DK173366B1 - Fremgangsmåde til isolering og rensning af hirudin fra komplekse og saltholdige opløsninger - Google Patents
Fremgangsmåde til isolering og rensning af hirudin fra komplekse og saltholdige opløsninger Download PDFInfo
- Publication number
- DK173366B1 DK173366B1 DK198806306A DK630688A DK173366B1 DK 173366 B1 DK173366 B1 DK 173366B1 DK 198806306 A DK198806306 A DK 198806306A DK 630688 A DK630688 A DK 630688A DK 173366 B1 DK173366 B1 DK 173366B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- hirudin
- complex
- acetic acid
- isolating
- saline solutions
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Extrusion Moulding Of Plastics Or The Like (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Magnetic Heads (AREA)
- Cable Accessories (AREA)
- Insulated Conductors (AREA)
- Two-Way Televisions, Distribution Of Moving Picture Or The Like (AREA)
- Communication Cables (AREA)
- Professional, Industrial, Or Sporting Protective Garments (AREA)
- Seal Device For Vehicle (AREA)
- Orthopedics, Nursing, And Contraception (AREA)
- Graft Or Block Polymers (AREA)
Description
i DK 173366 B1 π
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til isolering og rensning af hirudin fra komplekse og saltholdige opløsninger ved hydrofob chromatografi.
Ved det oprindeligt fra blodiglen Hirudo medicinalis 5 isolerede polypeptid hirudin drejer det sig om en høj specifik thrombininhibitor med bredt terapeutisk potentiale (P. Mark-wardt, Biomed. Biochim. Acta 44 (1985) 1007 - 1013) . De nødvendige mængder kan dog kun fremstilles ad genteknologisk vej over transformerede mikroorganismer. I den forbindelse 10 har det vist sig, at gæren Saccharomyces cerevisiae er egnet som værtsorganisme til fremstilling af korrekt foldet og fuldt aktiv hirudin (europæiske offentliggørelsesskrifter nr. 168.342, og 200.655). Secernering af proteinet giver koncentrationer på op til nogle hundrede milligram hirudin 15 pr. liter kulturfiltrat. I hvert tilfælde kan der kun opnås et stort udbytte af proteiner, når der ved gærfermentering anvendes komplekse næringsmedier indeholdende gærekstrakt, majsstøbevand, pepton eller kødpastaer, således at der ved oprensningen af proteinet opstår det problem at isolere 20 hirudin, som foreligger i stor fortynding i en blanding af proteinagtige ledsagestoffer. Ionbytterchromatografi som beskrevet i forbindelse med isoleringen af hirudinet ud fra igleekstrakter (P. Walsmann og F. Markwardt, Thromb. Res.
40 (1985) 563-570), er på grund af det høje saltindhold i de 25 anvendte næringsopløsninger udelukket som primært trin. Også den sædvanligvis praktiserede fremgangsmåde med ultrafiltrering til afsaltning og koncentrering af proteinopløsningen har betydelige ulemper. Således kræves dyrt apparatmæssigt udstyr, der sætter grænser for masseproduktionen ved den 30 lange procesvarighed, og ved tilsætningen fremmes tendensen til udfældning af næringsmediets indholdsstoffer, hvilket igen resulterer i tekniske vanskeligheder.
Fra europæisk offentliggørelsesskrift nr. 49.847 r kendes en fremgangsmåde til rensning af a-amylaseinhibitoren 35 fra kulturfiltrater af Streptomyces tendae under anvendelse af adsorptionsharpikser. En fremgangsmåde til rensning af DK 173366 B1 2 proinsulin med "Amberlite XAD"-harpikser under anvendelse af vandige elueringsmidler med et indhold af 10 til 30% acetone eller acetonitril beskrives i europæisk offentliggørelsesskrift nr. 197.764.
5 Opfindelsen har det formål at udvikle en fremgangs måde, hvormed det er muligt ud fra komplekse gærkulturfiltrater ved hydrofob chromatografi at isolere hirudin på enkel måde og i godt udbytte.
Denne opgave løses ifølge opfindelsen ved, at den 10 hydrofobe chromatografi gennemføres på porøse adsorberharpik-ser med en porediameter på 50 til 5000 Å og en specifik overflade på mindst 50 m2/g under anvendelse af en 10 til 40%'s opløsning af et eller flere med vand blandbare organiske opløsningsmidler som elueringsmiddel.
15 Som porøse adsorberharpikser anvendes fortrinsvis copolymere af styren og divinylbenzen, såsom "Diaion HP 10, 20, 30, 40, 50", eller copolymere af acrylatestere og divinylbenzen, såsom "Amberlite XAD-7 og 8", især "Diaion HP 20" og "Amberlite XAD-7". Som med vand blandbare organiske op-20 løsningsmidler kan nævnes f.eks. methanol, ethanol, n-pro-panol, isopropanol og acetone. Det foretrækkes at anvende en opløsning af et med vand blandbart organisk opløsningsmiddel .
Gennemførelsen af den her omhandlede fremgangsmåde 25 kan ske såvel i form af en batch- som en søjlechromatografi. Harpiksen ligevægtsindstilles i forvejen med en vandig puffer eller en opløsning af en organisk syre, såsom 0 til 0,2 M eddikesyre. Den hirudin-holdige prøveopløsning, især kulturfiltrat af Saccharomyces cerevisiae, indstilles til en pH-30 værdi på fra 2-8, fortrinsvis 3-5, og bringes i kontakt med harpiksen. Efter fuldstændig binding af hirudinet vaskes harpiksen med en vandig puffer (pH-værdi 2-9), f.eks. tris, ethylendiamin, og/eller en opløsning af en organisk syre, f.eks. 0 til 0,2 M eddikesyre. Elueringen sker derpå ved 35 hjælp af en 10-40%’s opløsning af et med vand blandbart organisk opløsningsmiddel. Den vandige del af elueringsmidlet
I I
DK 173366 B1 3 kan bestå af en vandig puffer, en opløsning af en organisk syre, såsom eddikesyre, eller vand. Fortrinsvis anvendes dog opløsninger af 20-3 0%'s isopropanol med 0 til 0,1 M eddikesyre for at opnå saltfrie elueringsmidler.
5 Fremgangsmåden er på analog måde egnet til opnå hi rudin, som er saltfri, ud fra saltholdige opløsninger, f.eks. ionbytterelueringsmidler.
Opfindelsen finder anvendelse til rensning af rekom-binante hirudiner, især sådanne, som bringes til udtryk i 10 Saccharomyces cerevisiae. Ved hirudiner forstås peptidagtige thrombinhibitorer med en specifik aktivitet på mindst 10000 AT-U/mg, som er afledt af de kendte isohirudiner fra arten Hirudo medicinalis og udviser væsentlige strukturkendetegn som disse, især den karakteristiske sammenknytning af de 15 tre disulfidbroer (J. Dodt med flere, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366 (1985) 379-385) (se f.eks. europæisk offentlig gørelsesskrift nr. 158.564, europæisk offentliggørelsesskrift nr. 168.342, tysk offentliggørelsesskrift nr. 3.445.-517, europæisk offentliggørelsesskrift nr. 193.175, europæisk 20 offentliggørelsesskrift nr. 200.655, europæisk offentliggørelsesskrift nr. 158.986, europæisk offentliggørelsesskrift nr. 209.061, tysk offentliggørelsesskrift nr. 3.342.139 og europæisk offentliggørelsesskrift nr. 171.024). Især forstås der ved hirudiner de i europæiske offentliggørelsesskrifter 25 nr. 171.024, 158.95^bg 209.061 beskrevne.
Den her omhandlede fremgangsmåde udmærker sig ved, at hirudin fra komplekse og saltholdige opløsninger, f.eks. komplekse gærkulturfiltrater, kan bindes kvantitativt til adsorberharpikser, uden at det får indflydelse på tertiær-30 strukturen og aktiviteten. Ved eluering med vandige opløsninger under tilsætning af med vand blandbare organiske opløsningsmidler kan hirudinet fås beriget i en saltopløsning eller i en uklarhedsfri opløsning, som direkte, f.eks. ved ionbytterchromatografi, kan videreforarbejdes.
35 De efterfølgende eksempler tjener til nærmere belys ning af opfindelsen.
DK 173366 B1 4
Eksempel 1
Der tages kulturmedium fra fermenteringen af en gærstamme af arten Saccharomyces cerevisiae, som svarer til Mata-mating-typen og med gær-hirudin-ekspressionsplasmid 5 transformeres der ved en analogifremgangsmåde ifølge Brake med flere, PNAS, bind 81, (1984) 4632-4646.
950 1 Kulturfiltrat af Saccharomyces cerevisiae indeholdende 20 g/1 gærekstrakt og 12 mg/1 hirudin hældes over en søjle af 100 1 "Diaion HP 20", ligevægtsindstillet med 10 20 mM eddikesyre. Efter påføringen vaskes der efter med 1000 1 50 mM Tris/HCl pH 8,5, efterfulgt af 300 1 20 mM eddikesyre. Derpå elueres der med 300 1 20 mM eddikesyre, indeholdende 20% isopropanol, efterfulgt af 500 1 20 mM eddikesyre, indeholdende 30% isopropanol. Elueringsmidlerne 15 fraktioneres og analyseres for deres hirudinindhold. Tre fraktioner (150 1) forenes og opnår 9,5 g hirudin svarende til et udbytte på 84%. Denne eddikesure opløsning indstilles derpå med 1 M piperazin til pH 6,0 og omrøres med 10 kg Matrex "Cellufine AM", ligevægtsindstillet med 20 mM pipe-20 razin (pH 6,0). Derved bindes hirudinet kvantitativt til ionbytteren. Materialet vaskes med 20 mM piperazin (pH 6,0) og fyldes i en søjle. Ved eluering med en saltgradient af 0 til 0,3 M NaCl i den samme puffer fås 6,7 g hirudin højbe-riget og koncentreret i 6 1 opløsning.
25
Eksempel 2 1,2 1 af et ionbyttereluat indeholdende 2,0 g hirudin, 20 mM piperazin (pH 6,0) og 200 mM NaCl gøres sur på 0,1 M eddikesyre og hældes med en strømningshastighed på 400 ml/h 30 over en søjle af 100 ml "Diaion HP 20" i 0,1 M eddikesyre. Efter endt prøveoptagelse vaskes harpiksen saltfri med 10 mM eddikesyre. Elueringen sker derpå ved en strømningshastighed på 200 ml/h med 30% isopropanol i 10 mM eddikesyre. Hirudinet opfanges i et samlet volumen på 200 ml. Efter 35 frysetørring af opløsningen resterer 1,7 g saltfrit hirudin.
! i DK 173366 B1 5
Eksempel 3 754 1 kulturfiltrat af Saccharomyces cerevisiae med et indhold af 27,2 g hirudin indstilles med 4,9 1 eddikesyre til pH 4 og omrøres med en suspension af 75 kg "Diaion HP 5 20" i 75 1 30%'s isopropanol. Efter 30 minutter frafiltreres kulturfiltratet over en tryksuger og kastes bort. Den i filteret resterende adsorberharpiks vaskes med 700 1 20 mM tris/HCl pH 8,5 og 250 1 0,1 M eddikesyre. Derpå elueres hirudinet ved ti på hinanden følgende vaskninger med hver 10 især 50 1 30%'s isopropanol i 20 mM eddikesyre. Eluaterne analyseres på deres hirudinindhold. Fire fraktioner (195 1) forenes og indeholder 22,6 g hirudin svarende til et udbytte på 83%.
Claims (3)
1. Fremgangsmåde til isolering og rensning af hirudin fra komplekse og saltholdige opløsninger ved hydrofob chroma-t ograf i, kendetegnet ved, at den hydrofobe chroma-5 tografi gennemføres på porøse adsorberharpikser med en porediameter på 50 til 5000 Å og en specifik overflade på mindst 50 m^/g under anvendelse af en 10 til 40%'s opløsning af et eller flere med vand blandbare organiske opløsningsmidler som elueringsmiddel.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at der som porøse adsorberharpikser anvendes copolymere af styren og divinylbenzen eller copolymere af acrylatestere og divinylbenzen.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kende-15 tegnet ved, at der som med vand blandbare organiske opløsningsmidler anvendes methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol og acetone. v 3 ! i
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3738541 | 1987-11-13 | ||
| DE19873738541 DE3738541A1 (de) | 1987-11-13 | 1987-11-13 | Verfahren zur isolierung und reinigung von hirudin |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK630688D0 DK630688D0 (da) | 1988-11-11 |
| DK630688A DK630688A (da) | 1989-05-14 |
| DK173366B1 true DK173366B1 (da) | 2000-08-14 |
Family
ID=6340409
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK198806306A DK173366B1 (da) | 1987-11-13 | 1988-11-11 | Fremgangsmåde til isolering og rensning af hirudin fra komplekse og saltholdige opløsninger |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5095092A (da) |
| EP (1) | EP0316650B1 (da) |
| JP (1) | JP2756279B2 (da) |
| AT (1) | ATE100109T1 (da) |
| DE (2) | DE3738541A1 (da) |
| DK (1) | DK173366B1 (da) |
| ES (1) | ES2049238T3 (da) |
| IE (1) | IE62538B1 (da) |
| PT (1) | PT88975B (da) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5268296A (en) * | 1988-06-11 | 1993-12-07 | Ciba-Geigy Corporation | DNA vector and recombinant host cell for production of hirullin P6 and P18 |
| DE3835815A1 (de) * | 1988-10-21 | 1990-04-26 | Hoechst Ag | Neue isohirudine |
| DE4140381A1 (de) * | 1991-12-07 | 1993-06-09 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt, De | Neue synthetische isohirudine mit verbesserter stabilitaet |
| DE4404168A1 (de) * | 1994-02-10 | 1995-08-17 | Hoechst Ag | Hirudinderivate und Verfahren zu deren Herstellung |
| KR0141651B1 (ko) * | 1994-09-07 | 1998-06-15 | 강재헌 | 금속이온 친화성 크로마토그라피를 이용한 히루딘의 정제방법 |
| DE10108211A1 (de) * | 2001-02-20 | 2002-08-22 | Aventis Pharma Gmbh | Verwendung von Fusionsproteinen, deren N-terminaler Anteil aus einem Hirudinderivat besteht, zur Herstellung rekombinanter Proteine über Sekretion durch Hefen |
| US7638618B2 (en) | 2001-02-20 | 2009-12-29 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Nucleic acids encoding a hirudin and pro-insulin as superscretable peptides and for parallel improvement of the exported forms of one or more polypeptides of interest |
| US7122641B2 (en) * | 2001-12-21 | 2006-10-17 | Immunex Corporation | Methods for purifying protein |
| US7795205B2 (en) | 2004-04-12 | 2010-09-14 | Canyon Pharmaceuticals, Inc. | Methods for effecting regression of tumor mass and size in a metastasized pancreatic tumor |
| AU2005265960B8 (en) * | 2004-06-29 | 2012-01-12 | Reliance Life Sciences Pvt Ltd | Process for improvement of virus-safe biological fluids |
| CN107001411B (zh) * | 2014-12-15 | 2021-07-23 | 默克专利股份公司 | 从粗溶液捕获靶分子 |
| CN107353338B (zh) * | 2017-07-27 | 2020-11-17 | 宁波博睿修存生物科技有限公司 | 一种分离水蛭素发酵液中色素分子的方法 |
| CN113984936A (zh) * | 2021-12-09 | 2022-01-28 | 车延柠 | 一种水蛭酶解多肽的lc-ms特征图谱、检测方法及其应用 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES8207217A1 (es) * | 1980-10-09 | 1982-09-01 | Hoechst Ag | Procedimiento para la preparacion de un inactivador de alfa-amilasa |
| DE3342139A1 (de) * | 1983-11-22 | 1985-05-30 | Ciba-Geigy Ag, Basel | Desulfatohirudine, verfahren zu ihrer herstellung und pharmazeutische mittel |
| DE3438296A1 (de) * | 1984-04-18 | 1985-11-07 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Neue polypeptide mit blutgerinnungshemmender wirkung, verfahren zu deren herstellung bzw. gewinnung, deren verwendung und diese enthaltende mittel |
| DE3429430A1 (de) * | 1984-08-10 | 1986-02-20 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
| US4616078A (en) * | 1985-04-08 | 1986-10-07 | Eli Lilly And Company | Process for purifying proinsulin-like materials |
| FR2593518B1 (fr) * | 1985-05-02 | 1989-09-08 | Transgene Sa | Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees |
| US4617376A (en) * | 1985-07-01 | 1986-10-14 | Eli Lilly And Company | Process for recovering glucagon from pancreas glands |
| EP0209061B1 (de) * | 1985-07-17 | 1994-01-12 | Hoechst Aktiengesellschaft | Neue Polypeptide mit blutgerinnungshemmender Wirkung, Verfahren zu deren Herstellung bzw. Gewinnung, deren Verwendung und diese enthaltende Mittel |
| DE3526995A1 (de) * | 1985-07-27 | 1987-02-05 | Hoechst Ag | Fusionsproteine, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
-
1987
- 1987-11-13 DE DE19873738541 patent/DE3738541A1/de not_active Withdrawn
-
1988
- 1988-11-02 ES ES88118182T patent/ES2049238T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-11-02 AT AT88118182T patent/ATE100109T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-11-02 EP EP88118182A patent/EP0316650B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-11-02 DE DE88118182T patent/DE3887095D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-11-10 PT PT88975A patent/PT88975B/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-11-11 IE IE339388A patent/IE62538B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-11-11 DK DK198806306A patent/DK173366B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-11-11 JP JP63284093A patent/JP2756279B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-09-27 US US07/590,581 patent/US5095092A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0316650B1 (de) | 1994-01-12 |
| ES2049238T3 (es) | 1994-04-16 |
| ATE100109T1 (de) | 1994-01-15 |
| PT88975A (pt) | 1989-11-30 |
| DE3887095D1 (de) | 1994-02-24 |
| JP2756279B2 (ja) | 1998-05-25 |
| EP0316650A2 (de) | 1989-05-24 |
| IE62538B1 (en) | 1995-02-08 |
| DK630688D0 (da) | 1988-11-11 |
| DE3738541A1 (de) | 1989-05-24 |
| EP0316650A3 (en) | 1990-07-25 |
| IE883393L (en) | 1989-05-13 |
| JPH01165599A (ja) | 1989-06-29 |
| DK630688A (da) | 1989-05-14 |
| PT88975B (pt) | 1994-11-30 |
| US5095092A (en) | 1992-03-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK173366B1 (da) | Fremgangsmåde til isolering og rensning af hirudin fra komplekse og saltholdige opløsninger | |
| JP3085973B2 (ja) | 組換え酵母による成熟タンパク質の分泌に関するシグナルペプチドについてコードする配列として新規ｄｎａ断片の適用、発現カセット、形質転換酵母及びそれに対応するタンパク質の製造方法 | |
| CA1315229C (en) | Chromatographic purification process | |
| KR940000758B1 (ko) | 혈액응고 억제작용을 갖는 폴리펩티드의 분리 및 제조방법 | |
| DE3382821T2 (de) | Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit der Proteasehemmenden Aktivität von Säugetier-alpha-1-Antitrypsin | |
| EP0734393B1 (en) | Method for purifying polypeptides | |
| US4760130A (en) | Serine protease inhibitors and methods for isolation of same | |
| AU625375B2 (en) | Novel polypeptides with an anticoagulant activity | |
| JPH0231687A (ja) | 血清アルブミンの純化方法 | |
| Bagdy et al. | Large scale preparation of hirudin | |
| CA2052455C (en) | Teicoplanin recovery process | |
| US5268296A (en) | DNA vector and recombinant host cell for production of hirullin P6 and P18 | |
| Van-Seuningen et al. | Separation of the two domains of human mucus proteinase inhibitor: Inhibitory activity is only located in the car☐ y-terminal domain | |
| US4677192A (en) | Process for the separation of mixtures of insulin, insulin derivatives and, where appropriate, impurities | |
| EP1306383B1 (en) | Method of purifying a calcium ion-binding protein | |
| US5698104A (en) | Purification process for hirudin using affinity chromatography | |
| Lehman et al. | A novel process for the large-scale purification of recombinant tick anticoagulant peptide using perfusion chromatography | |
| DE2509482C2 (de) | Verfahren zur Herstellung des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors aus Rinderlunge | |
| US7608583B2 (en) | Process for the extraction and isolation of insulin from recombinant sources | |
| JP2869417B2 (ja) | 遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミン | |
| JPS5836387A (ja) | プロリンイミノペプチダ−ゼおよびその製造法 | |
| KR20030092504A (ko) | 발효액으로부터 테이코플라닌ａ₂의 회수방법 | |
| Okada et al. | Demonstration of the universality of the genetic code in vivo by comparison of the coat proteins synthesized in different plants by tobacco mosaic virus RNA | |
| EP0446850A2 (en) | Process for purifying recombinant human beta-interferon | |
| WO1993025229A1 (en) | A method for purifying recombinant tap |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B1 | Patent granted (law 1993) | ||
| PUP | Patent expired |