msh2 aumenta la frecuencia de la recombinación homeóloga para secuencias de 95 % y 78 % de homología, y hay una mejora de la recombinación menos pronunciada pero todavía cuantificable entre secuencias 100 % idénticas. Además, la extensión de la mejora de la recombinación homeóloga por msh2 difiere para las dos selecciones: para cepas con insertos Oxa homeólogos, la inactivación de MSH2 aumenta la frecuencia de recombinantes Trp+CyhR en mayor medida que aumenta la frecuencia de recombinantes Ura+CanR. En principio, las frecuencias de ambos tipos de recombinantes (Ura+CanR y Trp+CyhR) deberían ser equivalentes, pero estos números indican que hay sesgos en el sistema que son provocados o mejorados por la mutación msh2, conjuntamente con variaciones en la extensión de la divergencia de secuencias. Los experimentos para ensayar las influencias relativas de los insertos y las secuencias marcadoras flanqueantes sobre los tipos de recombinantes obtenidos indican que este sesgo es una propiedad de los marcadores flanqueantes pero la influencia de los sustratos de recombinación en la dirección de los resultados de los sucesos de recombinación meiótica todavía no puede ser explicada (no se muestran los datos).

2.5 Análisis por PCR de recombinantes seleccionados

En la Figura 5 se muestra un ejemplo de análisis por PCR, como se aplica a las colonias de esporas Ura+CanR y Trp+CyhR derivadas de diploides de tipo natural y de tipo msh2 que contienen genes Oxa con 22 % de divergencia (MXY99 y MXY102, respectivamente). Para cada cepa, se analizaron diez colonias de esporas que presentaban cada fenotipo recombinante. Se usaron extractos de cada colonia como plantillas para amplificación con pares de cebadores que amplifican específicamente las moléculas parentales y con pares de cebadores que amplifican específicamente las moléculas recombinantes. En todos los casos, se amplificó solamente el inserto recombinante previsto, lo que indica que las colonias de esporas seleccionadas contenían secuencias producidas por la recombinación entre los sustratos de recombinación Oxa parentales. Estos resultados demuestran también que las moléculas recombinantes se pueden recuperar directamente a partir de los cultivos esporulados, incluso sin la imposición de una etapa de selección genética. Aquí, los sitios de reconocimiento del cebador localizados en los genes UPA3, CAN1, TRP1 y CYH2 representan secuencias marcadoras moleculares que flanquean cada sustrato de recombinación.

2.6 Análisis de secuencia del primer ciclo de recombinantes homeólogos meióticos: 5 % y 22 % de divergencia

Los recombinantes meióticos Oxa7-Oxa11 derivados de diploides de tipo natural y de tipo msh2 (MXY64 y MXY66, respectivamente), que contienen sustratos de recombinación que comparten 95 % de homología, que satisfacían los ensayos fenotípico y molecular (PCR) fueron sometidos a análisis de secuencia. Los fragmentos recombinantes se amplificaron con cebadores específicos para los marcadores flanqueantes y se secuenciaron usando cebadores próximos a los sitios de inicio y parada de la traducción. En total, se analizaron 55 secuencias recombinantes derivadas de la progenie haploide de los diploides Oxa7-Oxa 11: 14 recombinantes Ura+CanR y 13 recombinantes Trp+CyhR procedentes de MXY64, y 14 recombinantes Ura+CanR y 14 recombinantes Trp+CyhR procedentes de MXY66. El tamaño de la muestra secuenciada permite que se hagan varias observaciones. 1) Para ambos recombinantes, los de tipo natural y los de tipo msh2, la posición en la que tuvo lugar el cruzamiento se extendió a lo largo de toda la región codificante, con ninguna preferencia aparente por un intervalo específico. Los cruzamientos que tuvieron lugar en la región 5' fueron similares a los de la región 3'. También, para una cepa dada, no hubo ninguna diferencia aparente en las distribuciones de los sitios de cruzamiento para las colonias de esporas obtenidas por la selección -Ura+Can o por la selección -Trp+Cyh. 2) La longitud de la homología no interrumpida en el intervalo de cruzamiento tampoco tuvo importancia: se detectaron cruzamientos entre dos polimorfismos muy poco espaciados (posiciones 543-552 para MXY66 Trp+CyhR #7, #8, y #13, donde la posición 1 representa el residuo de adenosina del sitio de iniciación de la traducción ATG) así como entre los dos polimorfismos más ampliamente espaciados (posiciones 163-265, p. ej. MXY66 Trp+CyhR #15). 3) Los insertos Oxa recombinantes aislados tanto de un fondo de tipo natural como de un fondo de tipo msh2 contenían secuencias recombinantes de longitud completa potencialmente capaces de codificar nuevas proteínas Oxa funcionales. Esto es, todos los cruzamientos se realizaron de tal manera como para conservar un ORF intacto, sin una inserción o deleción neta de nucleótidos en el intervalo de cruzamiento o en cualquier otro intervalo. 4) Aunque las estructuras de la mayor parte de secuencias recombinantes son concordantes con un cruzamiento simple entre las dos secuencias Oxa en regiones locales de homología, varios recombinantes aislados en el fondo msh2 presentaron una mayor complejidad. Las secuencias derivadas de cuatro recombinantes (MXY66 Ura+CanR #16 y #31, y MXY66 Trp+CyhR #5 y #9) presentaron un mayor grado de mosaicismo, ya que fueron producidos por más de un suceso de cruzamiento. De hecho, el análisis de dos de estos recombinantes fue complicado porque la inspección de los electroferogramas reveló la presencia de dos picos solapantes en múltiples sitios dentro de la región secuenciada, correspondiendo cada sitio a un polimorfismo Oxa 7-Oxa11. Esta observación indica que la población de moléculas que fue secuenciada era heterogénea, para lo cual la explicación más probable es la presencia de ADN heterodúplex no reparado o parcialmente reparado presente en esporas recombinantes msh2. Esta interpretación concuerda con el aumento conocido de la frecuencia de segregación post-meiótica (PMS) causada por la mutación msh2. En estos dos casos, MXY66 Ura+CanR #16 y #31, uno o más sitios reparados fueron flanqueados por tramos de heterodúplex no reparados, lo que es concordante con el desenmascaramiento de una actividad de reparación de tramos muy cortos del apareamiento erróneo en el fondo msh2, como sugieren Coïc, Gluck and Fabre (EMBO J. 19:3408). Se observaron también otros casos diversos de PMS no asociada con la reparación de tramos muy cortos del apareamiento erróneo para las secuencias recombinantes de msh2, lo que indica que esta reparación alternativa del sistema de apareamiento erróneo no puede ser muy eficiente en la corrección de apareamientos erróneos en ADN heterodúplex. Juzgando a partir de los electroferogramas de secuencias, la extensión de los heterodúplex no corregidos varió, desde una región corta de aproximadamente 50 nucleótidos (nt) hasta una región que casi cubre el ORF total. No se encontraron signos de PMS ni de reparación de tramos muy cortos del apareamiento erróneo para las secuencias recombinantes de tipo natural. En conjunto, estos hallazgos dan a entender que el grado de diversidad creada es mayor en la meiosis de tipo msh2 que en la meiosis de tipo natural.

Los recombinantes meióticos se derivaron también de diploides de tipo natural y de tipo msh2 que contienen sustratos de recombinación que comparten el 78 % de homología, (MXY99 y MXY102, respectivamente). En total, se analizaron 24 secuencias recombinantes derivadas de la progenie recombinante de los diploides Oxa5-Oxa 11: cinco recombinantes Ura+CanR y tres recombinantes Trp+CyhR procedentes de MXY99, y nueve recombinantes Ura+CanR y siete recombinantes Trp+CyhR procedentes de MXY102. La inspección de estas secuencias sugiere varias tendencias. 1) Las secuencias recombinantes Oxa obtenidas en ambas cepas, de tipo natural y de tipo msh2, mediante selección en -Trp+CyhR presentaron cruzamientos en diferentes posiciones a lo largo del ORF, quizá con una ligera tendencia hacia la región media de 250 bp (nt 333-nt 573) de homología total compartida. En contraste, los recombinantes obtenidos en ambas cepas, de tipo natural y de tipo msh2, mediante selección en -Ura+CanR presentaron un sesgo pronunciado en las posiciones de los cruzamientos: en 3 de 5 secuencias de tipo natural y en 8 de 9 secuencias de tipo msh2, los cruzamientos tuvieron lugar dentro de los últimos 80 nucleótidos (nt) de la región de homología compartida, esto es, el último 10 % del ORF. 2) Los intervalos de homología absoluta en los que se identificaron cruzamientos variaron de 11 a 20 nt para la selección -Trp+Cyh, indicando una preferencia por estas regiones relativamente más grandes de identidad de secuencia. En contraste, los intervalos de cruzamiento fueron más cortos para la selección -Ura+Can, variando de 3 a 17 nt (13/14 de estos intervalos implicados de 13 nt y más cortos). 3) Como para la recombinación que implica secuencias que comparten 95 % de homología, las nuevas secuencias obtenidas también consisten en ORFs intactos y potencialmente codifican nuevas proteínas Oxa. 4) No se encontraron casos de PMS, como se juzga por la inspección de los electroferogramas, para los recombinantes de tipo natural, pero se encontraron tramos muy cortos de heterodúplex no reparados para algunos recombinantes msh2, incluyendo 3 de los 7 recombinantes Trp+CyhR. Estas regiones incluían como máximo 67 nt, más cortos que algunos de los tractos observados para los recombinantes Oxa7-Oxa11. En suma, estas observaciones indican que las secuencias recombinantes se pueden seleccionar a partir del aporte de sustratos de recombinación que varían al menos en un 22 %, y que estas secuencias codifican nuevas proteínas.

2.7 Análisis de secuencias de recombinantes Oxa7-Oxa11 de segundo ciclo

La capacidad del sistema de levaduras para aumentar la diversidad de secuencias de una manera iterativa se ensayó construyendo diploides procedentes de haploides recombinantes Oxa7-Oxa11 generados en un primer ciclo de meiosis y sometiendo estos nuevos diploides a un segundo ciclo de meiosis. Entre la progenie secuenciada Ura+CanR y Trp+CyhR de MXY64 y MXY66, se seleccionaron pares de recombinantes apropiados con cruzamientos en el mismo intervalo para construir nuevos diploides en los que el nivel global de homología de secuencia fue de nuevo 95 %. Se crearon tres diploides de tipo natural (MXY81, MXY82 y MXY83) y tres diploides de tipo msh2 (MXY86, MXY87 y MXY88). Se construyeron también diploides control de tipo natural y de tipo msh2 que contenían solamente insertos de secuencia Oxa11 a partir de la progenie recombinante apropiada de MXY60 y MXY62, dando MXY90 y MXY92. Estos diploides formaron esporas y las esporas se pusieron en placas en un medio que carece de uracilo y que contiene cicloheximida (-Ura+Cyh) y en un medio que carece de triptófano y que contiene canavanina (-Trp+Can) para seleccionar los recombinantes del segundo ciclo. Como se muestra en la Figura 6, las frecuencias de colonias de esporas -Ura+CyhR y Trp+CanR observadas para todas estas cepas son concordantes con el efecto anti-recombinación del gen MSH2. Se encontraron ambos tipos de colonias entre la progenie del homozigoto MXY90 de tipo natural a frecuencias por encima de 10-3, mientras que estas frecuencias disminuyeron de 5 a 10 veces entre la progenie de los diploides de tipo natural con heterología del inserto Oxa (MXY81, MXY82 y MXY83). La inactivación del gen MSH2 en los diploides con insertos Oxa divergentes (MXY 86, MXY 87, y MXY 88) lleva a un aumento de 2 a 6 veces en la frecuencia de colonias de esporas Ura+CyhR y Trp+CanR, similar a los niveles observados para un diploide msh2 que lleva idénticos insertos Oxa (MXY92). Aunque los medios usados difieren de los usados para la selección de los recombinantes del primer ciclo, las frecuencias a las que se seleccionaron los recombinantes de segundo ciclo de tipo natural y de tipo msh2 son comparables a las de los recombinantes del primer ciclo.

Se seleccionaron para secuenciación las colonias de esporas Ura+CyhR y Trp+CanR de ambos fondos, de tipo natural (MXY81 y MXY83) y de tipo msh2 (MXY86). En total, se secuenciaron 14 insertos Oxa de tipo natural y 7 insertos Oxa de

tipo msh2. En la mayor parte de los casos, tuvo lugar un cruzamiento en un nuevo intervalo durante la recombinación de segundo ciclo, de nuevo sin aparente sesgo con respecto a la posición o tamaño del intervalo: se encontraron cruzamientos que incluyen diferentes intervalos por todo el ORF Oxa y aparecieron en intervalos tan 5 grandes como de 101 nt y tan pequeños como de 5 nt. En un caso (un haploide MXY83 Trp+CyhR), un cruzamiento de segundo ciclo tuvo lugar en el intervalo del cruzamiento de primer ciclo, restaurando de este modo una secuencia completa Oxa11. Los recombinantes recuperados de los diploides msh2 fueron más diversos que los recuperados de las cepas de tipo natural. Para el diploide msh2, MXY86, se 10 observaron varias colonias de esporas que presentan PMS extensiva y mosaicismo de secuencia, concordante con la formación de largos tractos de heterodúplex en el intermedio recombinacional. Además, algunos apareamientos erróneos fueron reparados en el tracto heterodúplex, de nuevo de acuerdo con una actividad de reparación de tramos cortos del apareamiento erróneo. En suma, la recombinación de

15 segundo ciclo en el fondo de tipo msh2 es tan eficiente como la recombinación de primer ciclo, ambas cualitativamente, con respecto a generar diversidad de secuencias (p.ej., distribución del intervalo de cruzamiento e incidencia de PMS), y cuantitativamente, con respecto a aumentar la frecuencia global de recombinación homeóloga (5 % de divergencia).

20

LISTA DE SECUENCIAS

<110 > Mixis France S.A.

<120> Generación de genes recombinantes en Saccharomyces cerevisiae

<130> 18248

<140>

<141>

<160> 33

<170 > PatentIn Ver. 2.1

<210> 1

<211> 20

<212 > ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 1 agaactccag cactccgtat 20

<210> 2

<211> 20

<212 > ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 2 gagacctatc gccatcttca 20

<210> 3

<211> 20

<212 > ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 3 tcggttctta ctgccaagtg

20

<210> 4 <211> 20 <212 > ADN <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 4 gagtggcaag aacttgtagc

20

<210> 5 <211> 20 <212 > ADN <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 5 catgacgatg aggacatcac

20

<210> 6 <211> 20 <212 > ADN <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 6 cgttcggacc taacatctct

20

<210> 7 <211> 20 <212 > ADN <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 7 atgcttgatg gtcggaagag

20

<210> 8 <211> 20 <212 > ADN <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 8 tatgcctctt ccgaccatca

20

<210> 9 <211> 20 <212 > ADN <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 9 aggtcgcctg acgcatatac

20

<210> 10 <211> 20 <212 > ADN <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 10 tgaagaggag gtcgactacg

20

<210> 11 <211> 20 <212 > ADN <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 11 ccacctagcg gatgactctt

20

<210> 12 <211> 20

<212 > ADN <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 12 cgcctcgttc agaatgacac

20

<210> 13 <211> 45 <212 > ADN <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 13 acctctagat cttaattaag ttaacttacg gtgccctttg atcct

45

<210> 14 <211> 31 <212 > ADN <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 14 caagcggccg cagcgcatgt gtccgatctt t

31

<210> 15 <211> 39 <212 > ADN <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 15 caaggtacca gcggccgctg tgctgtctgc gctgcattc

39

<210> 16 <211> 28 <212 > ADN <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 16 acactcgagg caccgtaagg gaggagaa

28

<210> 17 <211> 39 <212 > ADN <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 17 caaggtacca gcggccgctg tgctgtctgc gctgcattc

39

<210> 18 <211> 36 <212 > ADN <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 18 acctctagac tagtcgaccc aaggaggtgc catgaa

36

<210> 19 <211> 35 <212 > ADN <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 19 accttaatta agtcgacctg cagcgaattg ttagc

35

<210> 20 <211> 31 <212 > ADN <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 20 accactagtc gacaccaaga aggtgccatg a

31

<210> 21 <211> 35 <212 > ADN <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 21 accttaatta agtcgacggt cacgatgctg tactt

35

<210> 22 <211> 20 <212 > ADN <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 22 tcattgcctt ctccactctc

20

<210> 23 <211> 20 <212 > ADN <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 23 caccagcgct ctagatacat

20

<210> 24 <211> 20 <212 > ADN <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 24 ggaccagaac tacctgtgaa

20

<210> 25 <211> 20 <212 > ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 25 gagtagcagc acgttcctta

20

<210> 26 <211> 41 <212 > ADN <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 26 ccaggatccc gggttaatta agttcccagg aaaccctttc g

41

<210> 27 <211> 28 <212 > ADN <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 27 caacgatcgg atctgccact ggtaactt

28

<210> 28 <211> 20 <212 > ADN <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 28 ttgtttgtgc acttgcctgc

20

<210> 29 <211> 20 <212 > ADN <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 29

aaagccgtat gactcaccca

20

<210> 30 <211> 20 <212 > ADN <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 30 gaaagggttt cctgggaact

20

<210> 31 <211> 37 <212 > ADN <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 31 cgcggatcca ctagtcgacc caccaaggta ccatgaa

37

<210> 32 <211> 35 <212 > ADN <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 32 accttaatta agtcgaccga gccttgagcg ccttg

35

<210> 33 <211> 20 <212 > ADN <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 33 tgagaagatg cggccagcaa

20

Claims (44)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para generar y detectar secuencias de ADN recombinante en Saccharomyces cerevisiae, que comprende las etapas de:

   a) generar en primer lugar células diploides de S. cerevisiae que llevan en un locus definido de su genoma una primera casete de recombinación (1) que comprende una primera secuencia de ADN a ser recombinada (A), que está flanqueada al menos por una primera y una segunda secuencias marcadoras y en una posición alélica una segunda casete de recombinación (2) que comprende una segunda secuencia de ADN a ser recombinada (B), que está flanqueada al menos por una tercera y una cuarta secuencias marcadoras,

   b) inducir la esporulación de las primeras células diploides obtenidas en a) y

   c) aislar las células haploides que contienen casetes de recombinación (3) en las que las primeras secuencias de ADN recombinadas (A/B) están flanqueadas al menos por la primera y la cuarta secuencias marcadoras, y las células haploides que contienen casetes de recombinación (4) en las que las segundas secuencias de ADN recombinadas (B/A) están flanqueadas al menos por la segunda y la tercera secuencias marcadoras.
2. 2. Un procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además las etapas de:

   a) generar segundas células diploides mediante el apareamiento de células haploides que contienen las primeras secuencias de ADN recombinadas (A/B) obtenidas en 1c) con las células haploides que contienen las segundas secuencias de ADN recombinadas (B/A) obtenidas en 1c),

   b) inducir la esporulación de las segundas células diploides obtenidas en a) y

   c) aislar las células haploides que contienen casetes de recombinación en las que las terceras secuencias de ADN recombinadas están flanqueadas al menos por la primera y la segunda secuencias marcadoras, y las células haploides que contienen las cuartas casetes de recombinación en las que las cuartas secuencias de ADN recombinadas están flanqueadas al menos por la tercera y la cuarta secuencias marcadoras.

3. 3.

   Un procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que se generan secuencias de ADN recombinadas adicionales sometiendo las células haploides obtenidas en 2c) al menos una vez a otro ciclo de apareamiento con otras células haploides, induciendo la esporulación de las células diploides obtenidas y aislando las células haploides con secuencias de ADN recombinadas sobre la base de la unión molecular entre dos secuencias marcadoras.

4. 4.

   Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la primera célula diploide se genera transformando simultánea o secuencialmente una célula diploide de S. cerevisiae con una molécula de ADN que contiene la primera casete de recombinación (1) y una molécula de ADN que contiene la segunda casete de recombinación (2) y permitiendo la integración de las dos casetes de recombinación en posiciones alélicas del genoma de S. cerevisiae.

5. 5.

   Un procedimiento según la reivindicación 4, en el que la molécula de ADN que comprende la primera o la segunda casetes de recombinación (1, 2) es un cromosoma artificial de levaduras (YAC).

6. 6.

   Un procedimiento según la reivindicación 4, en el que la molécula de ADN que comprende la primera o la segunda casetes de recombinación es un vehículo de clonación, por medio del cual las dos secuencias marcadoras respectivas están flanqueadas por secuencias de acceso que son homólogas para un locus definido del genoma de S. cerevisiae.

7. 7.

   Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la primera célula diploide se genera por fusión de una célula haploide de S. cerevisiae que lleva en un locus de su genoma la primera casete de recombinación con una célula haploide de S. cerevisiae que lleva en una posición alélica la segunda casete de recombinación.

8. 8.

   Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la primera célula diploide se genera por apareamiento de una célula haploide de

   S. cerevisiae que lleva en un locus de su genoma la primera casete de recombinación con una célula haploide de S. cerevisiae que lleva en una posición alélica la segunda casete de recombinación.
9. 9. Un procedimiento según la reivindicación 7 u 8, en el que las células haploides que llevan la primera o la segunda casete de recombinación se generan por:

   a) insertar la primera secuencia de ADN a ser recombinada entre la primera y la segunda secuencias marcadoras localizadas de forma adyacente sobre un primer vehículo de clonación e insertar la segunda secuencia de ADN a ser recombinada entre la tercera y la cuarta secuencias marcadoras localizadas de forma adyacente sobre un segundo vehículo de clonación, con lo que las dos secuencias marcadoras respectivas son flanqueadas por secuencias de acceso que son homólogas para un locus definido del genoma de S. cerevisiae,

   b) escindir de los vehículos de clonación obtenidos en a) los fragmentos que llevan la primera casete de recombinación (1) y la segunda casete de recombinación (2), respectivamente, con lo que cada una de las casetes comprende la secuencia de ADN a ser recombinada (A, B), flanqueada por las dos secuencias marcadoras respectivas, y cada casete (1, 2) a su vez está flanqueada por secuencias de acceso,

   c) transformar los fragmentos que llevan las casetes de recombinación (1,2) con secuencias de acceso flanqueantes obtenidas en b) separadamente en células diploides de S. cerevisiae, con lo que las secuencias de acceso dirigen la integración de las casetes (1,2) hacia aquel locus para el cual son homólogas, con el fin de obtener células diploides heterocigóticas para la primera casete (1), o para la segunda casete (2),

   d) inducir por separado la esporulación de las células diploides heterocigóticas obtenidas en c) y

   e) aislar las células haploides que contienen la primera casete (1) y que expresan la primera y la segunda secuencias marcadoras y por separado las células haploides que contienen la segunda casete (2) y que expresan la tercera y la cuarta secuencias marcadoras.

10. 10.

    Un procedimiento según la reivindicación 9, en el que el primer vehículo de clonación es el plásmido pMXY9 que tiene el número de depósito DSM 17010 y el

    segundo vehículo de clonación es el plásmido pMXY12 que tiene el número de depósito DSM 17011.

11. 11.

    Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, 9 o 10, en el que las células diploides de S. cerevisiae usadas para la transformación son auxotróficas al menos para dos factores nutricionales.

12. 12.

    Un procedimiento según la reivindicación 11, en el que las células diploides son homocigóticas para el alelo ura3-1 y para el alelo trp1-1, lo que las hace auxotróficas para el uracilo y el triptófano, respectivamente.

13. 13.

    Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 4-6 o 912, en el que las células diploides usadas para la transformación son resistentes al menos a dos antibióticos.

14. 14.

    Un procedimiento según la reivindicación 13, en el que las células diploides son homocigóticas para el alelo can1-100 y para el alelo cyh2R, lo que las hace resistentes a la canavanina y la cicloheximida, respectivamente.

15. 15.

    Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 4-6 o 914, en el que se usan para la transformación células diploides de la cepa MXY47 de S. cerevisiae que tienen el número de depósito DSM 17026, que son homocigóticas para los alelos ura3-1, trp1-1, can1-100 y cyh2R y heterocigóticas para la mutación msh2::KanMX.

16. 16.

    Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que las células de S. cerevisiae tienen un sistema funcional de reparación del apareamiento erróneo.

17. 17.

    Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que las células de S. cerevisiae son transitoria o permanentemente deficientes en el sistema de reparación del apareamiento erróneo.

18. 18.

    Un procedimiento según la reivindicación 17, en el que la deficiencia transitoria o permanente del sistema de reparación del apareamiento erróneo se debe

    a una mutación y/o a una expresión o represión inducible de uno o más genes implicados en el sistema de reparación del apareamiento erróneo, a un tratamiento con un agente que satura el sistema de reparación del apareamiento erróneo y/o a un tratamiento con un agente que globalmente reduce la reparación del apareamiento erróneo.

19. 19.

    Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que la primera (1) y la segunda (2) casetes de recombinación se integran en el locus BUD31-HCM1 sobre el cromosoma III del genoma de S. cerevisiae.

20. 20.

    Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el que la primera y la segunda secuencias de ADN a ser recombinadas (A, B) divergen al menos en 1 nucleótido.

21. 21.

    Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que la primera y la segunda secuencias de ADN a ser recombinadas (A, B) se derivan de organismos distintos de S. cerevisiae.

22. 22.

    Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que la primera y la segunda secuencias de ADN a ser recombinadas (A, B) comprenden una o más secuencias no codificantes y/o una o más secuencias codificantes de proteínas.

23. 23.

    Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que las secuencias marcadoras se seleccionan del grupo que consiste en marcadores nutricionales, marcadores de pigmentos, marcadores de resistencia a antibióticos, marcadores de sensibilidad a antibióticos, sitios de reconocimiento del cebador, límites intrón/exón, secuencias que codifican una subunidad particular de una enzima, secuencias promotoras, secuencias génicas reguladas hacia abajo y sitios de enzimas de restricción.

24. 24.

    Un procedimiento según la reivindicación 23, en el que la primera y la tercera secuencias marcadoras son marcadores nutricionales, cuyos productos génicos pueden compensar una auxotrofía de una célula de S. cerevisiae.

25. 25.

    Un procedimiento según la reivindicación 24, en el que la primera secuencia marcadora es URA3, cuyo producto génico puede conferir prototrofía para el uracilo a una célula de S. cerevisiae auxotrófica para uracilo.

26. 26.

    Un procedimiento según la reivindicación 24, en el que la tercera secuencia marcadora es TRP1, cuyo producto génico puede conferir prototrofía para el triptófano a una célula de S. cerevisiae auxotrófica para triptófano.

27. 27.

    Un procedimiento según la reivindicación 23, en el que la segunda y cuarta secuencias marcadoras son marcadores de sensibilidad a antibióticos, cuyos productos génicos pueden conferir sensibilidad frente a un antibiótico a una célula de

    S. cerevisiae que es resistente a dicho antibiótico.

28. 28.

    Un procedimiento según la reivindicación 27, en el que la segunda secuencia marcadora es CAN1, cuyo producto génico puede conferir sensibilidad para la canavanina a una célula de S. cerevisiae resistente a la canavanina.

29. 29.

    Un procedimiento según la reivindicación 27, en el que la cuarta secuencia marcadora es CYH2, cuyo producto génico puede conferir sensibilidad para la cicloheximida a una célula de S. cerevisiae resistente a la cicloheximida.

30. 30.

    Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, en el que las células haploides que contienen casetes de recombinación con la primera, la segunda, la tercera o la cuarta secuencias de ADN recombinadas se identifican por procedimientos de PCR con el fin de detectar la presencia de la respectiva combinación marcadora.

31. 31.

    Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, en el que las células haploides que contienen casetes de recombinación con la primera, la segunda, la tercera o la cuarta secuencias de ADN recombinadas se identifican poniendo en placas las células haploides en medios que seleccionan la unión molecular sobre la misma molécula de ADN de la respectiva combinación marcadora.

32. 32.

    Un procedimiento según la reivindicación 31, en el que las células haploides que contienen las primeras secuencias de ADN recombinadas (A/B) se ponen en placas en un medio que selecciona la unión molecular sobre la misma molécula de ADN de la primera y la cuarta secuencias marcadoras.

33. 33.

    Un procedimiento según la reivindicación 31, en el que las células haploides que contienen las segundas secuencias de ADN recombinadas (B/A) se ponen en placas en un medio que selecciona la unión molecular sobre la misma molécula de ADN de la segunda y la tercera secuencias marcadoras.

34. 34.

    Un procedimiento según la reivindicación 31, en el que las células haploides que contienen las terceras secuencias de ADN recombinadas se ponen en placas en un medio que selecciona la unión molecular sobre la misma molécula de ADN de la primera y la segunda secuencias marcadoras.

35. 35.

    Un procedimiento según la reivindicación 31, en el que las células haploides que contienen las cuartas secuencias de ADN recombinadas se ponen en placas en un medio que selecciona la unión molecular sobre la misma molécula de ADN de la tercera y la cuarta secuencias marcadoras.

36. 36.

    El plásmido pMXY9, número de depósito DSM 17010 que comprende de forma adyacente el gen marcador URA3 y el gen marcador CAN1, con lo que las dos secuencias marcadoras flanquean una secuencia con un ligador múltiple para insertar una secuencia de ADN a ser recombinada y con lo que los dos marcadores están flanqueados por secuencias de acceso homólogas para el locus BUD31-HCM1 sobre el cromosoma III del genoma de S. cerevisiae.

37. 37.

    El plásmido pMXY9, número de depósito DSM 17010, según la reivindicación 36, en el que la secuencia con un ligador múltiple comprende sitios de restricción para las enzimas de restricción SmaI, XbaI, PacIy BglII.

38. 38.

    El plásmido pMXY12, número de depósito DSM 17011, que comprende de forma adyacente el gen marcador TRP1 y el gen marcador CYH2, con lo que las dos secuencias marcadoras flanquean una secuencia con un ligador múltiple para insertar una secuencia de ADN a ser recombinada (A, B) y con lo que los dos

    marcadores están flanqueados por secuencias de acceso homólogas para el locus BUD31-HCM1 sobre el cromosoma III del genoma de S. cerevisiae.

39. 39.

    El plásmido pMXY12, número de depósito DSM 17011, según la reivindicación 38, en el que la secuencia con un ligador múltiple comprende sitios de restricción para las enzimas de restricción SmaI, SpeI, y PacI.

40. 40.

    La cepa MXY47 de S. cerevisiae, número de depósito DSM 17026, caracterizada porque las células diploides de la misma son homocigóticas para los alelos ura3-1, trp1-1, can1-100 y cyh2R y heterocigóticas para la mutación msh2::KanMX.

41. 41.

    La cepa JM101 de E. coli, que contiene el plásmido pMXY9, número de depósito DSM 17010.

42. 42.

    La cepa DH5a de E. coli, que contiene el plásmido pMXY12, número de depósito DSM 17011.

43. 43.

    Un kit que comprende al menos un primer recipiente que comprende células de la cepa MXY47 de S. cerevisiae, número de depósito DSM 17026, un segundo recipiente que comprende células de la cepa JM101 de E. coli que contienen el plásmido pMXY9, número de depósito DSM 17010, y un tercer recipiente que comprende células de la cepa DH5a de E. coli que contienen el plásmido pMXY12, número de depósito DSM 17011.

44. 44.

    Un kit que comprende al menos un primer recipiente que comprende células de la cepa MXY47 de S. cerevisiae, número de depósito DSM 17026, un segundo recipiente que comprende el ADN de plásmido pMXY9, número de depósito DSM 17010, y un tercer recipiente que comprende ADN de plásmido pMXY12, número de depósito DSM 17011.