DK155636B - Fremgangsmaade til at skille plasma eller serum fra fuldblod og middel til anvendelse ved udoevelse af fremgangsmaaden - Google Patents

Description

DK 155636B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til at skille plasma eller serum fra fuldblod, samt et middel til anvendelse ved udøvelse af fremgangsmåden.

5 I den kliniske kemi har adski liensen af serum eller plasma fra blod en meget stor betydning, da der praktisk taget kun af disse to uden forstyrrelser kan gennemføres analyse af opløste blodbestanddele.

10 Den normale og mest sædvanlige form for adskillelsen af serum eller plasma fra erythrocytterne er centrifugeringen. Dette er dog problematisk, specielt ved anvendelsen af små prøvemængder, ligesom adskillelsen af supernatant og blodkage ikke altid er simpel, således at der i litteraturen, f.eks. DE frem-15 læggelsesskrift nr. 2.559.242, kan findes en hel række hjælpe midler herti 1.

Anvendelsen af fuldblod ved hurtig-diagnostika er særlig problematisk. Hurtig-diagnostika er reagenshold i ge, sugedygt i ge 20 eller kvældbare bærere, fortrinsvis af filterpapir, hvorpå der anbringes en ringe mængde, f.eks. en dråbe, af den væske, der skal undersøges, og ved hvilken der på grund af den overvejende meget korte reaktion indtræder en farveændring, som enten bestemmes visuelt eller måles remissionsfotometri sk. Da 25 uklare og farvede opløsninger, såsom blod, forstyrrer aflæs ningen, har det ikke manglet på forsøg på at tilvejebringe hurtig-diagnostika til den direkte anvendelsen af fuldblod.

Her skal f.eks. nævnes overtrækningen af testpapir med semipermeable membraner (US patentskrift nr. 3.092.465) og anven-30 delsen af i vand kvældbare film, hvori kun blodets opløste bestanddele, men ikke erythrocytterne, kan trænge ind {DE fremlæggelsesskrift nr. 1.598.153). Disse to fremgangsmåder kan i og for sig anvendes, men kun ved undersøgelser for lavmolekylære bestanddele i blod, såsom f.eks. glucose eller urinstof; 35 mere højmolekylære bestanddele i blod, såsom f.eks. lipider, eller de på serumprotein bundne substrater, såsom f.eks. bilirubin, kan ikke bestemme på denne måde, da de ikke er i stand til at trænge ind i filmen henholdsvis forsyne sig gennem den

DK 155636 B

2 semipermeable membran. Der er desuden offentliggjort forslag om at dække det diagnostiske middel med membranfiltre for at fraseparere blodcellerne (DE fremlæggelsesskrift nr. 2.222.951 og DE offentliggørelsesskrift nr. 2.922.958). Ulempen ved det-5 te diagnostiske middel er, at blodet kun meget langsomt og i ringe mængde kan trænge gennem membranfilteret, da det let tilstoppes, og reaktionen varer tilsvarende lang tid. I modsætning til de ovenfor nævnte diagnostiske midler, som allerede er i handelen, findes der derfor endnu ikke "hurtigtest" 10 af den sidstnævnte art i handelen.

Fra DE off entliggjarelsesskEiftérne nr. 2.908.721 og 2.908.722 kendes det yderligere, at man kan skille lymfocytter henholdsvis leucocytter fra blod, når man filtrerer blodet over et lag 15 af syntetiske fibre med en gennemsnitlig fiberdiameter på 5-20 μ henholdsvis 3-10 μ. Da erythrocytterne imidlertid i overvejende grad løber med plasmaet gennem filteret, er dette filter ikke egnet til udvinding af plasma. Rent teoretisk nævnes desuden carbonfibre, glasfibre og metalfibre.

20

Formålet med opfindelsen var derfor at tilvejebringe en simpel fremgangsmåde til at skille plasma eller serum fra fuldblod, hvorved man uden centrifugering hurtigt og sikkert kan fra-skille små mængder blod og som specielt er egnet som prøvefor-25 beredning til diagnostiske formål.

Det har nu vist sig, at adskillelden af plasma henholdsvis serum fra fuldblod sker hurtigt og simpelt og tilstrækkelig mængde, når man lader blodet strømme gennem en masse af glas-30 fibre alene eller i blanding med andre fibre. Denne kendsgerning er desto mere overraskende, når henses til, at anvendelsen af glasfibermåtter til fraskillelse af hvide blodlegemer allerede er beskrevet i ovennævnte DE fremlæggelsesskrift nr. 2.222.951, men at der til fraskillelse af erythrocytterne dog 35 ubetinget nødvendigt kræves den yderligere anvendelse af membranf i 1 tre.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del angivne. Midlet ifølge opfindelsen

DK 155636 B

3 er ejendommelig ved det i krav 4's kendetegnende del angivne.

Glasfibrene kan anvendes i løst stablet form samt i form af papir eller filt, men også - ved hjælp af en udvendig form -5 holdt i en hvilken som helst ønsket form.

De således udformede glasfibre kan som afdækning for et af de ovenfor beskrevne hurtig-di agnost ika tjene til, at disse diagnostiske midler, til hvis anvendelse den forudgående udvinding 10 af serum eller plasma hidtil var nødvendig, nu er egnet til den direkte anvendelse af fuldblod.

Yderligere kan med glasfibre fyldte søjler, sugefiltre eller andre egnede beholdere også anvendes til gennem simpel gennem-15 løbning af blod at udvinde serum eller plasma uden centrifuge ring og stille disse til rådighed for diagnostiske midler på egnet måde, da serumet eller plasmaet løber hurtigere gennem et sådant lag end erythrocytterne og 1eucocytterne.

20 De ovennævnte fibre kan bestå af fibre af varierende tværsnit.

Glasmaterialet kan bestå af alkaliholdigt eller alkalifrit borsi 1 i katgi as, men kan også bestå af rent kvartsglas. Fibermateriale af andre tekniske glastyper, f.eks. borfrie alkali-glas, krystalglas, blyglas eller andre, er ikke i handelen i 25 de nødvendige fiberdimensioner og kunne derfor ikke undersøges. Man må imidlertid gå ud fra, at de også er egnede. Glasfibrenes middeldiameter kan ligge mellem 0,2 μ og 2,5 μ, fortrinsvis mellem 0,5 og 1,5 μ. Fiberdi arneteren kan variere kraftigt svarende til fremstillingen, men skal dog kun undta-30 gelsesvis overskride en øvre grænse på ca. 10 μ. Deres længde er kun begrænset af stabl ingsteknikken, men har ellers ikke nogen indflydelse. Alt efter stabl ingsteknikken findes der sædvanligvis densiteter fra 0,1-0,5, sædvanligvis 0,2-0,4 g/cm3.

35 Desuden kan glasfibrene være blandet med hinanden, men også med fibre af andre materialer, hvorved fibrenes indbyrdes sammenhold kan forbedres. Egnet er f.eks. syntetiske fibre, såsom polyester, polyamid og andre, men også fibre af polyethylen,

DK 155636 B

O

polypropylen og andre senere ved hjælp af varmedeformerbare syntetiske stoffer. Tilsætningerne kan også have større diameter (10-20 μ), når blot der ikke anvendes en så stor mængde heraf, at de påvirker separeringen gennem de finere glasfibre.

5

Yderligere kan glasfibrene være fastgjort ved tilsætning af uorganiske bindemidler (f.eks. vandglas) eller organiske bindemidler (f.eks. polyvinylacetat, polyvinylpropionat, poly-acrylsyreester og andre), hvorved glasfibrene sammenklæbes ved 10 berøringsstederne.

Særligt foretrækkes kombinationen af glasfiberlag i midlet ifølge opfindelsen med diagnostiske midler.

* 15 Glasfibrene kan i disse diagnostiske midler også indeholde reagenser, som forhindrer hæmolysen af erythrocytterne, og desuden reagenser, som hæmmer eller fremmer koagulationen, samt reagenser, som kræves i indikatorlaget, men som er uforligelige med de deri værende reagenser. Disse sidstnævnte reagen-20 ser kan naturligvis også anbringes i alle lag, som ligger mellem glasfiber- og indikatorlag.

Fig. 1 viser opbygningen af et sådant diagnostisk middel. På et strimmelunderlag 2 er påklæbet reaktionslaget 1 af hurtig-25 diagnostiket. Tæt over reaktionslaget er anbragt et tyndt væs-kegennemtrængeligt formstabilt skillelag 4, som består af et netværk af vævede eller sammenpressede plastfibre, og som på endefladerne af reaktionslaget på let løsnelig måde er klæbet på strimmelunderlåget på en sådan måde, at en let tilgængelig 30 snip 4a ikke er fastgjort på et længere stykke af underlaget.

Over reaktionslaget er nu anbragt glasfiberpapiret 3. Dette bliver fastholdt på plads ved hjælp af et yderligere netværk 5, der ligesom skillelaget 4 er fastklæbet over og på endefladerne af reaktionslaget.

35

Reakt ionsi åget 1 kan bestå af en i mprægneret, sugedygt i g bærer eller kvælbar eller porøs plastfilm. Som underlaget 2 tjener fortrinsvis en tykkere plastfolie, en fast karton, en glasplade eller et andet stabilt bæremateriale.

DK 155636 B

s

Efter anbringelse af en bloddråbe 8 på den øverste side af hurtig-di agnost iket bliver plasmaet i gi asf iberpapi ret skilt fra erythrocytterne og 1 eucocytterne. Det på denne måde separerede plasma når gennem skillelaget 4 ind i reaktionszonen 1 5 af det diagnostiske middel. Efter et bestemt tidsrum, hvor plasmaet er trængt ind i reaktionszonen, gribes skillalaget i den frie ende og fjernes med glasfiberpapiret og netværket 5. Derpå kan reaktionslaget, hvori nu påvisningsreaktionen finder sted, bestemmes visuelt eller remissionsfotometrisk.

10

En yderligere mulig opbygning af hurtig-di agnost iket belyses i fig. 2, hvor der udover den ovenfor beskrevne opbygning er anbragt et eller flere for væsker af enhver art gennemtrænge!ige lag 6 på en sådan måde, at de kommer til at ligge enten over 15 (fig- 2a) eller under (fig. 2b) glasfiberpapiret. Disse yder ligere lag kan være imprægneret med reagenser, som enten er let opløselige og sammen med plasmaet når ind i reaktionszonen eller er mindre opløselige og lader et eller flere fortrin af påvisningsreaktionen forløbe allerede uden for den egentlige 20 reaktionszone 1.

I fig. 3 vises en anden opbygning (fig. 3a set fra siden, fig.

3b set foroven) af hurtig-di agnostiket, hvor glasfiberpapiret 3 er klæbet direkte på underlaget 2. På en del af glasfiberpa-25 piret er anbragt reaktionslaget 1. På den frie del af glasfiberpapiret anbringes blodet 8. Den i glasfiberpapiret fra ery-throcytterne adskilte plasma diffunderer i glasfiberpapiret til reaktionslaget og ind i dette. De ved reaktionen dannede reaktionsfarver kan ses fra oversiden af hurtig-di agnost iket 30 og bestemmes. Reaktionslaget kan anbringes direkte ved påtrykning eller belægning på glasfiberpapiret. Det kan imidlertid også i form af en helt eller delvis imprægneret sugedygtig bærer klæbes på glasfiberpapiret.

35 Yderligere kan, som vist i fig. 4 og fig. 5, det diagnostiske middel være opbygget således, at der på underlaget 2 først er påklæbet et sugedygtgit materiale 9, såsom f.eks. cellulosepapir eller et plastfilt, og over dette materiale er opklæbet

DK 155636 B

6 glasfiberpapiret 3 og reaktionslaget 1. Derved kan det sugedygtige materiale 9 optage den samme flade som reaktionslaget (f i g. 5), men en større flade, således at materialet 9 frigør en flade (f i g. 4). Blodet dryppes på den fri flade af det su-5 gedygtige materiale (f i g. 4) eller direkte ved siden af det sugedygtige materiale (fig, 5) og optages hurtigt heraf og suges under glasfiberpapiret. Derpå suges blod på grund af glasfiberpapirets sugeevne gennem glasfiberpapiret opad, hvorved opnås adskillensen af erythrocytter og plasmaet når ind i 10 reaktionslaget 1. Reaktionen betragtes som i fig. 3 fra oversiden af hurtig-di agnost iket.

Fig. 6 viser en yderligere opbygning af et til den direkte anvendelse af fuldblod egnet hurtig-diagnostikum. Dette er op-15 bygget således, at der på strimmelunderlaget 2 ved siden af hinanden er anbragt et sugedygtigt lag 9, som f.eks. af et cellulosepapir eller af et cellulosehold igt plastfiberfilt og et glasfiberlag 3. De to lag skal være i inderlig kontakt med hinanden. På overfladen af det sugedygtige lag 9 findes de for 20 hurt ig-di agnost iket nødvendige påvisningsreagenser, som f.eks.

kan være anbragt ved belægning med en åben film ifølge DE offentliggørelsesskrift nr. 2.910.134. Ved anbringelse af bloddråben på den fra reaktionszonen fjerneste side af glasfiberlaget sker adskillelsen plasma - erythrocytter således, at 25 plasmaet med sin front på adskillelsesstedet først når til det sugedygtige lag 9 og straks bliver udsuget af dette. Ved ka-pillarkræfter når plasmaet så til reaktionslaget 1, hvor påvisningsreaktionen gøres synlig, f.eks. ved hjælp af en fra oven synlig farveændring.

30

Desuden kan det diagnostiske middel fremstilles i den i fig. 7 beskrvene form. Derved bliver glasfiberpapiret 3 klæbet på et underlag 2. Underlaget har på berøringsstedet et eller flere huller li. På den anden side er et reaktionslag 1 påført di-35 rekte eller klæbet på glasfiberpapiret. Blodet 8 anbringes således på det diagnostiske middel, at det kan gå gennem hullet (eller hullerne) til glasfiberpapiret 3. Det i glasfiberpapiret fraseparerede plasma kommer nu til reaktionslaget 1 og

DK 155636 B

7 fører til reaktionen, som kan bestemmes visuelt eller remissionsfotometrisk på overfladen. Reaktionslaget er derved beskyttet ved hjælp af et gennemsigtigt afdækningslag 7.

5 Reaktionslaget 1 kan bestå såvel af et f.eks. på gi asfiber-måtten påtrykt lag, men kan også bestå af et flerlaget element, som vist i fig. 7a, hvor lagene kan indeholde forskellige reagenser og/eller opfylde flere funktioner, således som det f.eks. er beskrevet i DE offentliggørelsesskrift nr.

10 2.922.958.

Fig. 8a viser fra siden og fig. 8b viser fra oven en yderligere opbygning af et sådant diagnostisk middel, hvor det af glasfibre bestående lag 3 samt et eller flere for reaktionen 15 nødvendige lag 6 sammenholdes ved hjælp af en forud fremstillet form 12. Blodet bliver herved dryppet på glasfiberfiltsi-den. Det fraseparerede plasma når derpå til reaktionslaget 1, hvorved indikatorreaktionen bliver bestemt visuelt eller remissionsfotometrisk på den over for glasfiberfilteret liggende 20 side.

Af i 11ustrationsmæssige grunde er de forskellige lag i nogle figuerer delvis vist med et mellemrum. I den praktiske udførelse ligger lagene på hinanden, således at væsker uhindret 25 kan passere videre. Desuden er reaktionslagene 1 og 6 tværdelt for at antyde, at de kan bestå af flere over hinanden liggende 1 ag.

Blodsepareringen med midler ifølge fig. 3a, 3b, 4 og 6 kan 30 forbedres væsentligt, når man på glasfibrene 3 ved siden af eller i reaktionslaget 1 anbringer en hydrofob barriere, som delvis rager ind i volumenet af glasfibrene 3. Fig. 3c, 3d, 6a og 6b viser denne barriere 15 og svarer i øvrigt med hensyn til opbygning til fig. 3, 4 og 6. Denne barriere 15 forhindrer 35 ikke blot, at blodet 8 først breder sig i glasfiberoverfladen og forurener indikatorområdet, men forbedrer også på afgørende vis glasfibrenes skillevirkning. Der kan derfor arbejdes med forholdvis små stykker g 1 asf iberpapir 3, hvilekt har til

DK 155636 B

s følge, at der kræves væsentligt mindre blodmængder. Barrieren kan påføres på sædvanlig måde, f.eks. fra dyser eller med ruller. Det hydrofobe materiale til barrieren kan f.eks. være en smelteklæber eller en almindelig opløsningsmiddelklæber eller 5 voks.

Desuden viser fig. 9 opbygningen af en form, som adskiller plasmaet fra ful dblodserythrocytter uden centrifugering og stiller den til rådighed for diagnostiske formål. Dertil fyl-10 des et rør eller en beholder 13, som f.eks. har den viste form, med de ovenfor beskrevne glasfibre 14. Blodet 8 fyldes i karret fra oven. På vejen nedad skilles plasmaet nu gennem glasfibrene fra blodets erythrocytter. Det plasma, som samler sig i den nederste del af beholderen 13, kan nu optages ved 15 hjælp af et "ende-ti 1-ende"-kappilarrør og opsuges og ledes direkte til en anden diagnostisk fremgangsmåde.

En anden opbygning ifølge opfindelsen vises i fig. 10, hvorved den til fraskillelse af erythrocytterne egnede beholder 13 har 20 form af en kolbesprøjte, som i den nederste del er tæt fyldt med glasfibre 14. Blodet 8 anbringes i den øverste åbne beholder. Efter endt adskillelse af erythrocytter og plasma, hvorved plasmaet samler sig i den nederste del af beholderen, kan plasmaet ved indføring og forsigtig trykning med kolben 17 ud-25 trykkes af sprøjtelegemet.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til plasmaudviklingen kan som vist i fig. 11 også gennemføres med en beholder 13, som ved hjælp af en i én retning passerbar ventil 16 er delt i to 30 dele og er fyldt med de ovenfor beskrevne glasfibre. Blodet 8 fyldes i beholderen foroven. Plasmaet samler sig efter fraskillelse af erythrocytter i beholderens nederste del og kan nu udtømmes ved sammenpresning af den nederste beholderdel. Derved forhindrer ventilen 16, at plasmaet strømmer tilbage i 35 den øverste blodcelleholdige del.

Yderligere kan fremgangsmåden ifølge opfindelsen gennemføres med en anordning, som beskrives ved hjælp af fig. 1, hvorved det på underlaget 2 klæbede reaktionslag 1 består af et defineret, sugende materiale, således at der ved på-

DK 155636 B

9 føringen af blod opnås et defineret piasmavolumen i laget 1. Efter adskillelsen af lagene 3, 4 og 5 kan plasmaet, dvs.

5 stoffer der skal analyseres, elueres ved hjælp af et opløs ningsmiddel. Elueringen af plasmaet og analysen kan også gennemføres straks, men også - alt efter hvilket stof, der skal analyseres gennemføres på et senere tidspunkt et andet sted. Såfremt analysen først skal gennemføres senere, 10 kan det være fordelagtigt først at tørre plasmaet f.eks. med varm luft eller ved frysetørring. Det er yderligere muligt adskilt fra det område, hvor prøven skal påføres, at forudse et eller flere områder, som indeholder reagenser, således at der ved eluering med opløsningsmidlet sker en samtidig 15 eluering af hele reaktionsblandingen« Når reaktionsfarverne ikke blot skal bestemmes visuelt, men skal måles i remissionsfotometere, er det hensigtsmæssigt at dække reaktionslaget 1 med et afdækningslag 7, som vist i f i g.

20 3e, for at forhindre en tilsmudning af måleanordningen. Så fremt reaktionslaget 1 er en film omtrent ifølge DE offentliggørelsesskrift nr. 2.910.134 eller DE patentskrift nr. 1.598.153, så er det hens i gtsmæss i gt at anbringe denne direkte på dæklaget 7 og så montere begge sammen. En mulig udførelses-25 form er fist i fig. 3e. Dæklaget 7 kan naturligvis også anven des til andre udførelsesformer, således som det er vist i fig.

7a, som i øvrigt med hensyn til opbygning svarer til fig. 7.

Det har yderligere vist sig at .være fordelagtigt at vælge anordninger, ved hvilke reaktionslaget 1 først ikke er i 30 væskeoverførende berøring med glasfibrene 3 eller det suge- dygtige lag 9, men at denne berøring først bliver etableret, når de nævnte lag er blevet fuldstændigt fyldt med plasma eller serum« -Fordelene ved disse anordninger er, at plasmaet eller serumet kan bringes i berøring med reaktionslaget 1 35 på et nøjagtigt tidspunkt, der kan bestemmes forud. Yderligere sker denne berøring over hele overfladen, således at kromatografivirkninger, som ellers eventuelt kan optræde ved de ovennævnte anordninger, er udelukkede. Den kends- * . j η 1 n Ο * . . r- T Ί J i f| , ,

DK 155636B

10 af reaktionen i reaktionslaget 1 kan forløbe et forudbestemt tidsrum, er af stor betydning ved reaktioner, som skal forløbe under særligt kontrollerede betingelser. Således kan reaktionen ved bestemmelser af enzymer, som skal forløbe ved særlig konstant temperatur, først startes, når det diag-5 nostiske middel er tilstrækkeligt konstant tempereret. Ligeledes kan der i zonerne 3 og 9, hvori plasmaet samler sig, anbringes reagenser, som bringer stoffet, der skal påvises, i tidsafhængig reaktion i en bestemt tilstand, dvs.

^0 lader en forreaktion forløbe. Et eksempel herpå er aktive ringen af kreatin-kinase med N-acetylcystein.

Fig. 12, 13 og 14 viser forskellige mulige anordninger, hvorhos i fig. 13 den hydrofobe barriere 15 samtidigt tjener som fastgørelse af lagene 1 og 7. Betegnelserne og sam-15 mensætningerne af de øvrige lag svarer til fig. 3-6.

I fig. 14 er beskrevet anvendelsen af et hydrofobt net 18 mellem reaktionslag 1 og glasfibre 3 eller sugelag 9. Det-20 te hydrofobe net beskytter anordningen mod utilsigtet let berøring og bevirker, at væskekontakt først indtræder ved kraftig presning. Dette fører til forbedringer i praksis.

Det er naturligvis muligt, at reaktionslaget 1 kan bestå af 25 to eller flere i forhold til hinanden forskudte områder. Dis se kan enten påvise det samme stof i forskellige koncentra-tionsområder eller forskellige stoffer, når recepterne er udvalgt tilsvarende. Desuden kan der også tænkes anordninger, ved hvilke forskellige reaktionslag samtidigt fugtes 30 af plasmaet, som stammer fra ét tildrypningssted. Der kan her tænkes vidt forskellige former, såsom langstrakte, runde og lignende.

I fig. 15a-17b vises nogle mulige anordninger, hvorved de 35 forskellige prøveområder blev adskilt,og de øvrige beteg nelser svarer til de foregående figurers.

DK 155636 B

11

Blodsepareringen kan ligeledes forbedres, når der på glasfibrene 3 på blodtildrypningsstedet anbringes et yderligere glasfiberområde 3a. Herved kan 3a og 3 bestå af det samme materiale, men der kan også til 3a anvendes et materiale 5 af en anden tykkelse eller med anden fiberdiameter. Fig. 18 og 19 viser mulige anordninger, som i øvrigt svarer til figurerne 3 og 12,

Opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af de efterfølgende 10 eksempler;

Eksempel 1

Chol estero 1-prøvestri ml er 15 0,117 g methylhydroxypropylcellulose (CULMINAL® MHPC 8000, leveres af Henkel) 7,000 g titandioxid 0,138 g KH2P04 0,479 g Na2HP04, 2H20 20 3400 U cholesterolesterase 5000 U cholesterol oxidase 7 · 104 U peroxidase 0,746 g natriumdioctylsulfosuccinat 25 opløses i 70 ml vand. Derpå indarbejdes homogent efter hinanden .

14,Q g cellulose 8,4 g polyvinylpropionat-dispersion 30

Til sidst tilsættes 0,66 g 3,3’^/S'-'tetramethylbenzidin opløst i 1,6 ml acetone.

35

Denne blanding anbringes derpå som et 300 yi tykt lag på en glat plastfolie og snittes efter tørring ved 60-70°C i 6 mm brede strimler. Disse strimler klæbes derpå sammen med et 60 y kraftigt netværk af nylon og en ligeledes 6 mm bred 12

DK 155636 B

strimmel af glasfiberpapir (glasfiberfilter nr. 3362 fra

Schleicher Qg Schiill, papirtykkelse 0,47 mm, densitet 0,27 3 g/cm , gennemsnitlig fiberdiameter ca. 2,5 y). på en poly= 5 esterfolie. Derpå udskæres 6 mm brede strimler.

Pådryppes der på prøvestrimmelens overflade 40 yl blod og fjernes glasfiberpapiret efter 1 min. forløb med det rested-rende blod sammen med netværket ved afrivning, så dannes der i løbet af 3 min. på prøveområdet en reaktionsfarve, som svarer til den farve, som opnås, når der i stedet for blodet dryppes med den fracentrifugerede plasma fra det samme blod.

Eksempel 2 15

Cholestero1-test 0,45 g KH2PO4 1,55 g Na2HP04, H20 1,5 x 1θ4 u cholesterolesterase 20 1 x 10^ U cholesterol ox i dase 3 x 10^ U peroxidase 2.0 g Na-diocty1su1fosucci nat 6,9 g natrium-alginat (ALGIP0N®, leveres af Henl< 25 opløses i 250 ml vand derpå tilsættes 2.0 g 3,3',5,5r-tetramethylbenz idin opløst i 30 15 ml acetone.

Derpå fordeles homogent yderligere 20,Q g kiselgur.

35

DK 155636 B

13

Denne reaktionsmasse anbringes i en 6 mm bred strimmel med en fi 1mtrykmaskine (væv: 190 μ) på et g 1 asf iberpapir i den i f i g -5 1 beskrevne form. Det trykte glasfiberpapir tørres ved 60-80°C

og skæres derpå i 12 mm brede strimler, som udgør den trykte reaktionszone, som udgør halvdelen af en strimmel. Denne strimmel klæbes så til enden af en polyesterfolie og derpå skæres på tværs af g 1 asf iberpapi ret i 6 mm brede strimler. Når 10 der nu dryppes 40 μΐ blod op de fra reagenslaget bortvendte kanter af den ubelagte glasfiberpapir, diffunderer plasmaet under reaktionszonen. Dette antager, afhængigt af blodets cholesterol koncentrai ton , en forskelligt stærkt farvet blå reaktionsfarve. Intensiteten af reaktionsfarven svarer til den 15 farve, som man opnår, når man i stedet for blodet drypper med det af det samme blod udvundne serum eller plasma.

På lignende måde kan også de i den efterfølgende tabel 1 anførte papir anvendes.

20

Tabel 1

Glasfiberf ilterpapir til plasmafraseparering.

25 Papir

Fiber- Gennem- Flade- Tyk- Densi- diameter snitlig vægt kelse tet

Fabrikant Type_(μ) f iberdiameter(u) (g/m2)_(gm) (q/cm3) 30 Nuclepore P 300 1-3 1,5 25 89 0,275

Schleicher & Schull 3362 1-7_2_J5_127_472 0,269

Eksempel 3 35

Choiesteroltest En reagensmasse bestående af 16,0 g cellulose M+N Ac 10

DK 155636 E

u 86,0 g af en 0,2%'ig opløsning af methy1hydroxy-propylcellulose (CULMINAL® MHPC 8000) 0,32 g befugtningsmiddel (MARLON®, leveres af

Chemische Werke HUls) 5 °,68 g befugtningsmiddel (Na-dioctylsulfosuccinat) 12,0 g polyvinylpropionat-dispersion (Propiofan 70 D, leveres af BASF AG) °,48 g tetramethyIbenzi din 9 titandioxid 10 9600 u cholesterolesterase 7200 u cholesteroloxidase 1»04 x io4g peroxidase °'01 9 gallussyre 15 anbringes i en tykkelse på 0,2 mm på et hydrofobt polyester-filt (Reemay 2033 fra Du Pont) og tørres ved 60 C. Derpå klæbes en 6 mm bred strimmel af denne belægning og en 12 mm bred strimmel af et glasfiberfilter (f.eks. filteret 20 3362 fra Schleicher & Schiill) således ved siden af hinanden på en fast plaststrimmel, at glasfiberfilteret støder meget tæt på det belagte filt. Når der af denne plaststrimmel på tværs udskæres 6 mm brede strimler fås teststrimler, ved hvilke efterdrypning af ca. 50 Til fuldblod på den fra rea-25 gensfiltet fjerneste side af glasfiberfilteret efter kort tid kun overgår rent plasma i reagensfiltet og fører til en blå reaktionsfarve, hvis intensitet tiltager med blodets cholesterolkoncentration.

30 Eksempel 4 Særskilt plasmaudvinding

En nedad konisk indsnævrende plastbeholder (plastspidsen af en kolbepipette, længde 5 cm, tykkelse 0,5 cm), fyldes løst 35 for 2/3 vedkommende med glasfibre ifølge den følgende tabel

IS

DK 155636 B

3 2, hvorved der opnås en rumvægt på 0,1-0,4 g/cm , Efter fyldning af den øverste frie del med blod diffunderer serumet i beholderspidsen. Herfra kan fyldes et "ende-til-ende"-g kapillarrør med 15 jjI indhold ved indføring af pipette sprøj teåbningen. Det på denne måde udvundne plasma kan nu føres direkte til en hvilken som helst ønsket analytisk fremgangsmåde .

10 15 20 25 30 35

DK 155636B

16 * nj ω <g

* U

CD

® jjj 2 § o + + + + |H+ + + + t±iiiti+l'' fj && •h co 3

G

tr (¾ 0) O Ό m d <N CN H CTi o g, η ΗΐΛΓ-ινο t-~ r- . *3< ^ | *. I * *.

*©* μ tr in η μ h O O O

tn S \ S é"e

tH

G

<D * <9

d U

Hg g1 cd “ S 8 8 8 8 8 G ·Η G m co O γί σι Λ Οι S Ή Ή Ή •Η \ □ g .

to (D Π d f Id Η P {τι * * -rt. g (DO fc}

tn G S

epj H £> I

__i η h in (N ^rco^rHLnr^cvjror^ [] Γ, Q) rsim. ^Lnmr-*r-co o in ^ ^ <n ro Ο G ΟΟΟΟΟΟΟΟιΗι-Ιγ-1Ηγμγοιτ» ·χ s ® IS *

G - ^ P

,P, 2 i σΐίηΜΜ^οιοποΐίΤίβαι O _ ^ n-j Ή s (θιΜΠ'3'ΐηνοοοΓ'σιΗ'<},ιΗ'5,Ηα>θ m og ^ V?y •»•»•»«t«.*»*»**^***^* p 0> mo) H OOOOOOOOfHMc^csmmTT h s ^ P CD I I I I I I I f 1 I I I 1 I I t ° ϋ ® Ό t m G g £ °d ffi h O' to Is "j ovinr- + jj

CD-H ίθΗ(Νπη·«'ΐηιηνοΡ'σΐ£>ιοο·<3’ιΗνοιη 4J

Γ! Lj ' ·Π β λ\ > o) Q O OOOOOOOOOHOrHMCN OJ 1¾ CD G "3 , to d S, h

tP ft ιβ H

GO) r-J ,3 -H CO O + £> n 2 + 2» CD * C 1}

HP H Q - <X> rg H

d CD _ ΟΟΟΟΟίΠ G CD

OiPffiG! cot^racnrHr-i 32 2 S >§ D DD3D D fo H ® „ » 3 a

Ή G to tR

d CD . &

cn tn ., p P

cd m ,¾ t. & ™

P r-i H <fP

Η H » -r-i -ri. O

(D 0 > < CQ jJ 00 ^ -S’ n j§ Q OJ TJ« ^ 00 CO Q <n 5* -H 2 OOOO 0 0 iHt-c

Λ CO -H f ,¾ ,¾ ,H <H X .H ^CrH

-Η H to d CD to c ^ bS5 1 + © DO n 17

DK 165636 B

Eksempel 5

Virkningen af en hydrofob' barriere

Til tydeliggørelse af virkningerne af en hydrofob barriere 15. fremstilledes anordningen ifølge fig. 14, som er afdæk-5 ket med en gennemsigtig polycarbonat-bærefolie 2 af en bredde på 6 mm og en tykkelse på 0,3 mm, et 9 x 6 mm stort sugedygtigt lag 9 af 0,09 mm tykt glasfiberpapir, et hydrofobt nylonnet 18 af en tykkelse på 0,075 mm og en transparent afdækningsfolie 7. I sugedygtig kontakt med laget 9 er et glas-10 fiberpapir 3 fastgjort på bæreren, som består af glasfiber-papir (Schleicher & Schull nr. 3362, tykkelse 0,47 mm) af en bredde på 6 mm og den i den efterfølgende tabel anførte længde. Halvdelen af denne anordning forsynes på berøringsstedet mellem lagene 3, 9 og 18 hver gang med et ca. 2 mm 15 bredt 0,1 mm tykt barrierelag 15 af paraffinvoks.

Til bestemmelse af plasmaudvindingen anbringes der midt på glasfiberpapiret 3 de i den efterfølgende tabel 3 anførte blodmængder,og efter 30 sek, forløb bestemmes befugt-ningen af det sugedygtige lag 9 samt eventuelt en overmæt-20 ning (indtrængningsdybden af erythrocytterne i laget 9).

Tabellens resultater viser, at ved hjælp af den hydrofobe barriere forbedres separeringen, og der opnås en fuldstændig mætning, således at man allerede med meget små blodvolumener, f.eks. med kapillarblod fra fingerlommen, kan 25 gennemføres en sådan test. Forsøgene blev hver gang gennemført fem gange og resultaterne bestemt på grundlag heraf.

__^_DK 155636 B

ih

G

LO

g1 c-q cm oo ro »— — o o ιό

Hl , η T— N r- CM Ι-Ό »— •Η Λ Ti GO O c

P m H

t?0 CQ \X

G H

Ή Ti ----" O >1

B B

0) G Ti © G Ti

© G

οιΰ (D

H © i-O r-- «μ ιό o-j r~- r-— cri oj o

fB4J-HG c^t^oo oo oo 0¾ r^OiO

> © -M § 11 ^

^ ££ G G

^ fd rH

o\° 1-i B G, IX

IH

G

C ^ 5 ooo ooo o o o

H II

G B Ti

•P O. OG

S'Ή H i go m x m h © Ti ---— Λ >i

B

©

Ti Ti G ©

© S

oG QJ

&>σ> h oo n οι vooo ooo Η ©ΐΛοοσ>σ> oo o O cnoo fj -P -H Cd T- T- ‘ r- T-

> © -Η ε II

-P Cn P ΰ G G JS ^

o\o ι-l B ci! IX

G

©

P S

© G

OiH lo o i-o cntor- tO o t''· ' Pi O /—i CM ΙΌ ΙΌ n « <i ιό *3-

>i > *G

HTI P

Ti O oG rH

ΓΗ B___ +> HH e _ c G -H g g , / g G U O O ' Ό O © CO Ή B K ^ ^ © Ή vo r-. oo H Gm n G © ω ^

B g G

G -HH

EH . Q tG____

Claims (13)

1. Fremgangsmåde til at skille plasma eller serum fra fuld- 5 blod, kendetegnet ved, at man lader blodet sive langsomt gennem et lag af glasfibre med en gennemsnitlig diameter på 0,2-2,5 μ, fortrinsvis 0,5-1,5 μ, og en densitet på 0,1-0,5 g/cm3 og udvinder det plasma, som løber af, hvorhos volumenet af det plasma og det serum, som skilles fra, højst 10 udgør 50%, fortrinsvis under 30% af glasfiberlagets sugevolu- men.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man indfører det plasma, som løber af, direkte i et di agno- 15 sti sk middel.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man opfanger det plasma, som løber af, i en sugedygtig bærer og tørrer og eluerer til påvisning af indholdsstofferne. 20

4. Middel til anvendelse ved udøvelse af fremgangsmåden ifølge ethvert af kravene 1 -3, kendetegnet ved, at det består af et lag af glasfibre med en gennemsnitlig diameter på 0,2-2,5 μ, fortrinsvis 0,5-1,5 μ, og en densitet på 0,1-0,5 25 g/cm3.

5. Middel ifølge krav 4, kendetegnet ved, at glasfibrene er iblandet syntetiske, organiske fibre, og disse er fastgjort eller sammenklæbet med hinanden ved hjælp af uorga- 30 niske eller organiske bindemidler.

6. Middel ifølge krav 4, kendetegnet ved, at glasfibrene er lagt i lag i en søjle og i toppen af søjlen er forberedt til optagelse af blodet og i bunden er forberedt til 35 afgivelse af plasmaet.

7. Middel ifølge krav 6, kendetegnet ved, at der under g 1 asf iber1 åget findes en ventil og derunder et mellemre- DK 155636 B servo ir for plasmaet, hvoraf plasmaet kan uddrives ved komprimer! ng.

8. Middel ifølge krav 4, kendetegnet ved, at glas-5 fiberlaget består af et glasfiberpapir eller gi asf iberfi 11 og er en del af et diagnostisk middel til påvisning af plasmaets i ndholdsstoffer.

9. Middel ifølge krav 8, kendetegnet ved, at glas- 10 fiberlaget er det øverste lag af et flerlaget diagnostisk mid del, som er fastgjort på en inaktiv bærer.

10. Middel ifølge krav 9, kendetegnet ved, at påvisningsreaktionen forløber i det underste lag og bliver ana- 15 lyseret gennem bæreren.

11. Middel ifølge krav 8, kendetegnet ved, at glasfiberlaget og eventuelt yderligere lag via et lag, der kan løsnes, er forbundet med reaktionslaget og efter gennemgangen 20 af plasmaet eller efter reaktionens forløb kan fjernes sammen med det løsnelige lag.

12. Middel ifølge krav 11, kendetegnet ved, at det løsnelige lag er et netværk, som ved siden af reaktionslaget 25 er forbundet med bæreren.

13. Middel ifølge krav 9, kendetegnet ved, at reaktionslaget på et delområde af g 1 asf iber1 åget i sugedygtig kontakt er fastklæbet eller fasttrykket, og at blodet bliver an- 30 bragt på det andet delområde. 35