EA008038B1

EA008038B1 - Стабилизированные водные композиции, содержащие ингибитор пути метаболизма, тканевого фактора (tfpi) или вариант ингибитора пути метаболизма тканевого фактора

Info

Publication number: EA008038B1
Application number: EA200501097A
Authority: EA
Inventors: Бао-Лу Чэнь
Original assignee: Чирон Корпорейшн
Priority date: 2003-01-08
Filing date: 2004-01-08
Publication date: 2007-02-27
Also published as: DE602004019761D1; ES2321297T3; SI1599222T1; US20060079459A1; WO2004062689A1; AU2004204720B2; EP1599222B1; US20040224886A1; CY1109096T1; CN1756559B; EP2174663A1; ATE424215T1; CA2512681A1; EA200501097A1; CN1756559A; PT1599222E; AU2004204720A1; DK1599222T3; JP2006515882A; US7659248B2

Abstract

Стабилизированные водные композиции, содержащие ингибитор пути метаболизма тканевого фактора (TFPI) или варианты TFPI, включающие также солюбилизирующий агент, антиоксидант и буфер. Сочетание солюбилизирующего агента и антиоксиданта обеспечивает значительное увеличение времени хранения композиций TFPI или варианта TFPI. Солюбилизирующий агент и антиоксидант в значительной степени препятствуют разложению TFPI или варианта TFPI вследствие агрегации и окисления.

Description

По настоящей заявке испрашивается приоритет на основании следующих совместно рассматриваемых предварительных заявок: регистрационный номер 60/438519, поданной 8 января 2003 г., регистрационный номер 60/494577, поданной 13 августа 2003 г., регистрационный номер 60/509260, поданной 8 октября 2003 г., и регистрационный номер 60/512090, поданной 20 октября 2003 г, и перечисленные заявки включены в данное описание посредством ссылок.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к стабилизированным композициям, содержащим белок ингибитора пути метаболизма тканевого фактора (ΤΕΡΙ). Более конкретно, оно относится к композициям, включающим ΤΡΡΙ или вариант ΤΡΡΙ, солюбилизирующий агент и антиоксидант.

Уровень техники

Ингибитор пути метаболизма тканевого фактора (ΤΡΡΙ) составляет в длину 276 аминокислот и функционирует как ингибитор свертывания крови, опосредованного тканевым фактором. Его аминокислотная последовательность приведена в 8ЕЦ ΙΌ N0:1. Амино-концевая область ΤΕΡΙ отрицательно заряжена, а карбокси-концевая область положительно заряжена. Белок ΤΕΡΙ содержит три домена ингибитора фермента ΚιιηίΙζ-типа. ΤΕΡΙ содержит 18 остатков цистеина и, если он правильно свернут, образует 9 дисульфидных связей. Первичная последовательность содержит три консенсусных сайта Ν-сцепленного гликозилирования (Λ5η-Χ-8οι7Τ1ΐΓ). Остатки аспарагина сайтов гликозилирования находятся в положениях 145, 195 и 256. ΤΕΡΙ также известен как липопротеин-ассоциированный ингибитор коагуляции (ЬЛО), ингибитор тканевого фактора (ΤΕΙ) и ингибитор внешнего пути метаболизма (ЕМ).

Предложено применение ΤΕΡΙ для лечения по различным показаниям, включая сепсис (И8 6063764 и N0 93/24143), тромбоз глубоких вен (И8 5563123, И8 5589359 и N0 96/04378), ишемия (И8 5885781, И8 6242414, и N0 96/40224), рестеноз (И8 5824644 и N0 96/01649) и рак (И8 5902582 и N0 97/09063). Было показано, что вариант ΤΕΡΙ, который отличается от ΤΕΡΙ добавлением остатка аланина на аминоконце (αΙα-ΤΕΡΙ), является эффективным в лечении сепсиса на моделях животных. Сагг и др., С1гс 8йоск, 1994, Νον; 44 (3):126-37.

После приготовления композиции, содержащие ΤΕΡΙ или вариант ΤΕΡΙ, можно упаковать для хранения в водной форме или в замороженном состоянии. ΤΕΡΙ или варианты ΤΕΡΙ, однако, могут агрегировать во время хранения в водных композициях. Агрегация вызвана взаимодействиями между молекулами ΤΕΡΙ или варианта ΤΕΡΙ, которые приводят к формированию олигомеров. Эти олигомеры могут оставаться растворимыми или могут образовывать большие, видимые скопления (агрегаты), которые осаждаются из раствора во время хранения. Образование агрегатов ΤΕΡΙ или варианта ΤΕΡΙ во время хранения водной композиции может неблагоприятно сказаться на его биологической активности, приводя к потере терапевтической эффективности в качестве противосвертывающего средства, эффективного для лечения различных состояний, включая сепсис. Кроме того, образование агрегатов может стать причиной других проблем, таких как закупорки трубок, мембран или насосов, когда композиция, содержащая ΤΕΡΙ или вариант ΤΕΡΙ, вводится с применением системы вливания. С тем, чтобы свести к минимуму эти проблемы, в данной области техники существует потребность для улучшенной стабилизации композиций, содержащих ΤΕΡΙ и варианты ΤΕΡΙ.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение основано на существенных улучшениях стабильности водных композиций, содержащих ΤΕΡΙ или варианты ΤΕΡΙ, которые имеют место в случаях, когда такие композиции содержат солюбилизирующий агент и антиоксидант. Антиоксидант может присутствовать в виде газа, замещающего кислород, поглотителя кислорода или свободных радикалов, или хелатирующего агента.

Изобретение включает, по меньшей мере, следующие варианты выполнения.

Один вариант выполнения настоящего изобретения представляет собой водную композицию, содержащую от приблизительно 0,05 до приблизительно 15 мг/мл ΤΕΡΙ или варианта ΤΕΡΙ; от приблизительно 50 до приблизительно 600 мМ солюбилизирующего агента, выбранного из группы, состоящей из (ί) аргинина или его аналога, (ίί) лизина или его аналога и (ίίί) смесей (ί) и (ίί); и антиоксидант, выбранный из группы, состоящей из (ί) газа, замещающего кислород, (ίί) поглотителя кислорода или свободных радикалов, (ίίί) хелатирующего агента и (ίν) их смесей; в котором водная композиция обладает (а) процентной устойчивостью к агрегации приблизительно 45% или больше; (Ь) процентной устойчивостью к окислению приблизительно 45% или больше; и (с) рН от приблизительно 4 до приблизительно 8.

Другой вариант выполнения настоящего изобретения представляет собой способ получения водной композиции, содержащей ΤΕΡΙ или вариант ΤΕΡΙ, включающий этап добавления к водной композиции, содержащей от приблизительно 0,05 до приблизительно 15 мг/мл ΤΕΡΙ или варианта ΤΕΡΙ, от приблизительно 50 до приблизительно 600 мМ солюбилизирующего агента, выбранного из группы, состоящей из (ί) аргинина или его производного, (ίί) лизина или его производного и (ίίί) смесей (ί) и (ίί); и Ь) антиоксидант, выбранный из группы, состоящей из (ί) газа, замещающего кислород, (ίί) поглотителя кислорода или свободных радикалов, (ίίί) хелатирующего агента и (ίν) смесей (ί), (ίί) и (ίίί), где водная композиция обладает (а) процентной устойчивостью к агрегации приблизительно 45% или больше; (Ь) процентной устойчивостью к окислению приблизительно 45% или больше; и (с) рН от приблизительно 4 до приблизительно 8.

- 1 008038

Еще один вариант выполнения настоящего изобретения представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую а) водную композицию и фармацевтически приемлемый наполнитель. Водная композиция содержит от приблизительно 0,05 до приблизительно 15 мг/мл ΤΡΡΙ или варианта ТЕР1; от приблизительно 50 до приблизительно 600 мМ солюбилизирующего агента, выбранного из группы, состоящей из (ί) аргинина или его аналога, (ίί) лизина или его аналога, и (ш) смесей (ί) и (ιί); и антиоксидант, выбранный из группы, состоящей из (ί) газа, замещающего кислород, (ίί) поглотителя кислорода или свободных радикалов, (ш) хелатирующего агента, и (ίν) их смеси; в которой водная композиция обладает (а) процентной устойчивостью к агрегации приблизительно 45% или больше; (Ь) процентной устойчивостью к окислению приблизительно 45% или больше; и (с) рН от приблизительно 4 до приблизительно 8.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показан период полураспада во время хранения (1_1/2, в днях) четырех стандартных а1аΤΕΡΙ композиций, исследованных с помощью ионообменной жидкостной хроматографии высокого давления (ΙΕΧ-НРЬС) как функция концентрации аргинина при 50°С. Все композиции содержали 0,15 мг/мл а1а-ТЕР1, доведенный до рН 5,5 в буфере либо с помощью основания Ь-аргинина и лимонной кислоты, либо с помощью Ь-аргинина НС1 и 10 мМ лимонной кислоты/цитрата натрия. Специфические композиции а1а-ТРР1 содержали: (а) 20-150 мМ Ь-аргинин НС1, 10 мМ лимонной кислоты/цитрата натрия в качестве буфера; (Ь) 20-150 мМ основания Ь-аргинина, титрованного лимонной кислотой; (с) 100-300 мМ Ьаргинина НС1, 10 мМ лимонной кислоты/цитрата натрия в качестве буфера; (б) 100-300 мМ основания Ьаргинина, титрованного лимонной кислотой.

На фиг. 2 показана стабильность стандартной композиции а1а-ТЕР1 как функция концентрации растворенного кислорода, выраженной как процентная доля от полного насыщения воздухом. Процент растворимого а1а-ТЕР1, остающийся в образцах устойчивости, хранившихся при 30°С, исследовали посредством обратно-фазной (ВР) НРЬС. Стандартная композиция а1а-ТЕР1 содержала 0,15 мг/мл а1а-ТРР1, 20 мМ лимонной кислоты/цитрата натрия и 300 мМ Ь-аргинина. Уровень рН составлял 5,5.

На фиг. 3 показан период полураспада во время хранения (1_1/2, в неделях) стандартной композиции а1а-ТРР1 как функция концентрации растворенного кислорода, выраженной как процентная доля от полного насыщения воздухом. Процентная доля растворимого а1а-ТЕР1, остающегося в образцах устойчивости, хранившихся при 30°С, была определена посредством КР-НРЬС. Стандартная композиция а1а-ТЕР1 содержала 0,15 мг/мл ТЕР1, 20 мМ лимонной кислоты/цитрата натрия и 300 мМ Ь-аргинина. Уровень рН составлял 5,5.

На фиг. 4 показана стабильность стандартной композиции а1а-ТЕР1, содержащей хелатирующие агенты ЕЬТЛ и ЬТРЛ. добавленные в количестве 0, 1, или 4 мМ. Процентная доля растворимого а1аТЕР1, остающегося в образцах устойчивости, хранившихся при 30°С, была определена посредством ВРНРЬС. Стандартная композиция а1а-ТЕР1 содержала 0,15 мг/мл а1а-ТРР1, 20 мМ лимонной кислоты/цитрата натрия и 300 мМ Ь-аргинина. Уровень рН составлял 5,5.

На фиг. 5 показана стабильность стандартной композиции а1а-ТЕР1, содержащей поглотитель кислорода метонин, добавленный в количестве 0, 2, 5, или 10 мМ. Процентная доля растворимого а1а-ТРР1, остающегося в образцах устойчивости, хранившихся при 30°С, была определена посредством КР-НРЬС. Стандартная композиция ТРР1 содержала 0,15 мг/мл а1а-ТЕР1, 20 мМ лимонной кислоты/цитрата натрия и 300 мМ Ь-аргинина. Уровень рН составлял 5,5.

Фиг. 6 представляет собой хроматограмму КР-НРЬС образца а1а-ТЕРЬ Пики Л-Е описаны в примере 1.

Фиг. 7 - графики выживания Каплана-Мейера. Ось X, выживание; ось Υ, время (часы).

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Водные композиции в соответствии с настоящим изобретением основаны на открытии, что прибавление к водной композиции, содержащей ТЕР1 или вариант ТЕР1, ί) аминокислотного солюбилизирующего агента (например, аргинина, лизина или их аналогов) и ίί) антиоксиданта, где уровень рН данной водной композиции составляет от приблизительно 4 до приблизительно 8, приводит к образованию композиции, содержащей ТЕР1 или вариант ТЕР1, обладающей в значительной мере увеличенной стабильностью во время хранения относительно композиций, содержащих ТЕР1 или вариант ТЕР1, приготовленных без сочетания этих двух дополнительных компонентов. Данная в полной мере увеличенная стабильность композиции достигается посредством воздействия солюбилизирующего агента в сочетании с тем из антиоксидантов, который обеспечивает получение композиции, противостоящей не только агрегации во время хранения, но также и нежелательному окислению, особенно на остатках метионина ТЕР1. Водные композиции в соответствии с настоящим изобретением также противостоят другим нежелательным воздействиям (например, разворачивание, повторное сворачивание и денатурация), которые приводят к потере биологической активности или другим нежелательным характеристикам.

Поскольку солюбилизирующий агент и антиоксидант, прежде всего, препятствуют независимым механизмам разложения ТЕР1 или варианта ТЕР1 (агрегация и окисление метионина, соответственно), сочетание солюбилизирующего агента и антиоксиданта обеспечивает более устойчивую композицию ТЕР1 или варианта ТЕР1, чем возможно без этого сочетания, или даже без одного из этих двух компонен

- 2 008038 тов. Например, окисление остатков метионина ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ может быть нежелательным, даже когда ΤΡΡΙ или вариант ΤΡΡΙ являются биологически активными.

Стабильность (устойчивость) водных композиций

Водные композиции, содержащие ΤΡΡΙ или вариант ΤΡΡΙ в соответствии с настоящим изобретением, как правило, повышали устойчивость во время хранения в отношении одного или более эффектов разложения ΤΡΡΙ (например, агрегации и окисления метионина) относительно композиций, приготовленных в отсутствие сочетания солюбилизирующего агента и антиоксиданта, как описано в настоящем изобретении. Таким образом, поскольку композиции, содержащие ΤΡΡΙ и вариант ΤΡΡΙ, в соответствии с настоящим изобретением, обладают повышенной процентной устойчивостью к агрегации и повышенной процентной устойчивостью к окислению, период полураспада неагрегированного неокисленного ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ повышается. Процентная устойчивость к агрегации и процентная устойчивость к окислению образца ΤΡΡΙ или вариантной ΤΡΡΙ могут меняться независимо. Предпочтительно ΤΡΡΙ или вариант ΤΡΡΙ в водных композициях в соответствии с настоящим изобретением являются биологически активными, как определяют, например, с помощью анализа времени протромбина, как описано ниже.

Водные композиции по изобретению обладают по меньшей мере 45% устойчивостью к агрегации. Процентной устойчивостью к агрегации называется пропорция образца ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ, который является растворимым в соответствии с измерением в 40°С ускоренной пробе устойчивости. В 40°С ускоренной пробе устойчивости образец ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ выдерживают в течение восьми недель при 40°С. После выдерживания образец ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ фильтруют через 0,2 мкм фильтр и подвергают анализу высокоэффективной жидкостной ионообменной хроматографии (ΙΕΧ-ΗΡΕί) с тем, чтобы определить количество растворимого ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ, оставшегося в растворе. Анализ ΙΕΧНГЬС показал содержание ниже 45%. Таким образом, например, композиция ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ, которая обладает 60% устойчивостью к агрегации, представляет собой композицию, в которой 60% ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ являются растворимыми в соответствии с измерением в 40°С ускоренной пробе устойчивости. Композиция ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ, которая обладает 80% устойчивостью к агрегации, представляет собой композицию, в которой 80% ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ являются растворимыми в соответствии с измерением в 40°С ускоренной пробе устойчивости. Процентная устойчивость к агрегации ΤΡΡΙ или различных композиций ΤΡΡΙ по изобретению предпочтительно составляет приблизительно 45, 50, 60, 70 или 75%, или больше, более предпочтительно приблизительно 80, 82, 84, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%, или больше в соответствии с измерением в 40°С ускоренной пробе устойчивости и может, например, быть в диапазоне от приблизительно 45% или больше до приблизительно 99% или больше, от приблизительно 45% или больше до приблизительно 70% или больше, от приблизительно 60% или больше, до приблизительно 80% или больше, от приблизительно 70% или больше, до приблизительно 90% или больше, от приблизительно 80% или больше, до приблизительно 90% или больше, или от приблизительно 45% или больше, до приблизительно 70% или больше в соответствии с измерением в 40°С ускоренной пробе устойчивости.

Водные композиции в соответствии с настоящим изобретением также обладают приблизительно 45% или большей устойчивостью к окислению. Процентной устойчивостью к окислению называется пропорция образца ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ, который не содержит окисленный метионин в соответствии с измерением в 30°С ускоренной пробе устойчивости. В 30°С ускоренной пробе образец ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ выдерживают в течение восьми недель при 30°С. После выдерживания образец ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ подвергают анализу высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (ΚΡ-ΗΡΕί) с тем, чтобы определить количество ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ с окисленным метионином, присутствующего в растворе. Анализ ΚΡ-ΗΡΕί описан ниже. Таким образом, например, ΤΡΡΙ или композиция варианта ΤΡΡΙ, которая имеет 60%-ную устойчивость к окислению, представляет собой композицию, в которой 60% ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ не содержат окисленный метионин в соответствии с измерением в 30°С ускоренной пробе устойчивости. Композиция ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ, которая обладает 80% устойчивостью к окислению, представляет собой композицию, в которой 80% ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ не содержат окисленный метионин в соответствии с измерением в 30°С ускоренной пробе устойчивости. Процентная устойчивость к окислению композиций ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно составляет приблизительно 45, 50, 60, 70 или 75% или больше, более предпочтительно - приблизительно 80, 82, 84, 85, 89, 90, 91, 92, 94, 95, 96, 91, 98 или 99% или больше в соответствии с измерением в 30°С ускоренной пробе устойчивости и может, например, быть в диапазоне от приблизительно 45% или больше до приблизительно 99% или больше, от приблизительно 45% или больше, до приблизительно 70% или больше, от приблизительно 60% или больше, до приблизительно 80% или больше, от приблизительно 70% или больше, до приблизительно 90% или больше, или от приблизительно 80% или больше до приблизительно 90% или больше в соответствии с измерением в 30°С ускоренной пробе устойчивости.

Период полураспада во время хранения ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ в композициях в соответствии с настоящим изобретением находится обычно в диапазоне от приблизительно 1 до приблизительно 36 месяцев (например до приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 36 месяцев) в зависимости от температуры хранения. Водные композиции, содержащие ΤΡΡΙ или вариант ΤΡΡΙ, солюбилизирующий агент

- 3 008038 и антиоксидант с уровнем рН от приблизительно 4 до приблизительно 8 в соответствии с настоящим изобретением, как правило, обладают периодом полураспада во время хранения в отношении агрегации и/или устойчивости к окислению, больше, чем приблизительно 8 недель при температуре приблизительно 15°С. Например, период полураспада во время хранения ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ составляет от приблизительно 1 месяца до приблизительно 24 месяцев (например, приблизительно 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 или 24 месяца) при температуре приблизительно 15°С или приблизительно 30°С.

Температура хранения

Повышенная устойчивость при хранении достигается в зависимости от того, хранили водные композиции в соответствии с настоящим изобретением в виде жидкости для более позднего использования или замораживали и размораживали до использования. Температуры хранения могут располагаться в диапазоне от приблизительно -70°С до приблизительно 25°С (например, приблизительно -70, -60, -50, -40, -30, -20, -10, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 21, 22, 23, 24 или 25°С). Предпочтительно, водные композиции по изобретению хранят в жидкой форме для получения полного преимущества той возможности, что повышенная устойчивость при хранении в этой форме облегчает введение без восстановления, и возможности поставлять композицию в предварительно заполненных, готовых к использованию шприцах или в виде препаратов для многократного использования, если композиция совместима с бактериостатическими агентами. Предпочтительная температура хранения для жидких композиций составляет от приблизительно 2 до приблизительно 8°С (например, приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8°С).

ΤΕΡΙ и варианты ΤΕΡΙ

ΤΡΡΙ представляет собой полипептид с аминокислотной последовательностью, показанной в 8ЕЦ ΙΌ N0:1. Предпочтительно, ΤΡΡΙ представляет собой рекомбинантный человеческий белок, получаемый в микробном организме. ΤΡΡΙ охарактеризован и описан с учетом его биологической активности в \70 01/24814.

Варианты ΤΡΡΙ включают аналоги и производные ΤΡΡΙ, в том числе фрагменты ΤΡΡΙ, аналоги ΤΡΡΙ и производные ΤΡΡΙ. Варианты ΤΡΡΙ могут быть взяты у человека или из других источников млекопитающих, синтезированы или получены с помощью рекомбинантных методик. Аналоги представляют собой молекулы ΤΡΡΙ с одной или более заменами аминокислот, вставками, делениями и/или присоединениями. Предпочтительны консервативные замены, в которых аминокислоту заменяют на другую, имеющую схожие свойства. Примеры консервативных замен включают, без ограничений, С1у А1а, Уа1

Не Ьеи, Акр 61и, Ьук Агд, Аки 61и, и ΡΙιο Ττρ Туг. Они обычно попадают в диапазон приблизительно 1-5 аминокислот (например, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот). Дополнительные аминокислоты могут быть присоединены в любом положении в молекуле, особенно на амино- или карбоксиконце. Например, один аналог ΤΡΡΙ, ^Ь-аланил-'ГТИ (;·11;·1-ΤΡΡΙ). содержит дополнительный остаток аланина в амино-концевой области. Присоединения аминокислот могут составлять 1, 2, 5, 10, 25, 100 или больше дополнительных аминокислот. Настоящее определение охватывает белки слияния.

Фрагменты представляют собой части ΤΡΡΙ, аналогов ΤΡΡΙ или производных ΤΡΡΙ. Примеры фрагментов включают домены ΚιιηίΙζ 1, 2 или 3, домены ΚιιηίΙζ 1 и 2 или 2 и 3, или делеции Ν-конца, С-конца или обоих. Содержательное руководство для получения вариантов найдено в И8 5106833. Фрагменты ΤΡΡΙ содержат по меньшей мере 20 последовательных аминокислот 8ЕЦ ΙΌ N0:1. Например, фрагмент может составлять в длину 20, 25, 30, 50, 100 150, 200, 250 или 275 последовательных аминокислот. Фрагменты ΤΡΡΙ, не обладающие биологической активностью, описаны в И8 5106833. Использование таких фрагментов в настоящем изобретении также рассмотрено.

Производные определены как аналоги ΤΡΡΙ, ΤΡΡΙ, или фрагменты ΤΡΡΙ, имеющие дополнительные компоненты. Примеры таких присоединений включают гликозилирование, фосфорилирование, ацетилирование или амидирование.

Процентную гомологию между вариантом ΤΡΡΙ и 8ЕЦ ΙΌ N0:1 определяли с применением программы выравнивания В1ак12 (В1окит62, Ехрес1 10, к1апйатй депейс сойек (стандартные генетические коды), ореп дар 11 (открытый промежуток 11), (ех1епкюп дар 1) промежуток продления 1, дар х_йгороГГ 50, и 1о\т сотр1ехйу П11ег оГГ (фильтр малой сложности выключен)). Варианты ΤΡΡΙ обычно обладают приблизительно 70% или больше, предпочтительно, приблизительно 80% или больше, более предпочтительно приблизительно от 90 до 95% (например, 90, 91, 92, 93, 94 или 95%) или больше, и наиболее предпочтительно приблизительно 98 или 99% идентичностью аминокислотной последовательности по отношению к 8ЕЦ ΙΌ N0:1.

Варианты аминокислотной последовательности ΤΡΡΙ могут быть приготовлены путем изменения последовательности ДНК, кодирующей ΤΡΡΙ. Способы для изменения нуклеотидной последовательности известны в данной области техники. См., например, \7а1кег апй 6аак1та, ейк. (1983) Τесйη^^иек ίη Мо1еси1аг Вю1оду (МасМШап ΡιιΝίκΙιπίβ Сотрапу, №\ν Уотк), Рнпке1 (1985) Егос. №11. Асай. 8ск И8А 82:488492, Кипке1 е1 а1. (1987) Ме1йойк Еηζуто1. 154:367-382, Затйтоок е1 а1. (1989) Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1 (Со1й 8ртшд НагЬог, №\ν Уотк), ϋδ 4873192, а также процитированные в них ссылки.

Варианты ΤΡΡΙ предпочтительно обладают значительной величиной биологической активности, например 10, 30, 50, 60, 80, 90% или больше биологической активности ΤΡΡΙ в соответствии с измерени

- 4 008038 ем, например, в протромбиновом (РТ) анализе, описанном ниже. Очевидно, любые изменения, сделанные в ДНК, кодирующей вариант ΤΡΡΙ, не должны вывести последовательность из рамки считывания и предпочтительно не должны создавать дополнительные области, которые могли бы произвести вторичную структуру мРНК. Руководство в определении, какие аминокислотные остатки можно замещать, вставлять или удалять без нарушения биологической или иммунологической активности ΤΡΡΙ, или варианта ΤΡΡΙ, можно найти, используя компьютерные программы, известные в данной области техники, такие как программное обеспечение ΌΝΑ8ΤΛΚ, или у ОауЬоГГ и др. (1978) в Л11ак оГ Ρτοΐβίη Зедиепсе апб З1гис1иге (Να11. Вюшеб. Кек. Роипб., АакЫпдЮп. Э.С.). Также рассмотрена стабилизация вариантов ΤΡΡΙ, которые не являются биологически активными.

ΤΡΡΙ или варианты ΤΡΡΙ могут быть произведены рекомбинантным способом, как показано в ИЗ 4966852. Например, кДНК для требуемого белка можно включить в плазмиду для экспрессии в прокариотах или эукариотах. Существует множество ссылок, известных специалистам в данной области техники, которые предоставляют подробности относительно экспрессии белков с применением микроорганизмов. Смотри ИЗ 4847201 и Мап1а1ак и др., 1982, МОВЕСВВЛК ^ΘΝΙΝΟ: Л ЬЛВОКЛТОКУ ΜΑΝиЛЬ (Со1б Зрппд НагЬог, Νο\ν Уотк).

Доступно множество различных методик для трансформации микроорганизмов и применения трансформированного микроорганизма для экспрессии ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ. Приведенное ниже представляет собой просто примеры возможных подходов. Последовательности ДНК ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ могут быть связаны с подходящими управляющими последовательностями. Последовательности ДНК ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ могут быть включены в плазмиду, такую как рИС13 или рВК322, которые коммерчески доступны от компаний, таких как ВоеЬппдег-Маппйепп. Как только ДНК ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ вставляется в вектор, ее можно клонировать в соответствующем хозяине. ДНК можно амплифицировать с помощью методик, таких как показанные в ИЗ 4683202 и ИЗ 4683195. кДНК можно получить путем индуцирования клеток, таких как клетки гепатомы НерС2 или ЗКНер, с тем, чтобы выработать мРНК, затем идентифицировать и выделить мРНК и обратно транскрибировать ее, чтобы получить кДНК. После того, как вектор экспрессии трансфомировали в хозяина, такого как Е. сой, бактерии можно культивировать и экспрессировать белок. Бактерии являются предпочтительными прокариотическими микроорганизмами, и особенно предпочтительной является Е. сой. Предпочтительный микроорганизм, применимый в настоящем изобретении, представляет собой Е. сой К-12, штамм ММ294, депонированный согласно условиям Будапештского Договора 14 февраля 1984 г. в Американской коллекции типовых культур, в настоящее время расположенной в 10801 Ишуегкйу Β1ν6., Мапаккак, V ίΓβίπίη (номер доступа 39607).

ΤΡΡΙ или варианты ΤΡΡΙ можно вырабатывать в бактериях или дрожжах и впоследствии очищать. В целом, можно использовать процедуры, показанные в ИЗ 5212091, ИЗ 6063764 и ИЗ 6103500 или АО 96/40784. ΤΡΡΙ или варианты ΤΡΡΙ можно очищать, делать растворимыми и повторно сворачивать в соответствии с АО 96/40784 и Сик1аГкоп и др., Ρ^οΐ. Ехргекк. Ριπ. 5:233 (1994). Например, при приготовлении согласно примеру 9 из АО 96/40784 получаются препараты аН-ΤΡΡΙ, которые содержат приблизительно от 85 до 90 мас.% полного белка по массе в виде биологически активного 81η-ΤΡΡΙ.

ΤΡΡΙ или вариант ΤΡΡΙ обычно добавляют к водным композициям в соответствии с настоящим изобретением в количестве от приблизительно 0,05 до приблизительно 15 мг/мл, (например, 0,05, 0,15, 0,5, 1, 2,5, 5, 7,5, 10, 12,5 или 15 мг/мл).

Аминокислотный солюбилизирующий агент

Аминокислотный солюбилизирующий агент, включенный в композиции, содержащие ΤΡΡΙ или вариант ΤΡΡΙ в соответствии с настоящим изобретением, прежде всего, предохраняет ΤΡΡΙ или вариант ΤΡΡΙ от агрегации, таким образом увеличивая его устойчивость во время хранения. Сниженное образование скоплений при добавлении аминокислотного солюбилизирующего агента встречается в зависимом от концентрации виде. Таким образом, повышающаяся концентрация аминокислотного солюбилизирующего агента приводит к увеличению устойчивости композиции ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ вследствие соответствующего понижения образования скоплений во время хранения.

Предпочтительные аминокислотные солюбилизирующие агенты представлены аргинином, лизином или аналогами аргинина или лизина. Аргинин или лизин могут присутствовать либо в свободной форме основания, либо в форме соли, например в форме соли соляной кислоты. Аналоги аргинина или лизина могут также быть в виде свободного основания или в форме соли. Аналоги аргинина включают, например, этиловый эфир аминогуанидин аргинина, гидроксамат аргинина и р-нитроанилид аргинина. Аналоги лизина включают, например, лизинамид, этиловый эфир лизина, гидроксамат лизина, и р-нитроанилид лизин. Предпочтительно, солюбилизирующий агент представляет собой аргинин, присутствующий либо в форме свободного основания, либо как форма соли соляной кислоты. Также предпочтительно использование в качестве солюбилизирующих агентов естественно встречающихся Ь-стереоизомеров аргинина или лизина, хотя стабилизированные композиции настоящего изобретения могут включать Όстереоизомеры или смеси Ь- и Ό-стереоизомеров.

Аргининовый или лизиновый солюбилизирующие агенты или их аналоги включают в водную композицию в количестве, которое вызывает требуемый эффект стабилизации композиций ΤΡΡΙ или вариан

- 5 008038 та ΤΕΡΙ во время хранения, такой, что, относительно подобной композиции, но без добавления солюбилизирующего агента, данная композиция демонстрирует улучшенную устойчивость к разложению. Предпочтительно, общее количество солюбилизирующего агента в композиции составляет от приблизительно 50 до приблизительно 600 мМ (например, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 или 600 мМ), более предпочтительно от приблизительно 100 до приблизительно 400 мМ, и наиболее предпочтительно - приблизительно 300 мМ.

Определение количества отдельного аминокислотного основания, которое будет добавлено к водной композиции, содержащей ΤΕΡΙ или вариант ΤΕΡΙ, чтобы уменьшить образование агрегатов, увеличить устойчивость полипептида и увеличить устойчивость композиции при хранении, можно легко определить с применением способов, общеизвестных для специалистов в данной области техники и описанных, например, в примере 6, ниже. Например, действие либо аргининового, либо лизинового солюбилизирующего агента на стабильность ΤΕΡΙ или варианта ΤΕΡΙ во время хранения в водной композиции можно легко определить путем измерения изменения одного или более из множества возможных свойств композиции ΤΕΡΙ или варианта ΤΕΡΙ с течением времени, как, например, концентрация растворимого полипептида. Количество растворимого полипептида в растворе может быть определено с помощью ионо-эксклюзионной (ΙΕΟ)-ΗΡΕΟ. В тех случаях, когда основной путь разложения ΤΕΡΙ или варианта ΤΕΡΙ представлен агрегацией, эффективное количество солюбилизирующего агента для смешения с композицией, содержащей ΤΕΡΙ или вариант ΤΕΡΙ, с тем, чтобы получить повышенную устойчивость, является количеством, которое привело к пониженному образованию скоплений с течением времени и, следовательно, к большей сохранности растворимого полипептида в растворе в неагрегированной (то есть, мономерной) молекулярной форме.

Антиоксиданты

Водные композиции ΤΕΡΙ или варианта ΤΕΡΙ в соответствии с настоящим изобретением также содержат антиоксидант. Антиоксидант представляет собой компонент, который уменьшает окисление ΤΕΡΙ или варианта ΤΕΡΙ, особенно аминокислотных остатков метионина в молекуле. Окисление остатков метионина, присутствующих в молекуле ΤΕΡΙ или варианта ΤΕΡΙ, является одним из основных путей разложения во время хранения композиций ΤΕΡΙ или варианта ΤΕΡΙ. Окисление связано с наличием примесей в композиции, которые либо реагируют с остатками метионина напрямую, либо катализируют реакции окисления. Поэтому использование определенных добавочных антиоксидантов для борьбы с эффектами таких примесей приводит к существенно большей стабильности композиций ΤΕΡΙ или варианта ΤΕΡΙ, даже композиций, которые уже содержат солюбилизирующий агент в соответствии с настоящим изобретением. Предпочтительно, антиоксидант является фармацевтически приемлемым и присутствует в концентрации от приблизительно 0,01 до приблизительно 50 мМ (например, приблизительно 0,01, 0,1, 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мМ), более предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 10 мМ (например, приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мМ). Термин фармацевтически приемлемый означает, что при введении композиции пациенту нет существенных неблагоприятных биологических действий. Термин пациент охватывает как людей, так и ветеринарных пациентов.

Три общих типа антиоксидантов эффективны в композициях ΤΕΡΙ или варианта ΤΕΡΙ в соответствии с настоящим изобретением: газы, замещающие кислород, поглотители кислорода или свободных радикалов и хелатирующие агенты.

Газы, замещающие кислород

Растворенный кислород, присутствующий в водной композиции ΤΕΡΙ или варианта ΤΕΡΙ, может, в конечном счете, привести к окислению метионина и, следовательно, либо к потере эффективности ΤΕΡΙ для его подразумеваемой терапевтической функции, либо к включению окисленных частиц (например, сульфоксида метионина) в полипептиде ΤΕΡΙ или варианта ΤΕΡΙ, которые могут обладать неизвестными или нежелательными физиологическими действиями. Газы, замещающие кислород, представляют собой газы, эффективные для удаления или вытеснения растворенного кислорода. Предпочтительно газ, замещающий кислород, значительно уменьшает концентрацию растворимого кислорода по отношению к концентрации растворенного кислорода в случае, если композиция уравновешена в воздухе при условиях окружающей среды. Предпочтительно газ, замещающий кислород, уменьшает концентрацию растворенного кислорода до менее чем приблизительно 10% по отношению к концентрации растворенного кислорода водной композиции ΤΕΡΙ или варианта ΤΕΡΙ, которая не содержит газ, замещающий кислород. Это условие резко усиливает устойчивость.

Предпочтительные газы, замещающие кислород, в основном, инертны по отношению к композиции ΤΕΡΙ или варианта ΤΕΡΙ, то есть, значительная величина химической реакционной способности не встречается при подвергании композиции ΤΕΡΙ воздействию газа, замещающего кислород, такого, что поддерживается биологическая активность ΤΕΡΙ. Подходящие газы, замещающие кислород, включают азот, обогащенный азотом воздух, обогащенный азотом кислород, инертные газы (например, гелий или аргон), метан, этан, пропан, углекислый газ и смеси этих газов. Обогащенный азотом воздух и обогащенный азотом кислород представляют собой смеси азота и воздуха или кислорода, соответственно, содержащие азот в концентрации, большей, чем обнаружено в атмосфере (то есть, больше чем приблизительно 79 об.%). Азот является предпочтительным газом, замещающим кислород.

- 6 008038

Газ, замещающий кислород, может присутствовать в любой концентрации в композиции, вплоть до предела его растворимости включительно. Растворимость газа, замещающего кислород, в композиции ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ можно увеличить путем поддержания композиции в атмосфере с повышенным давлением, такой как закрытая емкость, содержащая замещающий газ выше уровня жидкости композиции. В качестве альтернативы, в свободном объеме можно поддерживать давление ниже атмосферного с тем, чтобы уменьшить растворимость газа, замещающего кислород.

Газы, замещающие кислород, можно вводить в композицию ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ любым традиционным способом, таким как очистка свободного объема выше уровня жидкости в ампуле или другой емкости, содержащей композицию ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ, замещающим газом, распыление или барботирование вытеснительного газа через композицию ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ, применение циклов сжатия/сброса давления замещающего газа, создание вакуума, сопровождаемое созданием давления замещающего газа, и т.п.

После того, как замещение кислорода производят, как описано выше, повторное растворение кислорода в композиции ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ предотвращают путем его изоляции от воздуха с помощью газа, замещающего кислород.

Поглотители кислорода или свободных радикалов

Другим типом антиоксиданта, применимого в настоящем изобретении, является поглотитель кислорода или поглотитель свободных радикалов. В целом, такие поглотители реагируют с кислородом и/или свободными радикалами активнее, чем ΤΡΡΙ или вариант ΤΡΡΙ. Они служат расходуемыми молекулами, которые реагируют с доступным кислородом, таким образом предотвращая нежелательные взаимодействия кислород - ΤΡΡΙ или кислород - вариант ΤΡΡΙ, в особенности, окисление остатков метионина. В предпочтительном варианте выполнения концентрация поглотителя кислорода или свободных радикалов составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 мМ.

Подходящие поглотители кислорода или свободных радикалов являются устойчивыми в композициях ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ в соответствии с настоящим изобретением. Предпочтительные фармацевтически приемлемые поглотители кислорода или свободных радикалов включают метионин, аскорбиновую кислоту или аскорбат натрия, Ь-, ИЬ- или Ό-альфа-токоферол и ацетат Ь-, ИЬ- или Ό-альфатокоферола, бетакаротин, селен, пиритинол, пропилгаллат, бутилированный гидроксианизол (ВНА) и бутилированный гидрокситолуол (ВНТ). Подходящая фаза для поглотителя кислорода или свободных радикалов закономерно зависит от его совместимости с композицией ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ. Обычно в композиции, в соответствии с настоящим изобретением, подходящим образом можно включить гидрофильные антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или ацетатная соль альфа-токоферола (то есть, ацетат альфа-токоферола).

Можно использовать любой стереоизомер метионина (Ь-, Ό-, или ИЬ-изомер) или комбинацию изомеров. Особенно предпочтительным антиоксидантом является метионин, особенно Ь-метионин. Обычно наилучшие результаты получают, когда добавленный метионин представляет, по меньшей мере, количество, эквивалентное, на молярной основе, количеству, присутствующему в ΤΡΡΙ или варианте ΤΡΡΙ. В нативной форме ΤΡΡΙ содержит 5 остатков метионина на каждую молекулу белка. Метионин, который является частью белка ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ, называют метионином ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ, чтобы отличить его от метионина, добавленного в композицию в качестве антиоксиданта и который не является частью белка ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ. Конечно, метионин в полипептиде, который не является метионином ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ, может также выступать в качестве поглотителя кислорода для целей настоящего изобретения. Например, полипептид, содержащий поли(метионин) мог бы уменьшить коэффициент окисления метионина ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ способом, подобным свободному метионину, добавленному в композицию. Поэтому важно отличать метионин ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ в соответствии с определением выше от метионина, не принадлежащего ΤΡΡΙ или варианту ΤΡΡΙ, который включает любые остатки метионина, добавленные в композицию либо в свободной форме, либо связанные в полипептиде, который не является ΤΡΡΙ или вариантом ΤΡΡΙ.

Предпочтительно метионин присутствует в таком количестве, что молярное отношение метионина, не принадлежащего ΤΡΡΙ или варианту ΤΡΡΙ, и метионина ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ составляет от приблизительно 1:1 до приблизительно 10000:1, более предпочтительно от приблизительно 1:1 до приблизительно 5000:1, еще более предпочтительно от приблизительно 100:1 до приблизительно 1000:1 и еще более предпочтительно от приблизительно 300:1 до приблизительно 1000:1, и еще более предпочтительно от приблизительно 500:1 до приблизительно 1000:1. В пересчете на абсолютную концентрацию метионин предпочтительно присутствует в композиции в концентрации от приблизительно 1 до приблизительно 10 мМ (например, приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мМ). Однако концентрация используемого метионина может изменяться в зависимости от концентрации ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ в композициях в соответствии с настоящим изобретением. Важное действие метионина или других поглотителей кислорода заключается в предотвращении формирования остатков сульфоксида метионина ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ, которые могут вызвать нежелательные или неизвестные эффекты при физиологических условиях, даже в тех случаях, в которых ΤΡΡΙ или вариант ΤΡΡΙ могут быть биологически активными. Таким образом, количество добавляемого антиоксиданта, должно составлять достаточное количество

- 7 008038 для такого ингибирования окисления остатков метионина, что количество сульфоксида метионина, получающегося при окислении добавленного метионина, является допустимым для регуляторных воздействий. Как правило, это означает, что композиция содержит не больше чем от приблизительно 10 до приблизительно 30% остатков метионина в виде сульфоксида метионина.

Хелатирующие агенты

Другим типом антиоксиданта, применимого в настоящем изобретении, является хелатирующий агент, также известный как секвестрант, который эффективно связывает ионы переходных металлов (например, Ее⁺³). Ионы переходного металла могут присутствовать в композиции и могут катализировать нежелательные реакции окисления, которые приводят к разложению белка и агрегации. Хелатирующие агенты выбирают таким образом, чтобы они обладали небольшой или не обладали химической реакционной способностью по отношению к другим компонентам композиции и в целом были совместимы с поддержанием требуемых физиологических свойств композиции (например, рН и осмолярность). Поэтому предпочтительно, чтобы в композициях использовались хелатирующие агенты, при введении которых в композицию преднамеренно не добавлялись катионы переходных металлов для таких целей, как поддержание рН или осмолярности.

Хелатирующие агенты предпочтительно являются фармацевтически приемлемыми. Предпочтительные фармацевтически приемлемые допустимые хелатирующие агенты включают различные аминокарбоксилатные соединения, которые обладают емкостью для образования комплексов с лигандомметаллом с одним или более ионами переходного металла в растворе. Такие амино-карбоксилаты включают этилендиаминтетрауксусную кислоту (ΕΌΤΑ) и диэтилтриаминпентауксусную (ΌΤΡΑ), 1,2-бис(2аминофенокси)этан-ЫХ,№,№-тетрауксусную кислоту (ВАРТА), этиленгликоль-бис(2-аминоэтил)Ν,Ν,Ν',Ν'-тетрауксусную кислоту (ЕСТА) и другие амино-карбоксилатные соединения, имеющие одну или множество карбоксилатных групп. Можно также использовать любую производную соль этих амино-карбоксилатных хелатирующих агентов, например форму двунатриевой соли, при условии, что остается емкость хелатирующего агента для образования комплекса со свободными ионами переходного металла, присутствующего в композиции варианта ΤΕΡΙ или варианта ΤΕΡΙ. Также эффективны формы этих хелатирующих агентов, отличные от форм соли, включают различные сложные эфиры, ангидриды и галогенированные формы этих соединений.

Буфер

Уровень рН композиций ΤΕΡΙ или варианта ΤΕΡΙ влияет на растворимость белка и, следовательно, на его стабильность. См. Сйеи и др. (1999) 1. Ρΐιαηη. §с1еисе8 88(9):881-888. Предпочтительный диапазон рН для композиции в соответствии с настоящим изобретением составляет от приблизительно 4 до приблизительно 8 (например, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5 или 8), более предпочтительно от приблизительно 5 до приблизительно 6,5. Поскольку рН является существенным фактором для растворимости ΤΕΡΙ, использование буфера с тем, чтобы поддерживать подходящий уровень рН, может дополнительно увеличить устойчивость композиций. Таким образом, водные композиции в соответствии с настоящим изобретением могут дополнительно содержать буфер с тем, чтобы поддерживать уровень рН раствора. Предпочтительно, буфер представляет собой кислоту, в основном, не содержащую солевую форму, кислоту в форме соли или смесь кислоты и солевой формы.

Предпочтительно, рН композиции поддерживают с использованием аргининового или лизинового аминокислотного солюбилизирующего агента в форме основания в сочетании с кислотой, в основном не содержащей солевую форму. Такое сочетание обеспечивает более низкую осмолярность раствора, чем если бы в качестве буфера использовали кислоту и ее солевую форму в сочетании с аминокислотным основанием. Преимущество такого сочетания состоит в том, что в водную композицию можно включить более высокую концентрацию аргининового или лизинового аминокислотного солюбилизирующего агента и/или антиоксиданта (например, метионина), не выходя за пределы изотоничности раствора. Кислота, в основном, не содержащая солевую форму, означает, что кислота, служащая буферным агентом в водной композиции, обычно содержит меньше чем приблизительно 2% ее солевых форм.

Как правило, когда в водной композиции используют буфер, содержащий кислоту, он приготовлен с применением солевой формы кислоты или сочетания кислоты и солевой формы сопряженного с кислотой основания. Таким образом, например, буфер можно приготовить с применением кислоты с натриевой, калиевой, аммонийной, кальциевой и/или магниевой солью сопряженного с ней основания. В случае, если выбирают буфер, содержащий форму основания аргининового или лизинового солюбилизирующего агента в сочетании с кислотой, в основном, не содержащей солевую форму, предпочтительные буферы выбирают из лимонной кислоты, янтарной кислоты, фосфорной кислоты, глутаминовой кислоты, малеиновой кислоты, яблочной кислоты, уксусной кислоты, винной кислоты и аспарагиновой кислоты. Лимонная кислота и янтарная кислота особенно предпочтительны для использования в качестве буфера в сочетании с аргинином в форме свободного основания. В противном случае, как упомянуто выше, аргинин можно использовать в форме соли, такой как форма соли НС1 аргинина. В этом случае буфер обычно содержит сочетание кислоты, как описано выше, и солевой формы сопряженного с ней основания. Другие буферы, которые можно использовать, включают гистидин и имидазол. В целом, предпочтительные концентрации буфера составляют от приблизительно 0 до приблизительно 50 мМ (например, 0, 1, 2, 5,

- 8 008038

10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мМ), более предпочтительные концентрации составляют от приблизительно 5 до приблизительно 30 мМ.

Если используемый буфер представляет собой аминокислотное основание и кислоту, в основном, не содержащую солевую форму, можно приготовить композиции, содержащие ΤΡΡΙ или вариант ΤΡΡΙ, которые являются, в основном, изотоническими, без необходимости включать дополнительные изотонизирующие агенты, такие как хлорид натрия. Композиция, которая является, в основном, изотонической вызывает лишь минимальный поток воды или не вызывает потока воды через мембраны окружающих клеток после введения ίη νίνο. В целом, требуется изотоничность водных композиций, поскольку это уменьшает болезненность при введении и сводит к минимуму потенциальные гемолитические эффекты, связанные с гипертоническими или гипотоническими композициями. Изотоническое состояние соответствует осмолярности раствора от приблизительно 240 до приблизительно 340 мосмоль/л (например, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330 или 340 мосмоль/л), которое является предпочтительным в настоящем изобретении. Более предпочтительно, если изотоническое состояние в значительной степени достигается при осмолярности приблизительно 290 мосмоль/л.

В некоторых случаях, однако, в зависимости от требуемых свойств композиции ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ (например, рН и осмолярность), которые необходимо поддерживать, кислота, используемая в качестве буферного агента, может представлять собой солевую форму кислоты или смесь кислоты и ее солевой формы. В этом случае предпочтительный буфер представляет собой смесь кислоты и ее солевой формы. Кислота может быть представлена, например, лимонной кислотой, янтарной кислотой, фосфорной кислотой, глутаминовой кислотой, малеиновой кислотой, яблочной кислотой, уксусной кислотой, винной кислотой и аспарагиновой кислотой. Солевая форма кислоты может быть представлена натриевой, калиевой, кальциевой или магниевой солью сопряженного с ней основания. Особенно предпочтительными являются те буферы, в которых соль сопряженного основания находится в натриевой форме. Такие буферы включают лимонную кислоту/цитрат натрия, янтарную кислоту/сукцинат натрия, ортофосфорную кислоту/фосфат натрия, глутаминовую кислоту/глутамат натрия, малеиновую кислоту/малеат натрия, яблочную кислоту/малат натрия, уксусную кислоту/ацетат натрия, винную кислоту/тартрат натрия и аспарагиновую кислоту/аспартат натрия. Когда в качестве солюбилизирующего агента используют аргинин, даже в форме свободного основания, предпочтительным буфером является лимонная кислота/цитрат натрия или янтарная кислота/сукцинат натрия. В этом случае концентрация буфера предпочтительно составляет от приблизительно 5 до приблизительно 30 мМ (например, 5, 10, 15, 20, 25 или 30 мМ), более предпочтительно приблизительно 20 мМ.

При использовании сочетания аминокислотного основания в буфере с кислотой, в основном, не содержащем солевой формы, возможны композиции, близкие к изотоническим, содержащие более высокие концентрации стабилизирующей аминокислоты, чем можно достичь с использованием буферной системы, которая представляет собой смесь кислоты и ее солевой формы. Более высокие концентрации солюбилизирующего агента, связанного в значительной степени с изотоническими композициями, в таких случаях также приводят к увеличению устойчивости ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ и, таким образом, увеличению продолжительности хранения.

Например, при использовании лимонной кислоты, для получения буфера с основанием аргинина, добавленным в водную композицию, содержащую ΤΡΡΙ или вариант ΤΡΡΙ с уровнем рН 5,5, концентрацию аргинина можно увеличить до 300 мМ, в то время как изотоничность композиции еще поддерживается. Это приводит к почти 35% увеличению продолжительности хранения ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ при 50°С. Несмотря на то, что близкую продолжительность хранения ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ можно достичь с применением той же концентрации аргинина и лимонной кислоты/ацетата натрия в качестве буферного агента, аргинин следует добавить в кислотной форме с тем, чтобы достичь того же уровня рН, и конечная композиция является гипертонической. Возможность использовать более высокие концентрации аминокислоты в качестве первичного стабилизирующего агента устраняет потребность в более традиционных стабилизирующих агентах ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ, таких как бычий сывороточный альбумин или сывороточный альбумин человека, которые являются менее предпочтительными стабилизаторами из-за потенциального вирусного заражения.

Дополнительные стабилизирующие агенты

Композиции ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ в соответствии с настоящим изобретением могут содержать другие соединения, которые увеличивают эффективность или способствуют требуемым качествам ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ до тех пор, пока на первичный эффект стабилизации, достигнутый с помощью аминокислотного солюбилизирующего агента в сочетании с антиоксидантом не будет оказано неблагоприятное влияние. Например, разложение полипептида ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ вследствие размораживания или механического раскалывания в ходе обработки композиций ΤΡΡΙ или варианта ΤΡΡΙ в соответствии с настоящим изобретением можно ингибировать путем включения в них поверхностно-активных веществ с тем, чтобы понизить поверхностное натяжение на границе раздела раствор-воздух. Подходящие поверхностно-активные вещества представляют собой неионогенные поверхностно-активные вещества, включая сложные эфиры сорбита и полиэтиленоксида, такие как полисорбат 80 (Игссп 80) и полисорбат 20 (Игссп 20); сложные эфиры полиоксипропилена-полиэтиленоксида, такие как Ρΐυτοηίο Ρ68; спирты

- 9 008038 полиэтиленоксида, такие как ВгЦ 35; симетикон; полиэтиленгликоль, такой как РЕС400; лизофосфатидилхолин; и полиоксиэтилен-р-1-октилфенол, такой как Тритон Х-100. Классическая стабилизация фармацевтических препаратов поверхностно-активными веществами или эмульгаторами описана, например, у Ьеуше и др. (1991) 1. РагсШсга1 δοί. Тес11по1. 45(3):160-165. Предпочтительным поверхностно-активным веществом, используемым в практике настоящего изобретения, является полисорбат 80.

Другие стабилизирующие агенты, такие как альбумин, можно добавить в качестве опции с тем, чтобы дополнительно увеличить устойчивость композиций ТЕР1 или варианта ТЕР1. Известное количество альбумина можно добавить при концентрациях приблизительно 1% мас./об. или меньше. Сахар или сахарные спирты можно также включить в композиции, содержащие ТЕР1 или вариант ТЕР1 в соответствии с настоящим изобретением. Можно использовать любой сахар, такой как моно-, ди- или полисахарид или водорастворимый глюкан (например, фруктоза, глюкоза, манноза, сорбоза, ксилоза, мальтоза, лактоза, сахароза, декстран, пуллулан, декстрин, циклодекстрин, растворимый крахмал, гидроксиэтиловый крахмал и карбоксиметилцеллюлоза-Иа). Сахароза является самой предпочтительной сахарной добавкой. Можно использовать сахарные спирты (то есть, углеводороды С₄-С₈, с группой -ОН), например маннит, сорбит, инозит, галацитит, дульцит, ксилит или арабит. Маннит является самой предпочтительной добавкой сахарного спирта. Упомянутые выше сахара или сахарные спирты можно использовать по отдельности или в сочетании. Не существует фиксированного предела для используемого количества до тех пор, пока сахар или сахарный спирт растворим в жидком препарате и не оказывает неблагоприятного действия на эффекты стабилизации, достигнутые с применением способов в соответствии с настоящим изобретением. Предпочтительно, концентрация сахара или сахарного спирта лежит в диапазоне между приблизительно 1% вес./об. и приблизительно 15% вес./об., более предпочтительно между приблизительно 2% вес./об. и приблизительно 10% вес./об.

Приготовление стабильных композиций

Композиции в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно готовят путем предварительного смешивания солюбилизирующего агента, антиоксиданта, в качестве опции, буфера и любых других наполнителей до включения ТЕР1 или варианта ТЕР1. Последующее добавление предпочтительного количества солюбилизирующего агента и антиоксиданта с тем, чтобы достичь повышенной устойчивости ТЕР1 или варианта ТЕР1, рН композиции можно установить предпочтительно в пределах диапазона, раскрытого здесь, который является оптимальным для ТЕР1 или варианта ТЕРТ Несмотря на то, что рН можно установить после добавления ТЕР1 или варианта ТЕР1, предпочтительно установить его до добавления, поскольку это уменьшает риск денатурации. Затем можно использовать подходящие механические устройства для достижения правильного смешения компонентов.

Фармацевтические композиции

Предпочтительно, водные композиции в соответствии с настоящим изобретением либо находятся в форме, которую можно ввести субъекту, либо находятся в форме, которую можно использовать для приготовления композиции, которую можно ввести субъекту. Водные композиции, включающие ТЕР1 или варианты ТЕР1, можно разработать в виде унифицированной дозы, и они могут быть в форме инъекции или вливания, такой как раствор, суспензия или эмульсия. Предпочтительно водная композиция в соответствии с настоящим изобретением хранится в виде водной композиции с тем, чтобы воспользоваться преимуществом увеличенной устойчивости при хранении, достигаемым в соответствии с настоящим изобретением и как очерчено ниже. Фармацевтическую композицию ТЕР1 или варианта ТЕР1 предпочтительно стерилизуют посредством мембранной фильтрации и хранят в емкостях унифицированной дозы или мультидозы, таких как герметично закрытые флаконы или ампулы. Такие композиции также могут быть замороженными.

Дополнительные способы для разработки композиций являются общеизвестными в данной области техники и могут использоваться для дальнейшего увеличения устойчивости при хранении водных фармацевтических композиций ТЕР1 или варианта ТЕР1, если предусмотрено отсутствие нежелательного воздействия на положительные эффекты раскрытых здесь солюбилизирующих агентов, антиоксидантов и буферов. Полное обсуждение композиции и отбор фармацевтически приемлемых носителей, солюбилизирующих агентов, и т.д. может быть найдено в Кештд1оп'8 Рйаттасеибса1 8с1епсс5 (1990) (18⁴¹¹ еб., Маск РиЬ. Со., ЕаЮп. Репнкукаша).

Представленные ниже примеры приведены для иллюстрации, а не для ограничения. Все патенты, заявки на патенты и ссылки, процитированные в этом раскрытии, включены полностью в качестве ссылочного материала.

Экспериментальная часть

Следующие протоколы использовали в примерах 1-6, приведенных ниже с тем, чтобы определить действие отдельного солюбилизирующего агента и/или антиоксиданта на разложение ТЕР1 или варианта ТЕР1 и устойчивость во время хранения в водных композициях.

НРЬС с обращенной фазой

КР-НРЬС выполняли на системе \Уа1ег5 626 ЬС, оборудованной 717 автоматическими пипетками (\Уа1ег5 Сотротайоп, МбГотб, Мате), с применением колонки Уубас 214ВТР54 С₄ и предварительной колонки Уубас 214ССС54 (§ератабоп8 Сгоир, Непала, Са1гГотша). Колонки предварительно уравновесили

- 10 008038 подвижной фазой А (10% ацетонитрил, 0,1% ТЕЛ). Этот способ КР-НРЬС детектирует мономерные частицы ТЕР1 или варианта ТЕР1 в виде главного пика. Можно выявить другие пики, содержащие отдельные и множественные окисленные остатки метионина этого белка, а также пики, представляющие ацетилированные и карбамилированные формы ТЕР1 или варианта ТЕР1.

Ионообменная НРЬС (ΙΕΧ-НРЬС)

Ионнообменную (1ЕХ)-НРЬС выполняли на стеклянной колонке Рйаттас1а Мопо-8 НК 5/5 с применением системы \Уа1сг5 626 ЬС с 717 автоматическими пипетками разогрева/охлаждения, как описано у С11сп и др., выше. Колонку уравновесили 80% подвижной фазой А (70:30 об/об, 20 мМ ацетат натрия:ацетонитрил при рН 5,4) и 20% подвижной фазой В (70:30 об/об, 20 мМ ацетат натрия и 1М хлорид аммония:ацетонитрил при рН 5,4). После инжекции ТЕР1 или вариант ТЕР1 элюировали путем увеличения подвижной фазы В до 85% в течение 21 мин при скорости потока 0,7 мл/мин. ТЕР1 или вариант ТЕР1 элюировали приблизительно за 16,5 мин в виде отдельного пика и детектировали посредством поглощения υν при 280 нм с помощью детектора поглощения света \Уа1сг5 486. Сбор и обработку информации выполняли на системе Регкт-Е1тег ТигЬосйгот. Концентрацию белка оценивали путем интегрирования области пика и сравнения ее с калибровочной кривой, получаемой от образцов известных концентраций.

Измерение рН и осмолярности

Уровень рН раствора различных композиций измеряли с помощью рН-метра от Опоп (Мобе1 611, Опоп Кекеагсй 1псогрога1еб ЬаЬога1огу Ргобис1к Стоир, Вок1оп, Маккасйикейк). рН-метр калибровали в соответствии с калибровочной процедурой с двумя буферами, предложенной изготовителем, используя стандарт рН 4 (Икйег 8с1епййс, Са1. Ио. 8В 101-500) и стандарт рН 7 (Нкйег 8с1епйЕ1с, Са1. Ио. 8В107500).

Осмолярность раствора этих композиций измеряли с помощью Осмометра Давления Пара от Сексот (Мобе1 5500, Сексот 1пс., Ьодап, и1ай). Осмометр калибровали по двум стандартам, поставляемым изготовителем: стандарт 290 ммоль/кг (Сексот, Кеогбег Ио. ОА-010) и стандарт 1000 ммоль/кг (Сексот, Кеогбег Ио. ОА-029).

Другие материалы и способы

Буферный раствор композиции приготовили с помощью СЫтои Тесй 8егу1се. Для использования в следующих исследованиях были получены стеклянные 10 см³ флаконы типа I и ламинированные пробки без силикона Эа1куо Ситтт

Уровни растворенного кислорода в флаконах ТЕР1 или варианта ТЕР1 определяли с помощью Иоуа ВюРтоД1е 200. Наблюдаемую оценку постоянной скорости первого порядка для окисления ТЕР1 выполняли с применением программы Ка1е1баСгарй® (8упегду 8ой^ате, Кеабшд Реппкукаша).

Пример 1. Анализ протромбинового времени

Подходящие анализы протромбинового времени описаны в и8 Ра1еп1 5888968 и в XVО 96/40784. Вкратце, протромбиновое время можно определить с применением коагулометра (например, Соад-АМа1е МТХ II от Огдапоп Текшка). Подходящим буфером для анализа является 100 мМ ИаС1, 50 мМ Тик, доведенный до рН 7,5, содержащий 1 мг/мл бычий сывороточный альбумин. Дополнительными требуемыми реагентами являются нормальная плазма человека (например, 'Уетйу 1 от Огдапоп Текшка), реагент тромбопластина (например, 81тр1ак1ш Ехсе1 от Огдапоп Текшка) и стандартный раствор ТЕР1 (например, 20 мкг 100% чистого а1а-ТЕР1 (или его эквивалента) на каждый мл буфера для анализа).

Стандартную кривую получали путем анализа времени коагуляции ряда разбавлении стандартного раствора ТЕР1, например, до конечных концентраций в пределах от 1 до 5 мкг/мл. Для определения времени свертывания образец или стандарт ТЕР1 сначала разбавляли в буфере для анализа. Затем добавляли нормальную плазму человека. Реакцию свертывания запускали путем добавления реагента тромбопластина. Затем инструмент записывает время свертывания. Линейную стандартную кривую ТЕР1 получили из графика логарифма времени свертывания против логарифма концентрации ТЕР1. Стандартную кривую выверили на основании чистоты стандарта ТЕР1 для соответствия эквивалентной концентрации ТЕР1 100% чистого стандарта. Например, если стандарт представляет собой препарат а1а-ТЕР1, который является биохимически чистым на 97% (то есть, он содержит 3% по весу молекулярных частиц без биологической активности ТЕР1), тогда концентрацию каждого разбавления стандарта умножают на 0,97, чтобы получить фактическую концентрацию ТЕР1. Таким образом, стандарт ТЕР1, в котором присутствует 1,0 мкг/мл, основанный на фактическом весе на мл препарата, который является чистым на 97%, будет эквивалентен и расцениваться как концентрация 1,0х0,97, или 0,97 мкг/мл. Также возможны другие меры эффективности ТЕР1 в лечении сепсиса так же, как множества других показаний, включая такие измерения, как баллы 28-дневного снижения смертности от всех причин и улучшения состояния некоторой множественной дисфункции органов (МОИ) относительно плацебо.

Пример 2. Влияние концентрации Ь-аргинина на устойчивость а1а-ТЕР1 в различных композициях

Композиции А1а-ТЕР1, содержащие а1а-ТЕР1 с конечной концентрацией 0,15 мг/мл при рН 5,5, приготовили из 0,6 мг/мл растворов запаса, которые подвергли обмену с буфером посредством диализа, проанализировали на конечные концентрации а1а-ТЕР1, с применением спектроскопии υν/ν® и разбавили до стартовой целевой концентрации 0,15 мг/мл, используя буфер лимонной кислоты, с добавлением цитрата натрия или без него. Добавление цитрата натрия использовали только для тех образцов, в которых

- 11 008038

Ь-аргининовый солюбилизирующий агент присутствовал в виде Ь-аргинина НСР в то время как лимонную кислоту саму по себе использовали для получения буферов в композициях, содержащих основание Ь-аргинина.

Эти растворы затем разделяли на аликвоты (1 мл в каждой) во 3 см³ флаконы для хранения в устойчивом состоянии. Достаточное количество флаконов оставили для начальной во времени точки при измерениях концентрации. Остальную часть флаконов поместили в термостат при 50°С для ускоренного исследования устойчивости. Концентрации солюбилизирующего агента и буфера в композициях четырех образцов, содержащих 0,15 мг/мл а1а-ТРР1 при рН 5,5, приведены ниже:

1) 20-150 мМ НС1 Р-аргининовый солюбилизирующий агент и 10 мМ буфер лимонная кислота/цитрат натрия;

2) 20-150 мМ солюбилизирующий агент Р-аргининового основания, титрованный до рН 5,5 лимонной кислотой;

3) 100-300 мМ НС1 Р-аргининовый солюбилизирующий агент и 10 мМ буфер лимонная кислота/цитрат натрия; и

4) 100-300 мМ солюбилизирующий агент Р-аргининового основания, титрованный до рН 5,5 лимонной кислотой.

В дни 3, 7, 14 и 30 содержимое каждого флакона переносили в 1,7 мл пробирку микроцентрифуги и затем центрифугировали при 10000 об./мин в течение приблизительно 2 мин. После центрифугирования растворимый белок в образцах отделяли от агрегированного/осажденного белка. Количество растворимого белка определяли способом ΙΕΧ-НРЬС (СИеп и др. (1999) Г РИагт. 8с1. 88(9):881-888). Данные концентраций как функцию времени хранения затем наложили на модель экспоненциального затухания первого порядка (¥=¥_ое'^к1) для вычисления периода полураспада во время хранения для остающегося растворимого белка с применением графического программного обеспечения Ка1е1йа(лгар11®.

Значения периода полураспада во время хранения (ΐ_1/2) для композиций а1а-ТРР1 построены как функция концентрации Ь-аргинина на фиг. 1. Эти данные показывают увеличение периода полураспада а1а-ТРР1 во время хранения с увеличением концентрации Ь-аргинина. При применении только Ьаргининового солюбилизирующего агента композиции показывают значительное увеличение периода полураспада во время хранения по сравнению с композициями с небольшой добавкой солюбилизирующего агента или без него.

Пример 3. Кинетика разложения композиций а1а-ТРР1

Одним из главных путей разложения для а1а-ТРР1 во время хранения при 2-8°С является окисление остатков метионина.

Окислительные частицы метионина можно рассматривать как частицы от ранней элюции до частиц главного пика способа обратно-фазной НРЬС (КР-НРЕС). На фиг. 6 представлена хроматограмма КРНРЕС образца а1а-ТРР1, который демонстрирует анализ окисленных частиц. Пик А содержит множество частиц Ме18О, пик С содержит отдельные частицы Ме18О, пик ϋ представляет собой материал, содержащий а1а-ТРР1, замещенный норвалином, пики Е и Р представляют собой ацетилированный и/или карбамилированный а1а-ТРР1. Частицы пиков А и С интегрировали по отдельности. Все остальные частицы, включая главный пик и пики ϋ, Е и Р, группировали как частицы главного пика.

Для понимания кинетики разложения при 30°С 2 мл образцы а1а-ТРР1 приготовили, как описано в примере 2, каждый из которых содержал 0,15 мг/мл ΤΡΡΙ, 20 мМ буфер лимонная кислота/цитрат натрия и 300 мМ Б-аргинин. Этими образцами заполнили 10 см³ стеклянные флаконы (2 мл образцов на каждый) и выдерживали при 30°С. Потерю растворимого белка из-за агрегации/осаждения исследовали в первую очередь, поскольку этот феномен приводит к уменьшению общей площади под пиками, основанной на НРЕС. После 8 недель хранения при 30°С образцы устойчивости показали уменьшение от 2 до 5% общей площади под пиками из 1ЕХ-НРЕС и КР-НРЕС, указывая относительно малое количество агрегации/осаждения а1а-ТЕР1 с применением вышеуказанной композиции. Затем оценили разложение за счет окисления метионина путем отображения на графике содержания частиц главного пика, частиц пика А и частиц пика С из КР-НРЕС как функцию времени хранения при 30°С. Спаду частиц главного пика сопутствовало возрастание частиц пика С и частиц пика А. Приблизительно 11 и 9% окисленных частиц после 8 недель хранения сформировались в виде отдельных частиц Ме18О и множественных частиц Ме18О, соответственно. Это говорит о том, что окисление метионина является важным путем разложения при стандартных условиях хранения, на основании доступных способов детекции. Результаты, приведенные в табл. 1, также показывают, что формирование частиц Ме18О растет с температурой.

Таблица 1. Влияние температуры на окисление А1а-ТРР1

Температура	Область пика А1а-ТЕР1 Мер5О (пик С) из КР-НРЪС (%)
	Исходный материал	После 4 недель
40°С	СО	23, 7
30°С	6, 8	10, 4
2-8°С	6, 8	7,0

- 12008038

Пример 4. Влияние растворенного кислорода на устойчивость α1α-ΤΕΡΙ

Образцы готовили при наличии композиции, описанной в примере 3. Затем варьировали уровень растворенного кислорода путем освобождения свободного объема флакона с помощью смеси замещающих газов азот/воздух с помощью подготовленного ферментера. В каждом образце установили уровень рН 5,5 в буфере. С тем, чтобы способствовать уравновешиванию замещающего газа между свободным объемом и жидкостью, флаконы встряхивали при 200 об./мин в течение одного часа, в ходе освобождения. Флаконы затем содержали при 30°С, и образцы α1α-ΤΕΡΙ извлекали в намеченные моменты времени для анализов стабильности. Уровень растворенного кислорода в каждом флаконе повторно измеряли в моменты времени для анализа устойчивости.

В начальном пилотном исследовании флаконы α1α-ΤΕΡΙ готовили при наличии уровней растворенного кислорода, представляющих 0, 20, 100 и 200% насыщения воздухом (если принимать 21% содержание кислорода за 100% условие насыщения). Результаты оценки устойчивости при 30°С показаны на фиг. 2. Результаты указывают на то, что окисление αΙα-ΤΕΡΙ было в значительной степени ингибировано при уменьшении уровня кислорода почти до 0% насыщения воздухом, это означает, что атмосфера над жидкостью являлась, по существу, атмосферой чистого азотного замещающего газа. Улучшение устойчивости, следующее из уменьшения растворенного кислорода от 200 до 20% насыщения воздухом, напротив, было относительно незначительным.

Затем проводили второе исследование для более конкретной оценки рабочих характеристик устойчивости образцов αΙα-ΤΕΡΙ, содержащих растворенный кислород в пределах от 0 на 12% насыщения воздухом. В этом диапазоне обнаружили значительное влияние на устойчивость. Зависимость между периодом полураспада αΙα-ΤΕΡΙ во время хранения при 30°С и содержанием растворенного кислорода показана на фиг. 3. Исключительно сильного улучшения устойчивости αΙα-ΤΕΡΙ достигли, когда уровень кислорода в образце уменьшили до менее чем 5% насыщения воздухом (приблизительно 1% содержание кислорода). Уровень растворенного кислорода в отдельных флаконах образцов также измеряли в моменты времени, соответствующие анализам концентрации αΙα-ΤΕΡΙ, и значительное изменение в содержании растворенного кислорода в пузырьках не наблюдали. Эти результаты показывают, что использование замещающего газа, такого как азот, с тем, чтобы заместить достаточное количество кислорода, может значительно улучшить устойчивость αΙα-ΤΕΡΙ при хранении, если уменьшить концентрацию растворенного кислорода до достаточно низкого уровня. В связи с этим, замещающие газы, такие как азот, считаются антиоксидантами, поскольку они ингибируют окисление αΙα-ΤΕΡΙ.

Пример 5. Влияние хелаторов металлов на окисление αΙα-ΤΕΡΙ

Основной раствор αΙα-ΤΕΡΙ при 10 мг/мл разбавили до 0,15 мг/мл буфером, содержащим хелаторы металлов ΕΌΤΆ или ΌΤΡΆ при концентрации либо 1, либо 4 мМ. Эти композиции также содержали 20 мМ лимонную кислоту/цитрат натрия и 300 мМ Ь-аргинин в качестве солюбилизирующего агента. Разбавленными растворами αΙα-ΤΕΡΙ заполняли 10 см³ стеклянные флаконы (2 мл образца в каждом) и хранили при температурах либо 2-8°С, либо 30°С для анализа устойчивости.

Кривые устойчивости главной пиковой области, оставшейся при температуре хранения 30°С, полученные с применением анализа ΚΡ-НГЬС, показаны на фиг. 4. Данные периода полураспада во время хранения, полученные из этого исследования, при условиях 2-8°С и 30°С, представлены в табл. 2, ниже. Присутствие хелаторов металлов стабилизировало αΙα-ΤΕΡΙ в зависимости от концентрации, что говорит о том, что окисление остатка метионина αΙα-ΤΕΡΙ катализируется металлическими ионами в растворе. Независимо от фактического механизма, хелаторы металлов служат для предотвращения окисления а1аΤΕΡΙ и поэтому эффективны в качестве антиоксидантов.

Пример 6. Действие свободной аминокислоты метионина на окисление α1α-ΤΕΡΙ

Основной 10 мг/мл раствор α1α-ΤΕΡΙ разбавили до 0,15 мг/мл буфером, содержащим метионин. Эти композиции также содержали 20 мМ лимонную кислоту/цитрат натрия и 300 мМ Ь-аргинин в качестве солюбилизирующего агента. Разбавленными растворами α1α-ΤΕΡΙ заполняли 10 см³ стеклянные флаконы (2 мл образца в каждом) и хранили при температурах либо 2-8°С, либо 30°С для анализов устойчивости.

Кривые устойчивости главной пиковой области, оставшейся при температуре хранения 30°С, полученные с применением анализа ΚΡ-НГЬС, показаны на фиг. 5. Данные периода полураспада во время хранения, полученные из этого исследования, при условиях 2-8°С и 30°С предоставлены в табл. 2, ниже. Эти данные показывают, что окисление остатка метионина α1α-ΤΕΡΙ эффективно ингибируется включением в композицию от 2 до 10 мМ метионина. Фактически при температуре хранения 2-8°С окислительное разрушение α1α-ΤΕΡΙ не было обнаружено в присутствии от 2 до 10 мМ метионина после 6 месяцев хранения. Кроме того, устойчивость композиций αΠ-ΤΕΡΙ, содержащих Ь-аргининовый солюбилизирующий агент, была дополнительно увеличена при помощи антиоксиданта, в этом случае, метионинового поглотителя кислорода. Без ограничений какой-либо частной теорией, полагается, что свободный метионин ингибирует окисление α1α-ΤΕΡΙ путем обеспечения расходуемого метионина таким образом, что вероятность повреждения остатков метионина, связанных с белком, снижается.

Окисление метионина может быть вызвано множеством факторов, включая наличие ионов металлов, растворенного кислорода и перекиси. Для предотвращения окисления метионина в белках было идентифицировано несколько антиоксидантов, таких как хелатирующие агенты, поглотители кислорода,

- 13 008038 восстанавливающие агенты и замещающие газы. Хелатирующие агенты связываются с ионами металлов, которые катализируют окислительные реакции. Поглотители кислорода реагируют с кислородом, имея преимущества в окислении, и, таким образом, защищают белки за счет удаления источника окисления. Восстанавливающие агенты смягчают действие окислителей при окислении белков. Замещающие газы уменьшают парциальное давление кислорода над жидкостью и, следовательно, концентрацию растворенного кислорода.

Эффективность хелатирующих агентов металлов, таких какие тестировали в примере 4, и метионина - поглотителя кислорода в уменьшении окисления а1а-ТБР1 сравнили в табл. 2. По сравнению с контрольным образцом (композиция, приведенная в примере 3), содержащим 0,15 мг/мл а1а-ТРР1, 20 мМ буфер лимонной кислоты/цитрата натрия и 300 мМ Ь-аргинин, все антиоксиданты увеличили период полураспада а1а-ТБР1 во время хранения. Среди всех условий, подвергнутых оценке, включение в композицию а1а-ТЕР1 10 мМ метионина проявило особенную эффективность в стабилизации белка а1а-ТЕР1 против окисления.

Таблица 2. Сравнение действия антиоксидантов на устойчивость А1а-ТЕР1

Антиоксиданты	Время полураспада при хранении при 28°С (месяцы)	Время полураспада при хранении при 30°С (месяцы)
Хелаторы металлов (Пример 4)
1 мМ ΕϋΤΑ	63	25
4 мМ ΕϋΤΑ	157	28
1 мМ ϋΤΡΑ	52	11
4 мМ СТ РА	160	23
Поглотители кислорода (Пример 5)
2 мМ метионин	Разложение не было отмечено вплоть до шести месяцев хранения	23
5 мМ метионин	24
10 мМ метионин	39
Контрольная композиция
20 мМ цитрат, 300 мМ аргинин, рН 5,5	36	5, 3

Пример 7. Влияние концентрации белка а1а-ТЕР1 на окисление а1а-ТЕР1

Влияние концентрации а1а-ТЕР1 на окисление а1а-ТЕР1 исследовали для концентраций а1а-ТЕР1 в пределах от 0,15 до 10 мг/мл. Образцы стабильности готовили, разбавляя основную композицию 10 мг/мл а1а-ТЕР1 до 3, 1, 0,6, 0,3 и 0,15 мг/мл 20 мМ буфером лимонной кислоты/цитрата натрия, используемым в примере 3. Образцы также содержали 300 мМ Ь-аргинин. Неразбавленными и разбавленными основными пробами впоследствии заполнили 10 см³ стеклянные флаконы (2 мл образца в каждом), закрыли и хранили либо при 2-8°С, либо при 30°С для оценки устойчивости.

Кривые устойчивости для главного пика, оставляемого КР-НРТС как при ускоренном температурном условии 30°С, так и при фактическом условии хранения 2-8°С, показывают, что период полураспада во время хранения а1а-ТРР1 имеет, по существу, обратную зависимость от концентрации белка. Периоды полураспада этих кривых устойчивости приведены в табл. 3. Скорость окисления увеличивается при более низких концентрациях белка. Без ограничений какой-либо частной теорией, полагается возможным, что любое увеличение данной скорости может быть вызвано увеличением соотношения окислителей к молекулам белка в растворе.

Таблица 3. Период полураспада во время хранения главного пика, оставляемого КР-НРЬС для ΤΕΡΙ фазы при различных концентрациях после хранения либо при 30°С, либо при 2-8°С

Температура хранения	Т1/2 (месяцы) во время хранения при концентрации белка
	10 (мг/мл)	3 (мг/мл)	1 (мг/мл)	0,6 (мг/мл)	0,3 (мг/мл)	0,15 (мг/мл )
30°С	22	28	9,3	8,5	6,4	5,6
2-8°С	195	157	98	85	59	44

Пример 8. Исследование выживания

Исследование перевязки и пункции слепой кишки мышей проводили для сравнения свежеприготовленного материала клинической марки рекомбинантного а1а-ТЕР1 (γΤΕΡΙ) (ΤΕΡΙ92) с материалом клинической марки, который был частично дезамидирован и окислен (ΤΕΡΙ 78). Эта модель вызывает многомикробное внутрибрюшинное и общее заражение путем прямой фекальной инфекции и некроза слепой кишки, что в близкой степени имитирует внутрибрюшной сепсис человека. Ора1 и др., С1пнса1 Саге МесИсше 29, 13-18, 2001.

- 14008038

Оба препарата ΤΕΡΙ приготовили в соответствии с описанием в заявках: регистрационный номер 60/494546, поданной 13 августа 2003 г., регистрационный номер 60/509277, поданной 8 октября 2003 г. и регистрационный номер 60/512199, поданной 20 октября 2003 г. Эти заявки включены полностью в качестве ссылочного материала. Либо γΤΡΡΙ 78, γΤΡΡΙ 92, либо контроль разбавителя давали в слепой форме более 48 ч (§р. ц12 ч х четыре дозы). До и спустя 48 ч после хирургической процедуры брали кровь для определения уровня количественной бактериемии, эндотоксина и цитокинов (фактор некроза опухолиальфа и интерлейкин-6). За животными наблюдали ежедневно и регистрировали смертельные случаи, как только они происходили. Все животные проходили оценку вскрытия на гистологическое свидетельство повреждения органов и количественную бактериологию в конце экспериментального периода.

Графики выживания Каплана-Мейера изображены на фиг. 7. Значительное преимущество в выживании наблюдалось у мышей, которые получали свежеприготовленный γΤΡΡΙ по сравнению с частично окисленной, дезамидированной формой γΤΡΡΙ. Обе группы γΤΡΡΙ были в лучшем состоянии, чем мыши, которые получали разбавитель в контрольной группе. Как и ожидалось, ложно прооперированные мыши (хирургическое вмешательство с идентификацией слепой кишки, но без перевязки и пункции) пережили семидневный период исследования. Между двумя группами, обработанными γΤΡΡΙ, не было значительных различий во вторичных результатах бактериемии, наличии в крови эндотоксинов или выработке цитокина.

Это исследование демонстрирует, что ΤΕΡΙ, как представляется, предоставляет преимущество в выживании посредством механизма, который не объясняется уровнями в крови бактерий, эндотоксина или цитокинов. Дезамидированный, окисленный ΤΡΡΙ обеспечивает меньшую защиту, чем свежеприготовленный ΤΡΡΙ.

Claims

1. Водная композиция содержащая от приблизительно 0,05 до приблизительно 15 мг/мл ΤΡΡΙ или варианта ΤΕΡΙ;

от приблизительно 50 до приблизительно 600 мМ солюбилизирующего агента, выбранного из группы, состоящей из (1) аргинина или его аналога, (ίί) лизина или его аналога и (ш) смесей (1) и (и); и антиоксидант, выбранный из группы, состоящей из (1) газа, замещающего кислород, (ίί) поглотителя кислорода или свободных радикалов, (ш) хелатирующего агента и (ίν) их смесей, где водная композиция обладает процентной устойчивостью к агрегации, составляющей приблизительно 45% или более; процентной устойчивостью к окислению, составляющей приблизительно 45% или более; и рН от приблизительно 4 до приблизительно 8.

2. Композиция по п.1, содержащая вариант ΤΕΡΙ, который является приблизительно на 70% или более гомологичным по отношению к ΤΕΡΙ (ЗЕО ΙΌ N0:1).

3. Композиция по п.2, в которой вариант ΤΕΡΙ представляет собой αΙα-ΤΕΡΙ.

4. Композиция по п.1, в которой солюбилизирующий агент представляет собой аргинин и аргинин находится в форме, выбранной из группы, состоящей из соли соляной кислоты, Ь-аргинина и свободного основания.

5. Композиция по п.1, содержащая приблизительно 300 мМ солюбилизирующего агента.

6. Композиция по п.1, в которой антиоксидант представляет собой газ, замещающий кислород.

7. Композиция по п.6, содержащая растворенный кислород в концентрации, меньшей чем приблизительно 10% по отношению к концентрации растворенного кислорода в водной композиции, включающей ΤΕΡΙ или вариант ΤΕΡΙ, которая не содержит газ, замещающий кислород.

8. Композиция по п.6, в которой газ, замещающий кислород, выбран из группы, состоящей из воздуха, обогащенного азотом, кислорода, обогащенного азотом, азота, инертного газа, метана, этана, пропана, углекислого газа и их смесей.

9. Композиция по п.8, в которой замещающий газ представляет собой азот.

10. Композиция по п.1, в которой антиоксидант представляет собой поглотитель кислорода или свободных радикалов или хелатирующий агент, причем антиоксидант присутствует в концентрации от приблизительно 0,01 до приблизительно 20 мМ.

11. Композиция по п.10, в которой антиоксидант присутствует в концентрации от приблизительно 1 до приблизительно 10 мМ.

12. Композиция по п.1, в которой антиоксидант представляет собой поглотитель кислорода или свободных радикалов и присутствует в концентрации от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 мМ.

13. Композиция по п.1, в которой антиоксидант представляет собой поглотитель кислорода или свободных радикалов, выбранный из группы, состоящей из метионина, аскорбиновой кислоты, аскорбата натрия, Ь-альфа токоферола, ОЬ-альфа токоферола, Ό-альфа токоферола, ацетата Ь-альфа токоферола, ацетата БЬ-альфа токоферола, ацетата Б-альфа токоферола, бета-каротина, селена, пиритинола, пропилгаллата, бутилированного гидроксианизола, бутилированного гидрокситолуола, бутилированного гидрокситолуолметионина и их смесей.

- 15 008038

14. Композиция по п.13, в которой антиоксидант представляет собой метионин и метионин является Ь-метионином.

15. Композиция по п.13, в которой антиоксидант представляет собой метионин, где метионин присутствует в таком количестве, что композиция содержит мольное отношение метионина, не принадлежащего ΤΕΡΙ, к метионину ΤΕΡΙ от приблизительно 1:1 до приблизительно 1000:1.

16. Композиция по п.1, в которой антиоксидант представляет собой хелатирующий агент, выбранный из группы, состоящей из:

(ί) амино-карбоксилатного соединения или его производного;

(ίί) ΕΌΤΑ или его производного;

(ίίί) ΌΤΡΆ или его производного;

(ίν) ΒΑΡΤΑ или его производного;

(ν) ΕΟΤΑ или его производного и (νί) смесей (ίί), (ίίί), (ίν) и (ν).

17. Композиция по п.1, рН которой составляет от приблизительно 5 до приблизительно 6,5.

18. Композиция по п.1, осмолярность которой составляет от приблизительно 240 до приблизительно 600 мосмоль/л.

19. Композиция по п.18, осмолярность которой составляет приблизительно 290 мосмоль/л.

20. Композиция по п.1, период полураспада которой во время хранения составляет от приблизительно 1 до приблизительно 24 месяцев при температуре приблизительно 30°С.

21. Композиция по п.1, дополнительно содержащая буфер, выбранный из группы, состоящей из:

(ί) кислоты, в основном не содержащей солевой формы;

(ίί) кислоты в форме соли и (ίίί) смеси кислоты и солевой формы.

22. Композиция по п.21, в которой буфер представляет собой кислоту, в основном не содержащую солевую форму, при этом кислота выбрана из группы, состоящей из лимонной кислоты, янтарной кислоты, фосфорной кислоты, глутаминовой кислоты, малеиновой кислоты, яблочной кислоты, уксусной кислоты, винной кислоты и аспарагиновой кислоты.

23. Композиция по п.21, в которой буфер содержит смесь кислоты и солевой формы, где кислота выбрана из группы, состоящей из лимонной кислоты, янтарной кислоты, фосфорной кислоты, глутаминовой кислоты, малеиновой кислоты, яблочной кислоты, уксусной кислоты, винной кислоты и аспарагиновой кислоты, и солевая форма кислоты выбрана из группы, состоящей из натриевой, калиевой, кальциевой и магниевой соли основания, сопряженного с кислотой.

24. Композиция по п.23, в которой буфер выбран из группы, состоящей из лимонной кислоты/цитрата натрия, янтарной кислоты/сукцината натрия, фосфорной кислоты/фосфата натрия, глутаминовой кислоты/глутамата натрия, малеиновой кислоты/малеата натрия, яблочной кислоты/малеата натрия, уксусной кислоты/ацетата натрия, винной кислоты/тартарата натрия и аспарагиновой кислоты/аспартата натрия.

25. Композиция по п.21, в которой буфер присутствует в концентрации от приблизительно 5 до приблизительно 30 мМ.

26. Композиция по п.1, где ее процентная устойчивость к агрегации составляет от приблизительно 45% или более до приблизительно 50% или более.

27. Композиция по п.1, где ее процентная устойчивость к агрегации составляет от приблизительно 45% или более до приблизительно 99% или более.

28. Композиция по п.1, где ее процентная устойчивость к окислению составляет приблизительно 89% или более.

29. Композиция по п.1, где ее процентная устойчивость к окислению составляет от приблизительно 45% или более до приблизительно 99% или более.

30. Фармацевтическая композиция, содержащая водную композицию по п.1 и фармацевтически приемлемый наполнитель.

31. Фармацевтическая композиция по п.30, где ее процентная устойчивость к агрегации составляет от приблизительно 45% или более до приблизительно 99% или более.

32. Фармацевтическая композиция по п.30, где ее процентная устойчивость к окислению составляет от приблизительно 45% или более до приблизительно 99% или более.