EA007738B1

EA007738B1 - Макроциклические пептиды, обладающие активностью в отношении вируса гепатита с

Info

Publication number: EA007738B1
Application number: EA200400886A
Authority: EA
Inventors: Монсе Лина-Брюне; Вида Ж. Гори
Original assignee: Бёрингер Ингельхайм (Канада) Лтд.
Priority date: 2002-01-30
Filing date: 2003-01-24
Publication date: 2006-12-29
Also published as: ES2316718T3; NO20043591L; PE20030818A1; EA200400886A1; KR20040077899A; CN1639187A; EP1472278A2; JP4040578B2; DE60324660D1; ECSP045243A; RS67004A; BR0307297A; AR038330A1; TW200307692A; UY27630A1; ZA200405639B; ATE414098T1; CA2369711A1; WO2003064455A2; UA78014C2

Abstract

Соединения формулы (I)в которых Rобозначает гидрокси или NHSOR, где Rобозначает С-Салкил, С-Сциклоалкил или С-Салкил-С-Сциклоалкил, которые все необязательно замещены 1-3 заместителями, выбранными из ряда, включающего галоген, циано, нитро, ОС-Салкил, амидо, амино или фенил, или Rобозначает С- или Сарил, необязательно замещенный 1-3 заместителями, выбранными из ряда, включающего галоген, циано, нитро, С-Салкил, ОС-Салкил, амидо, амино или фенил; Rобозначает С-Сциклоалкил и Rобозначает циклопентил; или их фармацевтически приемлемые соли, которые можно применять в качестве ингибиторов NS3-протеазы HCV.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к соединениям, способам их синтеза, композициям и способам лечения инфекции, вызываемой вирусом гепатита С (НСУ). В частности, настоящее изобретение относится к новым пептидным аналогам, фармацевтическим композициям, содержащим такие аналоги, и к способам применения этих аналогов для лечения вызываемой НСУ инфекции.

Предпосылки создания изобретения

Вирус гепатита С (НСУ) является основным возбудителем гепатита, относящегося к не-А, не-Б гепатиту, который передается при переливании крови и поражает людей во всем мире. Установлено, что свыше 200 миллионов людей в мире заражено вирусом. Большой процент носителей становится хронически инфицированным и у многих пациентов это приводит к хроническому заболеванию печени, так называемому хроническому гепатиту С. В свою очередь, эта группа больных имеет высокий риск заболевания такой серьезной болезнью печени, как цирроз печени, печеночно-клеточный рак и последняя стадия болезни печени, приводящая к смерти.

Механизм, с помощью которого происходит сохранение вируса НСУ в организме и который обусловливает высокий коэффициент заболеваемости хронической болезнью печени, пока недостаточно изучен. Неизвестно, как НСУ взаимодействует с иммунной системой хозяина и преодолевает ее действие. Кроме того, еще не выявлены также роли клеточных и гуморальных иммунных ответов в защите от НСУ-инфекции и при заболевании гепатитом. Имеются данные о том, что для профилактики связанного с переливанием крови вирусного гепатита можно применять иммуноглобулины, однако, Центр по контролю заболеваемости в настоящее время не рекомендует для этой цели применять лечение с использованием иммуноглобулинов. Отсутствие эффективного защитного иммунного ответа затрудняет разработку вакцины или адекватных профилактических мер после контакта, поэтому в ближайшее время надежды, в основном, возлагаются на антивирусные средства.

С целью выявления фармацевтических агентов, обладающих эффективностью в отношении лечения НСУ-инфекции, были проведены различные клинические исследования с участием пациентов, страдающих хроническим гепатитом С. В этих исследованиях применяли интерферон-альфа индивидуально или в сочетании с другими антивирусными агентами. Эти исследования позволили установить, что у основного большинства участников эксперимента не было обнаружено реакции на такие схемы лечения, а из тех участников, которые оказались чувствительными к лечению, у большей части после окончания лечения происходил рецидив.

Таким образом, до последнего времени терапия с использованием интерферона (ΙΡΝ) оставалась единственным доступным методом лечения пациентов, страдающих хроническим гепатитом С, которая обладала доказанной в клинических условиях эффективностью. Однако эффективность такого лечения сохраняется в течение непродолжительного периода времени, и, кроме того, лечение интерфероном вызывает серьезные побочные действия (т. е. ретинопатию, тиреоидит, острый панкреатит, депрессию), что снижает качество жизни пациентов, подвергающихся лечению. В настоящее время интерферон в сочетании с рибавирином предложен для лечения пациентов, не чувствительных к ΙΡΝ при его индивидуальном применении. Однако побочные действия, вызываемые ΙΡΝ, не уменьшаются при такой совместной терапии. Установлено, что пэгилированные формы интерферонов, такие как ΡΕΟ-Ιηίτοη® и Редакук®, могут частично снижать указанные вредные побочные действия, однако, антивирусные лекарственные препараты все еще остаются основным средством для орального лечения НСУ.

Таким образом, существует необходимость в разработке эффективных антивирусных агентов для лечения НСУ-инфекции, которые были бы лишены недостатков существующих методов лечения, основанных на применении фармацевтических средств.

НСУ представляет собой заключенную в оболочку положительную цепь РНК-ового вируса семейства Р1ау1ушбае. Геном НСУ, представленный одноцепочечной РНК, состоит приблизительно из 9500 нуклеотидов и имеет одну открытую рамку считывания (ОРС), которая кодирует один большой полипротеин, состоящий примерно из 3000 аминокислот. В зараженных клетках этот полипротеин расщепляется во многих сайтах клеточными и вирусными протеазами с образованием структурных и неструктурных (N8) протеинов. В случае НСУ под действием двух вирусных протеаз образуются зрелые неструктурные протеины (N82, N83, Ν84Α, Ν84Β, Ν85Α и Ν85Β). Первая из указанных протеаз, которая пока еще недостаточно охарактеризована, расщепляет связь Ν82-Ν83 (далее в контексте настоящего описания обозначена как Ν82/3-протеаза; вторая представляет собой сериновую протеазу, содержащуюся в Νконцевой области Ν83 (далее обозначена как №3-протеаза), и она опосредует все последующие расщепления, происходящие по ходу транскрипции Ν83, как в цис-ориентации в сайте расщепления Ν83-Ν84Α, так и в транс-ориентации в остальных сайтах Ν84Α-Ν84Β, Ν84Β-Ν85Α, Ν85Α-Ν85Β. Протеин Ν84Α, вероятно, обладает множественными функциями, действуя в качестве кофактора для Ν83-протеазы и возможно способствуя мембранной локализации Ν83 и других компонентов вирусных репликаз. Образование комплекса протеазы Ν83 с Ν84Α, вероятно, необходимо для процессирования, усиления протеолитической эффективности во всех сайтах. Протеин Ν83 обладает также нуклеозидтрифосфатазной активностью и РНК-геликазной активностью. Ν85Β представляет собой РНК-зависимую РНК-полимеразу, принимающую участие в репликации НСУ.

- 1 007738

Общая стратегия разработки антивирусных агентов предусматривает инактивацию кодируемых вирусом ферментов, которые играют основную роль в репликации вируса.

Ниже приведен перечень заявок на патенты, опубликованных в течение последних нескольких лет, в которых описаны пептидные аналоги, являющиеся ингибиторами N83-протеазы НСУ, которые по строению отличаются от соединений, предлагаемых в настоящем изобретении:

ОБ 2337262; ДР 10298151; 1Р 11126861; 1Р 11292840; 1Р 2001-103993; И8 6159938; И8 6187905; АО 97/43310; АО 98/17679; АО 98/22496; АО 98/46597; АО 98/46630; АО 99/38888; АО 99/50230;

АО 99/64442; АО 99/07733; АО 99/07734; АО 00/09543; АО 00/09558; АО 00/20400; АО 00/59929;

АО 00/31129; АО 01/02424; АО 01/07407; АО 01/16357; АО 01/32691; АО 01/40262; АО 01/58929;

АО 01/64678; АО 01/74768; АО 01/77113; АО 01/81325; АО 02/08187; АО 02/08198; АО 02/08244;

АО 02/08251; АО 02/08256; АО 02/18369; АО 02/60926 и АО 02/79234.

Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, отличаются по своему химическому строению, и при создании изобретения неожиданно было установлено, что они специфично ингибируют N83протеазу НСУ, обладая при этом незначительной ингибирующей активностью в отношении других сериновых протеаз. Кроме того, соединения обладают активностью на культуре клеток и неожиданно хорошим фармакокинетическим профилем ίη νίνο.

Краткое изложение сущности изобретения

Изобретение относится к соединению формулы (I)

в котором К¹ обозначает гидрокси или NН8О2К^1Α, где К^1А обозначает метил, этил, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклопропилметил, циклогексил, СС13,. СР₃, фенил, 2-фторфенил или 4-метилфенил, К² обозначает С₅-С₆циклоалкил и К³ обозначает циклопентил; или его фармацевтически приемлемой соли.

Еще одним объектом изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая эффективное в отношении вируса гепатита С количество соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли в смеси с фармацевтически приемлемым носителем или вспомогательным веществом.

В заявке также описан способ лечения или предупреждения инфекции, вызываемой вирусом гепатита С у млекопитающего, предусматривающий введение млекопитающему эффективного в отношении вируса гепатита С количество соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли.

Еще в одном варианте осуществления изобретения указанное соединение может вводиться с одним или несколькими другими агентами, обладающими активностью в отношении НСУ.

И, наконец, последним объектом изобретения является применение соединения формулы (I) для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения или предупреждения инфекции, вызываемой вирусом гепатита С.

Определения

В тех случаях, когда для обозначения абсолютной конфигурации асимметричного центра используют дескрипторы (К) или (8), то обозначение относится ко всему соединению, а не только к заместителю.

Обозначение «Р1, Р2 и Р3» в контексте настоящего описания относится к положению аминокислотных остатков, начиная с С-конца пептидных аналогов и простираясь к Ν-концу [т.е. Р1 обозначает положение 1 относительно С-конца, Р2 обозначает положение 2 относительно С-конца и т.д. (см. Вегдег А. и 8сйесй1ет I., Ттапзасйопз о£ 1йе Коуа1 8ос1е1у Ьопбоп зепез, В257, 1970, сс. 249-264)].

В контексте настоящего описания понятие «(1К,28)-винил-АЦКК» относится к соединению формулы

О

т.е. (1К,28)-1-амино-2-этенилциклопропилкарбоновой кислоте.

- 2 007738

Понятие «галоген» в контексте настоящего описания обозначает галогеновый заместитель, выбранный из группы, включающей бром, хлор, фтор или йод.

Понятие «С1-С₆алкил» или «(низш.)алкил» в контексте настоящего описания, индивидуально или в сочетании с другим заместителем, обозначает ациклические алкильные заместители с прямой или разветвленной цепью, содержащие от 1 до 6 атомов углерода, и включает, например, метил, этил, пропил, бутил, гексил, 1-метилэтил, 1-метилпропил, 2-метилпропил, 1,1-диметилэтил.

Понятие «С₁-С₈алкил» в контексте настоящего описания, индивидуально или в сочетании с другим заместителем, обозначает ациклические алкильные заместители с прямой или разветвленной цепью, содержащие от 1 до 8 атомов углерода, и включает, например, метил, этил, 2,2-диметилбутил, гексил, 1-метилгексил, гептил и октил.

Понятие «Сз-С7циклоалкил» в контексте настоящего описания, индивидуально или в сочетании с другим заместителем, обозначает циклоалкильный заместитель, содержащий от 3 до 7 атомов углерода, и включает циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и циклогептил.

Понятие «С₁-С₆алкил-С₃-С₇циклоалкил» в контексте настоящего описания обозначает циклоалкильный радикал, содержащий от з до 7 атомов углерода, который непосредственно связан с алкиленовым радикалом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода, например циклопропилметил, циклопентилэтил, циклогексилметил, циклогексилэтил и циклогептилпропил. Например, когда К³'' обозначает С₁-С₆алкилС₃-С₇циклоалкил, то эта группа связана с 8О₂-группой через С₁-С₆алкил (т.е. алкиленовый фрагмент).

Понятие «ОС₁-С₆алкил» в контексте настоящего описания, индивидуально или в сочетании с другим заместителем, обозначает заместитель -ОС₁-С₆алкил, в котором алкил, как указано выше, содержит вплоть до 6 атомов углерода. ОС₁-С₆алкил обозначает метокси, этокси, пропокси, 1-метилэтокси, бутокси и 1,1-диметилэтокси. Последний заместитель обычно обозначают как трет-бутокси.

Понятие «фармацевтически приемлемая соль» обозначает соль соединения формулы (I), которую с медицинской точки зрения можно использовать в контакте с тканями человека и низших животных без признаков повышенной токсичности, раздражения, аллергической реакции и т.п., которая соответствует приемлемому соотношению польза/риск и, как правило, может растворяться или диспергироваться в воде или масле и обладает эффективностью при целевом использовании. Понятие включает фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли и фармацевтически приемлемые соли присоединения оснований. Перечень приемлемых солей приведен, например, у 8.М. Виде и др., 1. Рйагт. 8ст, 66, 1977, сс. 119, публикация полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки.

Понятие «фармацевтически приемлемая кислотно-аддитивная соль» обозначает соли, которые сохраняют свою биологическую эффективность и свойства свободных оснований и которые не являются нежелательными с позиций биологии или по другим причинам, образованные с неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, бромисто-водородная кислота, йодисто-водородная кислота, серная кислота, сульфаминовая кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и т.п., и с органическими кислотами, такими как уксусная кислота, трихлоруксусная кислота, трифторуксусная кислота, адипиновая кислота, альгиновая кислота, аскорбиновая кислота, аспарагиновая кислота, бензолсульфоновая кислота, бензойная кислота, 2-ацетоксибензойная кислота, масляная кислота, камфорная кислота, камфорсульфоновая кислота, коричная кислота, лимонная кислота, диглюконовая кислота, этансульфоновая кислота, глутаминовая кислота, гликолевая кислота, глицерофосфорная кислота, полусерная кислота, энантовая кислота, капроновая кислота, муравьиная кислота, фумаровая кислота, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота (изэтионовая кислота), молочная кислота, малеиновая кислота, гидроксималеиновая кислота, яблочная кислота, малоновая кислота, миндальная кислота, мезитиленсульфоновая кислота, метансульфоновая кислота, нафталинсульфоновая кислота, никотиновая кислота, 2-нафталинсульфоновая кислота, щавелевая кислота, памовая кислота, пектиновая кислота, фенилуксусная кислота, 3-фенилпропионовая кислота, пикриновая кислота, пивалиновая кислота, пропионовая кислота, пировиноградная кислота, салициловая кислота, стеариновая кислота, янтарная кислота, сульфаниловая кислота, винная кислота, паратолуолсульфоновая кислота, ундекановая кислота и т. п.

Понятие «фармацевтически приемлемая соль присоединения основания» обозначает соли, которые сохраняют свою биологическую эффективность и свойства свободных кислот и которые не являются нежелательными с позиций биологии или по другим причинам, образованные с неорганическими основаниями, такими как аммиак или гидроксид, карбонат или бикарбонат аммония, или катионами металла, такого как натрий, калий, литий, кальций, магний, железо, цинк, медь, марганец, алюминий и т.п. Наиболее предпочтительными являются соли аммония, калия, натрия, кальция и магния. Соли, полученные из фармацевтически приемлемых органических нетоксических оснований, включают соли первичных, вторичных и третичных аминов, четвертичных аминовых соединений, замещенных аминов, включая встречающиеся в естественных условиях замещенные амины, циклические амины и основные ионообменные смолы, такие как метиламин, диметиламин, триметиламин, этиламин, диэтиламин, триэтиламин, изопропиламин, трипропиламин, трибутиламин, этаноламин, диэтаноламин, 2-диметиламиноэтанол, 2-диэтиламиноэтанол, дициклогексиламин, лизин, аргинин, гистидин, кофеин, гидрабамин, холин, бетаин, этилендиамин, глюкозамин, метилглюкамин, теобромин, пурины, пиперазин, пиперидин, Ν-этилпиперидин, производные тетраметиламмония, производные тетраэтиламмония, пиридин, Ν,Ν-диметиланилин, Ν-ме

- 3 007738 тилпиперидин, Ν-метилморфолин, дициклогексиламин, дибензиламин, Ν,Ν-дибензилфенэтиламин, 1эфенамин, Ν,Ν'-дибензилэтилендиамин, полиаминовые смолы и т.п. Наиболее предпочтительными органическими нетоксическими основаниями являются изопропиламин, диэтиламин, этаноламин, триметиламин, дициклогексиламин, холин и кофеин.

Понятие «антивирусный агент» в контексте настоящего описания обозначает агент (химическое соединение или биологический агент), который обладает эффективностью в отношении ингибирования образования и/или репликации вируса в организме млекопитающего. Оно включает агенты, которые оказывают воздействие на связанные либо с хозяином, либо с вирусом механизмы, необходимые для образования и/или репликации вируса в организме млекопитающего. Антивирусные агенты включают, например, рибавирин, амантадин, УХ-497 (меримеподиб, фирма Уейех Рйагтасеийсак), УХ-498 (фирма Успех РНагтасеиПсаЕ). левовирин, вирамидин, цеплен (максамин), ХТЬ-001 и ХТЬ-002 (фирма ХТЬ Вюрйагтасеийсак).

Понятие «другой агент, обладающий активностью в отношении НСУ» в контексте настоящего описания обозначает агенты, эффективные в отношении снижения или предупреждения развития связанных с гепатитом С симптомов болезни. Такие агенты выбирают из иммуномодуляторов, ингибиторов Ν83протеазы НСУ, ингибиторов полимеразы НСУ или ингибиторов другой мишени в жизненном цикле НСУ.

Понятие «иммуномодулятор» в контексте настоящего описания обозначает агенты (химические соединения или биологические агенты), которые обладают эффективностью в отношении повышения или потенциирования реакции иммунной системы у млекопитающего. Иммуномодуляторы включают, например, интерфероны класса I (такие как α-, β-, δ- и ω-интерфероны, τ-интерфероны, консенсусные интерфероны и азиало-интерфероны), интерфероны класса II (такие как γ-интерфероны) и пэгилированные интерфероны.

Понятие «ингибитор №3-протеазы НСУ» в контексте настоящего описания обозначает агент (химическое соединение или биологический агент), который обладает эффективностью в отношении ингибирования функции №3-протеазы НСУ у млекопитающего. Ингибиторы №3-протеазы НСУ включают, например, соединения, описанные в АО 99/07733, АО 99/07734, АО 00/09558, АО 00/09543, АО 00/59929 или АО 02/060926, перспективное соединение, разработанное фирмой Воейппдег 1пдеШе1т, обозначенное как ΒΙΤΝ 2061, которое изучено в клиническом исследовании, и перспективные соединения, разработанное фирмой УеПех/ЕН ЬШу, обозначенные как УХ-950 или ЬУ-570310, которые еще не окончательно исследованы. В частности, соединения №№ 2, 3, 5, 6, 8, 10, 11, 18, 19, 29, 30, 31, 32, 33, 37, 38, 55, 59, 71, 91, 103, 104, 105, 112, 113, 114, 115, 116, 120, 122, 123, 124, 125, 126 и 127, представленные в таблице на сс. 224-226 АО 02/060926, можно применять в сочетании с соединениями, предлагаемыми в настоящем изобретении.

Понятие «ингибитор полимеразы НСУ» в контексте настоящего описания обозначает агент (химическое соединение или биологический агент), который обладает эффективностью в отношении ингибирования функции полимеразы НСУ у млекопитающего. Оно относится, например, к ингибиторам Ν85Βполимеразы НСУ. Ингибиторы полимеразы НСУ включают не относящиеся к нуклеозидам соединения, например, описанные в:

заявке на патент США № 10/198680, которая соответствует РСТ/СА02/01127, оба документа поданы 18 июля 2002г. (фирма Воейппдег 1пдеШе1т), заявке на патент США № 10/198384, которая соответствует РСТ/СА02/01128, оба документа поданы 18 июля 2002г. (фирма Воейппдег 1пдеШе1т), заявке на патент США № 10/198259, которая соответствует РСТ/СА02/01129, оба документа поданы 18 июля 2002г. (фирма Воейппдег 1пдеШе1т),

АО 02/100846 А1 и АО 02/100851 А2 (обе на имя фирмы 8Ыге),

АО 01/85172 А1 и АО 02/098424 А1 (обе на имя фирмы О8К),

АО 00/06529 и АО 02/06246 А1 (обе на имя фирмы Мегск),

АО 01/47883 и АО 03/000254 (обе на имя фирмы 1арап ТоЬассо) и

ЕР 1 256 628 А2 (на имя фирмы Адоигоп).

Кроме того, другие ингибиторы полимеразы НСУ включают также нуклеозидные аналоги, например соединения, описанные в:

АО 01/90121 А2 (фирма Иешх),

АО 02/069903 А2 (ВюсгуЦ Рйагтасеийсак 1пс.) и

АО 02/057287 А2 и АО 02/057425 А2 (обе на имя фирмы Мегск/Нщ).

Конкретными примерами ингибиторов полимеразы НСУ являются ИК-002, ТТК-003 и ТТК-109 (фирма 1арап ТоЬассо).

Понятие «ингибитор другой мишени в жизненном цикле НСУ» в контексте настоящего описания обозначает агент (химическое соединение или биологический агент), который обладает эффективностью в отношении ингибирования образования и/или репликации НСУ у млекопитающего, отличной от ингибирования функции №3-протеазы НСУ. Они включают агенты, которые оказывают воздействие на связанные либо с хозяином, либо с вирусом НСУ механизмы, необходимые для образования и/или реплика

- 4 007738 ции НСУ в организме млекопитающего. Ингибиторы другой мишени в жизненном цикле ИСУ включают, например, агенты, которые ингибируют мишень, выбранную из ряда, включающего геликазу, N82/3протеазу НСУ и внутренний сайт входа в рибосому (ГЯЕ8). Конкретным примером ингибиторов другой мишени в жизненном цикле НСУ является Ι8Ι8-14803 (Ι8Ι8 РйаттасеибсаИ).

Понятие «ингибитор ВИЧ» в контексте настоящего описания обозначает агент (химическое соединение или биологический агент), который обладает эффективностью в отношении ингибирования образования и/или репликации ВИЧ в организме млекопитающего. Оно включает агенты, которые оказывают воздействие на связанные либо с хозяином, либо с вирусом механизмы, необходимые для образования и/или репликации ВИЧ в организме млекопитающего. Ингибиторы ВИЧ включают, например, нуклеозидные ингибиторы, ненуклеозидные ингибиторы, ингибиторы протеаз, ингибиторы слияния и ингибиторы интегразы.

Понятие «ингибитор НАУ (вирус гепатита А)» в контексте настоящего описания обозначает агент (химическое соединение или биологический агент), который обладает эффективностью в отношении ингибирования образования и/или репликации НАУ в организме млекопитающего. Оно включает агенты, которые оказывают воздействие на связанные либо с хозяином, либо с вирусом механизмы, необходимые для образования и/или репликации НАУ в организме млекопитающего. Ингибиторы НАУ включают вакцины, содержащие вирус гепатита А, например Наупх® (фирма О1ахо8тййК1ше), УАЦТА® (фирма Мегск) и Ауах1т® (фирма Ауеийк РаЧеит).

Понятие «ингибитор НВУ (вирус гепатита В)» в контексте настоящего описания обозначает агент (химическое соединение или биологический агент), который обладает эффективностью в отношении ингибирования образования и/или репликации НВУ в организме млекопитающего. Оно включает агенты, которые оказывают воздействие на связанные либо с хозяином, либо с вирусом механизмы, необходимые для образования и/или репликации НВУ в организме млекопитающего. Ингибиторы НВУ включают, например, агенты, которые ингибируют ДНК-полимеразу вируса НВУ или вакцины на основе НВУ.

Конкретными примерами ингибиторов НВУ являются ламивудин (Ερίνίτ-НВУ®), адефовирдипивоксил, энтекавир, ЕТС (Εονίκ-ιΟΙ®). ИАРИ (ΌΧΟ), Ь-ЕМАИ (С^ибше®), АМ365 (амрад), Ьб! (телбивудин), моновалентный-ЬбС (валторцитабин), АСН-126,443 (Ь-Еб4С) (ахиллион), МСС478 (фирма Е11 Ы11у), рацивир (ЯСУ), фтор-Ь- и -Ό-нуклеозиды, робустафлавон, Ιί,’Ν 2001-3 ЦСЦ), Ват 205 (Νο\ό1ο5). ХТЬ-001 (ХТЬ), иминосахара (Νοιτνί-ΌΝΙ) (фирма 8упегду), НерВхуте: иммуномодуляторы, такие как интерферон альфа 2Ь, НЕ2000 (фирма НоШк-Ебеи), Тйетабщт (эпиммун), ЕНТ899 (фирма Εηζο Вюсйет), тимозин альфа-1 (2абахш®), вакцина на основе ДНК НВУ (фирма Рο^бе^^есΐ), вакцина на основе ДНК НВУ (фирма ЗеГГегоп Сеп!ет), антиген НВУ (фирма ОтаОеп), ВауНер В® (фирма Вауег), №Ы-НВ® (фирма №1Ы) и антитела к вирусу гепатита В (фирма Сапдепе); и вакцины на основе НВУ, такие, например, как Епдепх В, ЯеоттЬЯах НВ, 6еηИеνас В, Нерасаге, Вю-Нер В, ТЖпЯ1х, Сοтνаx, Неxаνас.

Понятие «интерферон класса Ι» в контексте настоящего описания обозначает интерферон, выбранный из группы интерферонов, которые все связываются с рецептором типа Ι. Оно включает как встречающиеся в естественных условиях, таких и полученные синтетическим путем интерфероны класса Ι. Примеры интерферонов класса Ι включают α-, β-, ω-интерфероны, τ-интерфероны, консенсусные интерфероны, азиало-интерфероны.

Понятие «интерферон класса ΙΙ» в контексте настоящего описания обозначает интерферон, выбранный из группы интерферонов, которые все связываются с рецептором типа ΙΙ. Примеры интерферонов класса ΙΙ включают γ-интерфероны.

Фармацевтические композиции, предлагаемые в изобретении, могут содержать одно или несколько дополнительных действующих веществ, например, выбранных из антивирусных агентов, иммуномодуляторов, других ингибиторов N83-пροтеазы НСУ, ингибиторов полимеразы НСУ, ингибиторов другой мишени в жизненном цикле НСУ, ингибиторов ВИЧ, ингибиторов НАУ и ингибиторов НВУ. Примеры таких агентов приведены выше в разделе «Определения».

Ниже представлены конкретные предпочтительные примеры некоторых таких агентов: антивирусные агенты: рибавирин и амантадин;

иммуномодуляторы: интерфероны класса Ι, интерфероны класса ΙΙ и пэгилированные интерфероны; ингибитор другой мишени в жизненном цикле НСУ, мишенью такого ингибитора являются N83геликаза, N82/3-пροтеаза НСУ или внутренний сайт входа в рибосому (ГЯЕ8);

ингибиторы ВИЧ: нуклеозидные ингибиторы, ненуклеозидные ингибиторы, ингибиторы протеаз, ингибиторы слияния и ингибиторы интеграз; или ингибиторы НВУ: агенты, которые ингибируют вирусную ДНК-полимеразу НВУ, или вакцина на основе НВУ.

Как указано выше, совместная терапия предусматривает совместное введение соединения формулы (Ι) или его фармацевтически приемлемой соли по меньшей мере с одним дополнительным агентом, выбранным из следующего ряда: антивирусный агент, иммуномодулятор, другой ингибитор N83-пροтеазы НСУ, ингибитор полимеразы НСУ, ингибитор другой мишени в жизненном цикле НСУ, ингибитор ВИЧ, ингибитор НАУ и ингибитор НВУ. Примеры таких агентов приведены выше в разделе «Определения».

- 5 007738

Указанные дополнительные агенты можно объединять с соединениями, предлагаемыми в изобретении, получая лекарственное средство, которое содержит однократную фармацевтическую дозу. В другом варианте указанные дополнительные агенты можно вводить пациенту индивидуально в виде составной части многокомпонентного лекарственного средства, например, используя набор. Указанные дополнительные агенты можно вводить пациенту до, одновременно или после введения соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли.

В контексте настоящего описания понятие «лечение» обозначает введение соединения или композиции, предлагаемых в настоящем изобретении, для облегчения или устранения симптомов гепатита С и/или снижения вирусного титра у пациента.

В контексте настоящего описания понятие «предупреждение» обозначает введение соединения или композиции, предлагаемых в настоящем изобретении, после контакта индивидуума с вирусом, но до проявления симптомов болезни и/или до обнаружения вируса в крови.

Предпочтительные варианты осуществления изобретения

Предпочтительно соединение формулы (I) является соединением, как оно определено выше, в котором К.¹ обозначает гидрокси или ΝΗ8Θ2Β^1Α, где К^1Л обозначает метил, циклопропил, СР3 или фенил. И в этом случае наиболее предпочтительно К^1Л обозначает циклопропил.

Наиболее предпочтительно К¹ обозначает гидрокси.

Наиболее предпочтительно К² обозначает циклопентил.

Предпочтительными вариантами осуществления изобретения являются все соединения формулы (I), приведенные в табл. 1.

Согласно другому варианту осуществления изобретения фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, может дополнительно содержать другой агент, обладающий активностью в отношении НСУ. Примеры других агентов, обладающих активностью в отношении НСУ, включают α(альфа), β- (бета), δ- (дельта), γ- (гамма) или ω- (омега) интерферон, рибавирин и амантадин.

Согласно другому варианту осуществления изобретения фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, может дополнительно содержать другой ингибитор №3-протеазы НСУ.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, может дополнительно содержать ингибитор полимеразы НСУ. Согласно следующему варианту осуществления изобретения фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, может дополнительно содержать ингибитор других мишеней жизненного цикла НСУ, включая (но не ограничиваясь ими) геликазу, №2/3-протеазу или внутренний сайт входа в рибосому (1КЕ8).

Фармацевтическую композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, можно вводить орально, парентерально или с помощью устройства для имплантации. Предпочтительным является оральное введение или введение с помощью инъекции. Фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, может содержать любые общепринятые нетоксические фармацевтически приемлемые носители, вспомогательные вещества или наполнители. В некоторых случаях значение рН композиции можно регулировать с помощью фармацевтически приемлемых кислот, оснований или буферов с целью повышения стабильности соединения, включенного в композицию или в форму для его введения. В контексте настоящего описания понятие «парентеральный» включает подкожный, внутрикожный, внутривенный, внутримышечный, внутрисуставной, интрасиновиальный, интрастернальный, интратекальный путь введения, введение с помощью инъекции или инфузии, а также введение в область повреждения.

Фармацевтическая композиция может иметь форму стерильного препарата для инъекции, например стерильной инъецируемой водной или жирорастворимой суспензии. Эту суспензию можно получать с помощью хорошо известных методов с использованием диспергирующих или смачивающих агентов (таких, например, как Твин 80) и суспендирующих агентов.

Фармацевтическую композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, можно вводить орально в виде любой приемлемой формы лекарственного средства, предназначенной для орального введения, включая (но не ограничиваясь ими) капсулы, таблетки и водные суспензии и растворы. В случае таблеток для орального введения обычно применяемые носители представляют собой лактозу и кукурузный крахмал. Как правило, добавляют также замасливатели, такие как стеарат магния. Для орального введения в форме капсул приемлемые разбавители представляют собой лактозу и безводный кукурузный крахмал. Когда оральным путем вводят водные суспензии, действующее вещество объединяют с эмульгирующими и суспендирующими агентами. При необходимости можно добавлять определенные подслащивающие вещества, и/или корригенты, и/или красители.

Другие пригодные наполнители или носители для указанных выше препаративных форм и композиций приведены в обычных фармацевтических справочниках, например в «Кет1пд1оп'8 Рйагтасеийса1 8с1епсе8», Тйе 8с1епсе апб Ргасйсе о£ Рйагтасу, 19-е изд. Маск РиЫкЫпд Сотрапу, Еайоп, Репп., (1995).

Для монотерапии с целью предупреждения и лечения опосредованной НСУ болезни можно применять дозы в диапазоне от примерно 0,01 до примерно 100 мг/кг веса тела в день, предпочтительно от примерно 0,1 до примерно 50 мг/кг веса тела в день предлагаемого соединения, которое является инги

- 6 007738 битором протеазы. Как правило, фармацевтическую композицию, предлагаемую в изобретении, можно вводить от примерно 1 до примерно 5 раз в день или в другом варианте путем непрерывной инфузии. Такое введение можно применять как для длительного, так и для экстренного лечения. Количество действующего вещества, которое можно объединять с носителями для получения однократной дозы лекарственного средства, должно варьироваться в зависимости от хозяина, подлежащего лечению, и конкретного пути введения. Обычная композиция может содержать от примерно 5 до примерно 95% действующего вещества (мас.%). Предпочтительно такие композиции содержат от примерно 20% до примерно 80% действующего вещества.

Как должно быть очевидно специалисту в данной области, можно применять и более низкие или более высокие дозы по сравнению с указанными выше. Конкретные дозы и схемы лечения любого конкретного пациента могут зависеть от различных факторов, включая активность конкретного применяемого соединения, возраст, вес тела, общее состояние здоровья, пол, рацион, время введения, скорость выведения, сочетание лекарственных средств, серьезность и особенности развития болезни, предрасположенность пациента к инфекции, и их определяет лечащий врач. Как правило, лечение начинают с небольших доз, существенно более низких, чем оптимальная доза пептида. Затем дозу повышают небольшими порциями до достижения оптимального действия в конкретных условиях. Как правило, наиболее предпочтительно вводить соединение в таком диапазоне концентраций, которые, в целом, обеспечивают антивирусную активность, но не обладают какими-либо вредными или опасными побочными действиями.

Когда композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, включают в комбинацию, содержащую соединение формулы (I) и один или несколько дополнительных терапевтических или профилактических агентов, то соединение и дополнительный агент должны присутствовать в дозе, составляющей примерно от 10 до 100% и более предпочтительно примерно от 10 до 80% от дозы, обычно применяемой в режиме монотерапии.

Когда эти соединения или их фармацевтически приемлемые соли объединяют в препаративной форме с фармацевтически приемлемым носителем, то полученную композицию можно вводить ίη νΐνο млекопитающему, такому как человек, для ингибирования Ы§3-протеазы НСУ или для лечения или предупреждения инфекции, вызываемой вирусом НСУ. Такое лечение можно осуществлять также при использовании соединения, предлагаемого в изобретении, в сочетании с агентами, включающими (но не ограничиваясь ими) α-, β-, δ-, ω-, τ- или γ-интерферон, рибавирин, амантадин; другие ингибиторы N83протеазы НСУ; ингибиторы полимеразы НСУ; ингибиторы других мишеней жизненного цикла НСУ, которые включают (но не ограничиваясь ими) геликазу, №2/3-протеазу или внутренний сайт входа в рибосому (ШЕ8); или их комбинации. С соединениями, предлагаемыми в настоящем изобретении, можно объединять другие агенты, получая однократную дозу лекарственного средства.

В другом варианте эти дополнительные агенты можно вводить млекопитающему по отдельности в виде составной части многокомпонентного лекарственного средства.

Если фармацевтическая композиция содержит в качестве действующего вещества только соединение, предлагаемое в настоящем изобретении, то такой способ может дополнительно предусматривать введение указанному млекопитающему агента, выбранного из ряда, включающего иммуномодулятор, антивирусный агент, ингибитор №3-протеазы НСУ, ингибитор полимеразы НСУ или ингибитор других мишеней жизненного цикла НСУ, таких как геликаза, №2/3-протеаза или ΓΚΕ8. Такой дополнительный агент можно вводить млекопитающему до, одновременно или после введения композиции, предлагаемой в настоящем изобретении.

Соединение формулы (I), предлагаемое в настоящем изобретении, можно применять также в качестве лабораторного реагента. Соединение, предлагаемое в настоящем изобретении, можно применять также для устранения или предупреждения вирусного загрязнения материалов, и тем самым оно снижает риск заражения вирусом персонала лабораторий или медицинских учреждений или пациентов, которые имеют контакт с такими материалами (например, кровью, тканями, хирургическими инструментами и предметами одежды, лабораторными инструментами и предметами одежды, приборами и материалами для сбора крови).

Соединение формулы (I), предлагаемое в настоящем изобретении, можно применять также в качестве реагента для исследований. Соединение формулы (I) можно использовать в качестве позитивного контроля для обоснования модельных анализов на клетках или анализов ίη \з1го или ίη νί\Ό репликации вирусов.

Ниже изобретение проиллюстрировано на примерах, не ограничивающих его объем, заявляемый в приведенной ниже формуле изобретения.

Методология

В целом, соединение формулы (I) и его промежуточные продукты получают известными методами, используя реакционные условия, которые, как известно, являются приемлемыми для реактантов. Некоторые такие методы описаны в \УО 00/09543 и \УО 00/09558.

На приведенной ниже схеме проиллюстрирован пригодный, основанный на применении известных методов процесс получения основного промежуточного продукта формулы 6а из ациклических промежуточных продуктов.

- 7 007738

Схема 1

Б

Стадии А, В, Г.

В целом, метод состоит в следующем: фрагменты Р1, Р2 и Р3 можно связывать с помощью известных методов пептидного сочетания, которые описаны в АО 00/09543 и АО 00/09558.

Стадия Б.

Эта стадия включает инверсию конфигурации 4-гидроксизаместителя. Имеется несколько путей осуществления этого процесса, как это должно быть хорошо известно специалистам в данной области. Одним из примеров пригодного метода является хорошо известная реакция Митсунобу (МЙ8ипоЬи, 8упШе818, январь 1981, с. 1-28; Капо и др. Тек Бей., 36, 1994, с. 3779-3792; КгсИпак и др. Тек Бей., 36, 1995, с. 6193-6196).

Стадия Д.

Получение макроцикла можно осуществлять с помощью реакции обмена олефина, используя катализатор на основе Ки, например, описанный у МШег 8.Б; В1аск\хе11 Н.Е.; СгиЬЬ8 К.Н.; 1. Ат. СИет. 8ос., 118, 1996, с. 9606-9614 (а); КшдкЬигу 1.8.; Наггйу 1.Р.А.; Вош1а1еЬи8 Р.Б; Ноуеуба А.Н.; 1. Ат. СИет. 8ос., 121, 1999, с.791-799 (б); и Ниапд 1.; 81ехеп8 Ε.Ό.; Цо1ап 8.Р.; Ре1ег8еп 1.Б.; 1. Ат. СИет. 8ос., 121, 1999, с. 2674-2678 (в); или в АО 00/59929. Следует иметь в виду также, что для этой реакции можно использовать катализаторы на основе других переходных металлов, таких как Мо.

(с) (а)

Катализатор Груббса (Ь)

Катализатор Хорейда

Катализатор Нолана

Последующее превращение основного промежуточного продукта формулы 6а в соединения форму- 8 007738 лы (I), предлагаемые в настоящем изобретении, подробно описано ниже в примерах.

Представленные в описании соединения формулы (I), в которых К¹ обозначает ΝΗ§Θ2Κ.^1Α, получают сочетанием соответствующей кислоты формулы (I) (т.е. К¹ обозначает гидрокси) с соответствующим сульфонамидом формулы К^1А 8Θ2ΝΗ₂ в присутствии связующего агента в стандартных условиях. Хотя можно применять несколько общепринятых связующих агентов, предпочтительными для практики являются ТБТУ и ГАТУ. Сульфонамиды поступают в продажу или их можно получать известными методами.

Примеры

Настоящее изобретение проиллюстрировано более подробно с помощью примеров, не ограничивающих его объем. Другие конкретные пути синтеза или разделения описаны в АО 00/09543; АО 00/09558 и АО 00/59929.

Температуры даны в градусах Цельсия. Проценты для растворов представляют собой % (мас./об.), а соотношения в растворах представляют собой соотношения объемов, если не указано иное. Спектры ядерного магнитного резонанса (ЯМР) регистрировали с помощью спектрометра фирмы Вгискег при частоте 400 МГц, химические сдвиги (δ) выражены в част./млн и отнесены к внутреннему дейтериевому растворителю, если не указано иное. ЯМР-спектры всех конечных соединений (ингибиторов) регистрировали в ДМСО-б₆, если не указано иное. Экспресс-хроматографию на колонке проводили на силикагеле (81О₂) согласно методу экспресс-хроматографии Стилла (А.С. 8Ш1 и др., 1. Огд. Сйеш., 43, 1978, с. 2923).

В примерах использовали следующие сокращения: Вос: трет-бутилоксикарбонил {Ме₃СОС(О)}; БСА: бычий сывороточный альбумин; ХАПС: 3-[(3-холамидопропил)диметиламмоний]-1-пропансульфонат; СН₂С1₂=ДХМ: метиленхлорид; ДЭАД: диэтилазодикарбоксилат; ДИАД: диизопропилазодикарбоксилат; ДИПЭА: диизопропилэтиламин; ДМАП: диметиламинопиридин; ДМФ: Ν,Ν-диметилформамид; ДМСО: диметилсульфоксид; (8,8)-Е!-ОиРНО8 В11 (СОЭ)ОТГ: трифторметансульфонат (+)-1,2-бис (28,58)-2,5-диэтилфосфолано)бензол(циклооктадиен)родия(1); ЕЮН: этанол; ЕЮАс: этилацетат; Е8-МС: масс-спектрометрия с ионизацией электронным пучком; ГАТУ: [гексафторфосфат О-(7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония]; ЖХВР: жидкостная хроматография высокого разрешения; МС: масс-спектрометрия; МАЕБ1-ТОЕ: Майтх Акмйеб Ьакег Όίκοτρΐίοη ΙοηίζαΙίοη-Τίπκ оГ Ейдй, ЕАВ: бомбардировка быстрыми атомами; Ме: метил; МеОН: метанол; К.Т.: комнатная температура (18-22°); ТБТУ: тетрафторборат 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония; ТФК: трифторуксуная кислота; ТГФ: тетрагидрофуран; ТСХ: тонкослойная хроматография; Трис/НС1: гидрохлорид трис(гидроксиметил)аминометана.

Смесь, содержащую Вос-гидроксипролин 1а (50,0 г, 216 ммолей), гидрохлорид (1К,28)-винил-АЦКК 1Ь (42,25 г, 238 ммолей), ТБТУ (76,36 г, 238 ммолей) и ДИПЭА (113 мл, 649 ммолей) в ДМФ (800 мл), перемешивали при К.Т. в атмосфере азота. Через 3,5 ч растворитель выпаривали и остаток экстрагировали ЕЮАс и промывали соляной кислотой (10%), насыщенным раствором бикарбоната натрия и соляным раствором. Затем органическую фазу сушили над сульфатом магния, фильтровали и упаривали, получая масло. После сушки масла в течение ночи (18 ч) в глубоком вакууме получали дипептид 1с в виде пены желтого цвета (72,0 г, 94%, чистота >95%, по данным ЖХВР).

Пример 2. Синтез дипептида 2а.

Дипептид 1с (72,0 г, 203 ммоля), трифенилфосфин (63,94 г, 243,8 ммоля, 1,2 экв.) и 4-нитробензойную кислоту (41,08 г, 245,8 ммоля, 1,2 экв.) растворяли в безводном ТГФ (1,4 л) и раствор при перемешивании охлаждали до 0° в атмосфере азота. Затем по каплям в течение 45 мин добавляли ДЭАД (38,4 мл, 244 ммоля, 1,2 экв.) и реакционной смеси давали нагреться до К.Т. Через 4 ч растворитель выпаривали и остаток разделяли на 4 порции. Каждую из них хроматографировали на силикагеле (зернистость 10-40 мкм, диаметр колонки 12 см, длина колонки 16 см), используя градиент от 2:1 гексан/ЕЮАс до 1:1 гексан/

- 9 007738

ЕЮАс и до чистого (100%) ЕЮАс. После выпаривания растворителей и сушки в глубоком вакууме при 70° в течение 1 ч получали сложный эфир 2а в виде аморфного твердого вещества белого цвета (108,1 г,

Сложный нитробензоиловый эфир 2а (108,1 г, 203,1 ммоля) растворяли в ТГФ (1,0 л) и образовавшийся раствор охлаждали до 0°. Затем быстро добавляли раствор моногидрата гидроксида лития (10,66 г, 253,9 ммоля) в воде (225 мл) и реакционную смесь перемешивали при 0° в течение 30 мин, после чего оставшееся основание нейтрализовали соляной кислотой (1н., 50,8 мл). Медленно вносили дополнительную порцию кислоты до исчезновения желтой окраски (7 мл). Затем образовавшуюся смесь упаривали и остаток экстрагировали ЕЮАс (3х150 мл). Экстракт промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия (150 мл) и соляным раствором (150 мл). Органическую фазу сушили над сульфатом магния - древесном углем, фильтровали через диатомовую землю и упаривали. После сушки остатка в глубоком вакууме получали спирт 3а в виде бесцветной пены (70,1 г, 98%, чистота >99%, по данным ЖХВР).

Пример 4. Синтез (28)-№Вос-аминонон-8-еновой кислоты (4д).

(_?оов^{Диоксан}-^н ₁ ^аОН(1н) СООВ

НООС^ЫНАс (4Ь) (5,3)-Е1-оирно8 гаусоорт/ (1/500) ыон

ΝΗΑο Н₂ (30 фунтов/кв.дюйм) х°

ЕЮОС ЫНАс (4а)

А.

Стадия А.

(4е)

СООВ Г

I, ТГФ

К раствору поступающего в продажу диэтил-2-ацетамидомалоната 4а (100 г, 0,46 моля) в диоксане (500 мл) добавляли по каплям в течение 30-45 мин водный раствор гидроксида натрия (1М, 1 экв., 460 мл). Образовавшуюся смесь выдерживали при перемешивании в течение 16,5 ч, затем диоксан выпаривали в вакууме. Полученный водный раствор экстрагировали 3 порциями по 300 мл ЕЮАс и подкисляли до рН 1 концентрированной НС1. Этот раствор оставляли для кристаллизации в бане лед-вода. После появления нескольких кристаллов смесь обрабатывали ультразвуком, после чего образовывалось большое количество осадка. После фильтрации и сушки в вакууме получали соединение 4Ь (62,52 г, выход 72%) в виде твердого вещества белого цвета.

Стадия Б.

К перемешиваемой с помощью магнитной мешалки эмульсии поступающего в продажу 7-октен-1,2диола 4с (25 г, 0,173 моля) и Н2О (100 мл) в 1-литровой круглодонной колбе добавляли в течение 20 мин водный раствор периодата натрия (40,7 г, 0,190 моля, 1,1 экв., в 475 мл Н₂О) (слабая экзотермическая реакция). Образовавшуюся смесь перемешивали при комнатной температуре в течение еще 1 ч (завершение реакции подтверждали с помощью ТСХ). Затем смесь сливали в делительную воронку и водный слой отделяли от органического слоя. Водный раствор насыщали №С1, сливали и еще раз отделяли от органической фракции. Две органические фракции объединяли, сушили над сульфатом натрия и фильтровали через ватную пробку (в Пастеровской пипетке), получая соединение 4ά (15,135 г, бесцветное масло, выход 78%). Водный раствор экстрагировали СН₂С1₂, сушили над безводным Мд8О₄ и концентрировали в вакууме (без нагревания, т.к. !_кип 6-гертанала 153°С), получая дополнительное количество соединения 4ά

- 10 007738 (1,957 г, бесцветное масло, выход 10%). Общий выход 88%.

Стадия В.

К твердому этил-2-ацетамидомалонату 4Ь (7,57 г, 40 ммолей) добавляли в течение 1 мин 6-гептенал 4ά (4,48 г, 40 ммолей) в растворе пиридина (32 мл, 10 экв.). Образовавшийся раствор охлаждали до 10° в бане. Добавляли в течение 4 мин уксусный ангидрид (1 мл, 3,2 экв.). Полученный раствор оранжевого цвета перемешивали в течение 3 ч при К.Т. и добавляли другую порцию этил-2-ацетамидомалоната 4Ь (2,27 г). Образовавшуюся смесь перемешивали при комнатной температуре еще 11 ч. Затем добавляли лед (60 мл) и раствор перемешивали в течение 1,5 ч, затем смесь разбавляли 250 мл воды и экстрагировали двумя порциями диэтилового эфира. Эфирный раствор промывали 1н. НС1, насыщенным раствором №1НСО₃. сушили над Иа₂8О₄, концентрировали и очищали экспресс-хроматографией (Е1ОАс 40%/гексан), получая соединение 4е (4,8 г, выход 50%) в виде масла светло-желтого цвета.

Стадия Г.

К дегазированному (барботирование аргоном в течение 30 мин) раствору 2-этил-2-ацетамидо-2,8нонадиеноата 4е (8,38 г, 35 ммолей) в безводном этаноле (70 мл) добавляли (8,8)-Е1-ЭиРНО8 Ей (СОЭ)ОТГ (51 мг, соотношение субстрата/катализатора=496). Смесь помещали под давление водорода 30 фунтов/кв.дюйм (после 4 циклов Н2-вакуумирования) и перемешивали в шейкере Парра в течение 2 ч. Образовавшуюся смесь упаривали досуха, получая неочищенное соединение 4£, которое применяли на следующей стадии без дополнительной очистки.

Стадия Д.

К раствору неочищенного (8)-этил 2-ацетамидо-8-ноненоата 4£ (7,3 г, 30,3 ммоля) в ТГФ (100 мл) добавляли Вос₂О (13,2 г, 2 экв.) и ДМАП (740 мг, 0,2 экв.). Реакционную смесь выдерживали при температуре дефлегмации в течение 2,5 ч. Затем большую часть растворителя ТГФ выпаривали, неочищенную смесь разбавляли СН₂С1₂ и промывали 1н. НС1 для удаления ДМАП. Органический слой дополнительно экстрагировали насыщенным водным раствором ЫаНСОз, сушили над безводным Иа₂8О₄ и концентрировали в вакууме. Затем неочищенный продукт разбавляли ТГФ (50 мл) и водой (30 мл). Добавляли ЫОН-Н₂О (2,54 г, 2 экв.) и образовавшуюся смесь перемешивали при К.Т. в течение 25 ч (завершение гидролиза подтверждали с помощью ТСХ). Реакционную смесь концентрировали в вакууме для удаления большей части растворителя ТГФ и разбавляли СН₂С1₂. Образовавшийся раствор промывали 1н. НС1, сушили над безводным Иа₂8О₄ и концентрировали в вакууме. Для удаления минорных примесей и избытка Вос₂О неочищенный продукт очищали экспресс-хроматографией (используя в качестве элюента градиент растворителя от 100% гексана до 100% ЕЮАс). Получали указанное в заголовке соединение 4д в виде высокоочищенного масла светло-желтого цвета (5,82 г, выход 71%).

'|| ЯМР (ДМСО, 400 МГц): δ 7,01 (ά, 1=8 Гц, 1Н), 5,79 (1άά, 11=6,7 Гц, 1ά=17,0, 10,2 Гц, 1Н), 5,00 (ωά, 1ά=17,0 Гц, 1Н), 4,93 (тй, 1ά=10,2 Гц, 1Н), 3,83 (т, 1Н), 2,00 (ф 1=6,9 Гц, 2Н), 1,65-1,5 (т, 2Н), 1,38 (8, 9Н), 1,35-1,21 (т, 6Н).

Пример 5. Синтез трипептида 5Ь.

РЗ-Р2-Р1

Стадия 1.

Раствор хлористого водорода в диоксане (4н.) добавляли к Вос-Р2-Р1-фрагменту 3а (5,32 г, 15,0 ммолей), получая бесцветный раствор. После перемешивания при комнатной температуре растворитель выпаривали и остаток помещали в глубокий вакуум на 3 ч, получая гидрохлорид соединения 5а в виде аморфного твердого вещества, которое использовали без дополнительной очистки.

Стадия 2.

Добавляли ДИПЭА (2,6 мл, 15 ммолей) к смеси вышеуказанного гидрохлорида Р1-Р2 (15 ммолей) в безводном ДХМ (100 мл), получая гомогенный раствор. Отдельно при перемешивании добавляли ТБТУ (5,30 г, 16,5 ммоля, 1,1 экв.) к раствору С9-линкера 4д (4,07 г, 15,0 ммолей) в безводном ДХМ (130 мл), что приводило к частичному растворению реагента. Добавляли ДИПЭА (2,6 мл, 15 ммолей), получая через 10 мин практически гомогенный раствор. Затем к этому раствору добавляли раствор Р1-Р2 и ДИПЭА

- 11 007738 до подщелачивания реакционной смеси (рН>8, определение с помощью влажной лакмусовой бумаги). После перемешивания в атмосфере азота в течение 5 ч растворитель выпаривали и остаток экстрагировали ЕЮАс (2x250 мл) и промывали разбавленной соляной кислотой (0,05н., 400 мл), водой (400 мл) и насыщенным раствором бикарбоната натрия (400 мл). Затем объединенные органические фазы сушили над сульфатом магния, фильтровали и упаривали, получая сироп желтого цвета. Неочищенный продукт хроматографировали на силикагеле, используя в качестве элюента градиент от 6:1 ЕЮАс/гексан до 100% ЕЮАс, после чего получали требуемый трипептидный диен 5Ь в виде пены белого цвета (5,88 г, 82%, чистота >95%, по данным ЖХВР).

Пример 6. Синтез макроциклического промежуточного продукта 6а.

Раствор диена 5Ь (4,0 г, 7,88 ммоля) в безводном ДХМ (800 мл) дезоксигенировали, барботируя Аг в течение 2 ч. Затем добавляли катализатор Ховейда (Ноуеуба) (262 мг, 0,434 ммоля, 5,5 мол.%) в виде твердого вещества и реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в атмосфере Аг, который поступал из баллона. Через 28 ч раствор красно-оранжевого цвета упаривали до получения аморфного твердого вещества и затем очищали с помощью экспресс-хроматографии на силикагеле. Начальная система растворителей представляла собой 10% ЕЮАс в СН₂С1₂. После элюирования катализатора из колонки растворитель заменяли на чистый ЕЮАс. Об элюировании катализатора из колонки судили по окраске. Выделяли макроциклический продукт 6а в виде бесцветной пены, которую повторно растворяли в смеси СН₂С1₂/гексан (~1:2). После выпаривания растворителя получали порошок белого цвета (3,362 г, выход 89%).

¹Н ЯМР (СЭС1₃, 400 МГц): δ 1,20-1,50 (т, 6Н), 1,43 (₈, 9Н), 1,53 (бб, 6=9,5 и 5,4 Гц, 1Н), 1,61-1,70 (т, 1Н), 1,76-1,90 (т, 2Н), 2,05-2,26 (т, 4Н), 2,45 (б, 6=14,3 Гц, 1Н), 3,67 (₈, 3Н), 3,71 (б, 1=11,1 Гц, 1Н), 3,90 (бб, 1=11,1 и 4,3 Гц, 1Н), 4,43-4,53 (т, 2Н), 4,76 (б, 1=8,6 Гц, 1Н), 4,86 (Ьб, 1=9,8 Гц, 1Н), 5,20-5,23 (т, 2Н), 5,57 (б1, 1=7,0 и 9,8 Гц, 1Н), 7,32 (Ь§, 1Н).

Пример 7. Получение тиомочевин 7.

Синтез тиомочевины 7а.

' 7а

К раствору трет-бутилизотиоцианта (5,0 мл; 39,4 ммоля) в ДХМ (200 мл) добавляли циклопентиламин (4,67 мл; 47,3 ммоля), а затем добавляли ДИЭА (диизопропилэтиламин) и реакционную смесь перемешивали при К.Т. в течение 2 ч. Смесь разбавляли ЕЮАс, промывали 10%-ным водным раствором лимонной кислоты (2х),насыщенным ХаНСО₃ (2х), Н₂О (2х) и соляным раствором (1х). Органический слой сушили над безводным М§ЗО₄, фильтровали и упаривали, получая трет-бутил-Х'-циклопентилтиомочевину в виде твердого вещества белого цвета (3,70 г; выход 47%). Х-трет-Бутил-Х'-циклопентилтиомочевину (3,70 г) растворяли в концентрированной НС1 (46 мл). Раствор темно-желтого цвета осторожно кипятили с обратным холодильником. Через 40 мин реакционной смеси давали охладиться до К.Т. и затем охлаждали на льду и подщелачивали до рН 9,5 с помощью твердого ХаНСО₃ и насыщенного водного раствора ХаНСО₃. Продукт экстрагировали ЕЮАс (3х), объединенные ЕЮАс-экстракты промывали Н₂О (2х) и соляным раствором (1х). Органический слой сушили (М§8О₄), фильтровали и концентрировали, получая твердое вещество бежевого цвета (2,46 г, неочищенный продукт). После растирания неочищенного продукта в гексане/ЕЮАс (95/5) с последующей фильтрацией получали Х-циклопентилтиомочевину 7а в виде твердого вещества белого цвета (2,38 г; выход 90%).

^!Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б6): δ 7,58 (Ь§, 1Н), 7,19 (Ь§, 1Н), 6,76 (Ь§, 1Н), 4,34 (Ь§, 1Н), 1,92-1,79 (т, 2Н), 1,66-1,55 (т, 2Н), 1,55-1,30 (т, 4Н). МС; е§⁺: 144,9 (М+Н)⁺, е§^-: 142,8 (М-Н)^-.

Получение тиомочевины 7Ь.

С помощью описанного выше процесса и используя поступающий в продажу циклогексиламин (вместо циклопентиламина), получали тиомочевину 7Ь.

- 12 007738

Стадия А.

К раствору, содержащему макроциклический промежуточный продукт 6а (13,05 г, 27,2 ммоля, 1,0 экв.), Р1цР (14,28 г, 54,4 ммоля, 2,0 экв.) и 2-карбоксиметокси-4-гидрокси-7-метоксихинолин (МО 00/09543; МО 00/09558 и МО 00/59929) (6,67 г, 28,6 ммоля, 1,05 экв.) в ТГФ (450 мл), при 0° по каплям в течение 15 мин добавляли ДИАД (10,75 мл, 54,6 ммоля, 2,0 экв.). Затем ледяную баню удаляли и реакционную смесь перемешивали при К.Т. в течение 3 ч. После завершения превращения исходного продукта в требуемые вещества растворитель выпаривали в вакууме, оставшуюся смесь разбавляли ЕЮАс, промывали насыщенным №НС'О₃ (2х) и соляным раствором (1х), органический слой сушили над безводным Мд§О₄, фильтровали и упаривали досуха. После колоночной экспресс-хроматографии получали чистое соединение 7а; колонку элюировали сначала гексаном/ЕЮАс (50:50), затем СНС1₃/ЕЮАс (95:5) для удаления побочных продуктов Рй₃РО и ДИАД и элюирование примесей оценивали с помощью ТСХ. Наконец, из колонки элюировали требуемый продукт 8а с помощью СНС1₃/ЕЮАс (70:30). Как правило, стадию хроматографии требовалось повторять 2-3 раза до тех пор пока соединение 8а можно было выделять в виде высокоочищенного твердого продукта белого цвета, общий выход которого составлял 68% (12,8 г, чисто

- 13 007738 та 99,5%, по данным ЖХВР).

Стадия Б.

К раствору защищенного с помощью Вос промежуточного продукта 8а (1,567 г) в СН₂С1₂ (15 мл) добавляли 4н. НС1 в диоксане (12 мл). Реакционную смесь перемешивали при К.Т. в течение 1 ч. (В случае, когда в середине реакционного периода образовывался густой гель, дополнительно вносили 10 мл СН₂С1₂.) После завершения стадии удаления защитной группы растворители выпаривали досуха, получая твердое вещество желтого цвета и пастообразный продукт. Смесь повторно растворяли примерно в 5% МеОН в СН₂С1₂ и повторно упаривали досуха в вакууме, получая соединение 8Ь в виде твердого вещества желтого цвета, которое использовали на следующей стадии без какой-либо очистки.

Стадия В.

К раствору циклопентанола (614 мкл, 6,76 ммоля) в ТГФ (15 мл) добавляли по каплям раствор фосгена в толуоле (1,93М, 5,96 мл, 11,502 ммоля) и смесь перемешивали при К.Т. в течение 2 ч, получая циклопентилхлорформиатный реагент (ζ). После этого примерно половину растворителя удаляли, выпаривая в вакууме. Оставшийся раствор светло-желтого цвета разбавляли, добавляя СН₂С1₂ (5 мл), и концентрировали до половины его первоначального объема для гарантии удаления всего избыточного фосгена. Затем вышеуказанный раствор циклопентилхлорформиатного реагента дополнительно разбавляли ТГФ (15 мл) и добавляли дигидрохлорид амина 8Ь. Смесь охлаждали до 0° в ледяной бане, значение рН доводили до ~8,5-9, добавляя Εΐ₃Ν (по каплям), и реакционную смесь перемешивали при 0° в течение 1 ч. Затем смесь разбавляли ЕЮАс, промывали водой (1х), насыщенным NаНСО₃ (2х), Н₂О (2х) и соляным раствором (1х). Органический слой сушили над безводным Мд§О₄, фильтровали и упаривали в вакууме, получая пену желто-янтарного цвета. После очистки с помощью колоночной экспресс-хроматографии (используя в качестве элюента градиент растворителей от 30% гексана до 20% гексана в ЕЮАс) получали сложный диметиловый эфир 8с в виде пены желтого цвета, выход 80% (1,27 г) и чистота >93%.

Стадия Г.

Сложный диметиловый эфир 8с (1,17 г) растворяли в смеси ТГФ/МеОН/Н₂О (20 мл, соотношение 2:1:1) и добавляли водный раствор ΝαΟΗ (1,8 мл, 1н., 1 экв.). Реакционную смесь перемешивали при К.Т. в течение 1 ч, а затем упаривали досуха, получая натриевую соль 86 в виде твердого вещества белого цвета (~1,66 ммоля). Соединение 86 использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

Стадия Д.

Неочищенную натриевую соль 86 (1,66 ммоля) растворяли в ТГФ (17 мл), добавляли Εΐ₃Ν и смесь охлаждали до 0° в ледяной бане. Добавляли по каплям изобутилхлорформиат (322 мкл, 2,5 ммоля) и смесь перемешивали при 0° в течение 75 мин. Затем добавляли диазометан (15 мл) и перемешивание продолжали при 0° в течение 30 мин, а далее при К.Т. в течение еще 1 ч. Большую часть растворителя упаривали досуха в вакууме, оставшуюся смесь разбавляли ЕЮАс, промывали насыщенным NаНСО₃(2х), Н₂О (2х) и соляным раствором (1х), сушили над безводным Мд§О₄, фильтровали и упаривали досуха, получая соединение 8е в виде светло-желтой пены (1,2 г, ~1,66 ммоля). Представляющий собой диазокетон промежуточный продукт 8е использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

Стадия Е.

Раствор диазокетона 8е (1,2 г, 1,66 ммоля), растворенный в ТГФ (17 мл), охлаждали до 0° в ледяной бане. Добавляли по каплям раствор водной НВг (48%, 1,24 мл) и реакционную смесь перемешивали при 0° в течение 1 ч. Затем смесь разбавляли ЕЮАс, промывали насыщенным NаНСΟ₃ (2х), Н₂О (2х) и соляным раствором (1х). Органический слой сушили над безводным Мд§О₄, фильтровали и упаривали досуха, получая промежуточный продукт, представляющий собой α-бромкетон 8£ в виде пены светложелтого цвета (~1,657 ммоля).

Стадия Ж.

К раствору бромкетона 8£ (2,51 г, 3,27 ммоля) в изопропаноле (105 мл) добавляли циклопентилтиомочевину 7а (565 мг, 3,92 ммоля) и реакционную смесь помещали в предварительно нагретую масляную баню с температурой 70° и перемешивали в течение 1,5 ч. Затем изопропанол удаляли в вакууме и продукт растворяли в ЕЮАс. Раствор промывали насыщенным NаНСО₃, водой и соляным раствором, органический слой сушили над безводным Мд§О₄, фильтровали и выпаривали, получая неочищенный продукт 8д (1,35 г) в виде твердого вещества светло-желтого цвета. Неочищенный продукт очищали экспресс-хроматографией на силикагеле (гексан/ЕЮАс, 1:1), получая 2,12 мг беловатого твердого вещества (выход 80%).

Стадия З.

Сложный метиловый эфир 8д (1,82 г, 2,2 ммоля) растворяли в растворе ТГФ/МеОН/Н₂О (38/20/18 мл) и омыляли с помощью ЫОН-Н₂О (935 мг, 22,3 ммоля). Осуществляли реакцию гидролиза в течение 18 ч при К.Т. Затем раствор упаривали досуха, получая беловатую пасту. Пасту разбавляли ЕЮАс и соляным раствором. Значение рН смеси доводили 6 с помощью 1н. НС1. ЕЮ Ас-слой отделяли и водный слой экстрагировали дважды ЕЮАс. Объединенные ЕЮАс-экстракты промывали деионизированной водой (2х) и соляным раствором (1х), сушили (Мд§О₄) и упаривали, получая циклическое трипептидное соединение 101 в виде твердого вещества желтого цвета (1,76 г; выход 99%).

- 14 007738

Превращение в \а-со.ль.

Соединение 81 (106 мг; 0,132 ммоля) растворяли в МеОН (20 мл) и добавляли 0,01н. раствор ХаО11 (13,2 мл). Прозрачный раствор желтого цвета разбавляли водой, замораживали и лиофилизировали, получая натриевую соль соединения 811 в виде аморфного твердого вещества желто-белого цвета (106 мг; выход 97%).

М.С.(электроспрей): 799,3 (М-Н)- 801,4 (М+Н), гомогенность, по данным ЖХВР, с обращенной фазой (0,06% ТФК; С^СК^О) 99%.

¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-бб): δ 8,02 (б, 1=9,2 Гц, 1Н), 7,90 (б, 1=6,4 Гц, 1Н), 7,76 (§, 1Н), 7,44 (Ь§, 2Н), 7,27 (б, 6=1,9 Гц, 1Н), 7,11 (б, 1=7,0 Гц, 1Н), 7,03 (б, 1=9,2 Гц, 1Н), 5,48 (бб, 1=18,4, 9,9 Гц, 1Н), 5,43 (Ь§, 1Н), 5,15 (б1, 1=17,8, 7,63 Гц, 1Н), 4,70 (Ь§, 1Н), 4,49-4,34 (т, 2Н), 4,34-4,25 (т, 1Н), 4,13-4,03 (т, 1Н), 3,99-3,86 (т, 1Н), 3,90 (§, 3Н), 2,58-2,44 (т, 1Н), 2,42-2,32 (т, 1Н), 2,15-1,93 (т, 4Н), 1,83-1,14 (т, 24Н), 1,14-1,12 (т, 1Н).

Пример 9.

Используя процесс, описанный в примере 8, но применяя на стадии Ж Ν-циклогексилтиомочевину 7Ь, получали натриевую соль соединения 102.

¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б₆): δ 8,02 (б, 1=9,2 Гц, 1Н), 7,86 (Ь§, 1Н), 7,78 (б, 1=7,3 Гц, 1Н), 7,43 (§, 2Н), 7,27 (б, 1=2,2 Гц, 1Н), 7,12 (б, 1=6,9 Гц, 1Н), 7,03 (бб, 1=9,2, 1,9 Гц, 1Н), 5,57-5,40 (т, 1н), 5,40 (§, 1н), 5,26-5,17 (т, 1Н), 4,70 (Ь§, 1Н), 4,52-4,35 (т, 2Н), 4,29-4,23 (т, 1Н), 4,18-4,00 (т, 1Н), 3,90 (§, 3Н), 3,87-3,65 (т, 1Н), 2,42-2,32 (т, 1Н), 2,19-2,10 (т, 1Н), 2,07-1,96 (т, 3Н), 1,82-0,95 (т, 28Н). МС; е§⁺: 815,4 (М+Н)⁺, е§^-: 813,4 (М-Н)^-.

Пример 10. Анализ N83-N84Α-проτеазы.

Ферментативный анализ, который применяли для оценки соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, описан в ЛО 00/09543 и ЛО 00/59929.

Пример 11. Анализ репликации РНК НСУ на культуре клеток.

Культура клеток.

Клетки линии Ни17, стабильно поддерживающие субгеномный репликон НСУ, создавали согласно описанному ранее методу (Бойтап и др., 8с1епсе 285, 1999, сс. 110-113) и обозначали их как клеточная линия 822.3 (ЛО 02/052015). Клетки линии 822.3 поддерживали в модифицированной по методу Дульбекко среде Игла (ΌΜΕΜ), дополненной 10% ФБС и 1 мг/мл неомицина (стандартная среда). В процессе анализа использовали среду ΌΜΕΜ, дополненную 10% ФБС, содержащую 0,5% ДМСО и не содержащую неомицин (среда для анализа). За 16 ч до внесения соединения клетки линии 822.3 обрабатывали трипсином и разбавляли до 50000 клеток/мл стандартной средой. По 200 мкл (10000 клеток) вносили в каждую лунку 96-луночного планшета. Затем планшет инкубировали при 37° в атмосфере с 5% СО₂ до следующего дня.

Реагенты и материалы.

Продукт	Компания	Каталожный №	Условия хранения
ΌΜΕΜ	Λίδεηί 1пс.	10013СУ	4°С
ДМСО	81§та	Ό-2650	К.Т.
Модифицированный по методу Дульбекко ЗФР	О1Ьсо-ВК.Ь	14190-136	К.Т.
Фетальная телячья сыворотка (ФТС) (сыворотка плода коровы)	Вю-ЛЫИакег	14-901Р	-20°С/4°С
Неомицин (0418)	О1Ьсо-ВКЬ	10131-027	-20°С/4°С
Трипсин-ЭДТК	Ойэсо-ВКЕ	25300-054	-20°С/4°С
96-луночные планшеты	Соз1аг	3997	К.Т.
Фильтр из поливинилиденфторида (ПВДФ), 0,22 мкм	МйНроге	8ЬОУ025Ь8	К.Т.
Титрационный планшет из полипропилена с глубокими лунками	Весктап	267007	К.Т.

- 15 007738

Подготовка тестируемого соединения к анализу.

мкл тестируемого соединения (в 100% ДМСО) добавляли к 2 мл среды для анализа до конечной концентрации ДМСО 0,5% и раствор обрабатывали ультразвуком в течение 15 мин и фильтровали через фильтр типа М1Шроте с размером отверстий 0,22 мкм. 900 мкл вносили в ряд А титрационного планшета из полипропилена с глубокими лунками. Ряды Б-3 содержали аликвоты по 400 мкм среды для анализа (содержащей 0,5% ДМСО), и их применяли для приготовления серийных разведений (1/2) путем переноса по 400 мкл из ряда в ряд (в ряд 3 не вносили никакого соединения).

Внесение тестируемого соединения в культуру клеток.

Среду для культуры клеток аспирировали из 96-луночного планшета, содержащего клетки линии 822.3. По 175 мкл среды для анализа с соответствующим образом разбавленным тестируемым соединением переносили из каждой лунки планшета, содержащего соединения, в соответствующую лунку планшета, содержащего культуру клеток (ряд 3 применяли в качестве «контроля без ингибитора»). Планшет с культурой клеток инкубировали при 37° в атмосфере с 5% СО₂ в течение 72 ч.

Экстракция общей клеточной РНК.

После 72-часового периода инкубации экстрагировали общую клеточную РНК из клеток линии 822.3, находящихся в 96-луночном планшете, используя набор типа КЫеаку 96 (О|адеп®. КЫеаку НаибЬоок, 1999.). В целом, метод состоит в следующем: среду для анализа полностью удаляли из клеток и в каждую лунку 96-луночного планшета с культурой клеток добавляли по 100 мкл КЕТ-буфера (фтадеп®), содержащего 143 мМ β-меркаптоэтанол. Микропланшет осторожно встряхивали в течение 20 с. Затем в каждую лунку микропланшета добавляли по 100 мкл 70%-ного этанола и перемешивали пипетированием. Лизат удаляли и вносили в лунки планшета, содержащего КЫеаку 96 (фтадеп®), который помещали в верхнюю часть блока с квадратными лунками (ф1адеп® 8с.|иаге-\Уе11 В1оск). Планшет с КЫеаку 96 запечатывали скотчем и устройство 8с.|иаге-\Уе11 В1оск с содержащим КИеаку 96 планшетом помещали в держатель и вносили в роторный резервуар центрифуги 4К15С. Образец центрифугировали при 6000 об./мин (~5600 х д) в течение 4 мин при комнатной температуре. Скотч удаляли с планшета и в каждую лунку планшета с КЫеаку 96 вносили по 0,8 мл К\У1-буфера (ф1адеп® набор КЫеаку 96). Содержащий КЫеаку 96 планшет запечатывали новым куском скотча и центрифугировали при 6000 об./мин в течение 4 мин при комнатной температуре. Содержащий КИеаку 96 планшет помещали в верхнюю часть другого чистого блока с квадратными лунками (типа 8с.|иаге-\Уе11 В1оск), скотч удаляли и в каждую лунку содержащего КЫеаку 96 планшета вносили по 0,8 мл КРЕ-буфера (ф1адеп® набор КЫеаку 96). Содержащий КЫеаку 96 планшет запечатывали новым куском скотча и центрифугировали при 6000 об./мин в течение 4 мин при комнатной температуре. Скотч удаляли и в каждую лунку содержащего КИеаку 96 планшета вносили еще по 0,8 мл КРЕ-буфера (ф1адеп® набор КЫеаку). Содержащий КЫеаку 96 планшет запечатывали новым куском скотча и центрифугировали при 6000 об./мин в течение 10 мин при комнатной температуре. Скотч удаляли, содержащий КЫеаку 96 планшет помещали в верхнюю часть адаптора, содержащего предназначенные для сбора образцов микроцентрифужные пробирки объемом 1,2 мл. РНК элюировали, добавляя в каждую лунку по 50 мкл свободной от РНКазы воды, запечатывая планшет новым куском скотча и инкубируя в течение 1 мин при комнатной температуре. Планшет затем центрифугировали при 6000 об./мин в течение 4 мин при комнатной температуре. Стадию элюирования повторяли, используя второй объем, равный 50 мкл свободной от РНКазы воды. Микроцентрифужные пробирки с общей клеточной РНК хранили при -70°.

Количественная оценка общей клеточной РНК.

РНК оценивали количественно с помощью системы 8ТОКМ® (Мо1еси1аг Эупатюк®), используя набор для количественной оценки РНК типа КтЬоОтееп® (Мо1еси1аг РтоЬек®). В целом, метод состоит в следующем: реагент КтЬоОтееп разбавляли в 200 раз ТЭ (10 мМ Трис-НС1, рН=7,5, 1 мМ ЭДТК). Как правило, 50 мкл реагента разбавляли 10 мл ТЭ. Образцы рибосомной РНК для построения стандартной кривой разбавляли в ТЭ до 2 мкл/мл и затем предварительно определенные количества (100, 50, 40, 20, 10, 5, 2 и 0 мкл) раствора рибосомной РНК переносили в новый 96-луночный планшет (СО8ТАК № 3997) и объем доводили до 100 мкл с помощью ТЭ. Как правило, колонку 1 96-луночного планшета использовали для построения стандартной кривой, а другие лунки использовали для количественной оценки образцов РНК. По 10 мкл каждого образца РНК, подлежащего количественной оценке, переносили в соответствующую лунку 96-луночного планшета и добавляли по 90 мкл ТЭ. В каждую лунку 96-луночного планшета вносили по одному объему (100 мкл) разбавленного реагента КтЬоОтееп и инкубировали в течение 2-5 мин при комнатной температуре, защищая от света (10 мкл образца РНК в 200 мкл конечного объема, т.е. 20-кратное разбавление). Интенсивность флуоросценции каждой лунки оценивали с помощью системы 8ТОКМ® (Мо1еси1аг Оупат1ск®). Стандартные кривые получали на основе известных количеств рибосомной РНК и соответствующей им интенсивности флуоресценции. Концентрацию РНК в экспериментальных образцах определяли исходя из стандартной кривой и корректировали с учетом 20-кратного разбавления.

- 16 007738

Реагенты и материалы.

Продукт	Компания	Каталожный №	Условия хранения
ОЕРС	81§та	Ώ5758	4°С
ЭДТК	81£та	Е5134	К.Т.
Основание Тпгта	81£та	Т8524	К.Т.
Тпгта-НС1	81£та	Т7149	К.Т.
Адапторы с пробирками для сбора	(^а^еп	19562	К.Т.
Набор для количественной оценки РНК типа КлЪоргееп	Мо1еси1аг РгоЬе	К.11490	-20°С
Набор типа КЛеазу 96	(^а^еп	74183	К.Т.
Блоки с квадратными лунками	Р1а§еп	19573	К.Т.

ОТ-ПЦР, проводимая в реальном времени.

ОТ-ПЦР в реальном времени осуществляли с помощью системы для анализа последовательности АВ1 Рпзт 7700 с использованием набора Тас|Мап ΕΖ К.Т.-РСК (фирмы Регкт-Е1тег Арркеб Вюзу^етз®). ОТ-ПЦР оптимизировали для количественной оценки 5'-1КЕ8 РНК НСУ с помощью технологии Тартал (фирма Коске Мо1еси1аг О1ацпохНс8 8уз!етз), которая аналогична методу, описанному ранее у Маг£е11 и др., 1. С1т. М1сгоЫо1. 37, 1999, сс. 327-332). Система основана на 5'^3' нуклеолитической активности ДНК-полимеразы АтрНТас]. В целом, метод состоит в следующем: для его осуществления использовали фторогенный гибридизующийся зонд с двойной меткой (РиТК-зонд), который специфично ренатурирует матрицу между ПЦР-праймерами (праймеры 8125 и 7028). 5'-Конец зонда содержит флуоресцентный репортер (6-карбоксифлуоресцин [ЕАМ]), а 3'-конец содержит гаситель флуоресценции (6-карбокситетраметилродамин [ТАМКА]). Спектр испускания репортера ЕАМ подавляли гасителем на неповрежденном гибридизующемся зонде. Расщепление гибридизующегося зонда высвобождало репортер, что приводило к повышению испускания флуоресценции. С помощью анализатора последовательности типа АВ1 Рг1§т 7700 непрерывно осуществляли определение повышения испускания флуоресценции в процессе ПЦР-амплификации, при этом количество амплифицированного продукта прямо пропорционально сигналу. Зависимость амплификации от времени анализировали на ранней стадии реакции, в момент времени, соответствующий логарифмической фазе накопления продукта. Точку, представляющую собой определенный порог обнаружения повышения сигнала флуоресценции, связанного с экспоненциальным увеличением количества ПЦР-продукта для анализатора последовательности, обозначали как порог цикла (Ст). Значения С_Т обратно пропорциональны количеству введенной РНК НСУ; т.е. при одинаковых условиях ПЦР чем больше исходная концентрация РНК НСУ, тем ниже значение С_Т. Стандартную кривую строили автоматически с помощью системы обнаружения АВ1 Рг1зт 7700 путем построения графика зависимости С_Т от каждого стандартного разведения с известной концентрацией РНК НСУ.

В каждый планшет для осуществления ОТ-ПЦР вносили эталонные образцы для стандартной кривой. РНК репликона НСУ синтезировали (посредством транскрипции Т7) ίη νίΐΓΟ, очищали и количественно оценивали по величине ОП₂₆₀. С учетом того, что в 1 мкг этой РНК содержится 2,15x10¹¹ копий РНК, осуществляли такие разведения, чтобы получать 10⁸, 10⁷, 10⁶, 10⁵, 10⁴, 10³ или 10² копий геномной РНК/5 мкл. В каждое разведение включали также общую клеточную РНК линии Ник-7 (50 нг/5 мкл). 5 мкл каждого эталонного образца (РНК репликона + РНК Ник-7) объединяли с 45 мкл реагента М1х и применяли в проводимой в реальном времени ОТ-ПЦР.

Проводимую в реальном времени ОТ-ПЦР осуществляли также с использованием экспериментальных образцов, которые очищали в содержащих КУеа^у 96 лунках планшета, объединяя 5 мкл каждого образца общей клеточной РНК с 45 мкл реагента М1х.

Реагенты и материалы.

Продукт	Компания	Каталожный №	Условия хранения
Набор ТацМап ΕΖ К.Т.РСК	РЕ АррИеб ВюзузЩтз	N808-0236	-20°С
Оптические колпачки типа М1сгоАтр	РЕ АррИеб В108уз1ет8	N801-0935	К.Т.
Оптический 96луночный реакционный планшет типа МхсгоАтр	РЕ АррНеб В1О8у81етз	N801-0560	К.Т.

- 17 007738

Состав для приготовления реагента Μίχ.

Компонент	Объем для 1 образца (мкл)	Объем для одного планшета (мкл) (объем для 91 образца + «мертвый» объем)	Конечная концентрация
Свободная от РНКазы вода	16,5	1617
5><буфер ТацМап ΕΖ	10	980	1*
Мп(ОАс)₂ (25мМ)	6	588	ЗмМ
дАТФ (ЮмМ)	1,5	147	ЗООмкМ
дЦТФ (ЮмМ)	1,5	147	ЗООмкМ
дГТФ (ЮмМ)	1,5	147 ’	ЗООмкМ
дУТФ (20мМ)	1,5	147	бООмкМ
«Прямой» праймер (ЮмкМ)	1	98	200нМ
«Обратный» праймер (ЮмкМ)	1	98	200нМ
РиТК-зонд (5мкМ)	2	196	200нМ
ДНК-полимераза гТ!Ь (2,5 ед./мкл)	2	196	0,1 ед./мкл
АтрЕгазе υΝΟ (1 ед./мкл)	0,5	49	0,01 ед./мкл
Общий объем	45	4410

Последовательность «прямого» праймера (8ЕР Ш. 1): 5'-АСО САО ААА ОСО ТСТ АОС САТ ООО ОТТ АОТ-3'

Последовательность «обратного» праймера (8ЕР Ш ΝΌ. 2): 5'-ТСС СОО ООС АСТ СОС ААО САС ССТ АТС АОО-3'

Примечание. Эти праймеры обеспечивают амплификацию области, состоящей из 256 нуклеотидов, которая присутствует в 5'-нетранслируемой области НСУ.

Последовательность РИТК-зонда (8ЕР Ш ХО. 3):

|6ГАМ|- ТОО ТСТ ОСО ОАА ССО ОТО АСТ АСА СС - ,ΤΑΜΚΑ

Не содержащие матрицы контроли (НМК): на каждом планшете по 4 лунки использовали в качестве «НМК». Для получения таких контролей в каждую лунку вместо РНК вносили 5 мкл воды.

Условия проведения реакции в термоячейке:

50°С мин

60°С мин

95°С

95°С мин

15с

60°С мин }· 2 цикла

90°С с

60°С мин циклов

После завершения ОТ-ПЦР для анализа данных необходимо определять порог обнаружения сигнала флуоресценции для ПЦР-планшета и для этого получали стандартную кривую путем построения графика зависимости значения С! от количества копий РНК, применяемых в каждой эталонной реакции. Значения С_!, полученные для анализируемых образцов, использовали для определения путем интерполяции количества копий РНК на основе стандартной кривой.

И, наконец, количество копий РНК стандартизовали (на основе количественной оценки РНК, экстрагируемой из лунки с клеточной культурой, с помощью набора КЛоОгееп ΚΝΑ) и выражали в виде геномных эквивалентов/мкг общей РНК [г.э./мкг].

Количество копий РНК [г.э./мкг] для каждой лунки планшета с культурой клеток принимали за меру количества реплицирующейся РНК НСУ в присутствии различных концентраций ингибитора. Ингибирование в % рассчитывали с помощью следующего уравнения:

100-[(г.э./мкг инг.)/(г.э./мкг контр.)х100].

Для обработки данных зависимости ингибирования от концентрации применяли основанную на модели Хилла аппроксимацию нелинейной кривой и значения концентрации, обеспечивающей 50%-ную эффективность (50%-ное ингибирование) (ЕС₅₀) рассчитывали с помощью программного обеспечения 8А8 (8!а!1з!1са1 8оГ1\\аге 8уз1еш; 8А8 1пЫИи1е, 1пс. Кэри, шт. Северная Каролина).

- 18 007738

Пример 12. Анализы специфичности.

Анализы специфичности, применяемые для оценки избирательности действия указанного соединения, соответствуют описанным в АО 00/09543.

Пример 13. Фармакокинетические свойства.

Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, обладают также удовлетворительными фармакокинетическими свойствами, такими как значительные уровни в плазме крыс через 1 и 2 ч после орального введения дозы 5 мг/кг.

Более конкретно, для оценки уровней в плазме крыс тестируемых соединений после орального введения применяли следующий анализ, основанный на оценке ш у1уо абсорбции после орального введения.

Материалы и методы.

1. Метод, применяемый для группировки соединений (отбор с помощью «кассет»).

Отбор соединений, предназначенных для объединения в «кассету», был основан на их структурном сходстве и физикохимических свойствах. Был разработан метод твердофазной экстракции, применимый для всех отобранных соединений. Данные начального тестирования, при котором каждое соединение вводили в плазму крыс и с помощью ЖХВР или ЖХВР-МС анализировали каждое соединение, взятое в концентрации 0,5 мкМ, с определением времени удерживания, ионной массы и возможности разделения соединений с помощью ЖХВР и/или ЖХВР/МС, использовали для объединения 3-4 соединений в одну «кассету».

2. Подготовка носителя и соединения для орального введения.

Каждая «кассета» содержала 3-4 соединения, каждое в концентрации 5 или 4 мг/кг. Кассету приготавливали в виде суспензии для орального введения, содержащей 0,5% водной метилцеллюлозы и 0,3% полиоксиэтилен(20)сорбитанмоноолеата (Твин-80). Объем вводимой дозы составлял 10 мл/кг, и ее вводили через оральный желудочный зонд.

3. Применяемые дозы и отбор образцов плазмы.

Самцов крыс 8рга§ие Оаш1еу содержали в индивидуальных клетках в течение ночи, и животные имели доступ к водной 10%-ной декстрозе. Каждую «кассету» вводили 2 крысам. Образцы плазмы (~1 мл) получали через 1 и 2 ч после обработки у каждой из двух крыс и объединяли для экстракции и анализа.

4. Экстракция и анализ соединений.

Для каждой «кассеты» образцы плазмы, полученные через 1 и 2 ч, образцы контрольной плазмы, образцы контрольной плазмы, в которую вводили все соединения, каждое в концентрации 0,5 мкМ, экстрагировали с помощью метода твердофазной экстракции. Для сравнения образцы анализировали с помощью ЖХВР и ЖХВР/МС. Концентрации в плазме определяли на основе одной концентрации стандарта, составляющей 0,5 мкМ.

Таблица 1

МеО

Соединение №	К¹		К³	МС (ΜΗ)-
101	ОН	циклопентил	циклопентил	799,3
102	он	циклогексил	циклопентил	813,4
103	ΝΗ-8Ο₂циклопропил	циклопентил	циклопентил	η/ά

При оценке соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, с помощью описанных выше ферментативных анализов и анализов клеточных культур выявлена их высокая активность. Более конкретно, установлено, что значения 1С₅₀ соединений составляли менее 0,01 мкМ при анализе Н83-№84Апротеазы, а значения ЕС₅₀ составляли менее 0,01 мкМ при анализе репликации РНК НСУ на культуре клеток.

При анализе специфичности соединений установлено, что соединения формулы (I) обладают изби

- 19 007738 рательным действием, т.е. они не обладают выраженной ингибирующей активностью в отношении эластазы человеческих лейкоцитов и катепсина В.

При осуществлении фармакокинетического анализа на крысах неожиданно было установлено, что при использовании дозы 5 мг/кг в метоцеле :Твин20® (0,5%:0,3%) получали высокие концентрации в плазме. Для соединений 101 и 102 величина площади под кривой (ЛиС) составляла 16 и 18 мкМ-ч соответственно, в то время как для их ближайших аналогов величина ЛиС составляла 0,8-4,5 мкМ-ч. Это неожиданное и важное повышение проникновения соединений в плазму крыс делает эти соединения очень перспективными в качестве возможных лекарственных средств, которые можно вводить оральным путем.

Перечень последовательностей <110> Бёрингер Ингельхайм (Канада) Лтд.

<120> Макроциклические пептиды, обладающие активностью в отношении вируса гепатита С <130> 13/092 <150> 2,369,711 <151> 2002-01-30 <160> 3 <170> ГазкБЕО для версии Игпдоюз 4.0 <210> 1 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> прямой праймер <400> 1 асдсадааад сдбсбадсса бддсдббадб 30 <210> 2 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> обратный праймер <400> 2 бсссддддса сбсдсаадса сссбабсадд 30 <210> 3 <211> 26 <212> ДНК

- 20 007738 <213> искусственная последовательность <220>

<223> ΡϋΤΚ-зонд <400> 3

ГддРсРдсдд аассдд+дад касасс 26

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ в котором К¹ обозначает гидрокси или NН8О2К^1А, где К^1А обозначает метил, этил, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклопропилметил, циклогексил, СС13, СР₃, фенил, 2-фторфенил или 4-метилфенил, К² обозначает С₅-С₆циклоалкил и К³ обозначает циклопентил; или его фармацевтически приемлемая соль.
2. Соединение по п.1, в котором К^1А обозначает циклопропил.
3. Соединение по п.1 или 2, в котором К¹ обозначает гидрокси.
4. Соединение по одному из пп.1-3, в котором К² обозначает циклопентил.
5. Соединение по п.1, имеющее формулу 101

- 21 007738
7. Соединение по п.1, имеющее формулу 103
8. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное в отношении вируса гепатита С количество соединения формулы (I) по одному из пп.1-7 или его фармацевтически приемлемой соли в смеси с фармацевтически приемлемой средой носителя или вспомогательным веществом.
9. Фармацевтическая композиция по п.8, дополнительно содержащая терапевтически эффективное количество одного или нескольких других агентов, обладающих активностью в отношении НСУ.
10. Фармацевтическая композиция по п.9, в которой другой агент, обладающий активностью в отношении НСУ, выбирают из α-интерферона или пэгилированного α-интерферона.
11. Фармацевтическая композиция по п.9 или 10, в которой другой агент, обладающий активностью в отношении НСУ, представляет собой рибавирин.
12. Фармацевтическая композиция по пп.9, 10 или 11, в которой другой агент, обладающий активностью в отношении НСУ, выбирают из ингибиторов: геликазы, №2/3-протеазы и внутреннего сайта входа в рибосому (ЧЕЕ8).
13. Способ лечения или предупреждения инфекции, вызываемой вирусом гепатита С у млекопитающего, заключающийся в том, что млекопитающему вводят эффективное в отношении вируса гепатита С количество соединения формулы (I) по одному из пп.1-7 или его фармацевтически приемлемой соли.
14. Способ лечения или предупреждения инфекции, вызываемой вирусом гепатита С у млекопитающего, заключающийся в том, что млекопитающему вводят эффективное в отношении вируса гепатита С количество композиции по одному из пп.10-12.
15. Способ лечения или предупреждения инфекции, вызываемой вирусом гепатита С у млекопитающего, заключающийся в том, что млекопитающему вводят эффективное в отношении вируса гепатита С количество соединения формулы (I) по одному из пп.1-7 или его терапевтически приемлемой соли в сочетании с одним или несколькими другими агентами, обладающими активностью в отношении НСУ.
16. Способ по п.15, заключающийся в том, что другой агент, обладающий активностью в отношении НСУ, выбирают из α-интерферона или пэгилированного α-интерферона.
17. Способ по п.15 или 16, заключающийся в том, что другой агент, обладающий активностью в отношении НСУ, представляет собой рибавирин.
18. Способ по пп.15, 16 или 17, заключающийся в том, что другой агент, обладающий активностью в отношении НСУ, выбирают из ингибиторов: геликазы, №2/3-протеазы и внутреннего сайта входа в рибосому (1ЕЕ8).
19. Применение соединения формулы (I) по одному из пп.1-7 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения или предупреждения инфекции, вызываемой вирусом гепатита С.