DK170343B1

DK170343B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af forbindelser beslægtet med avermectiner

Info

Publication number: DK170343B1
Application number: DK627088A
Authority: DK
Inventors: Christopher James Dutton; Stephen Paul Gibson; Shin-Jen Edward Lee
Original assignee: Pfizer Ltd
Priority date: 1987-11-14
Filing date: 1988-11-10
Publication date: 1995-08-07
Also published as: PT88991B; JP2854869B2; ATE85796T1; EP0317148A2; GB8726730D0; EP0317148B1; DE3878535T2; US5702924A; EP0317148A3; JPH01160983A; DK627088A; IE61513B1; IE883399L; US6362168B1; ES2053764T3; DK627088D0; PT88991A; DE3878535D1

Description

i DK 170343 B1

Denne opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte forbindelser beslægtet med avermecti-ner, men med en hidtil ukendt substituentgruppe ved 25-stillingen. Disse forbindelser er antiparasitiske midler.

5

Avermectinerne er en gruppe af bredspektrede antiparasitiske midler, hidtil omtalt som C-076-forbindelserne.

De produceres ved gæring af mikroorganismen Streptomyces avermitilis ATCC 31267, 31271 eller 31272 under aerobe 10 betingelser i et vandigt næringssubstrat indeholdende uorganiske salte og tilgængelige carbon- og nitrogenkil der. De morfologiske og dyrkningsmæssige egenskaber ved stammerne ATCC 31267, 31271 og 31272 er beskrevet i detaljer i GB patentskrift nr. 1 573 955, der også beskri-15 ver isoleringen og den kemiske struktur af de otte forbindelser, som udgør C-076-komplekset.

I EP patentansøgning nr. 0 214 731 angives, at det ved at tilsætte visse specifikke carboxylsyrer eller deriva-20 ter deraf til fermenteringen af en avermectinproducerende organisme er muligt at opnå hidtil ukendte forbindelser, som er beslægtet med avermectinerne, men har en unaturlig substituentgruppe ved 25-stillingen i stedet for den isopropyl- eller sekundær butylgruppe, som normalt er til 25 stede.

De således fremstillede forbindelser er karakteriseret ved, at substituentgruppen ved 25-stillingen er «-forgrenet, dvs. at carbonatomet, der er knyttet til C-25-ring-30 stillingen, er et sekundært carbonatom knyttet til yder ligere to carbonatomer. 1 EP patentansøgning nr. 0 284 176 beskrives nye mutantstammer af mikroorganismen Streptomyces avermitilis, som 35 mangler forgrenet-kæde-2-oxosyre-dehydrogenase-aktivitet.

Disse stammer er deponeret i The American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, under betegnelserne DK 170343 B1 2

Streptomyces avermitilis ATCC 53567 og ATCC 53568, i overensstemmelse med Budapest-traktatens bestemmelser.

Vi har nu fundet, at det ved anvendelse af disse nye 5 mutantstammer af Streptomyces avermitilis er muligt at , opnå en yderligere række af hidtil ukendte avermectinde-rivater, som ikke tidligere har været opnåelige, hvori C- 25-substituenten er forbundet via et uforgrenet (primært) carbonatom. De omhandlede forbindelser er højaktive anti-10 parasitiske midler, der har særlig anvendelighed som anthelmintika, ectoparasiticider, insekticider og acari-cider. Forbindelserne kan underkastes kendte kemiske omdannelsesprocesser til opnåelse af yderligere hidtil ukendte halvsyntetiske derivater.

15

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer således en fremgangsmåde til fremstilling af forbindelser med formlen (I): 20 R1 R4 <p"*3 CH3 I l r°^*CH2R2

25 o V

> °γ°

JohT

30 «^3 ^3

Ofr 35 hvori den punkterede linie i 22-23-stillingen repræsenterer en fakultativ binding, og hvori enten R1 er OH, og den fakultative binding er fraværende, eller den fakulta- DK 170343 B1 3 tive binding er til stede, og R1 er fraværende, 2 R er H, (C^-Cg)alkyl, halogen-(C^-Cg)alkyl, (Cg-Cg)cyc-loalkyl, (Cg-Cg)cycloalkenyl eller (C^-Cg)alkylthio, 5 3 R er hydrogen eller methyl, og 4 R er en 4'-(a-L-oleandrosyl)-a-L-oleandrosyloxy-gruppe med formlen:

CH. CH

CH3° CH30 15 hvilken fremgangsmåde er særegen ved, at man dyrker

Streptomyces avermitilis ATCC 53568 under tilstedeværelse 2 2 af en carboxylsyre med formlen R CH2C02H, hvori R er som defineret ovenfor, eller et salt, en ester eller et amid 20 deraf, og isolerer en eller flere forbindelser med formlen (I), hvorpå, om ønsket, en dannet forbindelse med formlen (1), hvori R er OH, og den fakultative binding er fraværende, 25 omdannes til den tilsvarende forbindelse med formlen (1), hvori den fakultative binding er til stede, og R* er fraværende, ved en dehydratiseringsreaktion under beskyttelse af hydroxygruppeme i 5- og 4"-stillingerne, efterfulgt af fjernelse af beskyttelsesgrupperne, 30 og, om ønsket, en dannet forbindelse med formlen (1), 3 hvori R er CHq, omdannes til den tilsvarende forbindelse * 3 med formlen (1), hvori R er H, ved en demethylerings-reaktion.

C-076 komplekset består af otte adskilte men tæt beslægtede forbindelser beskrevet som C-076 Ala, Alb, A2a, A2b, 35 DK 170343 B1 4

Bla, Blb, B2a og B2b. "a"-serien af forbindelser henviser til det naturlige averraectin, hvori 25-substituenten er (S)-sec-butyl og "b"-serien til den, hvori 25-substituen-ten er isopropyl. Betegnelserne HA" og "B" henviser til 5 avermectiner, hvori 5-substituenten er henholdsvis meth- t oxy eller hydroxy, og tallet "1" henviser til avermecti-ner, der har en dobbeltbinding i 22-23-stillingen, og tallet "2" til avermectiner, der er mættede i 22-23-stil-lingen og har et hydrogenatom ved 22-stillingen og en 10 hydroxygruppe ved 23-stillingen.

I denne beskrivelse er symbolerne "a" og "b" udeladt. Symbolerne Al, A2, Bl og B2 er bevaret for at henvise til ikke-naturlige avermectiner, der har strukturegenskaber 15 svarende til de naturlige avermectiner, som anført ovenfor.

2

Foretrukne forbindelser med formlen (I) er de, hvori R er methylthio eller ethylthio.

20 2 I en anden gruppe af foretrukne forbindelser er R methyl, isopropyl eller sekundær-butyl.

2 I en yderligere gruppe af foretrukne forbindelser er R 25 forgrenede Cg-Cg alkylgrupper substitueret med et eller flere halogenatomer, specielt l-(trifluorraethyl)ethyl.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan syren sættes til dyrkningen enten på podningstidspunktet eller med 30 intervaller under dyrkningen. Produktionen af forbindelserne med formlen (1) kan følges ved at udtage prøver fra dyrkningen, ekstrahere med et organisk opløsningsmiddel og følge forekomsten af forbindelser med formlen (1) ved chromatografi, f.eks. ved at anvende højtryksvæskechroma-35 tografi. Dyrkningen fortsættes, indtil udbyttet af for bindelsen med formlen (1) er maksimeret, i almindelighed i en periode på fra 12 til 16 dage.

DK 170343 B1 5

Et foretrukket niveau af hver tilsætning af carboxylsyren eller derivatet deraf er mellem 0,05 og 4,0 g pr. liter.

De bedste udbytter af forbindelser med formlen (I) opnås ved gradvis tilsætning af syren til dyrkningen, f.eks.

5 ved daglige tilsætninger af syren eller derivatet deraf over en periode på flere dage. Syren kan tilsættes som et salt, såsom natrium- eller ammoniumsaltet, eller som en ester, såsom methyl- eller ethylesteren, eller som et amid, men tilsættes fortrinsvis som den frie syre. Sub-10 straterne, der anvendes til dyrkningen, kan være konventionelle kompleksmedier indeholdende assimilerbare kilder til carbon, nitrogen og andre sporelementer.

Efter dyrkning i en periode på adskillige dage ved en 15 temperatur fortrinsvis i området fra 24 til 33 °C, centrifugeres eller filtreres dyrkningssubstratet, og myce-liekagen ekstraheres med acetone eller methanol. Ekstrakten koncentreres, og det ønskede produkt ekstraheres derpå i organiske opløsningsmidler, der ikke er blandbare 20 ®»ed vand, såsom methylenchlorid, ethylacetat, chloroform, butanol eller methylisobutyIketon. Ekstrakten inddampes, og det rå produkt indeholdende forbindelser med formlen (I) renses om nødvendigt yderligere ved chromatografi, f.eks. ved anvendelse af præparativ reversfase højtryks-25 væskechromatografi.

Produktet opnås i almindelighed som en blanding af forbindelserne med formlen (I), men mængdeforholdene kan variere afhængigt af den bestemte anvendte carboxylsyre og 30 de betingelser, der er anvendt under dyrkningen.

Vi har fundet, at en række carboxylsyrer med formlen 2 R CH2CO2H kan sættes til dyrkningen og producere avermec-tiner med en ny substituentgruppe i 25-stillingen.

35 Eksempler på bestemte syrer, som kan anvendes, inkluderer følgende: DK 170343 B1 6 methylthioeddikesyre ethylthioeddikesyre 3-methylbutansyre 3-trifluormethylbutansyre 5 3-methylpentansyre n-butansyre cyclopentaneddlkesyre og propansyre.

10 I en særlig og foretrukken udførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres dyrkningen under tilstedeværelse af methylthioeddikesyre, hvilket overvejende resulterer i forbindelsen med formlen (I), hvori R1 er OH, den 2 3 fakultative binding er fraværende, R er SCH0, R er CHQ, 4 o o 15 og R er 4’-(a-L-oleandrosyl)-a-4-oleandrosyloxy, i det følgende betegnet som 25-methylthiomethyl-avermectin A2.

I en anden foretrukken udførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres dyrkningen under tilstedeværelse af 20 propansyre, hvilket overvejende resulterer i forbindelsen med formlen (I), hvori R1 er OH, den fakultative binding λ λ i er fraværende, R er CHg, RJ er CHg, og R* er 4'-(e-L-oleandrosyl)-a-4-oleandrosyloxy, i det følgende betegnet som 25-ethyl-avermectin A2.

25 I en yderligere foretrukken udførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres dyrkningen under tilstedeværelse af 3-methylbutansyre, hvilket overvejende resulterer i forbindelsen med formlen (I), hvori R^ er fraværen- 2 30 de, den fakultative binding er til stede, R er isopro- 3 4 * pyl,R er H, og R er 4'-(a-L-oleandrosyl)-a-4-oleandro- syloxy, i det følgende betegnet som 25-isobutyl-avermec- tin Bl.

35 I en yderligere foretrukken udførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres dyrkningen under tilstedeværelse af 3-trifluormethylsmørsyre, hvilket overvejende DK 170343 B1 7 resulterer i forbindelser med formlen (I), hvori R1 er 2 OH, den fakultative binding er fraværende, R er l-(tri- 4 fluormethyl)ethyl, R er 4'-(a-L-oleandrosyl)-a-4-olean- 3 drosyloxy, og R er CH^ eller H, i det følgende betegnet 5 som henholdsvis 25-(2-trifluormethylpropyl)-avermectin A2 og B2.

Forbindelserne med formlen (1), hvori den fakultative binding er til stede, og R1 er fraværende, kan alterna-10 tivt fremstilles ud fra de tilsvarende forbindelser med formlen (I), hvori R1 er OH, og den fakultative binding er fraværende ved en dehydratiseringsreaktion. Reaktionen udføres ved først selektivt at beskytte hydroxygrupperne i 5- og 4"-stillingerne, f.eks. som t-butyldimethylsilyl-15 oxyacetylderivater, derpå omsætte med et substitueret thiocarbonylhalogenid, såsom (4-methylphenoxy)thiocarbo-nylchlorid, efterfulgt af opvarmning i et højtkogende opløsningsmiddel, f.eks. trichlorbenzen, for at opnå dehy-dratisering. Beskyttelsen fjernes derpå for at opnå det 20 umættede produkt. Disse trin samt passende reagenser og reaktionsbetingelser er beskrevet i US patentskrift nr. 4 328 335.

3

Forbindelserne med formlen (I), hvori R er H, kan også 3 25 fremstilles ud fra de tilsvarende forbindelser, hvori R er CHg, ved demethylering. Denne reaktion opnås ved at behandle 5-methoxyforbindelsen eller et passende beskyttet derivat deraf med mercuriacetat og hydrolysere den resulterende 3-acetoxyenolether med fortyndet syre for at 30 opnå den tilsvarende 5-ketonforbindelse. Denne reduceres derpå, f.eks. ved anvendelse af natriumborhydrid, for at opnå 5-hydroxyderivatet. Egnede reagenser og reaktionsbetingelser for disse trin er beskrevet i US patentskrift nr. 4 423 209.

De omhandlede forbindelser er højaktive antiparasitiske midler, der har særlig anvendelighed som anthelmintica, 35 DK 170343 B1 8 ectoparasiticider, insekticider og acaricider.

Forbindelserne er således effektive ved behandling af en > række sygdomstilstande forårsaget af endoparasitter om-5 fattende i særdeleshed helminthiasis, der oftest fremkaldes af en gruppe af parasitiske orme beskrevet som nema-toder, og som kan forårsage alvorlige økonomiske tab hos svin, får, heste og kvæg, ligesom de kan påvirke husdyr og fjerkræ. Forbindelserne er også effektive mod andre 10 nematoder, som angriber forskellige arter af dyr, f.eks. Dirofilaria i hunde og forskellige parasitter, der kan inficere mennesker inklusive gastrointestinale parasitter, såsom Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris, Enterobius og para-15 sitter, som findes i blod og andre væv og organer, såsom trådorme og de ekstraintestinale stadier af Strongyloides og Trichinella.

Forbindelserne er også værdifulde ved behandling af ecto-20 parasitiske infektioner, herunder især arthropod-ecto- parasitter hos dyr og fugle, såsom blodmider, mider, lus, lopper, spyfluer, bidende insekter og vandrende larver af tovingede insekter, der kan angribe kvæg og heste.

25 Forbindelserne er tillige insekticider, der er virksomme mod husholdningsskadedyr såsom kakkelakker, møl, museumsklaner og husfluer, ligesom de er anvendelige mod insektskadedyr i oplagret korn og på landbrugsplanter, såsom spindemider, bladlus og sommerfuglelarver, og mod vand-30 rende insekter såsom græshopper.

Forbindelserne med formlen (I) administreres som en sammensætning passende til den specielle tilsigtede anvendelse og til den bestemte art af værtsdyr, der behandles, 35 og den parasit eller det insekt der er involveret. Til anvendelse som anthelminticum kan forbindelserne administreres peroralt i form af en kapsel, bolus, tablet eller DK 170343 B1 9 fortrinsvis et indhældningspræparat, eller alternativt kan de administreres ved injektion eller ved implante-ring. Sådanne sammensætninger fremstilles på konventionel måde i overensstemmelse med veterinær standardpraksis.

5 Kapsler, piller eller tabletter kan fremstilles ved blanding af den aktive forbindelse med et passende findelt fortyndingsmiddel eller bærestof, endvidere indeholdende et henfaldsmiddel og/eller bindemiddel såsom stivelse, lactose, talkum, magnesiumstearat etc. Et indhældnings-10 præparat kan fremstilles ved at opslæmme det aktive stof i en vandig opløsning sammen med et dispergerings- eller befugtningsmiddel etc., og injektionspræparater kan fremstilles i form af sterile opløsninger, der kan indeholde andre stoffer, f.eks. tilstrækkeligt salte eller glucose 15 til at gøre opløsningen isotonisk med blod. Disse sammensætninger vil variere med hensyn til vægtmængden af den aktive forbindelse afhængigt af arten af værtsdyr, der skal behandles, infektionens sværhed og art og værtsdyrets kropsvægt. I almindelighed vil til peroral admini-20 stration en dosis fra ca. 0,001 til 10 mg pr. kg kropsvægt givet som en enkeltdosis eller i opdelte doser i en periode på fra 1 til 5 dage være tilfredsstillende, men naturligvis kan der være tilfælde, hvor højere eller lavere doseringsområder er indikeret.

25

Som et alternativ kan forbindelserne administreres med dyrenes foder, og til dette formål kan der fremstilles et koncentreret foderadditiv eller en præmix til blanding med det normale dyrefoder.

30

Til anvendelse som insekticid og til behandling af landbrugsskadedyr anvendes forbindelserne som spray, pulver, emulsioner og lignende i overensstemmelse med standardlandbrugspraksis .

Til human brug administreres forbindelserne som et farmaceutisk acceptabelt præparat i overensstemmelse med nor- 35 DK 170343 B1 10 mal medicinsk praksis.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses af de følgende .

eksempler, hvor eksempel 1 til 13 er eksempler på frem-5 stilling af forbindelserne med formlen (1), eksempel 14 er et eksempel på et indhældningspræparat, og eksemplerne 15 og 16 belyser den antiparasitiske og insekticide virkning af forbindelserne.

10 EKSEMPEL 1 25-ethyl-avermectin A2

En frossen podemængde (2 ml) af en kultur af Streptomyces 15 avermitilis ATCC 53568 blev podet i 50 ml af et substrat indeholdende stivelse (1 g), "Pharmamedia"© (0,75 g), "Ardamin pH" (0,25 g) og calciumcarbonat (0,1 g) i en 300 ml kolbe og inkuberet ved 28 °C i 2 dage. Denne podemængde (50 ml) blev overført til en anden podekolbe (1 liter) 20 indeholdende stivelse (20 g), "Pharmamedia"® (15 g), "Ardamin pH" (5 g) og calciumcarbonat (2 g) og inkuberet ved 28 °C i yderligere 2 dage. Denne podemængde blev anvendt til podning af 60 liter af et substrat indeholdende stivelse (6 kg), magnesiumsulfat (60 g), "Pharmamedia"® 25 (300 g), dinatriumhydrogenphosphat (60 g), jernsulfat (0f6 g), calciumcarbonat (420 g), glutaminsyre (36 g), zinksulfat (0,06 g) og mangansulfat (0,06 g) indeholdt i en 60 liter gæringsbeholder. Gæringsblandingen blev inkuberet ved 29 °C under omrystning med 350 omdrejninger pr.

30 minut og beluftning med 60 liter pr. minut. Natriumpropi-onat (140 g) tilsattes efter 96 timer og igen efter 192 timer (54 g). Efter 288 timer blev myceliet fjernet ved filtrering og ekstraheret med acetone (2 x 50 liter) efterfulgt af ethylacetat (50 liter). Acetoneekstrakten 35 blev inddampet til ca. 10 liter og ekstraheret med den ovenfor nævnte ethylacetatekstrakt i tre portioner. De resulterende ethylacetatlag blev kombineret og inddampet, DK 170343 B1 11 hvilket gav en brun olie (112 g).

Den ovennævnte olie blev opløst i 160 ml af en blanding af methanol og vand (95:5) og ekstraheret med n-hexan (2 5 x 300 ml), hexanekstrakterne blev smidt væk, og methanol-laget blev inddampet, hvilket gav en brun olie (87 g).

Den sidstnævnte blev opløst i methylenchlorid (250 ml) og omrørt med silicagel (80 g) og aktivt kul (30 g) i 1 time. Silicagel og aktivt kul blev fjernet ved filtrering 10 gennem "Arbacel", og filtratet blev inddampet, hvilket gav en gul olie (53 g). Den sidstnævnte blev opløst i methylenchlorid (2,2 liter) og omrørt med aluminiumoxid (190 g) i 2 timer. Aluminiumoxidet blev fjernet ved filtrering, og filtratet omrørt med yderligere aluminiumoxid 15 (64 g) i yderligere 1 time. Aluminiumoxidet blev fjernet ved filtrering, og de kombinerede filterkager fra begge filtreringer blev omrørt med chloroform (1,3 liter) i 45 minutter, hvorefter aluminiumoxidet blev fjernet ved filtrering. Filtratet blev inddampet, hvilket gav en bleggul 20 olie (12,5 g), der blev opløst i diethylether og sat på en søjle af silicagel (400 g). Søjlen blev elueret med diethylether, og der blev opsamlet fraktioner på 100 ml. Fraktionerne 21-28 blev kombineret, og opløsningsmidlet afdampet, hvilket gav et delvis renset stof (150 mg).

25 Produktet blev opløst i methanol (0,5 ml) og chromatogra-feret på en C18 "Zorbax ODS" (handelsnavn, DupontØ) søjle (21 mm x 25 cm), idet der blev elueret med en blanding af methanol og vand (77:23) ved en hastighed på 9 ml pr. minut. De relevante fraktioner blev kombineret, og opløs-30 ningsmidlet afdampet, hvilket gav forbindelsen med formlen (I), hvori R* er OH, den fakultative binding er fra-2 3 4 værende, R og R begge er CH^, og R er 4'-(a-L-olean-drosyl)-e-L-oleandrosyloxy, som et hvidt pulver, med smp. 146-153 °C. Produktets struktur blev bekræftet ved hur-35 tigt atombombardements-massespektrometri udført på et "VG Model 7070E" massespektrometer under anvendelse af en prøvematrix af triethylenglycol med fast natriumchlorid.

DK 170343 B1 12 (M+Na)+ observeret ved m/e 899 (teoretisk 899).

Elektronstrålemassespektrometri blev udført under anvendelse af et "VG Model 7070F" massespektrometer. m/e vær-5 dierne for de overvejende fragmenter var: 570, 295, 277, 275, 183, 165, 145, 127, 113, 95 og 87.

EKSEMPEL 2 10 25-methylthiomethyl-avermectin A2

En frossen podemængde (2 ml) af en kultur af Streptomyces avermitilis mutantorganisme ATCC 53568 blev podet i 50 ml 15 af et substrat indeholdende stivelse (1 g), "Pharmamedia" (0,75 g), "Ardamin pH" (0,25 g) og calciumcarbonat (0,1 g) i en 300 ml kolbe og inkuberet i 2 dage ved 28 °C på et rystebord ved 180 omdrejninger pr. minut. En podemængde fra denne kolbe (25 ml) blev overført til en 3 liter 20 kolbe indeholdende 600 ml af det ovennævnte substrat (alle ingredienser i samme forhold) og blev inkuberet i 2 dage ved 28 °C med omrystning på et rystebord ved 180 omdrejninger pr. minut. Væsken fra denne kolbe (40 ml) blev anvendt til at pode en 3 liter gæringsbeholder indehol-25 dende 2,5 liter af et substrat bestående af stivelse (250 g), magnesiumsulfat (2,5 g), "Pharmamedia" (12,5 g), dinatriumhydrogenphosphat (2,5 g), jemsulfat (0,025 g), calciumcarbonat (1,75 g), glutaminsyre (1,5 g), zinksulfat (0,0025 g) og mangansulfat (1,5 g). Denne gærings-30 blanding blev inkuberet ved 28 °C med omrystning ved 1000 omdrejninger pr. minut. Methylthioeddikesyre (1 g) til- 5 sattes efter 96 timer, og dyrkningen fortsattes i yderligere 11 dage. Derefter blev myceliet fjernet ved filtrering og ekstraheret med acetone (2x2 liter) efter-35 fulgt af ethylacetat (2 liter). Acetoneekstrakten blev inddampet til ca. 400 ml og ekstraheret med ethylace-tatekstrakten i tre portioner. De resulterende ethylace- DK 170343 B1 13 tatlag blev kombineret og inddampet, hvilket gav en brun olie (4 g), der blev opløst i diethylether og overført til en søjle af silicagel (100 g). Søjlen blev elueret med diethylether, og der blev opsamlet fraktioner på 50 5 ml. Fraktionerne 11-18 blev kombineret og inddampet, hvilket gav et delvis renset materiale, der blev yderligere renset ved chromatografi på en Cl8 "Zorbax ODS" (handelsnavn, Dupont®) søjle (21 mm x 25 cm), idet der blev elueret med en blanding af methanol og vand (77:23) 10 ved en hastighed af 9 ml pr. minut. De relevante fraktioner blev kombineret og inddampet, hvilket gav forbindelsen med formlen (I), hvori R1 er OH, den fakultative bin- 2 4 ding er fraværende, R er SCHg, R^ er CHg, og R er 4'-(o-L-oleandrosyl)-e-L-oleandrosyloxy, som et hvidt pul-15 ver, med smp. 105-112 °C. Produktets struktur blev bekræftet ved hurtigt atombombardements-massespektrometri udført på et "VG Model 7070E" massespektrometer under anvendelse af en prøvematrix af triethylenglycol med fast natriumchlorid. (M+Na)+ observet ved m/e 931 (teoretisk 20 931).

Elektronstrålemassespektrometri blev udført under anvendelse af et "VG Model 7070F" massespektrometer. m/e værdierne for de overvejende fragmenter var: 25 327, 309, 243, 225, 215, 145, 127, 113, 95 og 87.

EKSEMPEL 3 30 25-(2-trifluormethyl)propyl-avermectiner A2 og B2

Proceduren fra eksempel 1 blev fulgt, men under anvendelse af 3-trifluormethylbutansyre som substrat i stedet for natriumpropionat. De relevante kombinerede fraktioner fra 35 silicagelchromatografi indeholdende det rå A2-derivat blev chromatograferet på en C18 "Zorbax ODS" (handelsnavn, Dupont®) sølje (21 mm x 25 cm), idet der blev elu- DK 170343 B1 14 eret med en blanding af methanol og vand (75:25) ved en hastighed på 9 ml pr. minut. Fraktionerne 167-179 blev kombineret og inddampet, hvilket gav forbindelsen med formlen (I), hvori R1 er OH, den fakultative binding er 2 3 5 fraværende, R er l-(trifluormethyl)ethyl, R er CH«, og 4 J 5 R er 4,-(«-L-oleandrosyl)-L-oleandrosyloxy, som et hvidt pulver, smp. 130-136 °C. Produktets struktur blev bekræftet ved hurtigt atombombardements-massespektrometri udført på et "VG Model 7070E” massespektrometer under an-10 vendelse af en prøvematrix af triethylenglycol med fast natriumchlorid. (M+Na)+ observeret ved m/e 981 (teoretisk 981).

Elektronstrålemassespektrometri blev udført under anven-15 delse af et "VG Model 7070F" massespektrometer. m/e værdierne for de overvejende fragmenter var: 652, 377, 359, 293, 275, 265, 257, 247, 223, 179, 145, 127, 113, 111 og 87.

20

De relevante fraktioner fra silicagelchromatografi indeholdende det rå B2 derivat blev kombineret og chromato-graferet på en 018 "Dynamax" (handelsnavn, Rainin®) søjle (41,4 mm x 25 cm), idet der blev elueret med en blan-25 ding af methanol og vand (73:27) ved en hastighed på 60 ml pr. minut. De relevante fraktioner blev kombineret, hvilket gav forbindelsen med formlen (I), hvori R1 er OH, 2 den fakultative binding er fraværende, R er l-(trifluor-3 4 methyl)ethyl, R er H, og R er 4,-(a-L-oleandrosyl)-L-30 oleandrosyloxy, som et hvidt pulver, smp. 158-160 °C.

Produktet blev bekræftet ved hurtigt atombombardements- - massespektrometri udført på et "VG Model 7070E" massespektrometer under anvendelse af en prøvematrix af triethylenglycol med fast natriumchlorid. (M+Na)+ observeret 35 ved m/e 967 (teoretisk 967).

15 DK 170343 B1

Elektronstrålemassespektrometri blev udført under anvendelse af et "VG Model 7070F" massespektrometer. m/e værdierne for de overvejende fragmenter var: 5 638, 377, 359, 293, 275, 265, 261, 257, 247, 223, 145, 127, 113, 111, 95 og 87.

EKSEMPEL 4 10 25-ethylthiomethyl-avermectin A2

Proceduren fra eksempel 1 blev fulgt, men under anvendelse af ethylthioeddikesyre som substrat i stedet for na-triumpropionat. Efter chromatografi på en "Zorbax ODS" 15 (handelsnavn, Dupont®) søjle blev fraktionerne 24-72 kombineret, hvilket gav forbindelsen med formlen (I), hvori 1 2 R er OH, den fakultative binding er fraværende, R er 3 4 ethylthio, R er CH^, og R er 4'-(a-L-oleandrosyl)-L-oleandrosyloxy, som et hvidt pulver, smp. 265-270 °C (de-20 komponerer). Produktets struktur blev bekræftet ved hurtigt atombombardements-massespektrometri udført på et "VG Model 7070E" massespektrometer under anvendelse af en prøvematrix af triethylenglycol med fast natriumchlorid. (M+Na)+ observeret ved m/e 945 (teoretisk 945).

25

Elektronstrålemassespektrometri blev udført under anvendelse af et "VG Model 7070F" massespektrometer. m/e værdierne for de overvejende fragmenter var: 30 616, 473, 341, 323, 257, 239, 229, 211, 187, 179, 145, 113 og 87.

35 DK 170343 B1 16 EKSEMPEL 5 25-isobutyl-avermectin Bl , 5 Proceduren fra eksempel 1 blev fulgt, men under anvendel- i se af 3-methylbutansyre som substrat i stedet for natri-umproplonat. De relevante fraktioner fra silicagel-chro-matografi blev kombineret og chromatograferet på en C18 "Zorbax OD" (handelsnavn, Dupont®) søjle (21 mm x 25 cm), 10 idet der blev elueret med en blanding af methanol og vand (81:19) med en hastighed på 9 ml/minut. Fraktionerne 93-98 blev kombineret og inddampet, hvilket gav forbindelsen med formlen (I), hvori er fraværende, den fakultative binding er til stede, er isopropyl, RJ er H, og R er 15 4,-(e-L-oleandrosyl)-L-oleandrosyloxy, som et hvidt pulver, smp. 120-123 °C. Produktets struktur blev bekræftet ved hurtigt atombombardements-massespektrometri udført på et "VG Model 7070E" massespektrometer under anvendelse af en prøvematrix af triethylenglycol med fast natriumchlo-20 rid. (M+Na)+ observeret ved m/e 895 (teoretisk 895).

Elektronstrålemassespektrometri blev udført under anvendelse af et "VG Model 7070F" massespektrometer. m/e-vær-dierne for de overvejende fragmenter var: 25 565, 319, 305, 221, 193, 169, 145, 127, 113 og 87.

EKSEMPEL 6 30 25-(2-methylbutyl)-avermectiner A2 og Bl £

Proceduren fra eksempel 1 blev fulgt, men under anvendelse af 3-methylpentansyre som substrat i stedet for natri-umpropionat. De relevante fraktioner fra silicagel-chro-35 matografi indeholdende det rå A2-derivat blev kombineret og chromatograferet på en C-18 "Zorbax ODS" (handelsnavn,

Dupont®) søjle (21 mm x 25 cm), idet der blev elueret med DK 170343 B1 17 en blanding af methanol og vand (80:20) ved en hastighed på 9 ml/minut. Relevante fraktioner blev kombineret, hvilket gav forbindelsen med formlen (1), hvori er er 2 OH, den fakultative binding er fraværende, R er sekundær 3 4 5 butyl, R er methyl, og R er 4'-(a-L-oleandrosyl)-L-ole-androsyloxy, som et hvidt pulver, smp. 120-125 °C. Produktets struktur blev bekræftet ved hurtigt atombombardement s -mas sespektromet ri udført på et "VG Model 7070EH massespektrometer under anvendelse af en prøvematrix af 10 triethylenglycol med fast natriumchlorid. (M+Na)+ observeret ved m/e 941 (teoretisk 941).

Eletronstrålemassespektrometri blev udført under anvendelse af et MVG Model 7070F" massespektrometer. m/e-vær-15 dierne for de overvejende fragmenter var: 337, 319, 253, 235, 225, 207, 179, 145, 113 og 87.

De relevante fraktioner fra silicagelchromatografi inde-20 holdende det rå Bl-derivat blev kombineret og chromato-graferet på en C-18 "Ultrasphere" (handelsnavn, Beckman®) søjle (10 mm x 25 cm), idet der blev elueret med en blanding af methanol og vand (85:15) ved en hastighed på 4 ml/minut. Relevante fraktioner blev kombineret, hvilket 25 gav forbindelsen med formlen (I), hvori R1 er H, den fa- 2 3

kultative binding er til stede, R er sekundært butyl, R

4 er H, og R er 4,-(a-L-oleandrosyl)-L-oleandrosyloxy, som et hvidt pulver, smp. 158-164 °C. Produktets struktur blev bekræftet ved hurtigt atombombardements-massespek-30 trometri udført på et "VG Model 7070E" massespektrometer under anvendelse af et prøvematrix af triethylenglycol med fast natriumchlorid. (M+Na)+ observeret ved m/e 909 (teoretisk 909).

35 Elektronstrålemassespektrometri blev udført under anvendelse af et "VG Model 7070F" massespektrometer. m/e-vær-dierne for de overvejende fragmenter var: DK 170343 B1 18 319, 235, 207, 183, 145, 113, 95 og 87.

EKSEMPEL 7 5 25-n-propyl-avermectin A2

Proceduren fra eksempel 1 blev fulgt, men under anvendelse af n-butansyre som substrat 1 stedet for natriumpro-plonat. De relevante fraktioner fra silicagelchromatogra-10 fi blev kombineret og chromatograferet på en C-18 "Dynamax" (handelsnavn, Rainin®) søjle (41,4 mm x 25 cm), idet der blev elueret med en gradient af methanol og vand fra (75:25) til (100:0) i løbet af 170 minutter ved en hastighed på 40 ml/minut. Fraktioner blev opsamlet med 1 15 minuts mellemrum, og fraktionerne 36 og 37 blev kombineret, hvilket gav forbindelsen med formlen (I), hvori er o OH, den fakultative binding er fraværende, R er ethyl, 3 4 R er methyl, og R er 4’ -(a-L-oleandrosyl)-L-oleandro-syloxy, som et hvidt pulver, smp. 150-155 °C. Produktets 20 struktur blev bekræftet ved hurtigt atombombardements-massespektrometri udført på et MVG Model 7070E" masse-spektrometer under anvendelse af en prøvematrix af tri-ethylenglycol med fast natriumchlorid. (M+Na)+ observeret ved m/e 913 (teoretisk 913).

25

Elektronstrålemassespektrometri blev udført under anvendelse af et "VG Model 7070F" massespektrometer. m/e-vær-dierne for de overvejende fragmentet var: 30 584, 309, 291, 225, 207, 197, 179, 145, 113 og 87.

EKSEMPEL 8 9 25-cyclopentylmethyl-avermectiner Bl og B2 35

Proceduren fra eksempel 1 blev fulgt, men under anvendelse af cyclopentaneddikesyre i stedet for natriumpropio- DK 170343 B1 19 nat. De relevante fraktioner fra silicagelchromatografi indeholdende det rå Bl-derivat blev kombineret og chroma-tograferet på en C-18 "Dynamax" (handelsnavn, Rainin®) søjle (41,4 mm x 25 cm), idet der blev elueret med en 5 blanding af methanol og vand (84:16) ved en hastighed på 60 ml/minut. Relevante fraktioner blev kombineret, hvilket gav en forbindelse med formlen (I), hvori R1 er fra- 2 værende, den fakultative binding er til stede, R er cy-3 4 clopentyl, R er H, og R er 4'-(a-L-oleandrosyl)-L-ole-10 androsyloxy, som et hvidt pulver, smp. 140-146 °C. Produktets struktur blev bekræftet ved hurtigt atombombarde-ments-massespektrometri udført på et "VG Model 7070E" massespektrometer under anvendelse af en prøvematrix af triethylenglycol med fast natriumchlorid. (M+Na)+ ob- 15 serveret ved m/e 921 (teoretisk 921).

Elektronstrålemassespektrometri blev udført under anvendelse af et "VG Model 7070F" massespektrometer. m/e-vær-dierne for de overvejende fragmenter var: 20 592, 331, 295, 257, 247, 218, 195, 145, 127, 113, 111, 95 og 87.

De relevante fraktioner fra silicagel-chromatografi inde-25 holdende det rå B2-derivat blev kombineret og chromato-graferet på en C-18 "Ultrasphere" (handelsnavn, Beckman®) søjle (10 mm x 25 cm), idet der blev elueret med en blanding af methanol og vand (80:20) ved en hastighed på 4 ml/minut. Relevante fraktioner blev kombineret, hvilket 30 gav forbindelsen med formlen (I), hvori R1 er OH, den fa- 2 3 kultative binding er fraværende, R er cyclopentyl, R er 4 H, og R er 4'-(e-L-oleandrosyl)-L-oleandrosyloxy, som et hvidt pulver, smp. 155-165 °C. Produktets struktur blev bekræftet ved hurtigt atombombardements-massespektrometri 35 udført på et "VG Model 7070E" massespektrometer under anvendelse af en prøvematrix af triethylenglycol med fast natriumchlorid. (M+Na)+ observeret ved m/e 939 (teoretisk 939).

20 DK 170343 B1

Elektronstrålemassespektrometri blev udført under anvendelse af et "VG Model 7070F" massespektrometer. m/e-vær-5 dlerne for de overvejende fragmenter var:

A

349, 335, 331, 289, 265, 261, 257, 247, 237, 219, 195, 179, 145, 127, 113, 111, 95 og 87.

10 EKSEMPEL 9 25-(2-methylbutyl)-avermectin Bl

Proceduren fra eksempel 1 blev fulgt, men under anvendel- 15 se af 3-methylpentansyre som substrat i stedet for na- triumpropionat. De relevante fraktioner fra silicagel- chromatografi blev kombineret og chromatograferet på en "Ultrasphere ODS"-søjle (Beckman®) (10 x 250 mm) under eluering med en blanding af methanol og vand (85:15) med 20 en strømningshastighed på 4 ml/min. Fraktioner blev taget hvert halve minut, og fraktionerne 20-24 blev kombineret, hvilket gav forbindelsen med formlen (I), hvori R1 er 2 fraværende, den fakultative binding er til stede, R er 3 4 s-butyl, R er H, og R er 4’-(e-L-oleandrosyl)-L-olean-25 drosyloxy, som et hvidt pulver, smp. 158-164 °C. Produktets struktur blev bekræftet ved hurtigt atombombardements -massespektrometr i gennemført på et "VG model 7070E" massespektrometer under anvendelse af en prøvematrix af triethylenglycol med fast natriumchlorid. (M+Na)+ blev 30 iagttaget ved m/e 909 (teoretisk 909).

Elektronbombardements-massespektrometri blev gennemført under anvendelse af et "VG model 7070F" massespektrometer. m/e-værdierne for de overvejende fragmenter var: 319, 235, 207, 183, 145, 113 og 87.

35 DK 170343 B1 21 EKSEMPEL 10 25-(2-trifluormethyl)-propylavermectin B2 5 Proceduren fra eksempel 1 blev fulgt, men under anvendelse af trifluormethylsmørsyre som substrat i stedet for natriumpropionat. De relevante fraktioner fra silicagel-chromatografi blev chromatograferet på et "Prep LC/System 500" (Waters®) under eluering med en blanding af methanol 10 og vand (75:25) med en strømningshastighed på 100 ml/min. Efter et 8 minutters forløb blev der taget fraktioner hvert halvandet minut. Fraktionerne 15-26 blev kombineret, hvilket gav delvis renset produkt. Dette blev chromatograferet på en "C-18 Dynamax"-søjle (Rainih) (41,4 mm 15 x 25 cm) under eluering med en blanding af methanol og vand (73:27) med en strømningshastighed på 60 ml/min. Fraktioner blev taget hvert minut, og fraktionerne 7 og 8 blev kombineret, hvilket gav delvis renset produkt. Dette blev chromatograferet på en "Ultrasphere ODS"-søjle 20 (Beckman®) (10 x 250 mm) under eluering med en blanding af methanol og vand (73:27) med en strømningshastighed på 4 ml/min. Fraktionerne 49-78 blev kombineret, hvilket gav i forbindelsen med formlen (I), hvori R er OH, den fakul- 2 tative binding er fraværende, R er 1-(trifluormethyl)-3 4 25 ethyl, R er H, og R er 4'-(e-L-oleandrosyl)-L-oleandro-syloxy, som et hvidt pulver, smp. 158-160 eC. Produktets struktur blev bekræftet ved hurtigt atombombardements-massespektrometri gennemført på et "VG model 7070E" mas-sespektrometer under anvendelse af en prøvematrix af tri-30 ethylenglycol med fast natriumchlorid. (M+Na)+ blev iagttaget ved m/e 967 (teoretisk 967).

Elektronbombardements-massespektrometri blev gennemført under anvendelse af et "VG model 7070F" massespektro-35 meter, m/e-værdierne for de overvejende fragmenter var: 22 DK 170343 B1 638, 377, 359, 293, 275, 265, 247, 179, 223, 111, 261, 257, 145, 127, 113, 95 og 87.

EKSEMPEL 11 5 2 5-cyclopentylmethyl-avermectin Bl

Proceduren fra eksempel 1 blev fulgt, men under anvendelse af cyclopentaneddlkesyre 1 stedet for natriumpropio-10 nat. De relevante fraktioner fra silicagel-chromatografi blev kombineret og chromatograferet på en "Ultrasphere ODS "-søjle (Beckman®) (10 x 250 mm) tinder eluering med en blanding af methanol og vand (80:20) ved en strømningshastighed på 4 ml/min. Efter et 18 minutters forløb blev 15 der opsamlet fraktioner hvert halve minut, og fraktionerne 5-22 blev kombineret, hvilket gav forbindelsen med i formlen (I), hvori R er fraværende, den fakultative bin- 2 3 4 ding er til stede, R er cyclopentyl, R er H, og R er 4*-(e_L-oleandrosyl)-L-oleandrosyloxy, som et hvidt pul-20 ver, smp. 155-165 °C. Produktets struktur blev bekræftet ved hurtigt atombombardements-massespektrometri gennemført på et "VG model 7070E" massespektrometer under anvendelse af en prøvematrix af triethylenglycol med fast natriumchlorid. (M+Na)+ blev iagttaget ved m/e 939 (teo-25 retisk 939).

Elektronbombardements-massespektrometri blev gennemført under anvendelse af et "VG model 7070F" massespektrometer. m/e-værdierne for de overvej ende fragmenter var: 30 349, 335, 331, 289, 265, 261, 257, 247, 237, 219, 195, 179, 145, 127, 113, 111, 95 og 87.

35 DK 170343 B1 23 EKSEMPEL 12 25“(2-cyclopenten-l-methyl)-avermectin B2 5 Proceduren fra eksempel 1 blev fulgt, men under anvendelse af 2-cyclopenten-l-eddikesyre i stedet for natriumpro-pionat. De relevante fraktioner fra silicagel-chromato-grafi blev kombineret, og det rå produkt karakteriseret ved revers-fase høj ydelses-væskechromatografi (HPLC)/mas-10 sespektrometri.

HPLC blev gennemført under anvendelse af en C-18 "Ultras-phere"-søjle (Beckman®) (25 cm x 4,6 mm) under eluering med en blanding af methanol og vand (88:12) indeholdende 15 0,1 M ammoniumacetat ved en strømningshastighed på 1 ml/min. Massespektrometri blev gennemført på et nVG Trio 3" instrument.

Produktet var en forbindelse med formlen (I), hvori R* er 2 20 OH, den fakultative binding er fraværende, R er 2-cyclo- 3 4 pentenyl, R er H, og R er 4'-(a-L-oleandrosyl)-L-olean-drosyloxy.

Produktet havde en HPLC-tilbageholdelsestid på 8,8 mi-25 nutter og gav en (M+H)+ ved m/e 915 (teoretisk 915) og en (M+Na)+ ved m/e 937 (teoretisk 937).

EKSEMPEL 13 30 25-(2-cyclopenten-l-methyl)-avermectin Bl

Proceduren fra eksempel 1 blev fulgt, men under anvendelse af 2-cyclopenten-l-eddikesyre i stedet for natriumpro-pionat. De relevante fraktioner fra silicagel-chromato-35 grafi blev kombineret, og det rå produkt karakteriseret ved revers-fase højydelses-væskechromatografi (HPLC)/massespektrometri .

24 DK 170343 B1 HPLC blev gennemført under anvendelse af en C-18 "Ultras-phere"-søjle (Beckman®) (25 cm x 4,6 mm) under eluering med en blanding af methanol og vand (88:12) indeholdende 0,1 M ammoniumacetat, ved en strømningshastighed på 1 5 ml/min. Massespektrometri blev gennemført på et "VG Trio 3" instrument.

Produktet var en forbindelse med formlen (I), hvori R1 er 2 H, den fakultative binding er fraværende, R er 2-cyclo-3 4 10 pentenyl, R er H, og R er 4 * — (a-L-oleandrosyl)-L-olean-drosyloxy.

Produktet havde en HPLC-tilbageholdelsestid på 17,5 min og gav en (M+Na)+ ved m/e 919 (teoretisk 919).

15 EKSEMPEL 14 Indhældningspræparat 20 Produktet fra et vilkårligt af de forudgående eksempler blev opløst i polyethylenglycol (gennemsnitsmolekylvægt 300) for at opnå en opløsning indeholdende 400 pg/ml til brug som et indhældningspræparat.

25 EKSEMPEL 15

Anthelmintlsk virkning

Den anthelmintiske virkning blev bedømt mod Caenorhabdi-30 tis elegans under anvendelse af den in vitro screeningstest, der er beskrevet af K.G. Simpkin og G.L. Coles i Parasitology, 1979, 79, 19. Produkterne fra eksemplerne 1 til 8 dræbte alle 100% af ormene ved en brønd-koncentration på 0,1 ag/ml.

35 25 DK 170343 B1 EKSEMPEL 16 Insekticid virkning 5 Aktiviteten mod larvestadiet af spyfluen Lucilia cuprina (Q-stamme) påvises ved anvendelse af en standardprocedure, hvor første-stadiums-larver holdes i kontakt med filtrerpapir behandlet med prøveforbindelsen. Prøveforbindelsen påføres papiret som en acetoneopløsning. De be-10 handlede filtrerpapirer anbringes derpå i reagensglas indeholdende 1 ml serum fra nyfødt kalv, og første-stadiums -larverne tilsættes. Produkterne fra eksemplerne 1 til 8 dræbte 100% af larverne, når de blev påført fil- 2 trerpapiret i et niveau på 1 mg/m .

15 20 25 30 35

Claims

1. Fremgangsmåde til fremstilling af forbindelser beslægtet med avermectiner og med den almene formel: 5 R1 A CH3 RnA^V°n «Γ P I Nx^CHoR2

10. U — (i) ch3 j] T l 0^0 j! ohT

15 O-s. JL Y?CH3 OK hvori den punkterede linie i 22-23-stillingen repræsente-20 rer en fakultativ binding, og hvori enten R^ er OH, og den fakultative binding er fraværende, eller den fakultative binding er til stede, og R1 er fraværende. 2 R er H, (Cj-Cg)alkyl, halogen-(Cj-Cg)alkyl, (C3-Cg)cyc-25 loalkyl, (Cg-Cg)cycloalkenyl eller (C1-Cg)alkylthio, 3 R er hydrogen eller methyl, og 4 R er en 4'-(a-L-oleandrosyl)-a-L-oleandrosyloxygruppe 30 med formlen: ch ch

35 CII3O CH30 kendetegnet ved, at man dyrker Streptomyces 27 DK 170343 B1 avermitilis ATCC 53568 under tilstedeværelse af en 2 2 carboxylsyre med formlen R CI^CC^H, hvori R er som defineret ovenfor, eller et salt, en ester eller et amid deraf, og isolerer en eller flere forbindelser med formlen 5 (I), hvorpå, om ønsket, en dannet forbindelse med formlen (I), hvori R1 er OH, og den fakultative binding er fraværende, omdannes til den tilsvarende forbindelse med formlen (I), 10 hvori den fakultative binding er til stede, og R^ er fraværende, ved en dehydratiseringsreaktion under beskyttelse af hydroxygrupperne i 5- og 4"-stillingerne, efterfulgt af fjernelse af beskyttelsesgrupperne, 15 og, om ønsket, en dannet forbindelse med formlen (I), 3 hvori R er CH0, omdannes til den tilsvarende forbindelse 3 3 med formlen (I), hvori R er H, ved en deme thy lerings-reaktion.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 2 ved, at R er methylthio eller ethylthio.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 2 ved, at R er methyl, isopropyl eller sekundær butyl. 25

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 2 ved, at R er l-(trifluormethyl)ethyl. 30 35