DK164457B

DK164457B - Konjugater, hvor en monovalent carboxylionophor ved hjaelp af en kovalent binding er knyttet til et makromolekyle, fremgangsmaade til fremstilling af konjugaterne og disses anvendelse som immunotoksinpotentiatorer

Info

Publication number: DK164457B
Application number: DK224785A
Authority: DK
Inventors: Franz Jansen; Pierre Gros
Original assignee: Sanofi Sa
Priority date: 1984-05-23
Filing date: 1985-05-21
Publication date: 1992-06-29
Also published as: ES8604228A1; ES543367A0; IE58480B1; EP0162781B1; GR851229B; IL75228A; EP0162781A1; DK164457C; IE851279L; IL75228A0; US4919928A; DK224785D0; PT80501A; PT80501B; DE3571928D1; AU4279385A; NZ212118A; US5144009A; AU600651B2; US4977280A

Description

i

DK 164457 B

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte konjugater, hvori en monovalent carboxyl ionophor (som defineret på side 2, linie 26 - 38) ved hjælp af en kovalent binding er knyttet til et makromolekyle, en fremgangsmåde til fremstilling af konjuga-5 terne og disses anvendelse som immunotoksinpotentiatorer.

I beskrivelsen til fransk offentliggørelsesskri ft nr. 2.499.197 er carboxyl ionophorers potentier ingsevne over for immunotoksiner nævnt.

10

Udtrykket "immunotoksiner" betegner anticancerstoffer, der er opnået ved kobling ved hjælp af en kovalent binding af et cyto-toksisk protein (f.eks. ricins A-kæde) til antistoffer eller fragmenter af antistoffer, som er rettet mod et antigen, der 15 bæres af en celle, som skal ødelægges.

Sådanne immunotoksiner har især været beskrevet i fransk offentliggørelsesskrift nr. 2.376.040 og det tilhørende offentliggørelsesskrift nr. 2.415.224 samt i det franske offentiiggørelses-20 skrift nr. 2.476.231. Det er blevet muligt med fordel at anvende ionophorers potent i erende egenskaber i visse typer af situationer. De fører i sær til gunstige resultater, når et immunotoksi n anvendes som et selektivt cytotoksisk middel in vitro til nedbrydning af målcellerne, især når immunotoksinet anvendes som et 25 cytotoksisk middel til behandling af 1eukæmipat i enters benmarv, til hvilke patienter den på denne måde behandlede benmarv derpå skal transplanteres. Det er også tilfældet, når immunotoksinet anvendes til formindskelse af populationen af T-celler i et transplantat til benmarvsal lotransplantationsanvendelser med 30 henblik på at hindre de forstyrrelser, der er forbundet med transpiantets reaktion mod værten.

Når derimod immunotoksinet anvendes in vivo som et terapeutisk middel til mennesker, er in vivo anvendelsen af en ionophor med 35 henblik på at udnytte den potentierende virkning forbundet med visse iboende begrænsninger: - ionophorernes egentoksicitet;

DK 164457 B

2 - deres lave opløselighed i de opløsningsmidler, der er egnede til parenteral administration; og - deres meget hurtige eliminering fra blodplasmaet.

5 Ifølge den foreliggende opfindelse har det overraskende vist sig, at disse begrænsninger kan overvindes ved at erstatte carboxyl ionophorerne med konjugater, hvori en monovalent carboxyl-ionophor ved hjælp af en kovalent binding er knyttet til et ma-kromolekyle, såsom et antistof, et fragment af et antistof, et 10 protein, et peptid eller alternativt et blandet makromolekyle, som er opnået ved hjælp af kovalent kobling af et antistof til et protein.

Ifølge et første træk angår den foreliggende opfindelse derfor, 15 som hidtil ukendte produkter, konjugater (kunstigt blandede molekyler), der er opnået ved hjælp af kovalent binding af en monovalent carboxyl ionophor til makromolekyler (såsom antistoffer, anti stoffragmenter, proteiner, såsom peptidhormoner eller humane proteiner, peptidligander og blandede makromolekyler), hvorhos 20 de blandede makromolekyler er dannet ved kovalent kobling af et antistof og et protein.

I resten af den foreliggende beskrivelse vil sådanne konugater blive omtalt som "ionophore konjugater".

25

Carboxyl ionophorer er kendte molekyler, især naturstoffer, som er isoleret fra stammer af streptomycetessvampe, der indeholder et hydrocarbonskelet, hvori oxygen-heteroringe indgår. Der findes altid en carboxylsyregruppe ved den ene ende af kæden, og 30 der findes en eller flere alkoholgrupper ved den anden ende (B.C. Pressman, Annual Review of Biochemistry, 45, 501, 530, 1976) .

Disse naturstoffer tilligemed visse halvsyntetiske deraf afled-35 te forbindelser er fælles om en ionophor virkning, dvs. evnen til at muliggøre overførsel af metalioner (især monovalente ioner) fra en hydrofil fase til en lipofil fase, hvilke faser er indbyrdes ublandbare.

O

3

DK 164457 B

De benyttede makromolekyler kan være antistoffer (eller fragmenter af antistoffer), proteiner (såsompeptidhormoner eller humane proteiner, f.eks. humant serumalbumin), peptidligander (såsom naturlige eller syntetiske polypeptider og især poly-5 lysin) eller alternativt blandede makromolekyler, der er opnået ved kovalent kobling af et antistof til et protein.

I det tilfælde, hvor et antistof anvendes, kan dette være enten af polyclonal natur:, hvis det hidrører fra konventionel 10 immunisering udført på et dyr, eller af monoclonal natur, hvis det er fremstillet ved hjælp af en clon af hybridceller, som er opnået ved sammensmeltning mellem lymphocyter og nye-lomaceller. Dette antistof kan anvendes enten i form af hele immunoglubolinmolekyler, der har evnen til at genkende det 15 valgte antigen, eller i form af ethvert fragment af disse immunoglobulinmolekyler, som har bevaret evnen til at genkende det valgte antigen, især de fragmenter, der kendes som Fiab'^r Fab og Fab'.

OQ

Den kemiske kobling af makromolekylerne til ionophoren kan udføres ved hjælp af en række forskellige metoder, med det forbehold, at den valgte metode: bevarer konjugatkomponenternes respektive biologiske virkninger: sikrer en tilfredsstillende reproducerbarhed og et godt kob-25 lingsudbytte; muliggør styring af værdien af forholdet ionophor/makromole- kyle i det opnåede konjugat? og fører til et stabilt og vandopløseligt produkt.

30

Blandt alle de kemiske koblingsmetoder, der opfylder disse karakteristika, er det muligt at vælge de metoder, som anvender

en eller flere thiolgrupper til dannelse af bindingen. I

dette tilfælde er det muligt at anvende en thiogruppe, som er blevet indført kunstigt i en af de forbindelser, der skal 35 kobles, og at indføre en eller flere grupper i den anden forbindelse, hvilke grupper er i stand til at reagere/1¾¾¾ 1 grupperne, i et vandigt medium med en pH-værdi mellem 5 og 9, ved en temperatur, der ikke overstiger 30°c, til dannelse

O

DK 164457 B

4 af en stabil, kovalent og tydeligt defineret binding.

F.eks. kan en thiol kunstigt indføres /ionophorerne ved omsætning med S-acetylmercapto-ravsyreanhydrid der vil være i stand 5 til at acylere en af ionophorens alkoholgrupper. Det vil derefter være muligt at frigøre denne thiolgruppe ved omsætning med hydroxylamin til fjernelse af acetyl-beskyttelsesgruppen på den måde, der allerede er beskrevet (Archives of Biochemistry and Biophysics, 119, 41-49, 1967).

10

Egnede ionophorer er monensin, nigericin, grisonixin og lasa-locid. Særlig foretrukne er monensin og nigericin, der har formlerne:

LxL} E0 H \_ 3 'Q\/Ll?Vrf'0 h °-t~å2æ

CBjj (H

CH(ayo3 20 monensin CH~0. CH-. _ _ H.C._ H3>- h3c

^'(fe Τ» H ® * ‘‘CH20H

cooh nigericin 30

Den kunstige indføring af thiolen udføres ved omsætning af ionophoren med S-acetylmercaptcravsyreanydrid.'_, med formlen: S-CO-CH3 35 / 0

Nr- o i et indifferent organisk opløsningsmiddel ved tilnærmelsesvis

DK 164457 B

O

5 omgivelsernes temperatur.

Denne reaktion fører til dannelse af en esterbinding mellem en af ionophorens hydroxylgrupper, som er den primære hydro-5 xylgruppe i tilfælde af monensin og nigericin, og acetylmer-captoravsyren til opnåelse af en forbindelse med formlen: i°-o-co-ch-s-co-ch3 ch2cooh 10 o hvori I betegner den lonophorrest, hvorfra en af hydroxylgrup-perne, som er den primære hydroxylgruppe i tilfælde af monensin og.nigericin, er blevet fjernet.

Thiolgruppen i ovennævnte forbindelse kan frigøres ved omsætning med hydroxylamin, og den resulterende forbindelse med formlen:

I°-0-C0-CH-SH

I H

CH2COOH

20 hvori 1° er som ovenfor defineret, kan in situ anvendes til koblingsreaktionen. De nævnte aktiverede ionophorer, som har formlen:

I°-0-C0-CH-S-W

I IH

25 CH2COOH

hvori W er hydrogen eller en acetylgruppe, er hidtil ukendte og repræsenterer et andet træk ved opfindelsen.

30 Gruppen:

I°-0-C0-CH

CH2C00H

angives herefter som I og betegner "den ionophor, der skal kobles".

Koblingen med makromolekylet kan udføres med en eller flere af forbindelserne I og II, men den nævnte kobling er hurtigere med forbindelsen II, hvorfor anvendelsen af denne foretrækkes.

35

O

DK 164457 B

6

Koblingen vil således blive udført med makromolekylet, hvori-en eller flere grupper er i stand til at danne en kovalent binding med den thiol, som er blevet indført. Denne kovalente binding kan være enten en disulfidbinding eller en thioether-5 binding.

5i§ulfidbindingen^ I dette tilfælde kan fremstillingen af konjugatet angives ved reaktionsskemaet:

10 ISH + P-R-S-S-X-3 I-S-S-RfP + XSH

hvori I betegner ionophoren, der skal kobles, P betegner makromolekylet, der skal modificeres, og S-S-X betegner en aktiveret blandet disulfidgruppe, idet X er den aktiverende gruppe.

15

Makromolekylet, der er substitueret-med et aktiveret svovlatom, opnås ud fra selve makromolekylet ved substitution ved hjælp af et reagens, som selv bærer et aktiveret svovlatom, i overensstemmelse med reaktionsskemaet:

P + Y-R-S-S-X-£ P-R-S-S-X

20 hvori P er makromolekylet, der skal modificeres, Y betegner en gruppe, som muliggør den kovalente fiksering af reagenset til proteinet, R betegner en gruppe, der er i stand til samtidig at bære substituenterne Y og -S-S-X, og X betegner den aktiverende gruppe.

25

Den funktionelle gruppe Y er en gruppe, der er i stand til at blive bundet kovalent til enhver af de grupper, som bæres af sidekæderne på de aminosyrer, der indgår i proteinet, der skal substitueres. Blandt disse grupper anbefales især de terminale aminogrupper i de lysylgrupper, som er indeholdt i proteinet. I dette tilfælde kan Y især betegne:

En carboxylgruppe, som kan bindes til aminogrupperne i proteinet i nærværelse af et koblingsmiddel, såsom et carbodiimid

Ow og især et vandopløseligt derivat som l-ethyl-3-diethylamino-propyl-3-carbodiimid.

Et carboxylsyrechlorid, der er i stand til direkte at reagere

O

7

DK 164457 B

med aminogrupperne til acylering af disse,

En såkaldt "aktiveret" ester, såsom en ortho- eller para-nitro-phenyl- eller -dinitrophenylester, eller alternativt en N-5 hydroxysuccinimidester, der reagerer direkte med aminogrupperne til acylering af disse,

Et indre anhydrid af en dicarboxylsyre, såsom eksempelvis ravsyreanhydrid, der reagerer spontant med aminogrupperne 10 til dannelse af amidbindinger, eller

En imidoestergruppe:

. NH

15 _C

hvori R^ er en alkylgruppe, der reagerer med makromolekylets aminogrupper i overensstemmelse med reaktionsskemaet:

20 H

N

Prot-NH2 + &2~C<~-* Prot-NH-C-R2 + OHR1 X°Ri 25 Gruppen -S-S-X betegner et aktiveret blandet disulfid, der er i.stand til at reagere med en fri thiolgruppe. I det blandede disulfid kan X især betegne en pyridin-2-yl- eller pyridin- 4-yl-gruppe, der eventuelt er substitueret med en eller flere alkylgrupper, halogenatomer eller carboxylgrupper. X kan 30 også betegne en phenylgruppe, der fortrinsvis er substitueret med en eller flere nitrogrupper eller carboxylgrupper. Alternativt kan X betegne en alkoxycarbonylgruppe, såsom methoxy-carbonylgruppen.

35 Gruppen R betegner enhver gruppe, der er i stand til samtidig at bære substituenterne Y og -S-S-X. Den skal vælges således, at den ikke indeholder grupper, der under de efterfølgende reaktioner kan genere de benyttede reaktanter og de syntetise-

O

DK 164457 B

8 rede produkter. Gruppen R kan især være gruppen -(CH2)n, hvor n er mellem 1 eller 10, eller alternativt gruppen: R-j-CH- J l 5 CH- R4 hvori R^ betegner hydrogen eller en alkylgruppe med 1 til 8 carbonatomer, og R^ betegner en substituent, der er indiffβίο rent over for de reaktanter, som efterfølgende anvendes, såsom en carbamatgruppe: -NH-C-ORc II ^

O

hvori Rj. betegner en lineær eller forgrenet alkylgruppe med 15 O

1 til 5 carbonatomer, især tert.-butylgruppen.

Omsætningen af forbindelsen Y-R-S-X med makromolekylet P udføres i en homogen væskefase, mest almindeligt i vand eller 2Q en pufferopløsning. Hvis det nødvendiggøres af reaktanternes opløselighed, kan indtil 30 volumen% af et med vand blandbart organisk opløsningsmiddel, såsom en alkohol og især tertiær butanol, sættes til reaktionsmediet. Reaktionen udføres ved omgivelsernes temperatur i et tidsrum, der varier fra nogle 25 få minutter til 24 timer, hvorefter produkterne med lav molekylvægt og især de overskydende reaktanter kan fjernes ved hjælp af dialyse. Denne fremgangsmåde gør det sædvanligvis muligt at indføre mellem 1 og 50 substituenter pr. mol makro-molekyle.

30

Ved anvendelse af sådanne forbindelser udføres koblingen af makromolekylet til ionophoren ved at bringe de to forbindelser sammen i vandig opløsning ved en temperatur, der ikke overstiger 30°C, i et tidsrum, der varierer fra nogle få minutter 35 til 1 dag. Den opnåede vandige opløsning dialyseres til fjernelse af forbindelser med lav molekylvægt.

Ihioetherbindingen o

DK 164457 B

9 I dette tilfælde består fremstillingen af konjugatet i at omsætte I-SH med proteinet P, hvori en maleimidgruppe forinden er blevet indført. Reaktionen er herefter angivet ved reaktionsskemaet: s I-SH + P-NH-CO-Z-N -—-^ V1 0

O S-I

>-γ

10 P-NH-CO-Z-N

0^ hvori Z betegner en alifatisk eller aromatisk afstandsdel indeholdende fra 1 til 10 carbonatomer.

15

Det -med maleimid substituerede protein P opnås ud fra selve proteinet P ved substitution i proteinets aminogrupper ved hjælp af et reagens, der selv bærer maleimidgruppen, i overensstemmelse med reaktionsskemaet:

20 O

Vn Vji

P-NH2 + Yj-Z-N -± P-NH-CO-Z-N

25 hvori betegner: enten en carboxylgruppe, i hvilket tilfælde reaktionen efter aktivering af carboxylgruppen udføres i nærværelse af et koblingsmiddel, såsom carbodiimid og især et vandopløseligt deri-30 vat, såsom l-ethyl-3-diethylaminopropyl-3-carbodiimid, eller en såkaldt "aktiveret" ester, såsom en ortho- eller para-nitrophenyl eller -dinitrophenylester, eller alternativt en N-hydroxysuccinimidester, der reagerer direkte med amino-35 grupperne til acylering af disse.

Fremstillingen af sådanne reagenser er især beskrevet i Helvetica Chimica Acta, 58, 531-541 (1975). Andre reagenser tilhørende den samme klasse er kommercielt tilgængelige.

o

DK 164457 B

10

Omsætningen af forbindelsen:

O

y_

P-NH-CO-Z-N

med ionophoren udføres i en homogen væskefase, mest sædvanligt i vand eller en pufferopløsning. Hvis det nødvendiggøres af reaktanternes opløselighed kan indtil 20 volumen% af et 10 med vand blandbart organisk opløsningsmiddel, såsom en alkohol og især tertiær butanol, sættes til reaktionsmediet.

Reaktionen udføres ved omgivelsernes temperatur i et tidsrum, der varierer fra nogle få timer til 24 timer, hvorpå forbin-15 delserne med lav molekylvægt og især overskuddet af reaktanter kan fjernes ved hjælp af dialyse. Denne fremgangsmåde gør det muligt at indføre mellem 1 og 50 substituentgrupper pr. mol protein.

20 Ved anvendelse af sådanne forbindelser udføres koblingen af makromolekylet med ionophoren ved at bringe de to forbindelser sammen i vandig opløsning ved en temperatur, der ikke overstiger 30°C, i et tidsrum, der varierer fra nogle få timer til 1 dag. Den opnåede opløsning dialyseres til fjernelse 25 af forbindelser med lav molekylvægt, og konjugatet kan derpå renses ved hjælp af en række forskellige kendte metoder.

Ifølge et andet træk angår opfindelsen anvendelsen af de ionophore konjugater som immunotoksinpotentiatorer. Den angår også de medicinske forbindelser, hvori mindst ét immunotoksin og mindst én ionophor ifølge opfindelsen er til stede.

Undersøgelser foretaget med de ionophore konjugater har vist, at: 35 - ionophorernes potentierende virkning bevares efter kobling med makromolekylet.

Ionophorens binding til makromolekylet bibringer førstnævnte o

DK 164457 B

11 en høj opløselighed i vandige medier, hvilket begunstiger in vivo administration af forbindelsen.

- bindingen af ionophoren til makromolekylet forøger i betydelig grad ionophorens plasma-halveringstid, hvilket er væsent- 5 ...

ligt for opretholdelse af den potentierende virkning in vivo; - konjugatets toksicitet er mindre end toksiciteten af ionophoren alene.

For hver patient vil således i det mindste to effektorer, 10 der er væsentlige for opnåelse af resultatet, blive rettet mod målcellerne: - for det første et cytotoksisk protein (såsom eksempelvis ricins A-kæde), som vil være den cytotoksiske effektor, der er inkorporeret i det såkaldte immunotoksiske konjugat; og 15 - ionophoren (såsom eksempelvis monensin), som er bestanddelen i det potentierende system, der er inkorporeret i det såkaldte "ionophore konjugat".

I det tilfælde, hvor ionophoren er koblet til et makromolekyle, som har en receptor på overfladen af målcellerne (f.eks. når makromolekylet er et antistof eller et fragment af et antistof, der genkender et antigen, som er specifikt for den til nedbrydning bestemte cellepopulation, hvilket antigen er forskelligt fra det antigen, der genkendes af immunotoksinet), eller alter-nativt hvis ionophoren er koblet til et peptidhormon, der har en receptor på overfladen af de til nedbrydning bestemte celler, vil sandsynligheden for, at begge de valgte mål vil være tiljstede sammen på overfladen af ikke-mål cel lerne, blive 30 meget lille, således at der opnås en ekstremt effektiv metode til yderligere forøgelse af den specifikke natur af immunotok-siners cytotoksicitet.

De efterfølgende eksempler illustrerer opfindelsen, uden at 35 begrænse dens rammer.

Eksempel_l

Ionophort konjugat, der opnås ved omsætning af antistoffet

O

DK 164457 B

12 T 29-33, der er substitueret med en aktiveret disulfidgruppe; med monensin, hvori en thiol er blevet indført.

a) Antistof T 29-33 5

Dette antistof er et monoclonalt antistof, som er rettet mod antigenet T-200 i humane leukocyter. Dette antistof er beskrevet i J. Exp. Med., 1980, 152, 842. Det er kommercielt tilgængeligt fra Hybritech Inc., San Diego, Californien, USA.

10 ^i_^S£iveret_antistgf_T_29-33

En vandig opløsning indeholdende 3 mg 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)-propionsyre, der på forhånd er opløst i tertiær butanol, og 1,8 mg l-ethyl-3-dimethylaminopropyl-3-carbodiimid sættes 15 til 2 ml af en opløsning af antistof T 29-33 indeholdende 10 mg/ml (dvs. 0,133 μπιοί) antistof. Blandingen omrøres i 15 minutter ved 30°C og dialyseres derpå kontinuerligt mod 125 mM phosphatpuffér ; med pH 7 (40 timer ved 500 ml/time).

Efter dialyse centrifugeres proteinopløsningen til opnåelse 9Ω , af 2,5 ml af en opløsning indeholdende 6,6 mg modificeret antistof pr. ml. Ved hjælp af spektrofotometrisk analyse ved 343 nm af den ved udveksling med 2-mercaptoethanol frigjorte pyridin-2-thion viser det sig, at det opnåede antistof indeholder 7,2 aktiverende grupper pr. mol antistof.

25 c|_Aktiveret_monensin

Det benyttede monensin er et kommercielt produkt. Det blev modificeret som følger. 693 mg monensin opløses i chloroform og omsættes derpå med 350 mg S-acetylmercaptoravsyreanhydrid 30 (SAMSA). Reaktionen lades forløbe i 1/2 time ved omgivelsernes temperatur. Reaktionsmediet inddampes derpå til tørhed under vakuum, og resten optages i ethylacetat, hvorpå blandingen vaskes vidtgående med vand. Den organiske fase tørres 35 derpå og inddampes til tørhed under vakuum. Produktet opnås i krystallinsk form efter tørring under vakuum. Det identificeres ved dets NMR-spektrum og dets massespektrum.

Det således opnåede produkt (S-acetyl-aktiveret monensin) har ovennævnte? formel TT. hvori I® er rlon monenc;! nrpsf _ hwnrfra den primære hydroxylgruppe er blevet fjernet, og W er en ace tyl gruppe.

DK 164457 B

O

13

Acetylgruppen kan frigøres ved omsætning med hydroxylamin 5 ved slutkoncentration på 50 mM, og det således opnåede produkt, som svarer til ovenstående formel III, hvori 1° er den monen-sinrest, hvorfra den primære hydroxylgruppe er blevet fjernet, og W er hydrogen, kan anvendes direkte til koblingsoperationen.

10

Til det næste trin foretrækkes det imidlertid at frigøre thiol-gruppen in situ i nærværelse af det S-acetylaktiverede monensin og det det aktiverede antistof.

15 ^i_I!f§iB§tilling_af _det_ionophore_konjugat 8 mg. (dvs. 9 μπιοί) S-acetylaktiveret monensin opløses i den minimale mængde tert.-butanol, og opløsningen sættes til 2,5 ml af en opløsning af aktiveret antistof indeholdende 6,6 mg/ml (dvs. 0,11 μπιοί) i 125 mM phosphatpuffer med pH 7.

20 125 μΐ af en 1 N hydroxylaminopløsning tilsættes.

Inkubation finder sted i 2 timer ved 25°C, og reaktionsmediet renses derpå til fjernelse af overskud af reagenser ved dialyse mod PBS-puffer (10 mM med hensyn til phosphat, 140 mM 25 med hensyn til natriumchlorid, pH 7,4).

Dialyse og centrifugering resulterede i 2,8 ml af en opløsning af IgG T 29-33 indeholdende 5,6 mg/ml, der bærer et gennemsnit på 7 monensiner pr. mol antistof.

30

Eksempel_2

Potentiering af immunotoksinet anti-T65.

Konjugatet ifølge opfindelsen, der er opnået som ovenfor anført, 35 blev undersøgt med hensyn til dets biologiske egenskaber og nærmere betegnet dets evne til at potentiere immunotoksinet anti-T65's aktivitet i en egnet cellemodel.

DK 164457B

O

14

Denne model består af celler af CEM human lymfoblastoidlinien, som naturligt bærer antigenerne T65 og T200. Antigenet T65, mod hvilket det benyttede immuntoksin er rettet, udgør modellens første målantigen. Dette immunotoksin er det der er 5 beskrevet i beskrivelsen til en tidligere fransk patentansøgning nr. 81/21836. Antigenet T200, mod hvilket det ionophore konjugat er rettet, vil være modellens andet målantigen.

Eftersom immunotoksiners fundamentale egenskab består/at inhi- 10 bere målcellernes proteinsyntese,' består det benyttede forsøg i at måle de undersøgte stoffers virkning på inkorporeringen af C^-leucin i cancercellerne under dyrkning. Denne måling udføres ved hjælp af en metode, der er tilpasset metoden i

Journal of Biological Chemistry, 1974, 249 (11), 3557-3562, 15 τ λ under anvendelse af sporstoffet C -leucin til bestemmelse af proteinsyntesegraden. Den inkorporerede radioaktivitet bestemmes her på de hele celler, som er isoleret ved hjælp af filtrering.

20 På basis af disse bestemmelser er det muligt at optegne dosis/ virkning-kurverne, idet man efter abscissen afsætter den molære koncentration af A-kæde i de undersøgte stoffer, og efter 14 ordinaten afsætter inkorporeringen af C -leucin, udtrykt 2S som en procentdel af inkorporeringen i kontrolcellerne under fravær af noget stof, der påvirker proteinsyntese.

Det er således muligt for hvert undersøgte stof at bestemme 14 den koncentration, som inhiberer inkorporeringen af C -leucin 3Q med 50%, eller "50% inhiberende koncentration" (IC^q).

De forskellige forsøg blev udført på følgende måde, idet de tilsvarende forsøgsresultater er vist i fig. 1.

35 a) CEM-celler inkuberes i 18 timer i nærværelse af kendte koncentrationer af immunotoksin anti-T65, der anvendes som referencestof, og cellerne underkastes derpå trinnet til inkorporering af det radioaktive sporstof. Den opnåede IC^-vær--11 di er 2,8*10 M (kurve 1), hvilket viser, at cellerne har

O

15

DK 164457 B

en normal følsomhed over for virkningen af immunotoksinet.

b) CEM-cellerne inkuberes i 18 timer ved 37°C i nærværelse af en blanding af kendte koncentrationer af immunotoksin anti-5 T65 og henholdsvis enten: 1 - fri monensin i en koncentration på 50 nM (kurve 2), eller 2 - ionophort konjugat anti-T200, der allerede er beskrevet, —8 i en koncentration på 10 M (dvs. 70 nM med hensyn til monen- 10 sin) (kurve 3).

Et kontrolforsøg blev forinden udført for at vise, at monensin og det ionophore konjugat ikke var cytotoksiske over for de benyttede celler i de angivne koncentrationer.

De opnåede IC^-værdier er henholdsvis: -14 2.4- 10 M for 50 nM monensin, og -14 -8 1.4- 10 M for 10 M ionophort konjugat.

20

Disse resultater viser bemærkelsesværdige potentierende virkninger med en faktor på 1000 gange for 50 nM monensin og 2000 _o gange for det ionophore konjugat ved en koncentration på 10 M (dvs. 70 nM med hensyn til monensin).

25

Eksempel_3

Ionophort konjugat, som er opnået ved omsætning af det med en aktiveret disulfidgruppe substituerede antistof 3E10 med monensin, hvori en thiol er blevet indført.

30

Dette antistof er et monoclonalt antistof, der er rettet mod et humant membranantigen. Det blev opnået fra en lymfo- cytisk sammensmeltning af anti-celler af human melanoma SK 35 MEL 28 (R.G. Woodbury et al., Proceeding National Academy of Sciences, 77, side 2183-2186, 1980). Hybridomaen blev c.lonet og formeret. Antistoffet blev produceret i ascites-væske og derpå renset på Sepharose protein A.

O

DK 164457 B

16 ^i_dlSiiY§£§t_antistof_3E10

Dette antistof opnås ud fra ovennævnte antistof ved hjælp af en i eksempel 1 beskrevet teknik, hvorved der opnås 195 5 mg antistof 3E10 med 8 aktiverende grupper pr. mol antistof.

c2_Aktiveret_monensin

Monensinet aktiveres ved hjælp af den i eksempel 1 beskrevne metode.

10 d) Fremstilling af det ionophore konjugat 91 mg S-acetylaktiveret monensin (dvs. 104 μΐηοΐ) opløses i den minimale mængde tert.-butanol og sættes til 50 ml af en opløsning af aktiveret antistof indeholdende 3,9 mg/ml (dvs 1,3 μΐηοΐ) i 125 mM phosphatpuffer med pH 7. 2,5 ml af en 1 N hydroxylaminopløsning tilsættes.

Inkubation finder sted i 2 timer ved 25°C, og reaktionsmediet 2Q renses derpå til fjernelse af overskud af reaktanter ved hjælp af dialyse mod PBS-puffer (10 mM med hensyn til phosphat, 140 mM med hensyn til natriumchlorid, pH 7,4). Dialyse og centrifugering resulterede i 2,8 ml af en opløsning af IgG indeholdende 3,7 mg/ml, der indeholder et gennemsnit på 8 25 monensiner pr. IgG.

Eksempel_4_

Toksicitet af konjugatet 3E10/monensin.

30 Konjugatet 3ElO/monensin blev undersøgt for dets biologiske egenskaber in vivo. Nærmere betegnet blev dets toksicitet og dets farmakokinetik sammenlignet med fri monensins toksicitet og farmakokinetik.

35 Fri monensins toksicitet blev bestemt på mus. Den 50% dødelige dosis efter intravenøs indjektion er 4 mg/kg, dvs. 80 μg/mus.

O

DK 164457B

17

Konjugatets toksicitet blev afprøvet på mus i en enkelt ad- · ministration, også intravenøst. Produktet blev injiceret intravenøst i følgende doser til mus i hver gruppe: 3,7 mg, 1,85 mg, 0,952 mg og 0,496 mg konjugat, dvs. den ækvivalente 5 mængde monensin på henholdsvis 163 pg, 81,5 μg, 40,75 pg og 20,4 pg. Ingen dødelighed blev iagttaget i nogen af musegrupperne.

Eksempel 5 10 ----------

Farmakokinetik for konjugatet 3E10/monensin.

Farmakokinetikken blev undersøgt på nøgne hunmus ved anvendelse af det i eksempel 3 beskrevne ionophore konjugat.

15

Musene injiceres med følgende: - enten 1 ml ionophort konjugat indeholdende 3,7 mg/ml (dvs.

163 pg koblet monensin), 2Q - eller 163 pg fri monensin (kontrolgruppe).

Hver gang udtages prøver af plasmaet fra to mus. Det aktive monensin bestemmes i plasmaet ved fortynding af dette og sammenligning med en standardkurve for fri monensin ved forsøget 25 med inhibering af proteinsyntese, der er beskrevet i eksempel 1.

Bestemmelsen foretages på SEM-celler i nærværelse af immuno-toksinet anti-T65.

30

Resultaterne er angivet i fig. 2, hvori tiden i timer er blevet afsat efter abscissen, og monensinkoncentrationen i pg/ml er blevet afsat efter ordinaten. Resultaterne viser at: 1) det frie monensin kan ikke påvises i plasmaerne (undtagen 35 på tidspunktet nul, når der findes en plasmakoncentration på 5·10 ;M, dvs. ca. 0,5 pg/ml, hvilket svarer til en mængde på 0,007% af den injicerede dosis i den samlede blodmasse i musen), og

O

DK 164457 B

18 2) konjugatet kan påvises i mindst 8 timer i en koncentration af størrelsen 10 Mg/ml, dvs. ca. 1*10 5M.

Efter 24 timer er den fundne koncentration nu kun af størrelsen 5 1,5 μρ/πιΐ. Denne koncentration er ikke desto mindre 100 gange større end den koncentration, som er nødvendig til maksimal aktivering under in vitro forsøgenes betingelser.

Eksempel 6 10 ----

Ionophort konjugat, der er opnået ved omsætning af humant serumalbumin (SA), som er substitueret med en aktiveret disul-fidgruppe, med monensin, hvori en thiol er blevet indført.

15 a2_Aktiveret_humant_serumalbumin SA opnåedes fra ovennævnte SA ved hjælp af en metode, der er analog med den for antistofferne i de foregående eksempler beskrevne, hvilket fører til 220 mg SA indeholdende 16 aktiverende grupper pr. mol albumin.

20 ^i_^3Siiveret_monensin

Monensinet aktiveres ved hjælp af den i eksempel 1 beskrevne metode 25 2l_Ii§5f§tiIIiS2_§l_å§i_i2ii22i}2re_kgnjugat 228 mg S-acetylaktiveret monensin, dvs. 268 μπιοί, opløses i den mindste mængde tert.-butanol og sættes til 23 ml af en opløsning af aktiveret SA indeholdende 9,4 mg/ml (dvs.

30 52,7 μπιοί) i 125 mM phospha tpuf fer med pH 7. 1,15 ml af en 1 N hydroxylaminopløsning tilsættes.

Inkubation varer 1 time ved 25°C, og reaktionsmediet dialyseres derpå mod PBS-puffer (10 mM med hensyn til phosphat, 140 mM 35 med hensyn til natriumchlorid, pH 7,4).

Dialyse og centrifugering resulterede i 28 ml af en opløsning af modificeret SA indeholdende 8,7 mg/ml, der bærer et gennem-

DK 164457 B

O

19 snit på 16 monensiner pr. mol albumin.

Eksempel_7_ 5 Farmakokinetik for konjugatet SA/monensin.

Farmkokinetikken blev undersøgt på nøgne hanmus under anvendelse af det i eksempel 6 beskrevne ionophore konjugat.

10 Den benyttede forsøgsforskrift er den samme, som den i eksempel 5 beskrevne.

Resultaterne er angivet i fig. 3, hvori tiden i timer er blevet afsat efter abscissen, og monensinkoncentrationen i μg/Ial 15 er blevet afsat efter ordinaten. Resultaterne viser, at: 1) ligesom i tilfælde af eksempel 5 kan det frie monensin ikke påvises i plasmaerne, og 2) konjugatet kan påvises i mindst 4 timer i en koncentration 20 af størrelsen 30 μg/ml. Efter 8 timer er den nu fundne koncentration kun af størrelsen 6 pg/ml. Denne koncentration er ikke desto mindre 400 gange større end den koncentration, der er nødvendig til maksimal aktivering under in vitro forsøgenes betingelser.

25

Eksempel_8

Ionophort konjugat, der er opnået ved omsætning af fragmentet F(ab')2af antistoffet anti-T65, som er substitueret med en 30 aktiveret disulfidgruppe, med monensin, hvori en thiol er blevet indført.

a) Fragment F(ab')2 anti-T65.

Fragmentet F(ab')2 anti-T65 blev opnået ud fra det tidligere beskrevne antistof anti-T65 ved enzymatisk hydrolyse ved hjælp 35 af pepsin. Antistoffet anti-T65 dialyseres forinden mod 0,1 M natriumformiatpuffer med pH 3,7, og 176 mg antistof inkuberes derpå i nærværelse af pepsin (0,05 mg pepsin pr. mg antistof) i 2 timer ved 37°c. Enzymreaktionen standses derpå med 2,05

O

DK 164457 B

20 ml 2 M trispuffer.

Opløsningen centrifugeres og renses derpå ved filtrering på en ACA 44-søjle, idet afgangsstrømmens optiske tæthed måles 5 ved 280 nm. Inddampmng af de kombinerede rensede fraktioner resulterer i 26 ml af en opløsning indeholdende 3,3 mg/ml.

b) Aktiveret fragment F(ab')2 anti-T65 10 Produktet opnåedes ud fra det ovenfor beskrevne fragment F(ab')2 ved hjælp af en metode, der er analog med den for antistofferne i eksempel 1-b beskrevne, hvorved der opnåedes 0,5 mg F(ab')2 anti-T65 med 34,3 aktiverende grupper pr. mol antistof.

15 c) Aktiveret monensin.

Monensinet aktiveres ved hjælp af den i eksempel 1-c beskrevne metode.

d) Fremstilling af ionophorct konjugat.

20 0,44 mg (dvs. 0,52 mikromol) monensin opløses i den mindste mængde tert.-butanol og sættes til 1,02 ml af en opløsning af aktiveret F(ab')2 indeholdende 0,33 mg/ml (dvs. 0,003 mikromol) i 125 mM phosphatpuffer med pH 7 i nærværelse af 54 μΐ 1 M hydroxylaminopløsning.

25

Inkubationen varer 1 time ved 25°C, og reaktionsmediet renses derpå til fjernelse af overskud af reaktanter ved dialyse mod PBS-puffer (10 mM med hensyn til phosphat, 140 mM med 30 hensyn til natriumchlorid, pH 7,4). Dialyse og centrifugering resulterede i 1,1 ml af en opløsning af F(ab')2 anti-T65 indeholdende 0,33 mg/ml, der bærer et gennemsnit på 34 monensiner pr. F(ab')2.

35 Eksempel_9_

Ionophort konjugat, der er opnået ved omsætning af humant serumalbumin, som er substitueret med aktiverede disulfidgrupper, med for det første antistoffet anti-DNP, hvori en

DK 164457 B

O

21 thiol er blevet indført, og for det andet monensin, hvori en thiol er blevet indført. Udtrykket anti-DNP antistoffer betegner antistoffer, som er specifikt rettet mod 2,4-dini- trophenylgruppen.

5 a) Fremstilling af antistoffet anti-DNP.

Anti-DNP antistofferne, der anvendes i dette eksempel, opnås ved den metode, der er omhandlet i eksempel 4 i beskrivelsen 10 til fransk patentansøgning nr. 78/27838.

40 mikroliter af en opløsning af S-acetylmercaptoravsyreanhy-drid (SAMSA) indeholdende 17 mg/ml i DMF sættes til 30 mg af en opløsning af IgG anti-DNP indeholdende 6,5 mg/ml, dvs.

15 0,2 mikromol. Reaktionsmediet omrøres i 2 timer og renses derpå til fjernelse af overskud af reaktanter ved dialyse mod 125 mM phosphatpuffer med pH 7 i 24 timer med en hastighed på 400 ml/time.

20 Dette fører til 4,5 ml af en opløsning indeholdende 6,4 mg/ml. Ved hjælp af spektrofotometrisk analyse af SH-grupperne, som er frigjort ved omsætning med hydroxylamin, findes det, at det opnåede IgG bærer 4,4 SH-grupper pr. mol antistof.

25 b) Fremstilling af det aktiverede serumalbumin.

Det aktiverede serumalbumin opnåedes fra humant serumalbumin ved hjælp af en metode, som er analog med den i det foregående eksempler for antistofferne beskrevne, hvorved der opnås 30 mg serumalbumin indeholdende 38 aktiverende grupper pr.

30 mol albumin.

c) Aktiveret monensin.

Monensinet aktivers ved hjælp af den i eksempel 1-c beskrevne 35 fremgangsmåde.

d) Fremstilling af det ionophore konjugat.

3,5 ml af opløsningen af modificeret antistof anti-DNP (dvs.

DK 164457 B

22

O

0,149 mikromol) sættes til 4,1 ml af opløsningen af det som -ovenfor anført opnåede aktiverede serumalbumin (dvs. 0,450 mikromol). 380 mikroliter af en 1 N hydroxylaminopløsning tilsættes, og blandingen lades henstå i 5 timer ved 30°C.

5 Reaktionsmediet renses ved filtrering på en søjle af "SEPHA-DEX" G200, idet den optiske tæthed måles ved 280 nm. Fraktionerne indeholdende både antistoffet og serumalbuminet kombineres til opnåelse af 16 ml konjugat, der renses til fjernelse af overskud af frie antistoffer ved passage gennem en 10 søjle af DEAE-trisacr.ryl (IBF). Eluering foretages i 0,02 M trispuffer med pH 8,8 ved hjælp af en NaCl-gradient fra 0,035 M til 0,1 M, idet den optiske tæthed måles ved 280 nm.

Fraktionerne indeholdende både antistoffet og serumalbuminet 15 (SAH) kombineres, dialyseres mod 125 mM phosphatpuffer med pH 7 og inddampes derpå ved ultrafiltrering. Dette fører til 12 ml af en opløsning af konjugat IgG/SAH. Den gennemsnitlige koblingsgrad for dette præparat, bestemt ved hjælp af elektroforetisk densitometri, er 1,5 mol serumalbumin pr.

20 mol antxstof.

4,86 mg aktiveret monensin (dvs. 5,76 mikromol), som er opløst i den mindste mængde tert.-butanol, sættes til denne opløsning.

600 mikroliter af en 1 N hydroxylaminopløsning tilsættes, 25 o blandingen henstilles i 1 time ved 25 C, og reaktionsmediet dialyseres derpå mod PBS-puffer (10 mM med hensyn til phos- phat + 140 mM med hensyn til natriumchlorid, pH 7,4).

Dialyse og centrifugering resulterede i 13,5 ml af en opløs-30 ning af konjugat IgG/SAH indeholdende 0,915 mg/ml der bærer et gennemsnit på 26 monensiner pr. IgG (dvs. 17,4 monensiner pr. SAH).

Eksempel 10 35 ----------

Potentiering af immunotoksinet T65.

Konjugatet ifølge opfindelsen, der er opnået som anført i

DK 164457 B

O

23 eksempel 9, blev undersøgt for dets evne til at potentiere aktiviteten af immunotoksinet anti-T65 i den i eksempel 2 beskrevne cellemodel.

5 I et første trin kan CEM-cellerne eventuelt være kunstigt mærket med TNP, dvs. 2,4,6-trinitrophenylgruppén,som er mål-molekylet i det ionophore konjugat.

I et andet trin inkuberes disse celler sammen med det iono-10 phore konjugat og/eller immunotoksinet anti-T65, hvorefter proteinsyntesens inhiberingsgrad måles ved hjælp af den i eksempel 2 beskrevne metode.

a) Mærkning af cellerne med TNP.

15 Mærkningen med TNP udføres ved +4°C ved inkubering af 2 10^-CEM-celler pr. ml PBS-puffer med et tilsvarende volumen af en opløsning indeholdende 10 mg/ml natriumtrinitrobenzensulfo-nat. Reaktionen standses efter 15 sekunder ved tilsætning 20 af et overskud af en 10 JM opløsning af L-lysin. Derpå vaskes cellerne.

b) Måling af proteinsyntesens inhiberingsgrad.

CEM-cellerne, som eventuelt kan være mærket med TNP, bliver 25 5 i en koncentration på 5*10 pr. ml inkuberet i 1 time ved 4°C sammen det ionophore konjugat, der er tilsat i en koncen- _7 tration på 10 M med hensyn til antistoffer. Efter vaskning ved 4°C suspenderes cellerne i leucinfrit RPMI-1640 medium indeholdende 10% termisk inaktiveret kalvefosterserum og anti- 30 o biotika, og cellerne inkuberes derpå i 20 timer ved 37°C i nærværelse af kendte koncentrationer af immunotoksin anti-T65.

Cellerne underkastes derefter trinnet til inkorporering af det radiaktive sporstof.

35 c) Aktivitet af monensinet efter kobling (fig. 4).

De ikke-mærkede CEM-celler inkuberes direkte sammen med im-

O

DK 164457 B

24 raotoksinet i forskellige koncentrationer og med det koblede * eller ikke-koblede monensin, der er indført i en fast koncen- __o tration på 5·10 M. Potentieringen af immunotoksinets cytotoksicitet er identisk i de to. tilfælde, hvilket viser, at 5 koblingen af monensinet ikke påvirker dets aktiverende egenskaber.

d) Specificitet af aktiveringen af immunotoksinet (IT) ved hjælp af det ionophore konjugat (fig. 5).

10

Kurven 1 (kontrol) viser, at efter mærkning af cellerne med TNP, præinkubation med antistoffet anti-DNP i en koncentration _7 på 10 M og derpå inkubation med IT og monensinet i en kon- —8 centration på 5*10 M bevares potentieringen af IT ved hjælp 15 af ionophoren fuldt ud.

Kurven 2 repræsenterer den cytotoksicitet, der opnås ved præinkubation af de TNP-mærkede celler sammen med det ionophore _7 konjugat, der er indført i en koncentration på 10 M med hen-20 -6 syn til antistoffer, dvs. 2,6*10 M med hensyn til monensin, efterfulgt af inkubation sammen med immunotoksinet. Den opnåede ICgg-værdi er ikke mærkbart forskellig fra den IC,-ø-værdi, som opnås med det frie monensin (kurve 1).

25

Kurve 3 repræsenterer aktiviteten af det samme ionophore konjugat, der er præinkuberet sammen med de samme celler, med undtagelse af at de ikke er mærket med TNP.

En sammenligning mellem kurverne 2 og 3 viser, at den med det ionophore konjugat opnåede aktivering er meget specifik for de celler, der bærer antigenet (i dette tilfælde haptenet TNP) svarende til det ionophore konjugats antistof. Specificitetsfaktoren her er større end 100.

35

Kurve 4 viser de opnåede resultater, når de TNP-mærkede celler præinkuberes sammen med antistoffet anti-DNP og med det ukob-lede monensin. Immunotoksinets cytotoksicitet er meget lav i dette tilfælde og er identisk med den under de samme for

Claims

15 Patentkrav.

1. Konjugat, kendetegnet ved, at det er opnået ved kobling af en monovalent carboxyl ionophor (som defineret på 20 side 2, linie 26 - 38) til et makromolekyle ved hjælp af en kovalent binding, hvi1ket makromolekyle er valgt blandt antistoffer, antistoffragmenter, proteiner, såsom peptidhormoner eller humane proteiner, peptidligander og blandede makromole-kyler, der er dannet ved kovalent kobling af et antistof og et 25 protein.

2. Konjugat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at ma-kromolekylet er et monoklonalt antistof.

3. Konjugat ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at koblingen ved hjælp af en kovalent binding er opnået ved hjælp af en disulfidbinding eller en thioetherbinding.

4. Konjugat ifølge ethvert af kravene 1 til 3, kende- 35 tegnet ved, at ionophoren har en primær hydroxy1 gruppe.

5. Konjugat ifølge ethvert af kravene 1-4, kendetegnet ved, at ionophoren er monensin, nigericin, grisonixin DK 164457 B eller lasalocid.

6. Konjugat ifølge ethvert af kravene 1 til 5, kendetegnet ved, at makromolekylet er valgt blandt antistof- 5 fet T29-33, antistoffet 3E10, antistoffet anti-DNP og humant serumal bumi n.

7. Fremgangsmåde til fremstilling af konjugaterne ifølge ethvert af kravene 1 til 6, kendetegnet ved, at den 10 består i: 1. indføring af en thiolgruppe i en af de til kobling bestemte forbindelser, 15 2) indføring af en eller flere grupper, der er i stand til at reage_re med nævnte thiolgrupper, i den anden forbindelse, og 3. omsætning af de to resulterende forbindelser i et vandigt medium ved en pH-værdi mellem 5 og 9 og ved en temperatur un- 20 der 30°C.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at ionophoren, der bærer en thiolgruppe, omsættes med et makro-molekylte, hvori en gruppe, der er i stand til at reagere med 25 thiolgruppen, er blevet indført, og at denne reaktive gruppe har formlen -S-S-X, hvori X betegner en aktiverende gruppe.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at ionophoren, der bærer en thiolgruppe, omsættes med et makromo- 30 lekyle, hvori en gruppe, der er i stand til at reagere med thiolgruppen, er blevet indført, og at denne reaktive gruppe har formlen: >_

35 -NH-CO-Z-tt o>/_^ DK 164457 B hvori Z er en alifatisk eller aromatisk afstandsgruppe indeholdende fra 1 til 10 carbonatomer.

10 I ch2cooh hvori 1° betegner den ionophorrest, hvorfra en af hydroxyl-grupperne er blevet fjernet, og at thiolgruppen i ovennævnte forbindelse frigøres ved omsætning med hydroxylamin til opnå-15 else af forbindelsen med formlen: 1° - 0 - CO - CH - SH CH2COOH 20 hvori 1° er som ovenfor defineret.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, 5 at indføringen af thiolgruppen i ionophoren udføres ved omsætning af ionophoren med S-acetylmercaptoravsyreanhydrid til opnåelse af en forbindelse med formlen: 1° - 0 - CO - CH - S - CO - CH3

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at 1° er monensin eller nigericin, hvorfra den primære hydro-xylgruppe er blevet fjernet. 25

12. Anvendelse af konjugatet ifølge ethvert af kravene 1 til 6 som immunotoksinpotentierende middel.

13. Medicinsk forbindelse, kendetegnet ved, at den 30 indeholder mindst et immunotoksin og mindst et konjugat ifølge ethvert af kravene 1 til 6. 35