DK160561B

DK160561B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af 3-aminopregn-5-enderivater eller salte deraf

Info

Publication number: DK160561B
Application number: DK473182A
Authority: DK
Inventors: Vesperto Torelli; Josette Benzoni; Roger Deraedt
Original assignee: Roussel Uclaf
Priority date: 1981-10-27
Filing date: 1982-10-26
Publication date: 1991-03-25
Also published as: ES8405035A1; ES516825A0; IE54278B1; HU186983B; GB2110212B; JPH0411559B2; JPS5883700A; DK473182A; CA1193247A; DE3239823A1; DE3239823C2; IT8249354A0; PT75756A; FR2515188B1; ES8401497A1; AT387023B; DK160561C; SE8204918D0; BE894805A; FR2515188A1

Description

- 1 -

DK 160561 B

Opfindelsen angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte 3-aminopregn-5-enderivater eller deres additionssalte med uorganiske eller organiske syrer og med den almene formel I som anført i krav l's indledning.

5 I den almene formel I og i det følgende betegner udtrykket alkyl med 1-5 carbonatomer, f.eks. methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl eller pentyl, udtrykket hydroxy-alkyl med 2-5 carbonatomer betegner f.eks. hydroxyethyl el-10 ler hydroxypropyl. Udtrykket acyl afledt af en carboxylsyre med 3-8 carbonatomer betegner f.eks. propionyl, n-butyryl eller isobutyryl, udtrykket alkoxycarbonyl med 2-8 carbonatomer betegner f.eks. methoxy-, ethoxy- eller propoxycarbonyl. Resten, som afledes af en alpha-aminosy-15 re, kan f.eks. vælges blandt Ala, Val, Leu, Ile, Asp, Asn,

Glu, Gin, Ser, Thr, Cys, Met, Lys, Arg, Phe, Tyr, Trp, His,

Pro, Nva, Nle, Hyp og Orn, idet disse aminosyrer er i D-eller L-form, samt Sar og Gly. Når betegner en gruppe afledt af et peptid med 2-3 alpha-aminosyrer, vælges disse 20 f.eks. blandt alpha-aminosyrerne ovenfor.

Når alpha-aminosyrerne eller peptiderne er N-mono- eller dialkylerede, er det fortrinsvis med methyl, ethyl eller propyl.

25

Det fastlægges konventionelt, at symbolerne for alpha-aminosyrerne repræsenterer disse syrer i deres D- eller L-kon-figuration (f.eks. angiver udtrykket Ala alanin i D-eller L-form).

30

Den benyttede nomenklatur er ifølge IUPAC, hvis regler især er offentliggjort i Biochem. J. (1972) 1926, 773-780.

Additionssaltene med de uorganiske eller organiske syrer 35 kan f.eks. være de salte, som dannes med saltsyre, hydro-genbromidsyre, salpetersyre, svovlsyre, phosphorsyre, eddi- - 2 -

DK 160561 B

kesyre, myresyre, propionsyre, benzoesyre, maleinsyre, fu-marsyre, ravsyre, vinsyre, citronsyre, oxalsyre, glyoxylsy-re, asparaginsyre, alkansulfonsyrer såsom methan- eller ethansulfonsyre, arylsulfonsyrer såsom benzen- eller p-to-5 luensulfonsyre og arylcarboxylsyrer.

Blandt de forbindelser, som fås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, skal især nævnes derivaterne med formlen I samt deres syreadditionssalte med uorganiske eller organi-10 ske syrer, hvor aminogruppen er i 3alpha-stillingen, betegner et hydrogenatom, og R2 betegner en acylgruppe afledt af en alpha-aminosyre eller af et peptid med 2-3 aminosyrer.

15 Blandt disse skal især nævnes de derivater med formlen I, hvor X betegner CH., CH-j

I 3 eller | 3 -C=0 -CH/wOH

hvor hydroxidet er i 20alpha-stillingen, og navnlig 20 3alpha-methyl-ammopregn-5-en-20-on og de andre i eksemplerne fremstillede forbindelser.

Værdien af de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser påvises ved rosettesten ved sammen-25 ligning af forbindelserne fra eksempel 1, 2, 3 og 4 nedenfor med 3alpha-aminopregn-5-en-20-on-hydrochlorid (forbindelse A) .

A. Rosettest på røde blodceller fra får 3 0

Indgift på dyr af en forbindelse som er i stand til at stimulere immunsystemet, fører til en forøgelse af deres evne til at reagere på en indsprøjtning af et immunogent stof.

3 måneder gamle hanrotter sensitiveres ved intraperitoneal indsprøjtning af fåreerythrocytter på dag 0; 7 dage efter fjernes milten, og splenocytterne bringes i kontakt med fa-reerythrocytter. Procentsatsen af splenocytter, omkring 35

DK 160561 B

- 3 - hvilke erythrocytterne danner en roset, bestemmes. Testforbindelserne indgives oralt daglig fra dag -1 til dag 1, og den immunostimulerende dosis er den dosis af forbindelsen, som fordobler procentsatsen af rosetter, som iagttages 5 i forhold til kontroldyr. Resultaterne fremgår af tabel I.

Tabel I

Eksempel nr. Dosis i mq/kg 10 12 2 1 3 2 4 5 . c Forbindelse A inaktiv ved 5

1 O

B. Akut toksicitet

Den akutte toksicitet bestemmes ved oral indgift af testforbindelserne på mus, og den maksimale dosis, som ikke 2q forårsager nogen dødelighed efter 8 dage, bestemmes (LDq). Resultaterne fremgår af tabel II.

Tabel II

25 Eksempel nr. LD^ i mg/kq 1 200 2 400 3 400 4 600 30

Forbindelse A 200

Resultaterne af tabel I viser, at forbindelserne fremstillet ifølge opfindelsen har god immunostimulerende virkning.

2^ Omvendt har 3-amino-pregn-5-en-20-on ikke nogen virkning ved den undersøgte maksimale dosis på 5 mg/kg.

DK 160561 B

- 4 -

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

Under foretrukne betingelser for iværksættelse af frem-5 gangsmåden ifølge opfindelsen går man frem som følger: a) Omsætningen af aminen med formlen II med halogenidet med formlen III udføres i nærværelse af et syrebindende middel, især et hydroxid, et carbonat, et bicarbonat eller 10 et alkalimetalacetat (f.eks. natrium- eller kaliumacetat), et jordalkalimetalcarbonat (f.eks. calciumcarbonat), en tertiær amin (f.eks. trialkylamin eller pyridin) eller et alkalimetalalkoholat (f.eks. natriumethylat). Omsætningen kan f.eks. udføres i indifferente opløsningsmidler eller 15 suspensionsmedier såsom dioxan, dimethylformamid, benzen, toluen eller et halogeneret carbonhydrid såsom methylen-chlorid.

b) Omsætningen af aminen med formlen II med en syre med 20 formlen III1 udføres med et aktiveringsmiddel såsom et carbodiimid. Anden teknik kan benyttes, f.eks. den ifølge "The Peptides", bd. 1, Academic Press 1979.

c) Omsætningen af aminen med formlen II eller af forbin- 25 delsen med formlen I, hvor betegner et hydrogenatom, og betegner hydroxylalkyl, med alpha-aminosyren eller pep-tidet, hvis aminogruppe er monosubstitueret, disubstitueret eller beskyttet med en let fraspaltelig beskyttelsesgruppe, finder sted i nærværelse af et kondensationsmiddel. Konden-30 sationsmidlet har i dette tilfælde det formål at aktivere syregruppen i aminosyren.

Som kondensationsmiddel kan man benytte et carbodiimid med formlen 35 A1-N=C=N-B1 hvor A^ og betegner en alkylgruppe med 1-8 carbonatomer, som eventuelt bærer en dialkylaminogruppe, eller betegner

DK 160561 B

- 5 - en cycloalkylgruppe.

Man kan især nævne dicyclohexylcarbodiimid eller 1-ethyl--3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, fortrinsvis sidstnævnte .

5

Man kan ligeledes benytte et 2-chlor-N-methylpyriniumhalo-genid såsom iodidet.

Man kan ligeledes benytte et alkylchlorformiat såsom f.eks.

10 methyl-, ethyl- eller isobutylchlorformiat. Man kan også benytte et alkylpyrophosphit såsom f.eks. ethylpyrophos-phit.

Som let fraspaltelig beskyttelsesgruppe kan man efter om-15 stændighederne benytte fortrinsvis benzyloxycarbonyl (Z) eller tert.-butyloxycarbonyl (BOC).

Til eliminering af ovennævnte let fraspaltelige beskyttelsesgruppe benytter man som spaltningsmiddel fortrinsvis en 20 syre såsom saltsyre. Man arbejder f.eks. ved hjælp af en alkoholisk opløsning af hydrogenchlorid eller ved hjælp af vandfrit hydrogenchlorid ved gennembobling i nitromethan.

Man kan også benytte syrer såsom p-toluensulfonsyre, myresyre eller trifluoreddikesyre. Man kan ligeledes benytte 25 hydrogen i nærværelse af palladium, f.eks. til fjernelse af beskyttelsesgruppen Z.

d) Omsætningen af aminen med formlen II med methyl- eller hydroxyalkylhalogenidet sker i nærværelse af de samme syre- 30 bindende midler og opløsningsmidler som i tilfælde af reaktionen med halogenidet med formlen III.

e) Omsætningen af forbindelsen med formlen I, hvor betegner et hydrogenatom, betegner en hydroxyalkylgruppe 35 med 2-5 carbonatomer, og X og bølgelinien har samme betydning som ovenfor, med halogenidet med formlen IV udføres

DK 160561 B

- 6 - alt efter karakteren af R’’’^ under de betingelser, som er beskrevet ovenfor i forbindelse med omsætningen af aminen med formlen II med halogenidet med formlen III.

5 Derivaterne med formlen I har basisk karakter med undtagelse af dem, hvor R2 betegner acyl eller alkyloxycarbonyl.

Man kan med fordel fremstille additionssaltene af derivaterne med formlen I, idet man omsætter i praktisk taget støkiometriske mængder af en uorganisk eller organisk syre 10 med derivatet med formlen I. Saltene kan fremstilles uden isolation af de tilsvarende baser.

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser har meget interessante farmakologiske egenskaber.

15 De har navnlig bemærkelsesværdige immunoterapeutiske egenskaber. De er navnlig egnede til at stimulere immunoreak-tioner.

Disse egenskaber er vist nedenfor i den eksperimentelle 20 del.

Disse egenskaber retfærdiggør anvendelsen af 3-aminopregn--5-enderivaterne samt deres farmaceutisk acceptable salte som lægemidler.

25

Blandt lægemidlerne skal især nævnes sådanne, som udgøres af de hidtil ukendte 3-aminopregn-5-ener med den almene formel I, hvor aminogruppen er i 3alpha-stilling, betegner hydrogen, og R2 betegner en gruppe afledt af en alpha-30 -aminosyre eller af et peptid med 2-3 aminosyrer, samt deres additionssalte med acceptable syrer i farmaceutisk henseende.

Blandt dem skal især nævnes sådanne med formlen I, hvor X 35 betegner gruppen

DK 160561 B

- 7 - CH, CH-,

| 3 eller | 3 -C=0 -CH OH

hvor hydroxylgruppen er i 20alpha-stilling, samt deres additionssalte med farmaceutisk acceptable syrer.

5

Blandt sidstnævnte skal især nævnes følgende: 2-amino-N-(20-oxopregn-5-en-3alpha-yl)-acetamid, (2S)-2-amino-N-(20-oxopregn-5-en-3alpha-yl)-propionamid og 10 - 3alpha-methylaminopregn-5-en-20-on samt deres additionssalte med farmakologisk acceptable syrer.

Disse lægemidler finder f.eks. anvendelse til behandlingen 15 af immunomangler og navnlig autoimmunosygdomme hidrørende fra en mangel ved visse lymfocyter, hvad enten det drejer sig om ikke-specifikke sygdomme i bindevævet i et organ som f.eks. reumatoid arthritis, erythematøs systemisk lupus eller det drejer sig om specifikke sygdomme i et organ såsom 20 thyroiditis, pemphigus eller hemolytisk anæmi.

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser kan benyttes som adjuvantbehandling i antibiote-rapien og i den anticancerøse kemoterapi.

25

Den normale dosis, som varierer efter det benyttede derivat, den behandlede patient og den pågældende lidelse, kan f.eks. være fra 10 mg til 1 g pr. dag ad oral vej hos mennesker af derivatet ifølge eksempel 4 som antibioterapeu-30 tisk adjuvant.

Derivaterne med formlen I samt deres additionssalte med u-organiske eller organiske syrer kan således benyttes til fremstilling af farmceutiske præparater, der indeholder de 35 omhandlede derivater eller salte som aktiv bestanddel.

DK 160561 B

- 8 -

Derivaterne med formlen I samt deres additionssalte med u-organiske eller organiske syrer kan således benyttes til fremstilling af farmaceutiske præparater, der indeholder de omhandlede derivater eller salte som aktiv bestanddel.

5

Som lægemidler kan derivaterne med den almene formel I og deres additionssalte med farmaceutisk acceptable syrer inkorporeres i farmaceutiske præparater beregnet til indgivelse ad fordøjelsesvejen eller parenteralt.

10

De farmaceutiske præparater kan f.eks. være faste eller flydende og foreligge i de i den humane medicin gængs benyttede farmaceutiske former som f.eks. tabletter, oversukrede tabletter, gelatinekapsler, granulater, stikpiller og 15 injektionspræparater. De fremstilles efter de gængse metoder. Den eller de aktive bestanddele inkorporeres deri sammen med i disse farmaceutiske præparater normalt benyttede tilsætningsstoffer såsom talkum, gummiarabicum, lactose, stivelse, magnesiumstearat, kakaosmør, vandige eller 20 ikke-vandige bærestoffer, fedtstoffer, dyrisk eller plantisk oprindelse, paraffinderivater, glycoler og diverse fugte-, dispergerings- eller emulgeringsmidler samt konserveringsmidler .

25 Udgangsforbindelserne med formlen II, hvor X betegner en gruppe CH0

-CH OH

kan fremstilles som følger: 30

Man reducerer en forbindelse med formlen V

- 9 -

DK 160561 B

hvor bølgelinien har samme betydning som ovenfor, ved hjælp af f.eks. et alkalimetal såsom natrium i et opløsningsmiddel såsom en lavmolekylær aliphatisk alkohol som ethanol til opnåelse af en forbindelse med formlen 10 2 hvor bølgelinien har samme betydning som ovenfor, i form af en blanding af 20alpha- og 20beta-isomere, som man adskiller, f.eks. ved fremstilling af trifluoracetylderivatet af 15 aminen og alkoholen, hvorpå man chromatograferer og hydrolyserer trifluoracetylgrupperne af de fraskilte isomere.

Et eksempel på en sådan præparation er vist nedenfor i den eksperimentelle del.

20

Aminosyrerne eller peptiderne, hvis amingruppe er mono- eller disubstitueret, kan fremstilles ved klassiske aminalk-yleringsprocesser.

25 Nedenstående eksempler illustrerer fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

30 35

DK 160561 B

- 10 -

Eksempel 1,

Hydrockloridet af 3«~meth.ylaminopregn-5-en-20~on.

Trin A: (20-oxopregn-5-en-5a-yl)-carbaminsyreethylester.

Man opløser 6 g 3a~aminopregn-5-en-20-on (holamin) 5 i 100 ml methylenchlorid, tilsætter ved 5-10°C 22 ml 1 K natriumhydroxidopløsning og derefter i løbet af 10 minutter 2 ml ethylchlorformiat og omrører i 1 time«

Man syrner med 15 ml 2 I saltsyre, dekanterer, vasker den organiske fase med vand, tørrer og inddamper 10 til tørhed. Man optager den opnåede rest i 70 ml ethyl-ether, opvarmer til tilbagesvaling, suger fra, vasker med ether, tørrer og får 6,25 g af den forventede forbindelse. Smp, 202°C.

Trin Bi (20«20-ethylendioxypregn-5-en-3a-vl)-carbamins,yre-15 ethylester.

Man opvarmer til ca. 50°C under indifferent atmosfære 10,9 g af det i forrige trin opnåede stof med 54,5 ml ethy-lenglycol og 22 ml ethylorthoformiat. Man tilsætter 220 mg monohydratiseret p-toluensulfonsyre og omrører i ca. 3 ti-20 mer. Man afkøler til 20°G, tilsætter 4,2 ml triethylamin, hælder under omrøring på 550 ml vand, suger fra, vasker med vand, tørrer ved 60°C og får 12 g af den forventede forbindelse. Smp. ca. 200°C,

Trin C: 5a-methylaminopregn-5-en-20-on (U-methylholamin) 25 og dets hydrochlorid.

Man suspenderer under indifferent atmosfære 1,145 g lithiumaluminiumhydrid i 110 ml tetrahydrofuran og indfører under tilbagesvaling i løbet af J>0 minutter 6,51 g af den i forrige trin opnåede forbindelse opløst i 65 ml te-30 trahydrofuran. Efter tilbagesvaling i 1 time 5 minutter bringer man på 15-20°C, tilsætter forsigtigt 15 ml vand og derpå 15 ml koncentreret saltsyre og omrører i 1 time 45 minutter. Man gør alkalisk med 25 ml kaliumhydroxid og 5 ml koncentreret ammoniakvand, omrører 10 minutter, 35 tilsætter 100 ml seignettesaltopløsning, dekanterer, ekstraherer med ethylacetat, vasker med mættet saltvand, tørrer, inddamper til tørhed under formindsket tryk, omkrystalliserer af ethylacetat og får 4,07 g af den forven-

DK 160561 B

- 11 - tede forbindelse* Snip, ca, 139°C,

Dannelse af h.ydrochlorid.

Man opløser 1,5 g base i 50 ml ethylacetat ved 25-5 0°C,tils ætter et overskud af hydrogenchlorid opløst i 5 ethylacetat, isafkøler, suger fra, vasker med ethylacetat, tørrer ved 40° C under formindsket tryk, omkrystalliserer af ethanol og får 1,31 g af den forventede forbindelse,

Smp. ca, 270°C.

Analyse: ^22^36^^0- = 365,99 10 beregnet: C fo 72,20 Efo 9,91 W° 3,83 Cl$ 9,69 fundet: 72,4 10,1 3,8 9,7

Eksempel 2,

Fumarat af 2-amino-N-meth:/l-N-(20-oxopregn-5-en-3g-.yl)-15 -acetamid,

Trin A: 2-( ((phen.ylmethox.y)-carbonyl)-amino)-N-( (20-oxo)--P regn-5 -en-5a-y 1) -N -me thy lace tamid,

Man opløser under indifferent atmosfære 4,43 g af basen fra eksempel 1 i 130 ml chloroform og 27 ml triethyl-20 amin, tilsætter 5,6 g N-(benzyloxycarbonyl)-glycin (Z-gly- cin) og i løbet af 20 minutter under omrøring 3,89 g 2- -chlor-N-methylp2/ridiniumiodid. 1 time senere tilsætter man 800 mg af pyridiniumsaltet ovenfor, omrører i 20 minutter, tilsætter yderligere 400 mg pyridiniumsalt, omrører endnu 25 i 20 minutter, vasker med 1 N saltsyre og med 1 N natriumhydroxid samt med vand, tørrer, inddamper til tørhed, renser ved chromatografi på silicagel (elueringsmiddel: me-thylenchlorid og ethylacetat (9:1)), omkrystalliserer af ethylacetat og får 5,8 g af den forventede forbindelse, 30 Smp, 130°C og dernæst 150°C,

Trin B: 2-amino-Hf-meth.vl-W-(20-oxopregn-5-en-3o:-vl)-acetamid og dets fumarat.

Man opløser under indifferent atmosfære 6,2 g af den i trin A opnåede forbindelse i 60 ml tetrahydrofuran, 35 tilsætter 1,2 g kul med 5% palladium og lader hydrogen boble igennem. Efter 2 timers forløb filtrerer man, vasker katalysatoren med methylenchlorid, inddamper til tørhed og får 4,55 g af den forventede forblindelse i form af .

DK 160561 B

- 12 - harpiks.

Dannelse af fumarat.

Man opløser i varmen 1,9 g af basen ovenfor i 4 ml 95$’s ethanol, tilsætter en varm opløsning af 560 mg fu-5 marsyre i 6 ml 95$'s ethanol, indleder en krystallisation, isafkøler 1 time, suger fra, vasker med iskoldt ethanol, tørrer ved 60°C under vakuum og får 2,02 g af den forventede forbindelse i form af hemihydrat. Smp.ca, 160°C. Analyse: H2° = 511 »63 10 beregnet: C $ 65,73 H1° 8,67 TS& 5,47 fundet: 65,6 8,5 5,4

Eksempel 5« (2S)-2-amino-H-(20-oxopregn-5-en-5a-yl)-propionamid og dets 15 hydroohlorid.

Trin A: 2-( (1.1-dimethylethoxy )-oarbonyl)-amino-3<r-(20-oxo-preqn-5-en-3alpha-yl)-propionamid Man opløser under indifferent atmosfære 3,15 g h®l--amin og 2,08 g tert.-butyloxycarbonyl-L-alanin (BOC-l·-20 alanin) i 75 ml chloroform og 15 ml pyridin, tilsætter 2,1 g hydroohlorid af l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)--carbodiimid og omrører 1 time 15 minutter. Man vasker med 2 N saltsyre og med vandig natriumbicarbonatopløsning, tørrer, destillerer til tørhed under formindsket tryk, 25 renser ved ohromatografi på silicagel (elueringsmiddel: benzen og methylethylketon (1:1)) og får 4,5 g af den forventede forbindelse i olieform.

Trin B: Hydroohlorid af (2S)-2-amino-N-(20-oxopregn-5-en--3alpha-yl)-propionamid 30 Man omrører 2 timer 30 minutter under indifferent atmosfære 4,5 g af den i trin A opnåede forbindelse i opløsning i 30 il 2 S tørt hydrogenchlorid i methanol. Man destillerer til tørhed under formindsket tryk ved 30°0, krystalliserer af 30 ml ethylacetat, suger fra, opløser 35 i 15 ml methanol under tilbagesvaling, filtrerer, tilsætter 50 ml ethylaoetat, inddamper til halvt rumfang, suger fra, tørrer ved 40°G under formindsket tryk og får 2,5 g af den forventede forbindelse, Smp. 260°C.

DK 160561 B

- 13 -

Analyse! C24H39C1N2°2 = 423,03 beregnet: C# 68,14 H1° 9,29 N# 6,62 Cl# 8,38 fundet: 68,4 9,3 6,5 8,5 5 Eksempel 4«

Hydroohlorid af 2-amino-IT-(20-oxopregn-5-en-3a-yl)-acet-amid«

Idet man arbejder efter en fremgangsmåde i analogi med den, som er beskrevet ovenfor i eksempel 2, og idet 10 man omsætter Z-glycin eller ir-(benzyloxycarbonyl)-glycin med holamin, fremstiller man den forventede forbindelse.

Smp. 295°C efter krystallisation af ethylacetat.

Analyse: C2^H^gN202,HCl = 409,019 beregnet: C# 67,54 H# 9,12 Cl# 8,67 N# 6,85 15 fundet: 67,8 9,1 8,5 6,7

Eksempel 5.

Fumarat af (2S)-2-amino-lf-(29-oxopregn-5-en-3a-yl)-lH-indol--3-propanamid.

20 Idet man arbejder efter en fremgangsmåde i analogi med eksempel 3 ved omsætning af BOC-I-tryptophan med holamin, fremstiller man den forventede forbindelse. Smp. 180°C efter krystallisation af methanol.

Analyse: C32H45N302,H00C-CH=CH-C00H, CH^OH = 617,76 25 beregnet: C# 68,39 H# 7,91 N# 6,47 fundet: 68,1 8,0 6,5

Eksempel 6.

Hydrochlorid af 2-amino-N-((20S)-20-hydroxypregn-5-en-3a-30 -yl)-acetamid.

Idet man arbejder efter en fremgangsmåde, som er analog med den ovenfor i eksempel 2 beskrevne ved omsætning af Z-glycin med (20S)-3a-aminopregn-5-en-20-ol, fremstiller man den forventede forbindelse. Smp. 264°C (søn-35 derdeling) efter krystallisation af ethylacetat.

Analyse: C23H38rW202, HC1 = 447,495 beregnet: C# 67,20 H# 9,56 Cl# 8,63 B# 6,82 fundet: 67,3 9,6 8,7 6,8 “ 14 -

DK 160561 B

(20S)-3a-aminopregn-5-en-20-ol, der benyttes som udgangsforbindelse, kan fremstilles som følger: frin 1: 3a-aminopregn-5-en-20-ol.

Man tilbagesvaler 100 ml propanol, tilsætter i lø-5 bet af 20 minutter og på samme tid 5 g natrium i småpor-tioner og en opløsning af 5 g holamin i 5 ml propanol og opretholder tilbagesvalingen. Efter 1 time 25 minutter lader man genantage stuetemperatur, isafkøler, syrner med eddikesyre indtil en pH-værdi på 6, lader vende tilbage 10 tilen ρΗ-værdi på 8 ved hjælp af kaliumcarbonat, fortynder med 500 ml vand, afdamper delvis, optager i 300 ml vand, lader krystallisere i 24 timer i køleskab, filtrerer, skyller krystallerne med vand, opløser dem i 10 ml methylenchlorid, tilsætter 50 ml ethylacetat og 30 ml iso-15 propylether, afdamper methylenchloridet, lader krystallisere 16 timer i køleskab og får 3 g af den forventede forbindelse. Smp. 160°C.

Trin 2: (203)-(3a-( trifluoraoetylamino) -»pregn-5-en-2 0-vl)--trifluoraoetat.

20 Man opløser 5,5 g af forbindelsen ovenfor i 55 ml methylenchlorid, tilsætter 5,5 ml pyridin, bringer på 0°C, tilsætter 5,5 ml trifluoreddikesyreanhydrid i løbet af 5 minutter, omrører ved stuetemperatur i 15 minutter, inddamper til tørhed, optager i cyclohexan, filtrerer, inddamper til 25 tørhed, chromatograferer resten på silicagel (elueringsmid-del: cyclohexan og ethylacetat (9:1)) og får 3 fraktioner, den første svarende til (20R)-isomeren, den anden (3,56 g) til en blanding af (20R) og (20S), og den tredie (l,5g) til den ønskede (20S)-isomer, Smp. 140°0.

30 Trin 3: (2OS)-3a-aminopregn-5-en-20-ol.

Man .afkøpå isbad en suspension af 2,4 g af den ovenfor opnåede/forbindelse i 24 ml methanol, tilsætter 12 ml 2 I natriumhydroxid opløsning, omrører 2 timer 30 minutter ved stuetemperatur, fortynder med vand, ekstraherer 35 med methylenchlorid, vasker den organiske fase med mættet saltvand, tørrer, inddamper og får 1,42 g af den forventede base, Smp. 190 0.

DK 160561 B

- 15 -

Eksempel 7.

Man fremstiller tabletter efter recepten: - hydrochlorid af 2-amino-H-(20-oxopregn-5*-en- -3a-yl)-acetamid 20 mg 5 - tilsætningsstof til dannelse af 1 tablet på 100 mg (enkeltheder vedrørende tilsætningsstof: lactose, stivelse, talkum, magnesiumstearat),

Farmakologisk undersøgelse, 10 1· Adjuvant for anafylaktisk chok»

Princip.

Indgiften på dyr af et stof, son er i stand til at stimulere aktiviteten af de immunitære systemer, viser sig ved en forøgelse af choket som reaktion på indgiften af 15 et antigen, over for hvilket dyret er sensibiliseret.

Hanmus på 30-35 g sensibiliseres ad intraplantær vej med okseserumalbumin. 8 dage senere modtager de dette antigen ad intravenøs vej. Under betingelserne for minimal sensibilisering udviser kontroldyrene ikke noget døde-20 ligt chok ved denne sidste indgift.

Den forbindelse, som skal undersøges, indsprøjtes ad intraplantær vej blandet med antigenet: Hvis denne forbindelse er adjuvant, vil den forøge sensibiliseringen, og der vil opstå et dødeligt chok ved en indgift ad in-25 travenøs vej.

Man fastlægger som aktiv dosis den dosis, son fremkalder en dødelighed på eller over 50$ af dyrene.

Resultater:

Forbindelse ifølge eksempel Dosis pr, dyr i mg 30 4 1 6 4 2. Rosetteprøve på røoe blodlegemer fra får,

Princip,

Indgift på dyr af en forbindelse, som er i stand 35 til at stimulere aktiviteten af de immunitære systemer, viser sig ved en forøgelse af deres evne til reaktion ved indsprøjtning af et immunogent stof.

DK 160561 B

- 16 -

Hanr$tter på 3 måneder sensibiliseres ad intrape-ritoneal vej med erythrocyter fra får (dag 0). 7 dage senere (dag 7) fjernes deres milt, og splenocyterne bringes i kontakt med fåreerythrocyter . Man tæller derpå procentsatsen af leucocyter,. omkring hvilke erythrocyterne 5 har dannet rosetter.

Den forbindelse, som skal undersøges, indgives oralt dagligt fra dag -1 til dag 1,

Som immunostimulerende dosis betragter man den dosis af forbindelsen, som omtrent fordobler procentsatsen 10 af iagttagne rosetter i forhold til kontroldyr.

Resultater.

Forbindelse ifølge eksempel Dosis pr, dyr i _ mg/kg pr, os 3 2 15 4 5 3. Undersøgelse af akut toksicitet.

Man bedømmer de ikke-letale doser (DLq) af forskellige undersøgte forbindelser efter indgift ad oral vej på mus, 20 Med DLq betegner man den maksimale dosis, som ikke fremkalder nogen dødelighed på 8 dage.

De opnåede resultater er som følger:

Forbindelse ifølge eksempel DD^ i mg/kg 3 over 400 25 4 600 6 over 400 30 35

Claims

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af 3-aminopregn--5-enderivater eller deres additionssalte med uorganiske eller organiske syrer og med den almene formel I ' sXtSf ... Ϊ, 10 hvor X betegner en gruppe CH0 CH0 I 3 eller | 3 -C=0 -CH OH idet bølgelinierne angiver, at den pågældende gruppe er i alpha- eller beta-stilling, R^ betegner et hydrogenatom eller en hydroxyalkylgruppe med 2-5 carbonatomer, R2 betegner et hydrogenatom, en hydroxyalkylgruppe med 2-5 carbonatomer, aliphatisk acyl afledt af en carboxylsyre 2q med 3-8 carbonatomer eller alkoxycarbonyl med 2-8 carbonatomer eller en acylgruppe afledt af en alpha-aminosyre eller af et peptid med 2-3 aminosyrer, hvor amingruppen enten er fri eller mono- eller disubstitueret med en alkylgruppe med 1-5 carbonatomer, idet dog og R2 ikke på samme tid 25 betegner et hydrogenatom, og hvis aminogruppen er i 3beta--stillingen, så kan I) når X betegner en gruppe -COCH^f R-^ og R2 ikke på samme tid betegne en hydroxyethylgruppe, og II) når X betegner en gruppe -CHiO^CH^, og R^ betegner et 2q hydrogenatom, R2 ikke en ethoxycarbonylgruppe, eller med den almene formel I ovenfor, hvor X betegner gruppen CH_ 1 3 -C=0 35 - 18 - DK 160561 B betegner et hydrogenatom eller en acylgruppe afledt af en alpha-aminosyre, R£ betegner en methylgruppe, og amino-gruppen er i 3alpha-stilling, kendetegnet ved, at man omsætter en amin med formlen II rt5^' - 10 hvor bølgelinien og X har samme betydning som ovenfor, - enten med et halogenid med formlen III Hal-R'2 (III) hvor Hal betegner chlor, brom eller iod, og R^ betegner en aliphatisk acylgruppe afledt af en carboxylsyre med 3-8 15 carbonatomer eller alkoxycarbonyl med 2-8 carbonatomer, til opnåelse af en forbindelse med formlen I, hvor R^ betegner et hydrogenatom, R2 betegner en gruppe R'^ defineret som ovenfor, og X og bølgelinien har samme betydning som ovenfor, hvilken forbindelse med formlen I man om ønsket isole-20 rer og omdanner til et additionssalt med en uorganisk eller organisk syre, - eller med en syre eller et syreanhydrid med formlen III' A-O-R''2 (III1) hvor A betegner et hydrogenatom eller en gruppe R'^/ idet 25 r,,2 kete9ner en aliphatisk acylgruppe afledt af en carbox ylsyre med 3-8 carbonatomer, til opnåelse af en forbindelse med formlen I, hvor R^ betegner et hydrogenatom, R2 betegner r,,2 defineret som ovenfor, og X og bølgelinien har samme betydning som ovenfor, hvilken forbindelse I man om 30 ønsket isolerer og omdanner til et additionssalt med en u-organisk eller organisk syre, eller med en alpha-aminosyre eller et peptid med 2-3 aminosyrer, hvori amingruppen er monosubstitueret eller di-substitueret med en alkylgruppe med 1-5 carbonatomer eller 35 beskyttet med en gruppe, som er let fraspaltelig, især ved sur hydrolyse eller ved hydrogenolyse, og derpå behandler man den til fjernelse af beskyttelsesgruppen til opnåelse DK 160561 B - 19 - af en forbindelse med formlen I, hvor betegner et hydrogenatom, R2 betegner en acylgruppe afledt af en alpha-ami-nosyre eller af et peptid med 2-3 alpha-aminosyrer, hvor aminogruppen er fri eller mono- eller disubstitueret med en alkylgruppe med 1-5 carbonatomer, og X og bølgelinien har 5 samme betydning som ovenfor, som man om ønsket isolerer og omdanner til et additionssalt med en uorganisk eller organisk syre, eller med et hydroxyalkylhalogenid med 2-5 carbonatomer, og hvori halogenet er chlor, brom eller iod, 10 til opnåelse af en forbindelse med formlen I, hvor aminen i 3-stillingen er mono- eller disubstitueret med en hydroxylalkylgruppe med 2-5 carbonatomer, og X og bølgelinien har samme betydning som ovenfor, hvilken forbindelse med formlen I man 15 enten isolerer og omdanner til et additionssalt med en uorganisk eller organisk syre, hvis dette ønskes, eller, i det tilfælde, hvor R2 betegner et hydrogenatom, omsætter med et halogenid med formlen IV Hal-R '"2 (IV) 20 hvor r,,,2 betegner en hydroxyalkylgruppe med 2-5 carbonatomer, aliphatisk acyl afledt af en carboxylsyre med 3-8 carbonatomer eller alkoxycarbonyl med 2-8 carbonatomer, og Hal har samme betydning som ovenfor, til opnåelse af en forbindelse med formlen I, hvor R^ betegner en hydroxyalk-25 ylgruppe med 2-5 carbonatomer, R2 betegner en gruppe R''^ defineret som ovenfor, og X og bølgelinien har samme betydning som ovenfor, som man isolerer og omdanner til et additionssalt med en uorganisk eller organisk syre, hvis dettte ønskes, eller også i det tilfælde, hvor R2 betegner et hy-30 drogenatom, omsætter man forbindelsen med formlen I med en alpha-aminosyre eller et peptid med 2-3 aminosyrer, hvis aminogruppe er monosubstitueret eller disubstitueret med en alkylgruppe med 1-5 carbonatomer eller beskyttet med en gruppe, som er let fraspaltelig, især ved sur hydrolyse el-35 ler ved hydrogenolyse, og derpå behandler man den til fjernelse af beskyttelsesgruppen til opnåelse af en forbindelse DK 160561 B - 20 - med formlen X, hvor betegner en hydroxyalkylgruppe med 2-5 carbonatomer, R2 betegner en acylgruppe afledt af en alpha-aminosyre eller af et peptid med 2 eller 3 alpha-ami-nosyrer, hvor aminogruppen er fri eller mono- eller disub-5 stitueret med en alkylgruppe med 1-5 carbonatomer, og X og bølgelinien har samme betydning som ovenfor, som man isolerer og omdanner til et additionssalt med en uorganisk eller organisk syre, hvis dette ønskes, - eller, i det tilfælde, hvor X betegner en gruppe -COCH^, 10 og hvor aminogruppen er i 3alpha-stillingen, med et methyl-halogenid eller også ethylchlorformiat, efterfulgt af reduktion under intermediær beskyttelse af 20-oxogruppen, til opnåelse af en forbindelse med formlen I, hvor X betegner en gruppe -COCH^, R-^ betegner et hydrogenatom, R2 betegner 15 en methylgruppe, og aminogruppen er i 3alpha-stillingen, hvilken forbindelse isoleres og eventuelt omdannes til et syreadditionssalt eller omsættes med en alpha-aminosyre, hvis aminogruppe er intermediært. beskyttet, til opnåelse af en forbindelse med formlen I, hvor X betegner en gruppe 20 -COCH3, R^ betegner en acylgruppe afledt af en alpha-aminosyre, R2 betegner en methylgruppe, og aminogruppen er i 3alpha-stillingen, hvilken forbindelse isoleres og eventuelt omdannes til et syreadditionssalt.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at X betegner en gruppe CH CH I eller | -C=0 -CH OH 30 idet bølgelinierne angiver, at de tilsvarende grupper er i alpha- eller beta-stilling, R^ betegner et hydrogenatom eller en hydroxyalkylgruppe med 2-5 carbonatomer, R2 betegner et hydrogenatom, en hydroxyalkylgruppe med 2-5 carbonatomer, en aliphatisk acylgruppe afledt af en carboxylsyre med 35 3-8 carbonatomer eller en alkoxycarbonylgruppe med 2-8 carbonatomer eller en acylgruppe afledt af en alpha-aminosyre eller af et peptid med 2-3 aminosyrer, hvori amin- DK 160561 B - 21 - gruppen enten er fri eller mono- eller disubstitueret med en alkylgruppe med 1-5 carbonatomer, idet dog R^ og R2 ikke på samme tid kan betegne et hydrogenatom, og, hvis amino-gruppen er i 3beta-stilling, så kan 5 I) når X betegner en gruppe -COCHog R2 ikke på samme tid betegne en hydroxyethylgruppe, og II) når X betegner en gruppe -CHiOHjCH^, og R^ betegner et hydrogenatom, R2 ikke en ethoxycarbonylgruppe.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at X betegner gruppen -COCH^, R^ betegner et hydrogenatom, R2 betegner en methylgruppe, og aminogruppen er i 3alpha-stilling.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at man omsætter en forbindelse med formlen II, hvor aminogruppen er i 3alpha-stillingen, med en alpha-aminosyre eller et peptid med 2-3 aminosyrer, hvor amingruppen enten er intermediært beskyttet eller mono- eller disubstitueret 20 med en alkylgruppe med 1-5 carbonatomer, til opnåelse af en forbindelse med formlen I, hvor aminogruppen er i 3alpha--stillingen, R^ betegner et hydrogenatom, og R2 betegner en acylgruppe afledt af en alpha-aminosyre eller af et peptid med 2-3 aminosyrer, hvor aminogruppen enten er fri eller 25 mono- eller disubstitueret med en alkylgruppe med 1-5 carbonatomer.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at X betegner en gruppe

30 CEL OH.. I eller | -C=0 -CH OH hvor hydroxylgruppen er i 20alpha-stilling.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet *3 C ved, at man omsætter en forbindelse med formlen II, hvor X betegner en gruppe -CO-CH3, og aminogruppen er i 3alpha- - 22 - DK 160561 B -stilling, med N-(benzyloxycarbonyl)-glycin.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at man omsætter en forbindelse med formlen II, hvor X 5 betegner en gruppe -COCH^, og aminogruppen er i 3alpha--stillingen, med tert.-butyloxycarbonyl-L-alanin. 10 15 20 25 30 35