PT88975B

PT88975B - Processo para o isolamento e purificacao de hirudina

Info

Publication number: PT88975B
Application number: PT88975A
Authority: PT
Inventors: Paul Habermann; Dominique Tripier; Peter Crausse; Werner Badziong
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1987-11-13
Filing date: 1988-11-10
Publication date: 1994-11-30
Also published as: EP0316650B1; ES2049238T3; ATE100109T1; PT88975A; DE3887095D1; JP2756279B2; EP0316650A2; IE62538B1; DK630688D0; DE3738541A1; DK173366B1; EP0316650A3; IE883393L; JPH01165599A; DK630688A; US5095092A

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 88 975

REQUERENTE: HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT, alemã, com sede em D-6230 Frankfurt am Main 80, República Federal Alemã.

EPÍGRAFE: ’’ PROCESSO PARA 0 ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO

DE HIRUDINA .

INVENTORES: Dr.Werner Badziong, Dr.Peter Crause,Dr.Paul

Habermann e Dr.Dominique Tripier.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

República Federal Alemã em 13 de Novembro de 1987, sob o n^e . P 3738 541.0.

INP». MOO. 113 R F 16732

Memória descritiva referente à patente de invenção de HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT, alemã, industriai e comerciai, com sede em D—623O Frankfurt am Main 8θ, República Federal Alema, (inventores: Dr. Werner Badziong, Dr. Peter Crause, Dr. Paul Ha— bermann e Dr. Dominique Tri—pier, residentes na Alemanha Ocidental), para PROCESSO PARA 0 ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO DE HIRUDINA.

MEMÓRIA DESCRITIVA

A invenção refere-se a um processo para o iso lamento e purificação de hirudina a partir de filtrados de cul tura complexos e de soluçoes salinas.

O polipéptido hirudina isolado originariamen— te a partir da sanguessuga Hirudo medicinalis trata—se de um inibidor da trombina de elevada especificidade com um largo potencial terapêutico (I. Markwnrdt, Biomed. Biochim. Acta 44 (1985), 1007—1013· As quantidades necessárias só podem contudo preparar—se por meio de engenharia genética através de mi— croorganismos transformados. Para tal fim verificou-se ser ade quado como microorganismo hospedeiro a levedura Saccharomyces cervisiae para produzir uma hirudina correcta e totalmente activa (EP Al 168 342, EP Al l68 342, EP Al 2OO655). A decomposição da proteina dé origens a concentrações de atê algumas

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centenas de miligramas de hirudina por litro de filtrado de cultura· Por outro lado, sé se consegue atingir um elevado ren dimento da proteina, quando na fermentaÇao se utilizam meios nutrientes complexos com a adiçao de extracto de levedura, ce reais, peptona ou pasta de carne, de modo que a purificação da proteína poe o problema do isolamento da hirudina altamen— te diluída a partir de misturas com outros componentes protei cos. A cromatografia de permuta iónica, tal como descrita para o isolamento da hirudina a partir de extractos de sanguessuga (P. Walsmen e F. Markwardt, Tromb. Res. 40 (1985), 5^3— —570), elimina—se à partida devido ao elevado teor salino das soluçoes nutrientes utilizadas. Também o processo habitualmen te praticado da'ultrafiltraçao para dessalinizaçao e concentração da solução de proteína tem consideráveis desvantagens. Para tal sao necessários equipamentos operacionais dispendiosos, a produção em massa ê limitada peia longa duraçao dos pro cessos e hê uma tendência para a precipitaÇao de constituintes do meio nutriente com o enriquecimento da mistura, de que resultam mais uma vez dificuldades técnicas.

Da patente EP A2 049 847 conhece—se um proces so para a purificaÇao do inibidor de amilase a partir de fil trados de cultura de Streptomyces tendae utilizando resinas de adsorçao. Na EP A2 197764 encontra—se descrito um processo (K) para a purificaÇao de proinsulina por meio de resinas ^4mberlite XAD utilizando eluentes aquosos com um teor de 10 a 3θ/“ de acetona ou de acetonitrilo.

objectivo da invenção ê o de desenvolver um processo com o qual seja possível isolar hirudina a partir de filtrados de cultura de levedura complexos, de um modo simples e com bom rendimento.

Este objectivo atinge—se, de acordo com a invenção, com o processo para o isolamento e purificaÇao de hi— rudina a partir de soluçoes complexas e salinas por meio de cromatografia hidrofóbica, caracterizado por se efectuar acro

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matografia hidrofóbica em resinas adsorventes porosas com um diâmetro de poros de 5θ a 5000 X e uma área específica de pelo menos 50 m^/g utilizando uma solução de 10 a 40% de um ou mais solventes orgânicos miscíveis com água como eluente.

Como resinas adsorventes porosas utilizam—se de preferência copolimeros de estireno e diviniibenzeno, como por exemplo aion HP 10, 20, 30, 40, 50, ou copolimeros de éster acrílico e divinilbenzeno, como por exemplo ^Amberiite XAD—7 e 8, em especial ^liaion HP 20 e ®Amberlite XAD—7- Como solventes orgânicos miscíveis com água referem—se por exemplo metanol, etanol, n—propenoi, isopropanol e acetona· Utiliza— —se de preferência uma solução de um solvente orgânico miscí— vel com água.

A execução do processo de acordo com a invenção pode efectuar—se tanto na forma de uma cromatografia descontínua como em coluna. Pré-équilibra-se a resina com um tampao aquoso ou com uma solução de um ácido orgânico, como por exemplo ácido acético de 0 a 0,2 Μ. A solução de carga rica em hirudina, em particular o filtrado de cultura de Saccharo— myces cerevisiae, ajusta—se a um pH de 2 a 8, de preferência de 3 a 5, e poe—se em contacto com a resina. Após ligaçao total da hirudina lava-se a resina com um tampao aquoso (pH 2 a 9), por exemplo Tris, etiienodiamina e/ou uma solução de um ácido orgânico, por exemplo ácido acético 0 a 0,2 M. Efectua— —se então a eluição com uma solução de 10 a 40% de um solvente orgânico miscivel com água- A parte aquosa do eluente pode ser constituida por um tampao aquoso, por uma solução de um ácido orgânico, como por exemplo ácido acético, ou por água. Utilizam—se contudo de preferência soluçoes de isopropanol 20 a 30% com ácido acético 0 a 0,1 M, de modo a obterem—se eiuí— dos isentos de sai.

processo ê iguaimente apropriado para obter hirudina a partir de soluçoes salinas, por exemplo de eiuídos de permuta ióniea, na forma isenta de sal.

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A invenção aplica-se a purificação de hirudi— nas recombinantes, em particular das que se exprimiram em Sac charomyces cerevisiae. Por hirudinas entendem—se os inibidores de trombina peptídicos com uma actividade específica de pe lo menos 10000 AT—U/mg, derivadas das conhecidas iso—hirudinas da espécie Hirudo medicinalis e que apresentam de facto as características estruturais destas, em especial a ligaçao caractzrística das três pontes de dissulfureto (J. Dodt et al. Biol. Chem. Hoppe—Seyler 366 (1985), 379—385) ( vide por exemplo EP Al 158 564, EP Al 168 342, DE 344 5517 Al, EP A2193175, EP Al 200655, EP Al 158 986, EP Al 209 06l, DE 3342139, EP Al 171024 ).

Entendem—se em particular como hirudinas as descritas nas EP Al 171 024, EP Al 158986 e EP Al 209061 processo de acordo com a invenção distingue -se por se poder ligar a hirudina à resina adsorvente de forma quantitativa, a partir de soluçoes complexas e salinas, por exemplo de filtrados de cultura complexos, sem haver prejuizo da estrutura terciária ou da actividade. Por meio de eluição com soluçoes aquosas utilizando solventes orgânicos miscíveis com água, pode obter—se a hirudina enriquecida em soluçoes isentas de sais e de contaminantes insolúveis, que pode ser por exemplo posteriormente tratada directamente por cromatografia de permuta iónica.

Os exemplos seguintes destinam—se a ilustrar mais detalhadamente a invenção, sem contudo a limitarem.

Exemplo 1

Toma—se um meio de cultura da fermentação de uma estirpe de levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae, correspondente ao tipo Mat—Q(— mating e transformada com um pias mídeo de expressão levedura—hirudina por um processo análogo ao de Brake et al., PNAS, vol. 8l, (1984), 4632—4646.

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Carregaram—se 950 1 de filtrado de cultura de Saccharomyces cerevisiae, contendo 20 g/1 de extracto de leve dura e 12 mg/1 de hirudina, numa coluna de 100 1 de aion HP20 , equilibrada com ácido acético 20 mM. Apôs a carga lavou —se com 1000 1 de Tris/HCl 50 mM, pH 8,5, seguido por 300 1 de ácido acético 20 mM. Eluiu—se depois com 300 1 de ácido acético 20 raM, contendo 20% de isopropanol, seguido por 500 1 de ácido acético 20 mM, contendo 30% de isopropanol. Fraccionaram—se os eluidos e anaiisaram—se em relaçao ao seu teor em hirudina. Reuniram—se as fracçóes (150 l) e verificou—se que continham 9,5 g de hirudina correspondente a um rendimento de 84%. A solução de ácido acético ajustou—se depois a pH 6,0 com piperazina 1 M e agitou—se com 10 Kg de Matrex 'Cellufine AM, equilibrada com piperazina 20 mM (pH 6,0). Com isto conseguiu —se ligar a hirudina quantitativamente ao permutador iónico. Lavou—se o material com piperazina 20 mM (pH 6,0) e carregou—se numa coluna. Por eluiçao com um gradiente salino de 0 a 0,3 M de cloreto de sódio no mesmo tampao puderam obter-se

6,7 g de hirudina aitamente enriquecida e concentrada em 6 1 de solução.

Exemplo 2

Acidificaram—se com ácido acético 0,1 M 1,2 1 de um eluido de permuta iónica contendo 2,0 g de hirudina, pi perazina 20 mM (pH 6,0) e NaCl 200 mM, e carregaram—se com um fluxo de 400 mi/h numa coluna de 100 ml de «ti aion HP 20 em ácido acético 0,1 M. Após a toma das amostras lavou—se a resi na com ácido acético 10 mM para remover o sai. Efectuou-se en tao a eluiçao com um fluxo de 200 ml/h com 3θ% de isopropanol em ácido acético 10 mM. Recolheu—se a Hirudina num volume total de 200 ml. Após liofilizaçao da solução obtiveram—se 1,7g de hirudina isenta de sal.

Exemplo 3

Levaram-se a pH 4, com 4,9 1 de ácido acético,

75^ 1 de filtrado de cultura de Sacchromyces cerevisiae comum teor de 27,2 g de hirudina> e agitaram-se com uma suspensão de 75 Kg de aion HP 20 em 75 1 de isopropanol a 3θ%· Apôs 3θ minutos filtrou—se o filtrado de cultura através de um filtro sob pressão e rejeitou—se. A resina adsorvente retida no filtro lavou—se com 70θ 1 de Tris/HCl 20 mM, pH 8,5 e 250 i de ácido acético 0,1 M. Eluiu-se depois a hirudina por meio de dez lavagens consecutivas com 5θ 1 de cada vez de 30% de isopropanol em ácido acético 20 mM. Analisou—se o eluido em re— iaçao ao seu teor em hirudina. Recolheram—se quatro fracções (195 1) que continham 22,6 g de hirudina, correspondentes a um rendimento de 83%·

Claims

REIVINDICAÇÕES

Processo para o isolamento e purificação de hirudina (polipêptido inibidór da trombing) a partir de soluções complexas e salinas, por meio de cromatografia hidrofôbi ca, caracterizado por se efectuar a cromatografia hidrofôbica em resinas adsorventes porosas com um diâmetro de poros de 5θ a 5000 X e uma área específica de pelo menos 50 m^/g, utilizando como eluente uma solução de 10 a 40% de um ou mais solventes orgânicos miscíveis com água.

- 2a Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se utilizarem como resinas adsorventes poro—

- 6 sas copolímeros de estireno e divinilbenzeno ou copolímeros de éster acrílico e de divinilbenzeno.

- Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por se utilizarem como solventes orgânicos miscíveis com água, metanol, etanol, n-propanol, isopropanol e acetona.

A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na República Federal Alemã em 15 de Novembro de 198?, sob o ns P 59 58 541.0.