DK176489B1 - Neurotrofiske forbindelser, fremgangsmåde til fremstilling heraf og farmaceutiske sammensætninger indeholdende disse forbindelser - Google Patents

Description

DK 176489 B1

Titel: Neurotrofiske forbindelser, fremgangsmåde til fremstilling heraf og farmaceutiske sammensætninger indeholdende disse forbindelser

5 BAGGRUND FOR OPFINDELSEN

i 1. Opfindelsens område 10 Denne opfindelse angår ikke-immunosuppressive neurotrofiske forbin delser med den nedenfor viste almene formel I. Forbindelserne har en affinitet til FKBP-type immunophiliner og er anvendelige som inhibitorer af enzymaktiviteten i tilknytning til immunophilinproteiner, og især som inhibitorer af peptidyl-prolylisomerase- eller rotamase-enzymaktivitet.

15 2. _Beskrivelse af kendt teknik

Benævnelsen immunophilin henviser til et antal proteiner, der tjener 20 som receptorer for de vigtigste immunosuppressive medikamenter, cyclosporin A (CsA), FK506 og rapamycin. Kendte klasser af immunophiliner er cyclophili-ner og FK506 bindingsproteiner, som f.eks. FKBP. Cyclosporin A bindes til cyclophilin, medens FK506 og rapamycin bindes til FKBP. Disse immunophilin-medikamentkomplekser danner grænseflade med et varieret antal intracellulare 25 signaltransduktionssystemer, især i immunsystemet og nervesystemet.

i 2 DK 176489 B1

Immunophiliner er kendte for at have peptidyl-prolylisomerase- (PPIase) eller rotamase-enzymaktivitet. Det er blevet bestemt, at rotamaseaktivitet spiller en rolle i katalyseringen af interkonversionen af cis- og trans-isomererne af im-5 munophilinproteiner.

Immunophiliner blev oprindeligt opdaget og undersøgt i immunvæv. Det blev indledningsvis postuleret af fagfolk, at inhibering af immunophilinrotama-10 seaktiviteten fører til inhibering af T-celleproliferationen, hvorved den immunosuppressive virkning, som hæmmes af immunosuppressive medikamenter, som f.eks. cyclosporin A, FK506 og rapamycin, blev fremkaldt. Yderligere undersøgelser har vist, at inhibering af rotamaseaktiviteten, i og af sig selv, ikke er tilstrækkelig til immunosuppressiv aktivitet; Schreiber et al. Science 1990, 250, 15 side 556-559. Det er blevet påvist, at immunophilinmedikamentkomplekser vekselvirker med ternære protein-mål som deres virkeområde; Schreiber et al., Cell 1991, vol. 66, side 807-815. I tilfælde med FKBP-FK506 og FKBP-CsA bindes medikament-immunophilinkomplekserne til enzymet calcineurin, under inhibering af T-cellereceptorsignalering, hvilket fører til T-celleproliferation. Ligeledes 20 vekselvirker komplekset af rapamycin og FKBP med RAFT1/FRAP proteinet og inhiberer signalering fra IL-2 receptoren.

Immunophiliner er blevet påvist med høje koncentrationer i centralnervesystemet. Immunophiliner forekommer 10-50 gange hyppigere i centralnerve-25 systemet end i immunsystemet. I neurale væv påvirker immunophiliner tilsyneladende neuronal procesudvidelse, nitrogenoxidsyntese og neurotransmitter-afgivelse.

Det er blevet påvist, at picomolære koncentrationer af immunosuppres-30 siva, som f.eks. FK506 og rapamycin, stimulerer neuritudvækst i PC12 celler og sensoriske nerver, nemlig dorsalrod-ganglieceller (DRG); Lyons et al., Proc. of Natl. Acad. Sci., 1 994 vol. 91, side 3191-3195.1 heldyrs-eksperimenter har 3 DK 176489 B1 FK506 vist sig at stimulere nerveregeneration efter facialnervebeskadigelse og resulterer i funktionel helbredelse i dyr med ischias-nervelæsioner.

5

Det er på overraskende måde blevet påvist, at medikamenter med en stor affinitet til FKBP er kraftigt virkende rotamaseinhibitorer, hvilket medfører en neurotrofisk virkning; Lyons et al. Disse resultater foreslår brugen af immu-nosuppressiva ved behandling af forskellige perifere nervelidelser og forstærk-10 ning af neurogenvæksten i centralnervesystemet (CNS). Undersøgelser har vist, at neurodegenerative lidelser, som f.eks, Alzheimer's sygdom, Parkinson's sygdom og amyotrofisk lateral sklerose (ALS), kan fremkomme som følge af tab eller nedsat tilgængelighed af en neurotrofisk substans, som er specifik for en særlig population af neuroner, som er påvirket af lidelsen.

15

Der er blevet identificeret adskillige neurotrofiske faktorer, som påvirker specifikke neuronpopulationer i centralnervesystemet. For eksempel har det været antaget, at Alzheimer's sygdom er resultatet af en mindskelse eller tab af 20 nervevækstfaktor (NGF). Det er således blevet foreslået at behandle Alzheimer's patienter med exogen nervevækstfaktor eller andre neurotrofiske protei- i ner, som f.eks. hjerneafledt nervefaktor (BDNF), gliøst afledt nervefaktor, ciliær neurotrofisk faktor og neurotropin-3 med henblik på at forbedre overlevelsen af degenererende neuronpopulationer.

25

Klinisk anvendelse af disse proteiner i forskellige neurologiske sygdomsstadier hæmmes af vanskeligheder med hensyn til levering og biotilgængelighed af store proteiner til nervesystemmålene. Omvendt er immunosup-30 pressive medikamenter med neurotrofisk aktivitet relativt små og udviser god biotilgængelighed og specificitet. Når de imidlertid gives kronisk, frembyder immunosuppressiva et antal potentielt alvorlige bivirkninger, herunder nephro-toxicitet, som f.eks. svækkelse af den glomerulære filtration og irreversibel in- 4 DK 176489 B1 terstrtial fibrose (Kopp et al., 1991, J. Am. Soc. Nephrol. 1:162); neurologiske udfald, som f.eks. ufrivillige rystelser eller ikke-specifik cerebral angina, som f.eks. ikke-lokaliseret hovedpine (De Groen et al., 1987, N. Engl. J. Med.

317:861); og vaskulær hypertension med komplikationer, som fremkommer 5 deraf (Kahan et al., 1989 N. Engl. J. Med. 321:1725).

For at forhindre bivirkninger i tilknytning til brug af de immunosuppressive forbindelser tilvejebringer den foreliggende opfindelse ikke-immunosuppressive forbindelser, som indeholder småmolekylære FKBP-10 rotamaseinhibitorer til fremme af neuronvækst og regeneration i forskellige neu- i ropatologiske situationer, hvor neuronheling kan lettes, herunder perifer nervebeskadigelse ved fysisk beskadigelse eller sygdomstilstande, som f.eks. diabetes, fysisk beskadigelse af centralnervesystemet (rygmarv og hjerne) og hjerne-beskadigelse i forbindelse med slagtilfælde, og til behandling af neurologiske 15 sygdomme i forbindelse med neurodegeneration, herunder Parkinson's sygdom, Alzheimer's sygdom og amyotrofisk lateral sklerose.

SAMMENFATNING AF OPFINDELSEN

20

Den foreliggende opfindelse angår en ny klasse af neurotrofiske forbindelser, som har en affinitet til FKBP-type immunophiliner. Når de først er bundet til dette protein, er de neurotrofiske forbindelser kraftigt virkende inhibitorer af 5 DK 176489 B1 enzymaktiviteten i forbindelse med immunophilinproteiner og især rotamase-enzymaktiviteten, hvorved neuronal regeneration og udvækst stimuleres. Et afgørende kriterium ved forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse er, at ' 5 de ikke udøver nogen signifikant immunosuppressiv aktivitet ud over deres neu-rotrofiske aktivitet.

Nærmere bestemt angår den foreliggende opfindelse neurotrofiske forbindelser med den almene formel: 10 i Ογ,

nA, 0 J

i 20 hvor 25 Y er oxygen eller NR2, hvor R2 er hydrogen eller Ci-C6-alkyl; og i Z er et ligekædet eller forgrenet C^Ce-alkyl eller -alkenyl, hvorved alkyl- eller al- ! kenylkæden er substitueret i en eller flere positioner med An, C3-C8-cycloalkyl, 30 C3-C8-cycloalkyl forbundet ved hjælp af en Ci-C6-alkyl- eller C2-C6-alkenylkæde eller Ar2l hvor An er 1-naphthyl, 2-naphthyl, 2-indolyl, 3-indolyl, 2-furyl, 3-furyl, 2-thiazolyl, 2-thienyl, 3-thienyl, 2-pyridyl, 3-pyridyl, 4-pyridyl eller phenyl, som i 6 DK 176489 B1 har en til tre substituenter, som udvælges uafhængigt fra gruppen, som består af hydrogen, halogen, hydroxyl, nitro, trifluormethyl, ligekædet eller forgrenet Ci-Ce-alkyl eller -alkenyl, CrC4-alkoxy eller C-i-C4-alkenyloxy, phenoxy, benzy-5 loxy og amino, og Ar2 er 2-indolyl, 3-indolyl, 2-furyl, 3-furyl, 2-thiazolyl, 2-thienyl, 3-thienyl, 2-, 3- eller 4-pyridyl eller phenyl, som har en til tre substituenter, som udvælges uafhængigt fra gruppen, som består af hydrogen, halogen, hydroxyl, nitro, trifluormethyl, ligekædet eller forgrenet CrC6-alkyl eller -alkenyl, Ci-C4-alkoxy eller Ci-C4-alkenyloxy, phenoxy, benzyloxy og amino; eller 10 Z er et fragment med formlen:

O

H li C-C X2 r4

15 I

20 hvor R3 udvælges fra gruppen, som består af ligekædet eller forgrenet CrCB-alkyl, der eventuelt er substitueret med C3-C8-cycloalkyl eller An som defineret ovenfor; 25 X2 er 0 eller NRs> hvor R5 udvælges fra gruppen, som består af hydrogen, ligekædet eller forgrenet Ci-C6-alkyl og ligekædet eller forgrenet C2-C6-alkenyl; og 7 DK 176489 B1 R4 udvælges fra gruppen, som består af phenyl, ligekædet eller forgrenet C1-C5-alkyl, ligekædet eller forgrenet C2-Cs-alkenyl, ligekædet eller forgrenet C1-C5-alkyl substitueret med phenyl og ligekædet eller forgrenet C2-C5-alkenyl substi-5 tueret med phenyl, eller farmaceutisk acceptable salte eller hydrater deraf.

10 Det foretrækkes især, at Y er 0 eller NH og Z er fragmentet med den ovenfor viste formel.

I en anden foretrukket udførelsesform står Y for 0, og Z er ligekædet eller forgrenet C2-C6-alkyl eller -alkenyl, hvor alkyl- eller alkenylkæden er substi-15 tueret i en eller flere positioner med An, C3-C8-cycloalkyl, C3-Cs-cycloalkyl forbundet med en Ci-C8-alkyl- eller en C2-Ce-alkenylkæde eller Ar2.

En anden foretrukket udformning af opfindelsen er en neurotrofisk, non-immunosuppressiv forbindelse, som har en affinitet til FKBP-type immunophili-20 ner, som hæmmer immunophilinets rotamase-aktivitet.

Endnu en foretrukket udformning af den foreliggende opfindelse er et farmaceutisk præparat til behandling af en neurologisk sygdom hos et dyr, der omfatter en terapeutisk effektiv mængde af en forbindelse, som har en affinitet 25 til FKBP-type immunophiliner, som hæmmer immunophilinets romatase-aktivitet.

Endnu en foretrukket udformning af opfindelsen er et farmaceutisk præparat til fremme af neuronal regeneration og vækst i pattedyr, der omfatter 30 en effektiv mængde af en neurotrofisk, non-immunosuppressiv forbindelse til et pattedyr, der har en affinitet til FKBP-type immunophiliner, og som hæmmer immunophilinets rotamase-aktivitet.

i 8 DK 176489 B1

Endnu en anden foretrukket udformning af opfindelsen er et farmaceutisk præparat til forhindring af neurodegeneration i et dyr, der omfatter en effektiv mængde af en neurotrofisk, non-immunosuppressiv forbindelse til et dyr, der 5 har en affinitet til FKBP-type immunophiliner, og som hæmmer immunophi-linets rotamase-aktivitet.

Særligt foretrukne neurotrofiske N-glyoxylprolylester-forbindelser ifølge den ovennævnte formel udvælges fra gruppen, som består af: 10 3-(2,5-dimethoxyphenyl)-1-propyl-(2S)-1-(3,3-dimethyl-1,2-dioxopenty)- 2-pyrrolidincarboxylat, 15 3-{2,5-dimethoxyphenyl)-1-prop-2-(E)-enyl-(2S)-l-(3,3-dimethyl-1,2- dioxopentyi)-2-pyrrolidincarboxy1at, 20 2-(3,4,5-tnmethoxyphenyl)-1-ethyl-{2S)-1-(3,3-dimethyl-1,2- dioxopentyl)-2-pyrrolidincarboxylat, 3-(3-pyridyl)-1-propyl-(2S)-1-(3,3-dimethyl-1,2-dioxopentyl)-2- 25 pyrrolidincarboxylat, 9 DK 176489 B1 3-(2-pyridyl)-1 -propyl-(2S)-1 -(3,3-dimethyl-1,2-dioxopentyl)-2-py rro I id inca rboxy I at, 5 3-(4-pyridyl)-1-propyl-(2S)-1-(3,3-dimethyl-1,2-dioxopentyl)-2- pyrrolidincarboxylat, 10 3-phenyM-propyl(2$)-1-(2-tert-butyl-1,2-dioxoethyl)-2- pyrrolidincårboxylat, 3-phenyl-1 ~propyl(2S)-1 -(2-cyclohexylethyl-1,2-dioxoethyl)-2-15 pyrrolidincarboxylat, 3-(3-pyridyl)-1-propyl-(2S)-1-(2-cyclohexylethyl-1,2-dioxoethyl)-2- pyrrolidincarboxylat, 20 3-(3-pyridyl)-1 -propyl-(2S)-1 -(2-tert-buty]-1,2-dioxoethyl)-2-pyrrolidincarboxylat, 25 313-diphenyl-1-propyl(2S)-1-(3)3-dimethyl-1,2-dioxopentyl)-2- l pyrrolidincarboxylat, ' 10 DK 176489 B1 3-(3-pyridyl)-1 -propyl-(2S)-1 -(2-cyclohexyl-1,2-dioxoethyl)-2-pyrrolidincarboxylat, 5 3-(3-pyridyl)-1 -propyl- (2S)-N-([2-thienyl]glyoxyl)pyrrolidincarboxy- ; lat, 10 3,3-diphenyl-Vpropyl{2S)-1-(3,3-dimethyl-1,2-dioxobutyl)-2- pyrrolidincarboxylat, i 3.3- diphenyl-1-propyl(2S)-l-cyclohexylglyoxyl-2-pyrrolidincarboxylat, 15 og 3.3- diphenyl-1-propyl(2S)-1-(2-thienyl)glyoxyl-2pyrrolidincarboxylat. ! ! 11 DK 176489 B1

KORT BESKRIVELSE AF TEGNINGERNE

5 Fig. 1 er et mikrofotograf! af dorsale rodganglier i kylling, der er behand let med forskellige koncentrationer af eksempel 17 som angivet. Fig. 1 viser, at eksempel 17 ifølge den foreliggende opfindelse effektivt fremmer neuritud-væksten i sensoriske neuronale kulturer. Eksplanterede kulturer, som var isoleret fra embryonisk dag 9-10 dorsale rodganglier i kylling, blev behandlet med 10 forskellige koncentrationer af eksempel 17 som angivet. 48 timer senere blev neuritantallet med en længde større end én DRG eksplantation kvantificeret.

Antallet af neuritter, som kom til udtryk i ubehandlede DRG'er, blev trukket fra neuritantallet af prøver, som var behandlet med eksempel 17, for at give den eksempel 17-afhængige specifikke neuritudvækst. Der fremvises mikrografier af 15 DRG'er, som er behandlet med eksempel 17, samt kvantitativ dosisafhængig neuritudvækst, som er fremkaldt af eksempel 17.

Fig. 2 er en kurve, som viser kvantificeringen af neuritudvækst i dorsale 20 rodganglier i kylling, der er behandlet med forskellige koncentrationer af eksempel 17 som angivet. Fig. 2 viser, at eksempel 17 ifølge den foreliggende opfindelse effektivt fremmer neuritudvæksten i sensoriske neuronale kulturer.

Eksplanterede kulturer, som var isoleret fra embryonisk dag 9-10 dorsale rodganglier i kylling, blev behandlet med forskellige koncentrationer af eksempel 17 ! 12 DK 176489 B1 som angivet. 48 timer senere blev neuritantallet med en længde større end en DRG eksplantation kvantificeret. Antallet af neuritter, som kom til udtryk i ubehandlede DRG'er, blev trukket fra neuritantallet af prøver, som var behandlet 5 med eksempel 17, for at give den eksempel 17-afhængige specifikke neuritud-vækst. Kvantitativ dosis-afhængig neuritudvækst, som blev fremkaldt af eksempel 17, fremvises.

10 Fig. 3 er et mikrofotograf! af ischiasnervesnit i rotter. Fig. 3 viser, at ek sempel I ifølge den foreliggende opfindelse fremmer neuronal regeneration følgende efter læsioner på ischiasnerven. Ischiasnerver fra 150 g Sprague-Dawley hanrotter blev knust på højde med hofterne. Eksempel 1 (30 mg/kg s.c.), Inaktive (30 mg/kg s.c.) eller intralipidvehikel blev givet en gang dagligt i de næste 21.

15 dage. Dyrene blev aflivet, ischiasnerverne fjernet, og nervesegmenter, som var 2 mm distale i forhold til knusningsstedet, blev skåret fra og farvet med Holmes sølvfarve (for at vurdere axonantallet) og Luxol ægte blåt (for at vurdere remye-linationen). Mikrografierne viser ischiasnervesnit fra skinopererede rotter, vehikelbehandlede læderede dyr, behandlet med eksempel 1 og Inaktive ved 630x 20 forstørrelse, fire dyr pr. gruppe.

Fig. 4 er en kurve med [3H]-CFT binding pr pg af striatal membranprotein, Fig. 4 viser, at neuroimmunophilin-ligander ifølge den foreliggende opfindel-25 se fremmer helbredelsen af dopaminneuroner følgende efter MPTP-behandlingen af mus. CD1 mus (25 g) blev behandlet dagligt med 30 mg/kg 13 : DK 176489 B1 MPTP (i.p.) i 5 dage. Dyrene blev også behandlet dagligt med intralipidvehikel, eksempel 1 (100 mg/kg s.c,) eller eksempel 17 (40, 20, 10 mg/kg s.c., som angivet) samtidigt med MPTP, og det fortsatte i yderligere 5 dage. Efter 18 dage 5 blev musene aflivet, striata fra 5 dyr pr. gruppe blev samlet og bearbejdet til et vasket membranpræparat. [3H]-CFT’s binding til disse stribede membranpræpa-rater af forskellige grupper blev kvantificeret for at bestemme dopamin-trans-portniveauerne på levedygtige nerveender. Binding ved tilstedeværelse af 10 μΜ umærket CFT tilvejebragt ved en vurdering af ikke-specifik binding, som 10 blev trukket fra den samlede binding til kvantitativt specifikt bundet [3H]-CFT.

Bindingen blev normaliseret til proteinindholdet i de striataie membraner fra hver forsøgsgruppe. Frontal- og sagittalhjernesnit fra MPTP- og medikamentbehandlede dyr blev farvet med anti-tyrosin-hydroxylase (TH) Ig for at kvantificere et striatalt, medialt forhjernebundt med axonale og nigrale niveauer af TH, 15 som er et tegn på funktionelle dopaminerge neuroner.

Fig. 5 er et søjlediagram over [3HJ-CFT, som er afsat til 200 pg membranprotein. Fig. 5 viser, at neuroimmunophilin-ligander ifølge den foreliggende 20 opfindelse fremmer helbredelse af dopaminneuroner følgende efter MPTP-behandling af mus i henhold til den fremgangsmåde, som er beskrevet i fig. 4.

14 DK 176489 B1

Fig. 6 er et mikrofotograf], ved 630x forstørrelse, af frontal- og sagittal-hjernesnit. Fig. 6 viser hjernesnit fra MPTP- og medikamentbehandlede dyr, som er farvet med anti-tyrosin-hydroxylase (TH) Ig for at kvantificere striatale 5 niveauer for TH, der er et tegn på funktionelle dopaminerge neuroner.

Fig. 7 er et mikrofotograf!, ved 50x forstørrelse, af frontal- og sagittal-hjernesnit. Fig. 7 viser hjernesnit fra MPTP- og medikamentbehandlede dyr, der 10 er farvet med anti-tyrosin-hydroxylase (TH) Ig for at kvantificere nigrale niveauer af TH, der er et tegn på funktionelle dopaminerge neuroner.

Fig. 8 er et mikrofotograf!, ved 400x forstørrelse, af frontal- og sagittal-15 hjemesnit. Fig. 8 viser hjernesnit fra MPTP- og medikamentbehandlede dyr, der er farvet med anti-tyrosin-hydroxylase (TH) Ig for at kvantificere et medialt forhjernebundt med axonale niveauer af TH, der er et tegn på funktionelle dopaminerge neuroner.

15 DK 176489 B1

DETALJERET BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN

5 De nye neurotrofiske forbindelser ifølge denne opfindelse er forholdsvis små molekyler i forhold til andre kendte forbindelser, som binder til FKBP-type immunophiliner, som f.eks. rapamycin, FK506, og cyclosporin.

10 De neurotrofiske forbindelser ifølge denne opfindelse har en affinitet til de FK506 bindende proteiner, som f.eks. FKBP-12. Når de neurotrofiske forbindelser ifølge opfindelsen bindes til FKBP, er det blevet konstateret, at de uventet hæmmer prolyl- peptidyl cis-trans-isomeraseaktiviteten eller rotamase-aktiviteten i det bindende protein og stimulerer neuritvæksten, medens de ikke 15 udviser en immunosuppressiv virkning.

Denne opfindelse angår mere specifikt en ny klasse af neurotrofiske forbindelser, som er repræsenteret ved den ovenfor viste formel I.

20

Forbindelserne ifølge denne opfindelse findes som stereoisomere former, enten enantiomerer eller diastereoisomerer. Stereokemien ved position 1 (formel 1) er R eller S, med S foretrukket. Enantiomerer, den racemiske form og 16 DK 176489 B1 diastereoisomere blandinger hører inden for opfindelsens rammer. Enantiome-rer samt diastereoisomerer kan adskilles ved hjælp af fremgangsmåder, som er 5 kendte for fagfolk.

Det er kendt, at immunophiliner, som f.eks. FKBP, fortrinsvis genkender 10 peptidsubstrater, som indeholder Xaa-Pro-Yaa enheder, hvor Xaa og Yaa er li-pofile aminosyrerester. Schreiber et al. 1990 J. Org. Chem. 55, 4984-4986; Harrison and Stein, 1990 Biochemistry, 29, 3813-3816. Således modificerede pro-lylpeptidomimetiske forbindelser, som bærer lipofile substituenter, bør binde med høj affinitet til den hydrofobe kerne i det FKBP-aktive site og hæmme dets 15 rotamase-aktivitet.

Forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes i form 20 af salte, som er afledt af uorganiske eller organiske syrer og baser. De følgende er indeholdt i sådanne syresalte: acetat, adipat, alginat, aspartat, benzoat, ben-zensulfonat, bisulfatbutyrat, citrat, kamferat, kamfersulfonat, cyclopentanpropio-nat, digluconat, dodecylsulfat, ethansulfonat, fumarat, glucoheptanoat, glyce-rophosphat, hemisulfat-heptanoat, hexanoat, hydrochlorid, hydrobromid, 17 DK 176489 B1 hydroiodid, 2-hydroxyethansulfonat, lactat, maleat, methansulfonat, 2-naphthalensulfonat, nicotinat, oxalat, pamoat, pectinat, propionat, succinat, tartrat, thiocyanat, tosylat og undecanoat. Basesalte omfatter ammoniumsalte, alkalimetalsalte, som fx. natrium- og kaliumsalte, jordalkalimetalsalte, som fx.

5 calcium- og magnesiumsalte, salte med organiske baser, som fx. dicyclohexyla- minsalte, N-methyl-D-glucamin og salte med aminosyrer, som fx. arginin, lysin og så videre. De basiske nitrogenholdige grupper kan også kvaterniseres med sådanne stoffer som lavere alkylhalogenider, som fx. methyl-, ethyl-, propyl-og butylchlorid, -bromider og -iodider; dialkylsulfater som dimethyl-, diethyl-, ίο dibutyl- og diamylsulfater, langkædede halogenider, som fx. decyl-, lauryl-, my- ristyl- og stearylchlorider, -bromider og -iodider, aralkylhalogenider som benzyl- og phenethylbromider og andre. Der opnås derved vand- eller olieopløselige eller dispergerbare produkter.

De neurotrofiske forbindelser ifølge denne opfindelse kan periodisk ad-15 ministreres til en patient, som gennemgår en behandling for neurologiske li delser eller af andre grunde, hvorved det er ønskeligt at stimulere neuronal regeneration og vækst, som fx. i forskellige perifere neuropatiske og neurologiske lidelser i forbindelse med neurodegeneration. Forbindelserne ifølge denne opfindelse kan også gives til andre pattedyr end mennesker til behandling 20 af forskellige neurologiske lidelser hos pattedyr.

De nye forbindelser ifølge den foreliggende opfindelse er kraftigt virkende inhibitorer af rotamase-aktivitet og har en udmærket grad af neurotrofisk aktivitet. Denne aktivitet er nyttig ved stimulering af beskadigede neuroner, fremme af neuronal regeneration, forhindring af neurodegeneration og i be- 25 handlingen af adskillige neurologiske lidelser, som er kendte for at blive sat i forbindelse med neuronal degeneration og perifere neuropatier. De neurologiske lidelser, som kan behandles, omfatter, men. er ikke begrænset til: trigeminal neuralgi, glossopharyngeal neuralgi, Bell's Parese, myasthenia gravis, muskeldystrofi, amyotrofisk lateral sklerose, progressiv muskelatrofi, progressiv bul-30 bærarvet muskelatrofi, brokdannede, bristede eller fremfaldne invertabrae discus syndromer, cervikal spondylosis, plexussygdomme, torakale udgangsdestruktionssyndromer, perifere neuropatiske sygdomme, som fx. er fremkaldt af bly, dapson, blodmider, profyria eller Gullain-Barre syndrom, Alzheimer's sygdom og Parkinson’s sygdom.

35 Til disse formål kan forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse gives oralt, parenteralt, ved hjælp af indåndingsspray, topisk, rektalt, nasalt, bukkalt, vaginalt eller via et indopereret reservoir i doseringssammensætninger, som indeholder almindelige ikke-toksiske farmaceutisk acceptable bærere, t i DK 176489 B1 18 ' i adjuvanser og vehikler. Udtrykket parenteral som anvendt her omfatter sub- \ kutane, intravenøse, intramuskulære, intraperitoneale, intratekale, intraven-trikulære, intrasternale og intrakranielle injektions- eller infusionsteknikker.

For at være effektivt terapeutisk som centralnervesystemmål bør immu-s nophilin-medikamentkomplekset let gennemtrænge blodhjernebarrieren, når det gives perifert. Forbindelser ifølge denne opfindelse, som ikke kan gennemtrænge blodhjernebarrieren, kan gives effektivt ad intraventrikulær vej.

De farmaceutiske sammensætninger kan være i form af et sterilt indsprøjteligt præparat, for eksempel som en sterial indsprøjtelig vandig eller 10 olieagtig suspension. Denne suspension kan sammensættes ifølge kendte teknikker ved anvendelse af egnede dispergerings- eller befugtningsmidler og suspenderingsmidler. Det sterile indsprøjtelige præparat kan også være en ste- ! ril indsprøjtelig opløsning eller suspension i et ikke-toksisk parenteralt acceptabelt fortyndingsmiddel eller opløsningsmiddel, for eksempel som en opis løsning i 1,3-butandiol. Til de acceptable vehikler og opløsningsmidler, som kan anvendes, hører vand, Ringer’s opløsning og isotonisk natriumchloridopløs-ning. Derudover anvendes der i almindelighed sterile, faste olier som opløsningsmiddel eller suspenderingsmedium. Til dette formål kan der anvendes enhver ikke inficeret fast olie, herunder syntetiske mono- eller diglycerider.

20 Fedtsyrer, som fx. oliesyre og dets glyceridderivater - finder anvendelse ved fremstillingen af indsprøjtningsmidler, olivenolie eller ricinus olie, især i deres polyoxyethylerede udgaver. Disse olieopløsninger eller -suspensioner kan også indeholde et langkædet alkoholfortyndingsmiddel eller dispergeringsmid-del.

2S Forbindelserne kan for eksempel gives oralt i form af kapsler eller tab letter eller som en vandig suspension eller opløsning. I tilfældet med tabletter til oral brug indholder bærerne, som anvendes i almindelighed, lactose og majs-stivelse. Smøremidler, som fx. magnesiumstearat, tilsættes også typisk. Til oral indgivelse i kapselform indeholder nyttige fortyndingsmidler lactose og tørret 30 majsstivelse. Når der behøves vandige suspensioner til oral brug, kombineres den aktive ingrediens med emulgatorer og suspenderingsmidler. Hvis det ønskes, kan der tilsættes visse søde- og/eller smags- og/eller farvestoffer.

Forbindelserne ifølge denne opfindelse kan også gives i form af suppositorier til rektal indgivelse af medikamentet. Disse sammensætninger kan frem- 35 stilles ved at blande medikamentet med en egnet ikke-irriterende excipiens, som er fast ved rumtemperatur, men flydende ved rektal temperatur og derfor vil smelte i rektum for at frigøre medikamentet. Sådanne materialer omfatter kakaosmør, bivoks og polyethylenglycoler.

19 DK 176489 B1

Forbindelserne ifølge denne opfindelse kan også gives optisk, specielt når de forhold, som skal behandles, omfatter områder eller organer, som er let tilgængelige ved topisk anvendelse, herunder neurologiske lidelser ved øjet, huden eller den nedre tarmkanal. Egnede topiske sammensætninger fremstilles let s til ethvert af disse områder.

Til brug ved oftalmi kan forbindelserne sammensættes som mikroniserede suspensioner i isotonisk, pH-tilpasset sterilt saltvand, eller fortrinsvis, da opløsningerne er isotoniske, pH-tilpasset sterilt saltvand enten med eller uden et konserveringsmiddel, som fx. benzylalkoniumchlorid. Alternativt til brug ved jo oftalmi kan forbindelserne sammensættes i en salve, som fx. vaseline.

Til anvendelse topisk på huden kan forbindelserne sammensættes i en egnet salve, som indeholder forbindelsen suspenderet eller opløst deri, for eksempel en blanding med én eller flere af de følgende: mineralolie, flydende vaseli ne, hvid vaseline, propylenglycoi, polyoxyethylen-polyoxypropyien-jj forbindelse, emulgerende voks og vand. Alternativt kan forbindelserne sam mensættes i en egnet lotion eller salve, som indeholder den aktive forbindelse suspenderet eller opløst deri, for eksempel en blanding af én eller flere af de følgende: mineralolie, sorbitanmonostearat, polysorbat 60, cetyl-estervoks, ce-tearylalkohol, 2-octyIdodecanol, benzylalkohol og vand.

20 Topisk anvendelse til den nedre tarmkanal kan udføres i en rektal suppo- sitoriesammensætning (se ovenfor) eller i en egnet klystersammensætning.

Doseringsniveauer i størrelsesordenen på ca. 0,1 mg til ca. 10.000 mg af den aktive ingrediensforbindelse er nyttige i behandlingen af de ovennævnte tilstande med foretrukne niveauer på ca. 0,1 mg til 1.000 mg. Mængden af aktiv 25 ingrediens, som kan kombineres med bærermaterialerne for at frembringe e n enkelt doseringsform, vil variere afhængigt af den behandlede vært og den særlige indgivelsesmåde.

Det forstås imidlertid, at et specifikt dosisniveau til enhver enkelt patient vil afhænge af mange forskellige faktorer, herunder aktiviteten i den specifik- ! 30 ke, anvendte forbindelse, alder, legemsvægt, almen sundhed, køn, kost, indgi velsestid, ekskretionshastighed, medikamentkombination og styrken af den særlige sygdom, som behandles, og indgivelsesformen. j

Forbindelserne kan indgives med andre neurotrofiske midler, som fx. neu-rotrofisk vækstfaktor (NGF), gliøst afledt vækstfaktor, hjerneafledt vækstfaktor, 35 ciliær neurotrofisk faktor og neurotropin-3. Doseringsniveauet for andre neu rotrofiske medikamenter vil afhænge af de tidligere fremførte faktorer og medikamentforbindelsens neurotrofiske effektivitet.

R

20 DK 176489 B1 K! forsøgsmetode Hæmningen af peptidylprolyl-isomerase- (rotamase) aktiviteten ved forbindelserne ifølge opfindelsen kan vurderes ved hjælp af kendte fremgangsmåder, som er beskrevet i litteraturen (Harding, M.W. et al. Nature 341: 758-760 5 (1989); Holt et al. J. Am. Chem. Soc. 115: 9923-9938). Disse værdier opnås som til syneladende Kj’er og fremstilles i tabel I. Cis-trans isomeriseringen af en ala-nin-prolin-binding i et modelsubstrat, N-succinyl-Ala-Ala- Pro-Phe-p-nitroanilid, undersøges spektrofotometrisk i et chymotrypsin-koblet assay, som frigør /?ara-nitroanilid fra substratets trans-form. Hæmningen af denne reak-lo tion, som er fremkaldt ved tilsætningen af forskellige inhibitorkoncentrationer, bestemmes, og dataene analyseres som en ændring i hastighedskonstanten af første orden som en funktion af inhibitorkoncentrationen for at tilvejebringe de tilsyneladende Kj-værdier.

I en plastickuvette tilsættes der 950 ml af iskold assaypuffer (25 mM HEPES, 15 pH „ 100 mM NaCl), 10 ml FKBP (2,5 mM i 10 mM Tris-Cl pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol), 25 ml chymotrypsin (50 mg/ml i 1 mM HC1) og 10 ml af forsøgsforbindelsen ved forskellige koncentrationer i dimethylsulfoxid. Reaktionen sættes i gang ved tilsætningen af 5 ml substrat (succinyl-Ala-Phe-Pro-Phe-para-nitroanilid, 5 mg/ml i 2.35 mM LiCl i trifluorethanol).

20 Absorbansen ved 390 nm som funktion af tiden undersøges i 90 sek. ved anvendelse af et spektrofotometer, og hastighedskonstanterne bestemmes ud fra absorbansen sammenlignet med tidsdatafiler.

Dataene for disse forsøg vises i tabel I.

j r 21 DK 176489 B1

TABELI

yk °

Ri s Nr. R R' Ki 1 1,1-dimethylpropyl 3-pheny lpropy 1 42 2 “ 3-phenyl-prop-2- (E) -enyl 125 3 “ 3-(3,4,5-tri - jo raethoxyphenyl) propyl 200 4 “ 3- (3,4,5-trimethoxy- phenyl) -prop-2- (E) -enyl 65 5 “ 3- (4,5-methylendioxy) phenylpropyl 170 15 6 “ 3- (4,5-roethylendioxy) phenylprop-2- (E) -enyl 160 7 “ 3-cyclohexylpropy1 200 8 “ 3-cyclohexylprop-2- (E) - enyl 600 20 9 “ (IR) -1,3-diphenyl-l- propyl 52 10 2-furanyl 3-phenylpropyl 4000 11 2- thienyl “ 92 12 2-thiazolyl “ 100 25 13 phenyl “ 1970 14 1, 1-dimethylpropyl 3- (2,5-dimethoxy) phe nylpropyl 250 15 3- (2,5-dimethoxy) phenylprop-2- (E) -enyl 450 30 16 “ 2- (3,4,5-trimethoxy- phenyl) ethyl 120 17 3- (3-pyridyl) propyl 5 18 3- (2-pyridyi) propyl 195 19 “ 3- (4-pyridyl) propyl 23 35 20 cyclohexyl 3-phenyipropyI 8 2 21 tert-butyl “ 95 22 cyclohexylethyl " 1025 23 cyclohexylethyl 3- (3-pyridyl) propyl 1400 24 tert-butyl 3- (3-pyridyl) propyl 3 40 25 1,1-dimethylpropyl 3,3-diphenylpropyl 5 26 cyclohexyl 3- (3-pyridyl) propyl 9 27 2-thienyl 3- (3-pyridyl) propyl 1000 28 tert-butyl 3,3-diphenylpropyl 5 29 cyclohexyl “ 20 45 30 2-thienyl “ 150 22 DK 176489 B1 I pattedyr celler danner FKBP-12 kompleks med inositoltriphosphat-receptoren (IP3R) og ryanodin-receptoren (RyR). Det antages, at de neurotrofi-ske forbindelser ifølge denne opfindelse disassocierer FKBP-12 fra disse komplekser, hvilket forårsager, at calciumkanalen bliver "lækkende” (Cameron et 5 al., 1395). Calciumstrømme er involveret i neuritudvidelser, således at IP3R -receptoren og ryanodin-receptoren kunne involveres i de neurotrofiske virkninger af medikamenter. Eftersom medikamenterne binder til det samme site som FKBP-12 som IP3R-receptoren, kunne man formode, at medikamenterne fortrænger kanalerne fra FKBP-12.

10

Dorsal rodganglion i kylling Kulturer og neuritudvækst

Dorsale rodganglier blev dissekeret fra kyllingefostre med ti dages svangerskab. Hele ganglieeksplantater blev dyrket på tynde lag Matrigel-belagte 12 is brøndsplader med Liebovitz L15 plus højglucosemedier, som var suppleret med

2mM glutamin og 10% føtalt kalveserum og også indeholdende 10 μΜ cytosin β-D

arabinofuranosid (Ara C) ved 37°C i et miljø, som indeholder 5% COj· 24 timer senere blev DRG’erne behandlet med forskellige koncentrationer af nervevækstfaktor, immunophilin-ligander eller kombinationer af NFG plus medika- 20 menter. 48 timer senere efter medikamentbehandling blev ganglierne gjort synlige under fasekontrast eller Hoffmann Modulation kontrast med et Zeiss Axiovert omvendt mikroskop. Der blev taget mikrofotografier af eksplanaterne, og neuritvæksten blev kvantificeret. Neuritter længere end DRG-diameteren blev talt som positive, med et samlet antal neuritter kvantificeret for hver for-25 søgstilstand. Tre til fire DRG’er dyrkes pr. kultur, og hver behandling blev udført i to eksemplarer.

Dataene for disse forsøg vises i tabel II. Repræsentative mikrofotografier til eksempel 17 vises på fig. 1; en dosisreaktionskurve til dette eksempel angives på fig. 2.

23 DK 176489 B1

1ABSL II

Neuritudvækst i DRG i kylling

Eksempel nr. ED50, neuritudvækst, nM

5 1 53 2 105 3 149 4 190 5 10 ίο 6 75 10 0,46 11 0,015 14 2 15 0,8 15 16 0,015 17 0,05 18 30 19 .6 20 0,13 20 21 0,025 22 0,66 23 1100 24 0,014 25 0,50 25 26 . 2 27 500 28 0,50 29 10 30 100 30

Ischiasnerve-axotomi

Seks uger gamle Sprague-Dawley hanrotter blev bedøvet, og ischiasner-ven blev afdækket og knust med en pincet på højde med hoften. Prøveforbindelser· eller vehikler blev givet subkutant lige før læsionen og hver dag i de 35 følgende 18 dage. Dele af ischiasnerven blev farvet med Holmes sølvfarve for at kvantificere antallet af axoner og med Luxol ægte blåt for at kvantificere mye-linationsniveauet. 18 dage efter læsionen var der en signifikant nedgang i antallet af axoner (50% nedgang sammenlignet med ikke-læderet kontrol) og my- i i ! 24 DK 176489 B1 elinationsgraden (90% nedgang sammenlignet med ikke-læderet kontrol) i dyr, som var blevet behandlet med vehikel.

Indgivelse af eksempel 1 (30 mg/kg s.c.) lige før læsionen og hver dag i 18 dage, som fulgte efter læsionen, resulterede i signifikant regeneration af både s axonantal (5% nedgang sammenlignet med ikke-læderet kontrol) og myelinati-onsgraden (50% nedgang sammenlignet med kontrol) sammenlignet med dyr, som var blevet behandlet med vehikel. Den signifikante effektivitet ved eksempel 1 er i overensstemmelse med dets kraftigt virkende aktivitet ved hæmning af rotamase-aktiviteten og stimulering af neuritudvæksten i DRG’er i kylling, ίο Disse resultater vises på fig, 3. “Skinbehandling” betegner kontroldyr, som modtog vehikel, men ikke blev læderet; “Vehikel” betegner dyr, som blev læde ret og kun modtog vehikel (dvs. intet medikament). Eksempel 1 viste en påfaldende lighed med de skinbehandlede dyr, påvisende de kraftige neuroregene-rative virkninger af disse forbindelser in vivo. Inaktiv er en forbindelse, som is er inaktiv som en FKBP12-inhibitor. Dyr, som blev behandlet med denne for bindelse, lignede vehikel-behandlede, læderede dyr i overensstemmelse med de neuroregenerative resultater, som blev iagttaget med eksempel 1, der blev direkte fremkaldt af dets hæmning af FKBP12. Kvantificeringen til disse1 data vises i tabel III.

20

TABEL III

Behandling Axon-antal Myelin- (% kontrol) niveau 25 Skinbehandling 100 100 Læsion:.

+ Vehikel (s.c.) 50 10 + Eksempel 1 100 50 (30 mg/kg s.c.) jo + Inactive 25 25 (30 mg/kg s.c.) MPTP model for Parkinson's sygdom i mus MPTP-lædering af dopaminerge neuroner i mus blev anvendt som en dy-35 remodel for Parkinson’s sygdom. Fire uger gamle CD1 hvide hanmus blev doseret i.p. med 30 mg/kg af MPTP i 5 dage. Eksempel 17 (10-40 mg/kg) eller vehikel blev givet s.c. sammen med MPTP i 5 dage samt i yderligere 5 dage, som fugte efter MPTP-behandlingens ophør. Efter 18 dage, som fulgte efter MPTP-behandling, blev dyrene aflivet, og striata blev dissekeret og homogeniseret.

40 Der blev foretaget binding af [3H] CFT, en radioligand til dopamintransporten, til de striatale membraner for at kvantificere niveauet for dopamintransporten (DAT) følgende efter læsionen og medikamentbehandlingen. Immunofarvning 25 DK 176489 B1 blev udført på sagittal* og frontalhjernesnit ved anvendelse af anti-tyrosin-hydroxylase Ig for at kvantificere dopaminerge neuroners overlevelse og helbredelse. I dyr, som blev behandlet med MPTP og vehikel, blev der iagttaget et væsentligt tab af funktionelle dopaminerge ender sammenlignet med ikke-5 læderede dyr. Læderede dyr, som modtog eksempel 17, viste en næsten kvantitativ helbredelse af TH-farvede dopaminerge neuroner.

Fig. 4 og 5 viser kvantificeringen i DAT niveauer, hvorimod fig. 6 - 8 e r mikrofotografier, som viser de regenerative virkninger ved eksempel 17 i denne model. Fig. 4 påviser den signifikante helbredelse i funktionelle dopaminer-io ge ender, som prøvet ved [3H]-CFT binding i forhold til dyr, som modtog MPTP 15, men ikke Guilford forbindelserne. Fig. 5 gengiver disse data i søjlediagramform.

Det vises, at dyr, som modtog 40 mg/kg af eksempel 17 ud over MPTP, gav udtryk for en mere end 90% helbredelse af [3H]-CFT binding. Som vist på fig. 6-8 viser immunofarvning til tyrosinhydroxylase (en markør for levedygtige dopami-15 nerge neuroner) i striatumet, nigra og det mediale forhjernebundt en klar og markant helbredelse af funktionelle neuroner i dyr, som modtog eksempel 17, sammenlignet med dyr, som modtog læderende stof, men intet medikament (MPTP/Vehikel).

De følgende eksempler belyser foretrukne udformninger af opfindelsen 20 og skal ikke opfattes som begrænsning af opfindelsen. Alle foretrukne udformninger af opfindelsen skal ikke opfattes som begrænsning af opfindelsen. Alle polymere molekylvægte er middelgennemsnitsmolekylvægte. Alle procenter er baseret på vægtprocenten i det endelige leveringssystem eller den fremstillede sammensætning, medmindre der er angivet andet, og alle totaler er lig med 100 25 vægt-%.

EKSEMPLER

Forbindelserne ifølge opfindelsen kan fremstilles ved hjælp af mange forskellige syntetiske sekvenser, som anvender anerkendte kemiske omdannelser.

Den almindelige vej til de foreliggende forbindelser beskrives i skema 1, N-30 glyoxylprolin-derivater kan fremstilles ved omsætning af L-prolinmethylester med methyloxalylchlorid som vist i skema I. De resulterende oxamater kan omsættes med mange forskellige carbonnucleophiler for at opnå mellemforbindelser. Disse mellemprodukter omsættes derpå med mange forskellige alkoholer, amider eller beskyttede aminosyrerester for at opnå propylestere og amider 35 ifølge opfindelsen.

26 DK 176489 B1 SKEMA I o oJ\.OCH3

y-t ^ --, RLi eller RMgX

- sAy'”'· - “•γΛ, 0 OCHj

Qv”—- - - I , _ , Koblingsmetode

O MeOH/H20 O

°γ\ °γ\

R R

γ\ 0

R

s EKSEMPEL 1

Syntese af 3-phenyI-l-propyl (2S) -1- (3,3-dimetbyl-l,2-dioxopentyl) -2-pyrrolidincarboxylat (eksempel 1).

Syntese af methyl (2S) -1- (l,2-dioxo-2-methoxyethyl) -2-pyrrolidin-carboxylat.

io En opløsning af L-prolinmethylesterhydrochlorid (3,08 g; 18,60 mmol) i tørt methylenchlorid blev afkølet til 0°C og behandlet med triethylamin (3,92 g; 38,74 mmol; 2,1 ækv.)· Efter omrøring af den dannede opslæmning i en nitrogenatmosfære i 15 min. blev en opløsning af methyloxalylchlorid (3,20 g; 26,12 mmol) i methylenchlorid (45 ml) tilsat dråbevis. Den deraf følgende blanding 15 blev omrørt ved 0°C i 1,5 time. Efter filtrering for at fjerne faste stoffer blev den organiske fase vasket med vand, tørret over MgS04 og koncentreret. Den rå remanens blev renset på en silicagelsøjle, som blev elueret med 50% ethylacetat i hexan for at opnå 3,52 g (88%) af produktet som en rødlig olie. Blanding af cis- 27 DK 176489 B1 trans amidrotamerer; data for trans rotamer givne. ‘H NMR (CDC13); d 1,93 (dm, 2H); 2,17 (m, 2H); 3,62 (m, 2H); 3,71 (s, 3H); 3,79, 3,84 ( s, 3H total); 4,86 (dd, IH, J = 8,4, 3,3).

Syntese af methyl (2S) -1- (l,2-dioxo-3,3-dimethylpentyl) -2-pyrrolidin-5 carboxylat.

En opløsning af methyl (2S) -1- (l,2-dioxo-2-methoxyethyl) -2-pyrrolidin-carboxylat (2,35 g; 10,90 mmol) i 30 ml tetrahydrofuran (THF) blev afkølet til -78°C og behandlet med 14,2 ml af en 1,0 M opløsning af 1,1-dimethyIpropyl-tnagnesiumchlorid i THF. Efter omrøring af den deraf følgende homogene blan-10 ding ved -78°C i tre timer blev blandingen hældt i mættet ammoniumchlorid (100 mt) og ekstraheret med ethylacetat. Den organiske fase blev vasket med vand, tørret og koncentreret, og det rå materiale, som blev opnået ved fjernelse af opløsningsmidlet, blev renset på en silicagelsøjle ved eluering med 25% ethylacetat i hexan, for at opnå 2,10 g (75%) af oxamatet som en farveløs olie. ‘H is NMR (CDClj): d 0,88 (t, 3H); 1,22, 1,26 (s, 3H hver); 1,75 (dm, 2H); 1,87-2,10 (m, 3H); 2,23 (m, IH); 3,54 (m, 2H); 3,76 (s, 3H); 4,52 (dm, IH, J = 8,4, 3,4)

Syntese af (2S) -1- (l,2-dioxo-3,3-dimethylpentyl) -2-pyrrolidincarboxyl- syre.

En blanding af methyl (2S) -1- (l,2-dioxo-3,3-dimethylpentyl) -2-pyrro-20 lidincarboxylat (2.10 g; 8.23 mmol), 1 N LiOH (15 ml) og methanol (50 ml) blev omrørt ved 0°C i 30 min. og ved stuetemperatur natten over. Blandingen blev gjort sur til pH 1 med 1 N HC1, fortyndet med vand og ekstraheret med 100 ml methylenchlorid. Den organiske ekstrakt med blev vasket med mættet natri-umchloridopløsning og koncentreret for at levere 1.73 g (87%) af snehvidt fast 25 stof, som ikke behøvede yderligere rensning. lH NMR (CDCl3): d 0.87 (t, 3H); 1.22, 1.25 (s, 3H hver); 1.77 (dm, 2H); 2.02 (m, 2H); 2.17 (m, IH); 2.25 (m, IH); 3.53 (dd, 2H, J = 10.4, 7.3); 4.55 (dd, IH, J = 8.6, 4.1).

Syntese af 3-phenyl-l-propyl (2S) -1- (3,3-dimethyl-l,2-dioxopentyl) -2-pyrrolidincarboxylat (eksempel 1). En blanding af (2S) -1- (l,2-dioxo-3,3-30 dimethylpentyl) -2-pyrroIidin-carboxylsyre (600 mg; 2.49 mmol), 3-phenyl-l-propanol (508 mg; 3.73 mmol), dicyclohexylcarbodiimid (822 mg; 3.98 mmol), kamfersulfonsyre (190 mg; 0.8 mmol) og 4-dimethylaminopyridin (100 mg; 0.8 mmol) i methylenchlorid (20 ml) blev omrørt natten over i en nitrogenatmosfære. Reaktionsblandingen blev filtreret igennem Celite for at fjerne faste 35 stoffer og koncentreret i vakuum, og det rå materiale blev renset på en flashsøjle (25% ethylacetat i hexan) for at opnå 720 mg (80%) af eksempel 1 som e n farveløs olie. Ή NMR (CDC13): d 0,84 (t, 3H); 1,19 (s, 3H); 1,23 (s, 3H); 1,70 (dm, 2H); 28 DK 176489 B1 1,98 (m, 5H); 2,22 (m, IH); 2,64 (m, 2H); 3,47 (m, 2H); 4,14 (m, 2H); 4,51 (d, IH); 7,16 (m, 3H); 7,26 (m, 2H).

Fremgangsmåden ifølge eksempel 1 blev benyttet til at fremstille de følgende belysende eksempler: s Eksempel 2: 3-phenyl-l-prop-2- (E) -enyl (2S) -1- (3,3-dimethyl-l,2-dioxo- pentyl) -2-pyrroHdincarboxylat, 80%, lH NMR (360 Mhz, CDC13): d 0,86 (t, 3H); 1,21 (s, 3H); 1,25 (s, 3H); 1,54-2,10 (m, 5H); 2,10-2,37 (m, IH); 3,52-3,55 (m, 2H); 4,56 (dd, IH, J = 3,8, 8,9); 4,78-4,83 (m, 2H); 6,27 (m, IH); 6,67 (dd, IH, J = 15,9); 7,13-7,50 (m, 5H).

ίο Eksempel 3: 3- (3,4,5-trimethoxyphenyI) -1-propyl (2S) -I (3,3-dimethyl- 1,2-dioxopentyI) -2-pyrrolidincarboxylat, 61%, Ή NMR (CDC13): d 0,84 (t, 3H); 1,15 {s, 3H); 1,24 (s, 3H); 1,71 (dm, 2H); 1,98 (m, 5H); 2,24 (m, IH); 2,63 (m, 2H); 3,51 (t, 2H); 3,79 (s, 3H); 3,83 (s, 3H); 4,14 (m, 2H); 4,52 (m, IH); 6,36 (s, 2H).

Eksempel 4: 3- (3,4,5-trimethoxyphenyl) -l-prop-2- (E) -enyl (2S) -1- (3,3-15 dimethyl-l,2-dioxopentyl) -2-pyrrolidincarboxylat, 66%, Ή NMR (CDC13): d 0,85 (t, 3H); 1,22 (s, 3H); 1,25 (s, 3H); 1,50-2,11 (m, 5H); 2,11-2,40 (m, IH); 3,55 (m, 2H); 3,85 (s, 3H); 3,88 (s, 6H); 4,56 (dd, IH); 4,81 (m, 2H); 6,22 (m, IH); 6,58 (d, IH, J = 16); 6,63 (s, 2H).

Eksempel 5: 3- (4,5-methyIendioxyphenyl) -1-propyl (2S) -1- (3,3-dimethyl 20 -1,2-dioxopentyl) -2-pyrrolidincarboxylat, 82%, Ή NMR (360 MHz, CDC13): d 0,86 (t, 3H); 1,22 (s, 3H); 1,25 (s, 3H); 1,60-2,10 (m, 5H); 3,36-3,79 (m, 2H); 4,53 (dd, IH, J = 3,8, 8,6); 4,61- 4,89 (ro, 2H); 5,96 (s, 2H); 6,10 (m, IH); 6,57 (dd, IH, J =6,2, 15,8); 6,75 (d, IH, J = 8,0); 6,83 (dd, IH, J = 1,3, 8,0); 6,93 (s, IH).

Eksempel 6: 3- (4,5-methylendioxyphenyl) -l-prop-2- (E) -enyl (2S) -1-25 (3,3-dimethyl-l,2-dioxopentyl) -2-pyrrolidincarboxylat, 82%, ‘H NMR (360' MHz, CDC13): d 0,86 (t, 3H); 1,22 (s, 3H); 1,25 (s, 3H); 1,60-2,10 (m, 5H); 2,10-2,39 (m, IH); 3,36-3,79 (m, 2H); 4,53 (dd, IH, J =3,8, 8,6); 4,61-4,89 (m, 2H); 5,96 (s, 2H); 6,10 (m, IH); 6,57 (dd, IH, J = 6,2, 15,8); 6,75 (d, IH, J = 8,0); 6,83 (dd, IH, J = 1,3, 8,0); 6,93 (s, IH).

30 Eksempel 8: 3-cyclohexyl-l-prop-2- (E) -enyl (2S) -1- (3,3-dimethyl-l,2- dioxopentyl) -2-pyrrolidincarboxylat, 92%, Ή NMR (360 MHz, CDC13): d 0,86 (t, 3H); 1,13-1,40 (m + 2 singlets, 9H total); 1,50-1,87 (m, 8H); 1,87-2,44 (m, 6H); 3,34-3,82 (m, 2H); 4,40-4,76 (m, 3H); 5,35-5,60 (m, IH); 5,60-5,82 (dd, IH, J = 6,5, 16).

Eksempel 9: (IR) -1,3-Dipheayl-l-propyl (2S) -1- (3,3-dimethyl-l,2- 35 dioxopentyl)-2-pyrrolidincarboxylat, 90%, Ή NMR (360 MHz, CDC13): d 0,85 (t, 3H); 1,20 (s, 3H); 1,23 (s, 3H); 1,49-2,39 (m, 7H); 2,46-2,86 (m, 2H); 3,25-3,80 (m, 2H); 4,42-4,82 (ra, IH); 5,82 (td, IH, J = 1,8, 6,7); 7,05-7,21 (m, 3H); 7,21-7,46 (m, 7H), 29 DK 176489 B1

Eksempel 10: 3-phenyl-l-propyl (2S) -1- (l,2-dioxo-2-[2-furanyl]) ethyl-2-pyrrolidincarboxylat, 99%, Ή NMR (300 MHz, CDC13): d 1,66*2,41 (m, 6H); 2,72 (t, 2H, J = 7,5); 3,75 (m, 2H); 4,21 (m, 2H); 4,61 (m, IH); 6,58 (m, IH); 7,16-7,29 (m, 5H); 7,73 (m, 2H).

s Eksempel 11: 3-phenyl-l-propyl (2S) -1- (l,2-dioxo-2-[2-thienyl]) ethyl-2- pyrrolidincarboxylat, 81%, 'H NMR (300 MHz, CDC13): d 1,88-2,41 (m, 6H); 2,72 (dm, 2H); 3,72 (m, 2H); 4,05 (m, IH); 4,22 (m, IH); 4,64 (m, IH); 7,13-7,29 (m, 6H); 7,75 (dm, IH); 8,05 (m, IH).

Eksempel 13: 3-phenyl-l-propyl (2S) -1- (l,2-dioxo-2-phenyl) ethyl-2-10 pyrrolidincarboxylat, 99%, Ή NMR (300 MHz, CDC13): d 1,97-2,32 (m, 6H); 2,74 (t, 2H, J = 7,5); 3,57 (m, 2H); 4,24 (m, 2H); 4,67 (m, IH); 6,95-7,28 (m, 5H); 7,51-7,64 (m, 3H); 8,03-8,09 (m, 2H).

Eksempel 14: 3- (2,5-dimethoxyphenyl) -1-propyl (2S) -1 (3,3-dimethyl-l,2-dioxopentyl) -2-pyrrolidincarboxylat, 99%, 'H NMR (300 MHz, CDC13): d 0,87 (t, is 3H); 1,22 (s, 3H); 1,26 (s, 3H); 1,69 (m, 2H); 1,96 (m, 5H); 2,24 (m, IH); 2,68 (m, 2H); 3,55 (m, 2H); 3,75 (s, 3H); 3,77 (s, 3H); 4,17 (m, 2H); 4,53 (d, IH); 6,72 (m, 3H).

Eksempel 15: 3- (2,5-dimethoxyphenyl) -l-prop-2- (E) -enyl (2S) -1- (3,3-dimethyl-l,2-dioxopentyl) -2-pyrrolidincarboxylat, 99%, 'H NMR (300 MHz, CDCI3): d 0,87 (t, 3H); 1,22 (s, 3H); 1,26 (s, 3H); 1,67 (m, 2H); 1,78 (m, IH); 2,07 (m, 20 2H); 2,26 (m, IH); 3,52 (m, 2H); 3,78 (s, 3H); 3,80 (s, 3H); 4,54 (m, IH); 4,81 (m, 2H); 6,29 (dt, IH, J = 15,9); 6,98 (s, IH).

Eksempel 16: 2- (3,4,5-trimethoxyphenyl) -1 -ethyl (2S) -1 (3,3-dimethyl- 1,2-dioxopentyl) -2-pyrrolidincarboxylat, 97%, Ή NMR (300 MHz, CDC13): d 0,84 (t, 3H); 1,15 (s, 3H); 1,24 (s, 3H); 1,71 (dm, 2H); 1,98 (m, 5H); 2,24 (m, IH); 2,63 (m, 25 2H); 3,51 (t, 2H); 3,79 (s, 3H); 3,83 (s, 3H); 4,14 (m, 2H); 4,52 (m, IH); 6,36 (s, 2H).

Eksempel 17: 3- (3-Pyridyl) -1-propyl (2S) -1- (3,3-dimethyl-l,2-dioxo- pentyl) -2-pyrrolidincarboxylat, 80%, 'H NMR (CDC13, 300 MHz): d 0,85 (t, 3H); 1,23, 1,26 (s, 3H hver); 1,63-1,89 (m, 2H); 1,90-2,30 (m, 4H); 2,30-2,50 (m, IH); 2,72 (t, 2H); 3,53 (m, 2H); 4,19 (m, 2H); 4,53 (m, IH); 7,22 (m, IH); 7,53 (dd, IH); 8,45.

30 Eksempel 18: 3- (2-Pyridyl) -I-propyl (2S) -1- (3,3-dimethyl-l,2-dioxo- pentyl) -2-pyrrolidincarboxylat, 88%, Ή NMR (CDCl3, 300 MHz): d 0,84 (t, 3H); 1,22, 1,27 (s, 3H hver); 1,68-2,32 (m, 8H); 2,88 (t, 2H, J =7,5); 3,52 (m, 2H); 4,20 (m, 2H); 4,51 (m, IH); 7,09-7,19 (m, 2H); 7,59 (m, IH); 8,53 (d, IH, J = 4,9).

Eksempel 19: 3- (4-Pyridyl) -1-propyl (2S) -1- (3,3-dimetbyl-l,2-dioxo- 35 pentyl) -2-pyrrolidincarboxylat, 91%, 'H NMR (CDC13, 300 MHz): d 6,92-6,80 (m, 4H); 6,28 (m, IH); 5,25 (d, IH, J = 5,7); 4,12 (m, IH); 4,08 (s, 3H); 3,79 (s, 3H); 3,30 (m, 2H); 2,33 (m, IH); 1,85-1,22 (m, 7H); 1,25 (s, 3H); 1,23 (s, 3H); 0,89 (t, 3H, J = 7,5), 30 DK 176489 B1

Eksempel 20: 3-phenyl-l-propyl (2S) *1- (2-cyclohexyl-l,2-dioxoethyl) -2-pyrrolidincarboxylat, 91%, Ή NMR (CDC13, 300 MHz): d 1,09-1,33 (m, 5H); 1,62-2,33 (m, 12H); 2,69 {t, 2H, J = 7,5); 3,15 (dm, IH); 3,68 (m, 2H); 4,16 (m, 2H); 4,53, 4,84 (d, IH total); 7,19 (m, 3H); 7,29 (m, 2H).

s Eksempel 21: 3-phenyl-l-propyl (2S) -1- (2-tert-butyl-l,2-dioxoethyl) -2- pyrrolidincarboxylat, 92%, Ή NMR (CDCI3, 300 MHz): d 1,29 (s, 9H); 1,94-2,03 (m, 5H); 2,21 (m, IH); 2,69 (m, 2H); 3,50-3,52 (m, 2H); 4,16 (m, 2H); 4,53 (m, IH); 7,19 (m, 3H); 7,30 (m, 2H),

Eksempel 22: 3-phenyl-l-propyl (2S) -1- (2-cycIohexyl-ethyl-l,2- to dioxoethyl) -2-pyrrolidincarboxylat, 97%, ‘H NMR (CDC13, 300 MHz): d 0,88 (m, 2H); 1,16 (m, 4H); 1,43-1,51 (m, 2H); 1,67 (m, 5H); 1,94-2,01 (m, 6H); 2,66-2,87 (m, 4H); 3,62-3,77 (m, 2H); 4,15 (m, 2H); 4,86 (m, IH); 7,17-7,32 (m, 5H).

Eksempel 23: 3- (3-pyridyl) -1-propyl (2S) -1- (2-cyclohexylethyl-l ,2-dioxoethyl) -2-pyrrolidincarboxylat, 70%, !H NMR (CDC13, 300 MHz): d 0,87 (m, is 2H); 1,16 (m, 4H); 1,49 (m, 2H); 1,68 <m, 4H); 1,95-2,32 (m, 7H); 2,71 (m, 2H); 2,85 (m, 2H); 3,63-3,78 (m, 2H); 4,19 (m, 2H); 5,30 (m, IH); 7,23 (m, IH); 7,53 (m, IH); 8,46 (m, 2H).

Eksempel 24: 3- (3-pyridyl) -1-propyl (2S) -1- (2-tert-butyl-l,2-dioxoethyl) -2-pyrrolidincarboxylat, 83%, 'H NMR (CDC13, 300 MHz): d 1,29 (s, 9H); 1,95-2,04 20 (m, 5H); 2,31 (m, IH); 2,72 (t, 2H, J =7,5); 3,52 (m, 2H); 4,18 (m, 2H); 4,52 (m, IH); 7,19-7,25 (m, IH); 7,53 (m, IH); 8,46 (m, 2H).

Eksempel 25: 3,3-diphenyI-l-propyl (2S) -1- (3,3-dimethyI-l,2-dioxopentyl) -2-pyrrolidincarboxylat, 99%, Ή NMR (CDC!3, 300 MHz): d 0,85 (t, 3H); 1,21, 1,26 (s, 3H hver); 1,68-2,04 (m, 5H); 2,31 (m, IH); 2,40 (m, 2H); 3,51 (m, 2H); 4,08 (m, 25 3H); 4,52 (m, IH); 7,18-7,31 (m, 10H).

Eksempel 26: 3- (3-pyridyl) -1-propyl (2S) -1- (2-cycIohexyl-l,2- dioxoethyl) -2-pyrrolidincarboxylat, 88%, Ή NMR (CDC13, 300 MHz): d 1,24-1,28 (m, 5H); 1,88-2,35 (m, 11H); 2,72 (t, 2H, J =7,5); 3,00-3,33 (dm, IH); 3,69 (m, 2H); 4,19 (m, 2H); 4,55 (m, IH); 7,20-7,24 (m, IH); 7,53 (m, IH); 8,47 (m, 2H).

30 Eksempel 27: 3- (3-Pyridyl) -1-propyl (2S) -N- ([2-thienyl] glyoxyl) pyrro lidincarboxylat, 49%, Ή NMR (CDC13, 300 MHz): d 1,81-2,39 (m, 6H); 2,72 (dm, 2H); 3,73 (m, 2H); 4,21 (m, 2H); 4,95 (m, IH); 7,19 (m, 2H); 7,61 (m, IH); 7,80 (d, IH); 8,04 (d, IH); 8,46 (m, 2H).

Eksempel 28: 3,3-Diphenyl-l-propyl (2S) -1- (3,3-dimethyl-l,2-dioxobutyI) -35 2-pyrrolidincarboxylat, 99%, Ή NMR (CDC13, 300 MHz): d 1,27 (s, 9H); 1,96 (m, 2H); 2,44 (m, 4H); 3,49 (m, IH); 3,64 (m, IH); 4,08 (m, 4H); 4,53 (dd, IH); 7,24 (m, Ι0Η).

j 31 DK 176489 B1

Eksempel 29: 3,3-Diphenyl-I-propyl (2S) -l-cyclohexylglyoxyI-2-pyrro-lidincarboxylat, 91%, 'H NMR (CDC13, 300 MHz): d 1,32 (m, 6H); 1,54-2,41 (m, IOH); 3,20 (dm, IH); 3,69 (m, 2H); 4,12 (m, 4H); 4,52 (d, IH); 7,28 (m, 10H).

Eksempel 30: 3,3-Diphenyl-l-propyl (2S) -1- (2-thienyl) glyoxyl-2-pyrro-5 lidincarboxylat, 75%, Ή NMR (CDC13, 300 MHz): d 2,04 (m, 3H); 2,26 (m, 2H); 2,48 (m, IH); 3,70 (m, 2H); 3,82-4,18 (m, 3H total); 4,64 (m, IH); 7,25 (m, 1 IH); 7,76 (dd, IH); 8,03 (m, IH).

De nødvendige substituerede alkoholer kan fremstilles ved hjælp af et antal fremgangsmåder, som er kendt for fagfolk inden for organiske syntese. Som ίο beskrevet i skema II kan alkyl- eller arylaldehyder homologiseres til phenyl-propanoler ved reaktion med methyl- (triphenylphosphoranyliden) acetat for at tilvejebringe mange forskellige /rans-cinnamater; disse sidstnævnte kan reduceres til de mættede alkoholer ved reaktion med overskydende lithiumalu-miniumhydrid eller sekventielt ved reduktion af dobbeltbindingen ved kataly- 15 tisk hydrogenering og reduktion af den mættede ester ved hjælp af egnede reduktionsmidler. Alternativt kan rranj-cinnamaterne reduceres til (E) - allylalkoholer ved brug af diisobutylaluminumhydrid.

Ph3P=CHCOOCH3 COOCH3Llt^lu™ aluminum .-n.

RCHO-Js-R ^

THF . A H

lithium .aluminum**

Diisobutylaluminium H2 hydnd· eller

Pd/C Diisobutylaluminium— Æ: V hydrid /COOCH3

OH

20 SKEMA II

Længere kædede alkoholer kan fremstilles ved homologation af ben.zylal-dehyd og højere aldehyder. Alternativt kan disse aldehyder fremstilles ved omdannelse af de tilsvarende phenyleddikesyre og højere syrer og phenethyl og 25 højere alkoholer.

En almindelig fremgangsmåde for syntesen af acrylsyreestere, eksempli ficeret ved methyl (3,3,5-trimethoxy) /ra/is-cinnamat:

En opløsning af 3,4,5-trimethoxybenzaldehyd (5,0 g; 25,48 mmol) og methyl- (triphenylphosphoranyliden) acetat (10,0 g; 29,91 mmol) i tetrahydro- 30 furan (250 ml) blev kogt med tilbagesvaler natten over. Efter afkøling blev reaktionsblandingen fortyndet med 200 ml ethylacetat og vasket med 2 x 200 ml vand, tørret og koncentreret i vakuum. Den rå remanens blev kromatograferet 32 DK 176489 B1 på en silicagelsøjle ved eiuering med 25% ethylacetat i hexan, for at opnå 5,63 g (88%) cinnamat som et hvidt krystallinsk fast stof. Ή NMR (300 Mhz; CDC13): d 3,78 (s, 3H); 3,85 (s, 6H); 6,32 (d, IH, J = 16); 6,72 (s, 2H); 7,59 (d, IH, J = 16).

En almindelig fremgangsmåde for syntesen af mættede alkoholer ud fra s acrylsyreestere. Eksemplificeret ved (3,4,5 trimethoxy) phenylpropanol.

En opløsning af methyl (3,3,5-trimethoxy) - trans-cinnamat (1,81 g; 7,17 mmol) i tetrahydrofuran (30 ml) blev tilsat dråbevis til en opløsning af lithiu- ! maluminumhydrid (14 mmol) i THF (35 ml) med omrøring og i en argonatmosfære. Efter at tilsætningen var fuldstændig, blev blandingen opvarmet til 75°C io i 4 timer. Efter afkøling blev reaktionen standset ved forsigtig tilsætning af 15 ml 2N NaOH efterfulgt af 50 ml vand. Den deraf følgende blanding blev filtreret igennem Celite for at fjerne faste stoffer, og filterkagen blev vasket med ethylacetat. De kombinerede organiske fraktioner blev vasket med vand, tørret, koncentreret i vakuum og renset på en silicagelsøjle ved eiuering med is ethylacetat, for at opnå 0,86 g (53%) af alkoholen som en klar olie, 'H NMR (300

Mhz; CDClj): d 1,23 (br, IH); 1,87 (m, 2H); 2,61 (t, 2H, J =7,1); 3,66 (t, 2H); 3,80 (s, 3H); 3,83 (s, 6H); 6,40 (s, 2H).

En almindelig fremgangsmåde for syntesen af rrans-allylalkoholer ud fra acrylsyreestere. Eksemplificeret ved (3,4,5-trimethoxy) phenylprop-2- (E) -20 enol.

En opløsning af methyl (3,3,5-trimethoxy) - irons-cinnamat (1,35 g; 5,35 mmol) i toluen (25 ml) blev afkølet til -10°C og behandlet med en opløsning af diisobutylaluminumhydrid i toluen (11,25 ml af en 1,0 M opløsning; 11,25 mmol). Reaktionsblandingen blev omrørt i 3 timer ved 0°C, og reaktionen blev derefter 25 standset roed 3 ml methanol efterfulgt af.l N HC1, indtil pH var 1, Reaktionsblandingen blev ekstraheret til ethylacetat, og den organiske fase blev vasket med vand, tørret og koncentreret. Rensning på en silicagelsøjle ved eiuering med 25% ethylacetat i hexan, tilvejebragte 0,96 g (80%) af en tyk olie, Ή NMR (360 Mhz; CDC13): d 3,85 (s, 3H); 3,87 (s, 6H); 4,32 (d, 2H, J =5,6); 6,29 (dt, IH, J = 15,8, 30 5,7), 6,54 (d, IH, J = 15,8); 6,61 (s, 2H).

5.

33 DK 176489 B1

In vivo- fors øg

En særlig forbindelse ifølge opfindelsen har følgende struktur:

yV

"Π

Denne forbindelse benævnes GPI 1046, og med denne forbindelse er der foretaget in vivo forsøg med henblik på at bestemme dens immunosuppressive ίο potentiale ved legems væskeimmunitet, når det administreres ved subkutan in· jektion. Det blev påvist, at GPI 1046 ikke er immunosuppressiv, når det administreres med op til 200 mg/kg (den højest undersøgte dosis).

Hunmus blev behandlet med GPI 1046 eller en af de to kendte immunosuppressive midler (FK506 eller cyklosporin A) som kontrol i 28 dage. På den 29. dag is blev dyrene undersøgt for passende immunologiske og toksikologiske parametre.

De følgende tre tabeller gengiver resultaterne af forsøget samt tre sammenlignelige tabeller for kontrolmidlet FK506. Resultaterne viser, at mus behandlet subkutant ved doser på 5, 10 og 200 mg(kg med GPI 1046 ikke havde s i g -20 nifikante ændringer i legemsvægt eller legemsvægttilvækst, når de observeredes over de 28 dages behandlingsperiode. Endvidere blev der ikke observeret statistisk signifikante virkninger på hjerne-, thymus- eller miltvægtene.

Ved den in vivo-bestemte antistofdannende cellerespons påvirkede behandlingen med GPr 1046 ikke musenes evne til at frembringe en IgM antistof-25 respons på fåre-erythrocyter, når de undersøgtes enten ved AFC/10® miltceller (specifik aktivitet) eller som AFC/milt (total milt aktivitet). Begge kontrolforbindelserne frembragte en signifikant suppression af den in vivo-bestemte antistofdannende cellerespons på fåre-erythrocyter. I modsætning til cyklosporin A og FK506 undertrykker GPI 1046 således ikke den in vivo-bestemte le-30 gemsvæskeimmunrespons, når det administreres som en subkutan injektion med doser mindre end eller lig med 200 mg/kg. Hermed er der anført et eksem- 34 DK 176489 B1 pel på, at forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse virkelig er ikke-immunosuppressive.

DK 176489 B1 = £> O 0^,0 å,É Ϊ % ΖΖ?ΖΖΖ$Ζ3.-|“*“·“5,« H < §=5κ§. = ·2"« i g 3 + s -2 δ g ! _, ω«Ξό2=° ® g>w.g&£g§^ Z _< +- ++ S c .3 ^ c XXXXXt£XXS< MuO- « ss z z«g'S-:?^-e » .s ε I s JS 5>| g g* 5 .2 5 ! 2 -5 S E ! O åfl «hB„ ίωθ4Ϊ^*«>4> λλ cSf^r^iO^^r^oor-iOH^-^ ^ *τ

« ^ “ o d o o o « w. *. *. 2 i s M * “S

.- ®^^-+)-Η+)-Η+4θΟΟΟ 0-oOO = ,jUC

^ 5 .^Η«“ϊ,Η-

+1- fc. ^ o - n ri i^’ ® Ϊ ? 2 ^ ^ '3 ® ® s S

- ---^2gicis«vS.

jr· §o*jj3M««a.=‘

U -,-,******* 55»*- S^oO

60 «Ί -¾ -» »O O O vr> Ό uSoia--S>u»u T3 M O O O O O “1 Ό M _ 3 -° .-==11¾ « '^'Z.'-'-H+I-H-M-H©®0® o^Sii+lfeo.Si 3ί JQ gug^^l^c-g Ό —•^•^•tOp*C>onrtincÆ « E.S<Sw^in_,--oo

JS eJ’Ov.S^-e O

4> ΛΪ! OiHilf'lJu £i nNnnfflanri-1 η ό -η η > o i- i „ ΟΟθ'θθΝ1Ν.-.ί> § O g = S g g.

3 0^-+)+1+1+)+10000 . ,-00(- go.

c 0=0,--^^,-^.+1+1 +i+i 5S-S— "S«2 7 PI w Ά <1 λ ^ + — ^a+ic^u ob —ι "Τ' ο’-ΝΝΙΊ'Ί"'*0' θ5ΡΌ!“ΪΛΒβ7 tL, S μ η η Ν η ό. °°. °1 °u'b1 3 ό .* Π =ί Ο--γ"1 S η g .5? § Κ «’-Ξ -,¾ « lMl"sis|s «S * * »i E-Sa β §;? - ν4 N.N.,rn.v!r-i)!)H S - Sz ϊβΕ s ά Η c ο ο © ο ο Ί =+ =Ί “Τ. Ο οο Λ -Ϊ = S) - ο ^ cq ·= ^,+ι+ι+ί^+ιΟοοο . 5 6 <2 Λ -g 2 3 = 'o200«.rJQOrs10+l+++H-H'^-'C5L^'-2-n£ • Η -2 2 sssssS”ss:||^|:io»| .. °"Ν" |*a|'|»I»s οο _ “β oS = 5«1? ϋ Λ, -ΜηΑ+ΟΟββΛ-^,ί’π^ΒΒ " .....-η Ν η η » S D = ο" ωι rj ooooo.tN-tN-.ji«es u- ? © - .2 .Ξ Λ.+Η)4)+Ι+Ο000ϊ£τ!^=0»^ -5 ^Α-οη«^^ ϊ§ϊΐ,> Γϊ G ο’ —* Ν ν' Ν ο 1Ν νο σ'. - ο Ο « « - 2 -ΐ S ν η c-i η γί f". “ 'ΡΚο^ή-^ο^ο Μ 0--Μ Οΰ gSfi.Sf-fl Μ Μ „ π « Ο 2 ΐ .

ζ eJs2o.>ecuii_ δ ~ ^ =5^3 °*·2 ε — ηηη^-^Γ'—<0\t— 1Λ>^««Ρ®

ω Φ —Γ —Γ —Γ —Γ Ο Γ*-) Μ fl iU+^lBEvU

W> υ Ο Ο Ο Ο Ο » ► - •.-pS'tijUflVii « !ί'-'+ι+ΐΉ+ι+ιθοοοη5_·αω« Κ Λ w^^<-r.O+(+'+'-Hfi S>feo§i-„“

Sf φ ο - - Μ η ^ Ι”· ° ° S J £ » Ο Ο. « « ϊ> ΠΜΠΜΜ». Ο®|η §·5β θ.>^ s °rt iial§:ia^a —, ; - c t. u g o

op ^non'fvoosoor'^S — «"SgO

> >. d d o’ d o' 1 1 N. n. " „ > 5 2 h ό 5 o M .--+1+1+1+1+10000^ ΜΌ e - Εΐ i E « “ « « "Π 41 41 ^ c .? § s 5 w -g ii s 60 Z o-nnr·, “ίίΓ- « *30 l. *3 + +> "g e ω noi(NcsiNl<l,,T.i:r'.0'-3«|t>u-!«ii;eo>ii i-J οπ-ri B^fiSc=0-“

i C V "Τϊ c a U

ΐϊ!η B’2>3u+lE-, ®* 2 " a Q > w L, r^0.?-i -3(03 φ —, -η -η —, y o t «<*-c.s?u *- ΜΙίίΜίΙ1ϊ·6τ)>Ββ 0^= φ escaaa®.5-2,^-0+^ S QQQC^'SS-Kii^g η - M 2 S S 'ήΝ0.5§--5| £5 Λ Kft2 5?>Ηε*^ b ΟΟΟΟΡΟΟΟΟ«3β«|ο,ο«.ί2 ίί M ¢3 C C *3 <*- .* i—

vn O

DK 176489 B1

•O u lo οΰ τ' b 1 G

£ u. ~ ^ G -r Ό " 8«ϋ2? £·® ► “ — ; "j: W <u

Ό « _ so <= E -S e c ·> S

e>> o oUjh^u0^'·

C — CO CO - Μ M « COCOCO VI « c " M

ΐS 2 z? zzz zzz £ϊΞ . lijg H 2 D. ^ a« " 3 Β>ϊ ·) < O0UÆtn«~o

O ^ c = ^ S

. o - > « c m ·< u .£ ώ u ·£ « -

W c ω u .o « ® O

2 æ EX 55s E S E a S s£ > a y~ “ * 's. -o S? + o v bs o >: > ω ϋ « — a(jE“5«oo.

O·3* U u! i — Ό ^ g> - co - g g £ o ' α 3 « w *- „i ®- ®. °- ®- u ·ρ = £ ^ s ϊ s s 00 ^-5.5+1 *® * * 41 is'> S c I^g'-CN 41 c-o - - =“5 = Η οοΐ^ ·- lit m m —1 O — c*s cn λ m - g,o~SajjeOC —

tS 3- Os o Tf CS ΤΪ ' ’ - .. S -- C MTJ

SO " 2 - E. - - ® ® = _“-— cu 'se 1 -i|:il:is| e : . ?s .11 ι^ι;ι:ιι» n 60 2. s ^ ® ® f - - S ^ ^2 c ° 0 W Γ— O 5l o 2oO CS O © κ ϋ s A . V « 3 T3 Ϊ +1 -HO -H-HHH +I-H+I — c 2 . Q c o «3 ω Π Ξ — m « - _ -i o eS^d.Sc-ag- C U| .Ξ — : CO O in CTs 5 B 11 » - > S g-

® 2 so os — r- os so 0-0 S’wæ^’oEa-cS

- CN so f·" « -o co 3- - - S S, g « Η fl g- § μ ω ^ ^ o © «*g. a-s;2^« -Γ5 yiB-yj« jJiOC'i S _ ^ OO^cq^CO ~ j= ^ ^ 00 2 b — "S ^ > D «s c^J —' . bC rt rt O C « X) - S 00 °- °- «So-o^CabOc-c O « °. so q 0 — 00 = 0 § ca ίί £ 5 2 S«+l +1® +1+)+1 +I+I+I ω-=·ΐία“5ίη = S OOO J, 0\ n\ OJ) Oi ^ ^ u -* o

S .N-Tf 41 3- vo 22 « "»s-^ B E

' c co CO- σ* >n © - is - Si£§»« = uu

« fc .2' « 2“ 2 "i ^ O ® ~%°%o I

^ co S; tt-h— 00 s-'e-cSws'C-aKe

ί U α n s ii Sul S E S

OW « J -g SS -c=g5«-“« ^<5 au «0. „ e g g

◄ .5 o -o o ® o o co o o o.-g 8 ^ « .SPIg S

H c Q^+I +H O +1+1+1 +1+1+I E2«il_1_“ce'3 'S -S— +1 °sso 2 ό c a 5 a μ "

E s® ® 00 ©©ssS-omE-E

Æ Tf —. — CO -NN O N - ΕίΒ-ΕΟΕΪ» © Μ Ό °s Ό SO CO V) > * w g O. « 3 E 3 S '»

^ "OO °° -|"g^SW°S

ς£ ^So£^c«vu s « ;o o 2 5

„ o s °- °- SS

ω O 00 ©, O00 CO O O . ^-«„W > Ui ω -«-H +i o +1 +H -Η ++I+

Ql tr> CO jj Ovin <yJ3^i3“TiG

“ -oo +1 g!2 MO E „ C - uu u C ri (N ^ H h ^ M N — - Ξ . J ϋ ® „ Έ *c 03 a s 2 °i 2 ”*^ ® © ^ a . i =3 -“! 1 ©

s ^--00 S

° •Stt-a?Xc-D·14« M 0 ^ ° — co— 00—S-“-a®°-Ee

—> Oi Ί so OO °. °- 0^03^ — ugS

“ Ji © °°°. os o* o <NOO Ϊ3„3 ε > π .M c: +1 +1® +1++ ++I+ s ωϊ 5 -, ra ¢3 03 — _a ” _ +1 — — »eSi-MB> ω ·® © os o co-es ·=·οΛ·αΐ_ '“c

Bi v rn o— — SOO COCS— =„«., = ^>uS

> > « 52 -22 -no o I S * § “ 5 3 “S

OO 3._.3icm£a> - h a 3 o u c - S o $ o- *<n jaa|l!-?l8 ^ 22 t>o s « 5 o ^ 5

Tf u-1 OO © © wrtCL} 85 Ό ^ ^ U

is O* 00©. * o* © <NO® .- - +, +1 o +1 +1 +1 ^ +1 +H Jr C +1 I g. = ^ ° 2 ^2 °2 m “ U “ s « “ 5 ji ^ Tf m m©so t-fscs ^2=35)¾ ri°o -i ^ N in * _·' L/ <u i- 2 *^c2'-£‘— ‘12 ? - O O 0 0 s® e* £ E £ ^ M i>

00 ca — OgoeOh-S

- . - u * Ό o C “ Μ . - = £ u ® ^ O .

u ^ Ei ** — — en ω a ω no a c^o'—eS— 00 1 » ω « IS 3 S«5 c ϋ 2 - » I B “ ΐ α» a p> — > ·-! — > .+1 6 £ - έ sE* μ ε * £S'eh5S“5-§ « e 1 ^ £ g* g i s1 g « 5 « a , &fl tZP r. tsft —.

DK 176489 B1 ΰβ 00 · ' C ' U J) C ioCLwL" o i c 2 « W ϋ s u q υ ,/¾ c Q. «_» n 3 -= - = - ύ - ®?^£>λ-2·3·- Ε * .2 i- u åi "° — ΟΌ v> -¾. o o ι/ί oo ov oo va ^03^-33^,.

3 O« 3- M m ττ rt vo c- >>= u 2' ® r ό J) Ο Λ < -η“-η“ ·η£-η*-η» -η 5 ^5*2 . ~ Ή ~ 5 ° = ;Ξ * u ΓΊ —4 VD Ρ~ Ο νΟ Tt CS (Ν — ω«ο»«·“ —

Ji 2 ο Tt αν m m 00 cs SjDtQS'a .a,u i" 00 vt m m vo m m cn S-iiO.KeSi'n«

® « 0·° 1 *iS MO

* ov S - "2 ° - U (ΝκΕΐίΚξ-ν c «Ληω<ι,ϊ = =κι É ϋϋ^, (SI - vo cs ^ £ c^S'gS®®1®!!

o fe — V") v> ^ t*- Ό On 6OOH-2(li«^ cflS>S

J ν© (Π /—s y“v. iM r«» — --^ — r'*'· r^J ''“'v N ·—-v fa ·" W !> !“ ¢) lt C !_

O S 00 00 M oo ce CO 01 °0 “iglriScSQiccS

hh “ -H -+I s^ -Hw+i'— +|— +1— +|w S5yg-®1=We§S

S ^ sg-^.s?-i«=c j- se p ρί r~ 1 ·η ov o- ov r~ g » „ « w S3 . £ <u

J*i <-* s oo cs cs r- «i m Ov « c’2‘«E->S~*tlS

Ps o cs cn m rs γί m Oh£tS„iia;«i

υ cs rs cs cs cs —1 —1 ω —1 .S S Λ o· S H

O Ό x Ό ca ® — 3 C « Kli-2 “ VJu

r M C is' H ^ o 5 5 S

~ _g U> “t)'0‘=p «00 « CS O O' O - r- 1-S§33>^

2 cs c —> 't "t ^ °°. “ »i ® VO 6 S & i Q S s a O

52 — 4» © O pc -* *“> -μ^ΟλΟ'-' rt/-' CS'*s^w^'“4J§^ Mg'"1-1

^ u2 +ι~+Η^ -h S » S2 Z 2 g £ g i <3 J

a* 2 - x _ Sjo^uguu-S

og — wo\ O O ov vr -I OV — ’£ Α®οοΛο0'Π «2 “ “ r- o os -3· ’i- ov ov £:30-0^.:2.= 00 "i»

^ 'B _ o S en in »n in Tf oo‘ — ° II c^o = °1 S

jgSS ^ ^ rscsrs cs cs „^| O „|u h d ø (S O'-wV-S^.Sot; t-H1- 'p-cs5s = s lit§“s>*å ^ ÉPS M ~ E i u S* S £ H S jg «

Uh jo p- oo ·ΞΕ^ία,·οχ:ρ-ο λ .SPQ g— - * ''»IS,«*' Ss y-rv^ >.00 h-^ov^ in^s_,^-vo^ _^s r-pUM.ouSj3 ,^- -S ^~+t« 4S~+I~+H~ -H “ 4)«gZ 53 g’ “ β;·3·"| ΐ^^βυαΪ£.Ε -)3¾ u-1 —I « _I OV rs —I βΜ^ °S ™ ^ -η m rvmrs n o yj^OoSaoe^o.

°-·α --, ~ -η - ».Ϊ E “ “»O - K Ϊ a S 'c‘'0c0uo'«go3 o e^yiiugSh-s o.— a , (fl „ > S .. £ .2 o o <D*t * ,, se« i: i « > Tf Tf Tt in PO l·, ^ '5"°S ^S'-=cC>V = 7: » ο λ o .λ o ^ O'-ν ®λ¥κ c«mSo“o5 ,0.2 S a^o -H«-H« -H « 4)£*Z ^nh i B > >gafl| al « -O o « o Tf « cs S-ϊ L? a;=H Ϊ T3 60 rs Tt ro vo cv SS aj;Ei.->ii)o C « cs rs cs cs cs cs rs «*J eSfS-'eSc1·”«1· g I -S iSgSSSg^ls.

S fi β-ίϊ-Μ * !«α « -οοΛβο^ε-ΟΒ S ia2S>ec«iSw)irn s ·=οο®ο«ο®£.™°ίι « β < «'‘-“"eStssc-x.

S - so-Ξ S 2s?o^"oS%i ^ vd MJi Jr M y, 5En.5«^wJ<:clSo

co c ΰ S^1 =¾ « o·^ o·^ <-ogaSa.«.2 “1S

β B J3 2 s E S “ 2 ob j-fc^asvSaiju.S

O _ ^ oil g 5E °c ΚΐηΟ'ί-βΜίΐΕίίο <-> *e > r- c c _ in c 7 f, n s β· O v -E > o ^ ΰ " aj O -r- é^hi^^S'COOSiOe

— « n « O- O O 3^ in * i.v-vo dos > S » E

S β z > O m — cs U cs CUcn SCHffl-as:„o s< g e ««Ϊ5ί33·§“.-:>§« ω5'«^ S u t c η Ό ~ ω- « 2 j 5 S u 15 g g co-^ ΕΪ si E 1. s E iJ D _CÆSu*0^

Uh tis ώ C C. 7 'μ Ό m O *2 DK 176489 B1

wj i t t i jr » C

o E ^ io ΐ ϊ-β “ « inmui iDinmu11 „c Ot-«

S >1 r„©©©r/.©©©*;>r>Op E

« rt 2ZOOOZOOOV C^f 4) dj

fa 2 ^'‘‘VVV^'VVVJS . « U « = „ S

L·* j 0.0.0. 0.0.0. fa λ » u E t. kl ^ < ΰΚ5·=ΰ^οΰ“ “ΪΌΪ| Ϊ " O £ o S ^§C5>S£-3 ω T KXEWKSXSeSE3-; £ - m ^ i SaSE “woo

«> * j? "* -S - S .3 > v II

04 J S S SI« &-g

.— 4i.^>b£)3c*,ipOW

* -QOOO S 5| £ t> -C

g n *i ^ °i °°* £ Ji 2 ^ -S S £ g = « η > ϋ 5 ,Λ ^ O o ° o ° t fa 3 E “ k. . u * «1«,^^+,+, -Ή oooogo |^g!-g> ^ ^ °Λ. - E 3 u — r^fnio^o«2i;f23'“w'0 °ϋ c 11

0 N N N Μ N °, N, t .3 U Si ϋ » g B S

g uigg“ii“a s-^oeS = s «&.

1 g'si-slgsi c 2 — EC o n e j=

« si .IfgigS

« ^ «'S-r-\ocotSo^^.2,a^^g)>|l) -° « o ~ o o" o o o ^ “I Ό.'Ί .5 g-s g= Ά " g « JS rn^+1-H-H-H+lOOOO _ s -g 5 ^ = ^ i *. « « o « «-. -n 1 >S o i ·fa 1 s i 1 i Μη^ίΓιΌ0'^®^ 3+J^6I1rtSi,a w £ s Ν^ΝΝ*·"·:·!·^ίοίΐ'!ΐ

5 u “ * & .Ϊ 5 S. I J S

Η Λ gStSeugs-go ? U > h c ϋ Ό 1 ω -"HE—<_ω— ^ « jj « O I ® °. £ o o o o o - « N. N. £ S = é ! * S S s « *s * .ls£ se|s

^ - n nW « rt S S ° - i ® § ΐ = ^ -S

« n n n n rt ” ® n. 3ΐ)^ϋ«Ε5Μ G wj °--n -¾ * S «? » E£ 2 OCCioTlS^S^e α £ is-.s^g^lls < £ 2^» ^ fa — G = rt p ^6 ,/*, G Gfaai“»faU.— w aj ^^Ovor'r^vof'ir'wo^S,, 5 £ 5 a ” fafa '— Λ Λ « η n N n N ^ « O — 4k o BJ) -CO000®0'-*· — βό^ίϊ^ΐή — — « oS+i-H-H-H-HOOOOOfa -Ξ g g V - i — °~«+|;:; 1 ^|-=s sl-s — £ '-g § . " g § c e fa fa I) S Ji 3 u «

60 " H i> w « .O S

0 =>E^'c=faO = I &2§ί3^ϊ "oo -isjcSA-oS·®« fa. ._ ^ O o o © © ^ ^. ^ ^ 60 J= .2 « g 60 S fa

Sf -S e^+J+H^OOOO^OiSuSolS

> * ^0M»nO ^+^+1 « c ^ O o ® £ C > ri ri ri ^ <n‘ 5 « g g 3 » « 1 o c α π 1 «ννννβ· ·ν·?2ϊϊΜ!^

60 C’^'-^fa-SuSi’S

kJ m » M « 2 .SP ^ U o Jr £ »o — ·- fa Ό — ^0.^-0^¾ it PQ 3 S « λ “ fa MiiiiOti., S'3S:H>l:a g QQDo|a«faS-l^ i -«saa-isål^åZligsl

£ 00 60 00 e06i 60 60 60 60 U.«faUfa O— O

Λ (¾ :¾ ti ή fl rt ej pj a^Cfafci/iOfifa—

CU QQQQQQQQP

Ό O

DK 176489 B1 οχ» li c ϋ > Ό π « O <ϋ ^ ίί o u ^

,1». "ΐ ε·α S

« u-, _ _ _, ,η ,η _, ^-ac Si c 'u© oo oo oo H£„o.2(uc « S"d g g g g O O O O Ο Ο Ό Ϊ 5 c § 5) a o u ^ A ^ vv vv vv S « 5 --S3-3

^ O. &. 0. CL C- ^ ø· *0 I— <U

M c « 13 , V = O V,

Ssl5S|^£ Ϊ & wiEtj i x i " i § i § -S g 2 S Kl SS =2 S3 II >JtCi^-=

s s-a||gg.§-S

JP « = = 2 Ξ v S

λ. „ W w au . οχ) S * i- Ϊ -uoo«&u tt, -i IN O 0*0 O cscu— Ο») «λ fc * _* * _Γ λ, _r o ^ c 4J o es ^ o ^ © t-· © r~i o ®o c"5 - ϋ> — Ό Ο Λ “ " O'ooo +1+1 +1+1 +1+1 +l+i +1+1 43 £ O M = 5 s S —^"+1 Λ «> TJ » ΓΪ — .C = —

_ Co o ep.jJ.eSwo’S

CO t'l >Λ —, fS l£> .^Λ«π-°ώ VO ιΛ m f+o !/">*- n N J> > = oe £ « S ~ - *© 2° S- |ϊ |·ο^°Ιΐ

l/-\ — Ό C U U C

L J MN Λ L|_| ^ O

E ^ i § - " i 'i s — rt S w s Ϊ «

o - « I

0 ΓνΙ rsl i—i C3 p. </5 > I

1 » *Ί ®. ® °. q ^E = is|5 ! \0 © U"> © ΓΛ O O© 6C w »2 O C vi w hll __CO rtOSeaj.«« iri oj i o *·^ *· *ό lj ^ > '^ tfl u ϋ w - OO o +1+1 +1+1 +1 +1 +1 +t -H +1 = . i c s O t>

r— *·**. ^ _ ™ 3 4J ;λ Q O <U

2 61 O. O -» °? in r- V S O « +r - Ό Ό Ό Ί ^ « ί &ϋ·8 ecii "i s° s« s- ^gssrl , s ·“ s I s -a s -s taj = r? £ J= ^ C t 5 W ^

M s 3 <N S

H ® 'to'+-o"oocsooo ““ SoSi^iS

g, I ^ X 2' S ® ^+1 41+1 +141 ^+1 Sø Λ w J S *,» S oo s * g &S 3*1 -=2¾ J2 i « 2 -* ° 'Z o* « O ^ - Ώ I s g «g s c SS - - - " t+gcQ-al^-go ^ ι-ΰ'*-π.£?ί;ΗΊ3 Π— 5“«— ‘J'inj

3 =S, >s^E

CL .-“n Ό 60 ω ϋ c ii 2 - Λ.2Ρ ^ ^ © m *- u Χϊ c ™ y, 5* S ΙΝΙΝ o o o o ^ u * E « Ϊ ^ w ^ O* ·♦ o‘ —O ro© Oo ^Ξ£·ο:25£:Β o ” “1 ,£·ωι=9Λ+;2

ω _- S ° ^+1 ^+1 44+1 +144 +l+t s P S fi £ S S

Si ° +i _ bSc o>0<'H

S o o\ a ^ m „ " o > m q o (s —i ιη~> — β o

g. m £ *t « t S *· .SgS-agV

o > > I al Ξ* > § ΙΓ» ^ *3 C o ^ hil O ^ γΛ «-Η ^ Æ> 03 ^ ^ “ - O - O O o O S u « c -O go« ϋ - S ^ ^ o --° Sgg^SS-si-g eo * ^ . S^Mnawi iC- 8J '2 °°o +i+) -H +i +i+t +1+1 +!+< : dl O ·; S fi c - ·ο «« vd o gS Ι.ΙϊΙΙί ε> ο<Ν^ o IN o Γ+ -ao-Sgl å g <U ^ Lr, <3\ -). — N- —I +~ (N Γ-l Ό+- «oC^Ej, h = Ξ I, « o ^ I ° sa - o c s S u 5 ofl æ α Μ o u ε·2ζ5 - ϊε0"& t 00 to rj o ^ 2? _ OD C O g· 3 ___ « OB 00-ΟΟΒΟΒΟΒ_οΒ^ορ">β·3^ί; - 20 -s Μ « S1 « EH ς£Η « u ^~.> c> -+-> c > . ΐ a ccSi S > s. s ' e s ^ έ « έ «as-cga^- * β .. g» s? i s* -g1 |s asgifS g 5 a ©J s,-3 !II«q||S = a, j s# llll-aslal ir> o DK 176489 B1 ΟϋΟΜ·- ► **-· C ' C fl C «'S'’— ^ <U oo O ^ « « 5? c — o ,ϋ ; s 3 C O o C w „ ύ - £ = 6^073^53^ = S o « ίι t - ϊ^=ί5 1°λ ua -5 Ί- m m S- Sf^i^^V'0 c rt3 = S >—'’ JScQS^O^C^^ Cl £Ί M oo Ό ΓΊ -1 0\ T3C£jiicE30fii.<uO.

Si Λ OO M c\ r~ ^C3 '« -Ϊ -S S

SS""" SSS01S4S||| . i--|^z =ΐ| .Ξ * * -3¾ - S S “ d °·- “ .Ξ r- s- ^ ^ ^ r- m>>Eo^S“>

S ^ 2 “ 2 _8«M>E:ii-3j=SS

£ 5- -s - ~ - - - so.-^gJsJig?el

Ή 2.--H S-H S-H S

3-r QOOrturtOj^cw^S

't*. *- r- oo o\ 00 θ' -Γηωβ^3°· 'Πθ' s w s -o- *3- r- ~ rr n°|O=·

22 M θ' (ΝΙΛΓΛ 0®<u5'5>iiT3‘S

>i —1 <n γί ucooa'2tfl“

υ cUl.-ooo^EcS

0- a o -o 2 Æ e « ϊ Ό 5¾ * -S « ^ I « 3 s s S o ~ £?« l „ ^ * o 'i '?®e®lgSj3o

M jjfl « -O S 5 « Λ “Έΐ ,g§2^'S

JoSn r ^ ® °* o - ° = g « ; ΐ " « § = s w ^ - «2 +i“ +i~-H«-H«^e s ^3 ^ s s «I s π ^ ϊ « ^ O o OO * « 1^ε&ο^§|-·3 < i O b '" t-> οι to o a\ 3; « c g “ c o pSmu-ics - - - - * S Ϊ £ £ Ξ w -o H '2 W O « οι n in θ' t~- T3C-S°·-— wab_ , - w N - " s ° I ·* S O S3 o "S s •«U — -οίτ ώ ώΕ^ O T3I- a a £ > c „ c ^ ϋ .£? g ^ * ®oa £P ** ni it f- « it S {> M o -o J S ϊ .M & := rt «Γ 5+1^:2¾ «;£·.= ~ ίϊ a Tn Q 8 n i_rr„oi)>u^oi

λ λ /—· -—- mw uMu.Hocc!;B

5 ed 23 ^ - +.00 +,00+.00+.00+,00 S7 = S.c-£Ma — g ,¾ ~ E +l - -H^+iw+'w+'w «&ϊ# 5^«·“

Qa W—W po^COo^fi0, M

“ Ja ** —, \d o —1 m ^u + cs“e“=c3t) O, ·**-o ^ o -irooi a=«BScgH ΐ <J °* S -> - — - '—u-<^w« uVe j™ 2"Uat«tjS, ¥ w i ,-3 -O O M 60 d, >

G =E’a«= n^o:S

O Oc'e<uOf"CT3co

Cl,*- . B « o fe « o « 00 ir, γ-'Ό-οοοο 0 « - - - * ' S'S^'SraKcE0

1- Si o o o o o -ii-0l«e_S,l>§S = tB

« > o o S^ftSSta^ 8-« s a« ^-4.e+is-«2 « i °- α s^31-s :¾ a g-s^ c * <s m m m m So,!i32ca jjg ig -o2S «^3&>o.

2 o μ — o q c ca 'g O „ ^ c e „ c β> u 2 M J^oS & i Sg-g = w s o®7,£nu“ c c ωωΜ^ c2m 5 « β S M S w M G o eoeobog ^ e i « c u«o

J= s rifgS ε ε Ε·αα,«ΐ;§ “ 1¾ £ S

£ j= +=S o 7 = Γΐ = ϋ^ι-ΓωΞ ο S *5 o 3- O o -° » .2 § ^ s s ·° s ea > fe o - « - KH®s>K5å“£J3g o“|2s «sc_,v:

Ξ e w> 2 5 - π « V

s § s ° a s- S -i =2P ε__£ .

- E'l = 3' & §'§ S “ « 5 M 8i ssbQfis a «

Vi o DK 176489 B1 41

Af den således beskrevne opfindelse vil det være tydeligt, at denne kan varieres på mange måder. Sådanne variationer skal ikke betragtes som en afvigelse fra opfindelsens ånd og omfang, og det er hensigten, at alle sådanne ændringer er omfattet af de følgende krav.

5

Claims (18)

1. Neurotrofisk forbindelse med formlen: Oys V^o ° 1 10 hvor 15 Y er oxygen eller NR2, hvor R2 er hydrogen eller CrC6-alkyl; og Z er et ligekædet eller forgrenet C2-C6-alkyl eller -alkenyl, hvorved alkyl- eller al-kenylkæden er substitueret i en eller flere positioner med An, C3-C8-cycloalkyl,

20 C3-C8-cycloalkyl forbundet ved hjælp af en Ci-C6-alkyl- eller C2-C6-alkenylkæde eller Ar2, hvor An er 1-naphthyl, 2-naphthyl, 2-indolyl, 3-indolyl, 2-furyl, 3-furyl, 2- thiazolyl, 2-thienyl, 3-thienyl, 2-pyridyl, 3-pyridyl, 4-pyridyl eller phenyl, som har en til tre substituenter, som udvælges uafhængigt fra gruppen, som består af hydrogen, halogen, hydroxyl, nitro, trifluormethyl, ligekædet eller forgrenet

25 Ci-C6-alkyl eller -alkenyl, C-i-C4-alkoxy eller Ci-C4-alkenyloxy, phenoxy, benzy-loxy og amino, og Ar2 er 2-indolyl, 3-indolyl, 2-furyl, 3-furyl, 2-thiazolyl, 2-thienyl, 3- thienyl, 2-, 3- eller 4-pyridyl eller phenyl, som har en til tre substituenter, som udvælges uafhængigt fra gruppen, som består af hydrogen, halogen, hydroxyl, nitro, trifluormethyl, ligekædet eller forgrenet Ci-C6-alkyl eller -alkenyl, Ci-C4- 30 alkoxy eller Ci-C4-alkenyloxy, phenoxy, benzyloxy og amino; eller Z er fragmentet: DK 176489 B1 43 O H M -C-C-x2—R4 R3 5 hvor R3 udvælges fra gruppen, som består af ligekædet eller forgrenet Ci-C8-alkyl, som eventuelt er substitueret med C3-C8-cycloalkyl eller Ari, som defineret ovenfor; 1

2. Forbindelse ifølge krav 1, hvori Y er O; og 20 Z er et fragment med formlen: O H || -C-G-X2—R4

25 R3 hvor X2, R3 og R4 er som defineret i krav 1.

3. Forbindelse ifølge krav 1, hvori: j 30. er NH; og Z er et fragment med formlen: B DK 176489 B1 44 O H || —c—c—x2—r4 R3 5 hvor X2( R3 og R4 er som defineret i krav 1.

4. Forbindelse ifølge krav 1, hvori: 10. er O; og Z er et ligekædet eller forgrenet C2-Ce-a1kyl eller -alkenyl, hvori alkyl eller alke-nylkæden er substitueret i en eller flere positioner med An, C3-C8-cycloalkyl, C3-Cs-cycloalkyl forbundet med en CrCe-aikyl eller en C2-Ce-alkenylkæde eller Ar2. 15

5. Forbindelse ifølge ethvert af de foregående krav til medicinsk anvendelse.

6. Forbindelse ifølge ethvert af de foregående krav til anvendelse i forbindelse med en neurologisk sygdom. 20

7. Farmaceutisk sammensætning omfattende en forbindelse ifølge ethvert af de foregående krav og en farmaceutisk acceptabel bærer. !

8. Farmaceutisk sammensætning ifølge krav 7, omfattende en neurotrofisk ef-25 fektiv mængde af en ikke-immunosuppressiv forbindelse og en farmaceutisk acceptabel bærer, hvori den ikke-immunosuppressive forbindelse har formlen: cv-

30 I sA, ° DK 176489 B1 45 hvori Y og Z er som defineret i krav 1.

9. Farmaceutisk sammensætning ifølge krav 7, omfattende en neurotrofisk effektiv mængde af en ikke-immunosuppressiv forbindelse og en farmaceutisk 5 acceptabel bærer, hvori den ikke-immunosuppressive forbindelse har formlen: evs ° 15 hvori Y og Z er som defineret i krav 2.

10. Farmaceutisk sammensætning ifølge krav 7, omfattende en neurotrofisk effektiv mængde af en ikke-immunosuppressiv forbindelse og en farmaceutisk 20 acceptabel bærer, hvori den ikke-immunosuppressive forbindelse har formlen Ογ, 25 lo hvori Y og Z er som defineret i krav 3. 30 DK 176489 B1 46

10 X2 er O eller NRs, hvor R5 udvælges fra gruppen, som består af hydrogen, ligekædet eller forgrenet CrCe-alkyl og ligekædet eller forgrenet C2-C6-alkenyl; R4 udvælges fra gruppen, som består af phenyl, benzyl, ligekædet eller forgrenet CrC5-alkyl, ligekædet eller forgrenet C2-C5-alkenyl, ligekædet eller forgre-15 net CrCs-alkyl substitueret med phenyl og ligekædet eller forgrenet C2-Cs-alkenyl substitueret med phenyl; eller farmaceutisk acceptable salte eller hydrater deraf.

11. Farmaceutisk sammensætning ifølge krav 7, omfattende en neurotrofisk effektiv mængde af en ikke-immunosuppressiv forbindelse og en farmaceutisk acceptabel bærer, hvori den ikke-immunosuppressive forbindelse har formlen 0 10 hvori Y og Z er som defineret i krav 4. 15

12. Farmaceutisk sammensætning ifølge ethvert af kravene 7-11 til fremme af nervevækst eller regenerering til behandling af en neurologisk lidelse eller til fo- i rebyggelse af neurodegeneration.

13. Farmaceutisk sammensætning ifølge ethvert af kravene 7-11 til stimulering af væksten af beskadigede perifere nerver. i

14. Farmaceutisk sammensætning ifølge krav 12, hvori den neurologiske lidelse udvælges fra gruppen bestående af perifere neuropatier, neurologiske neu- 25 ropatier i forbindelse med neurodegeneration, Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom og amyotrofisk lateral sklerose.

15. Fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse ifølge ethvert af kravene 1-6, omfattende at lade den tilsvarende L-prolinmethylester reagere med den j 30 tilsvarende methyloxalylchlorid.

16. Fremgangsmåde ifølge krav 15, hvori forbindelsen er som defineret i krav 4. DK 176489 B1 47

17. Fremgangsmåde ifølge krav 15 eller 16, som yderligere omfatter dannelsen af et mellemprodukt ved at lade produktet ifølge krav 15 eller krav 16 omsætte med en carbonnukleofil forbindelse.

18. Fremgangsmåde ifølge krav 17, der yderligere omfatter omsætning af mel lemproduktet med en alkohol, et amid eller en beskyttet aminosyrerest. i