DK141555B - Fremgangsmaade til fremstilling af baererbundne proteiner - Google Patents

Description

(11) FREMLÆ66ELSESSKRIFT 141555 ^ DANMARK <»’> mtci.» c 12 s 11/06 «(21) Ansøgning nr. 6421/75 (22) Indleveret den 28· HOV. 1973 (23) Løbedsg 28. noV· 1973

(44) Ansøgningen fremtagt og Q

framlasggøleeeekriftet offentiiggjort den 21 · 8pr · 19°0

DIREKTORATET FOR

PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET i30* Prioritet bageret fra den

8. dec. 1972, 2260185* DE

(71) BOEHRINGER MANNHEIM GMBH., Sandhofer Strasse 112-132, 68 Mannheim, DE.

(72) Opfinder: Dieter Jaworek, Zoepfstrasse 4, 812 Weilheim/Obb., DE: Michael Nelboeck-HochstetTer, Bahnhofstrasse 5a, 8132 Tutzing, DE: Klaus Beaucamp, Bahnhofstrasse 5a, 8132 Tutzing, DE: Hans Ulrich Bergmeyer, Brahmsweg 6, 8132 Tutzing, DE: Karl-Heinz Botsch, Zugspitzstråsse 10, 8131 Bernried, DE.

(74) Fuldmægtig under sagens behandling:

Firmaet Chas. Hude«_ (54) Fremgangsmåde til fremstilling af bær er bundne proteiner.

I patent nr. 133.009 beskrives en fremgangsmåde til fremstilling af biologisk aktive bærerbundne proteiner, som er ejendommelig ved, at et protein i vandig opløsning omsættes med en forbindelse, der har mindst én epoksygruppe og mindst én yderligere til copolymerisa-tion egnet funktionel gruppe, og at denne yderligere funktionelle gruppe derpå forbindes med et bærestof.

Opfindelsen ifølge nævnte patent beror altså på princippet om forud fiksering af proteinet med en mindst difunktionel forbindelse i vandig opløsning, idet den ene funktion indgår en binding med proteinet, især med en aminogruppe i proteinet, og at der efter 2 141555 forbindelse af de to stoffer derpå fremstilles en binding til en bærer med den anden funktion af den oprindelige monomere.

Det bar nu vist sig, at gennemførligheden af fremgangsmåden ifølge nævnte ansøgning ikke er begrænset til forbindelser, der indeholder en epoksygruppe til kobling med proteinet, men at alle forbindelser er egnede hertil, som indeholder en til kobling med et protein i vandig opløsning egnet gruppe,og en epoksygruppe kun er et særtilfælde af dette almene princip.

Opfindelsen angår derfor en fremgangsmåde til fremstilling af bærer-bundne proteiner ved omsætning af et protein i vandig opløsning med en polyfunktionel forbindelse og med et bærestof, og fremgangsmåden er ejendommelig ved, at proteinet omsættes mecf én forbindelse, der ' indeholder mindst én i vandig opløsning proteinacylerende eller -alkylerende gruppe med undtagelse af en epoxygruppe og mindst en til fremstilling af en binding med en bærer egnet funktionel gruppe, og denne yderligere funktionelle gruppe derefter forbindes med et bærestof.

Fordelene ved fremgangsmåden ifølge patent nr. 133.009 bevares i fuldt omfang ved den videre udvikling ifølge den foreliggende opfindelse. Som i vandig opløsning proteinacylerende eller -alkylerende gruppe i den forbindelse, der i det følgende kaldes koblingsforbindelse, og som bringes til omsætning med proteinet, egner sig talrige grupper, som allerede er kendt, især fra peptidkemien. Foretrukne acylerende eller alkylerende grupper i opfindelsens forstand er ætylenimingrupper, halogenidgrupper aktiveret ved umætning, syreha-logenidgrupper, azidgrupper, syreanhydridgrupper, aldehydgrupper, oksazolongrupper, samt forbindelser af den almene formel y E.-C , hvor X har en af følgende formler:

^X

1 - ir = HH

2 -O-C-O-R1 !! 0 3 141555 2 o - ir

3 - o - Y

nV 2 O xO - Ά 4 - O - /° 5 - O - S - Oli o/ O - R1 6 - O - As - R1

7 - S - CH2 - COOH

8 - O - CH2 - CR

>U

9 - O - R I

\ ^ c^° /N - «i 10 - O - N I ‘ \/° * *2

X

x1

11 - O - O - N

n'vr1 12 - O ^Β°2 4 1415 εε

Cl 13 - Ο -^~~\-Cl

Cl

14 - Η-CH

I II

CH CH

15 - 1_- S02 -CV0^ /“Ό

16 - O - C

''-O

17 - Η I

Ψ

O

18 - O

f II' »—K/ I ovenstående formler 1-18 betyder R1 en alkylgruppe, fortrinsvis p en alkylgruppe med 1-6 kulstofatomer, R en aryl-, aralkyl- eller halogengruppe. Renyl- og benzylgrupper foretrækkes blandt aryl- og aralkylgrupperne. R har samme betydning som R og kan desuden også være et hydrogenatom. Indre eksempler på acylerings- eller alkyle-ringsmidler, der er egnede til kobling med proteinet, svarer til følgende formler 19 og 20:

5 Ut5SS

19 Η - OH· I N° HH-

II

o

20 E - CH

I ® HH- \ I ovenstående formler betyder R resten af koblingsforbindelsen, som indeholder den til binding med en bærer egnede funktionelle gruppe.

Som til binding med en basrer egnede funktionelle grupper kommer fortrinsvis sådanne grupper på tale, der er egnede til addition eller kondensation med det egentlige bærestof. Hvis der anvendes koblingsforbindelser med en kondensat!onsdygtig gruppe, skal der tages hensyn til, at der ved kondensationen ikke fraspaltes nogen stoffer, som påvirker aktiviteten af det bundne protein på skadelig måde. Konstateringen af, om fraspaltningen ved en bestemt kondensationsdygtig gruppe fører til et produkt, som har en skadelig indvirkning på aktiviteten af det anvendte enzym, kan let foretages ved nogle • simple forsøg i hvert tilfælde med det bestemte protein, som skal bindes. Almene udtalelser om egnetheden af bestemte grupper kan ikke gives, da de forskellige aktive proteiner udviser højst forskellig følsomhed. E.eks. har det vist sig, at fraspaltning af halogenider ved mange følsomme proteiner fører til et aktivitetstab, medens andre aktive proteiner ikke påvirkes skadeligt herved.

Ganske særligt skånsomt kan forbindelsen af mellemproduktet med bærestoffet ske ved indpolymerisation i bærestoffet. Særligt foretrækkes derfor indenfor opfindelsens rammer anvendelse af en koblingsforbindelse, der indeholder mindst én copolymerisationsdygtig dobbeltbinding, især kulstof-kulstof-dobbeltbinding, som yderligere funktionel gruppe, der er egnet til fremstilling af en binding med en bærer.

6 urssø

Som bærestoffer kan indenfor opfindelsens rammer anvendes alle sådanne vanduopløselige, faste stoffer, som over den yderligere funktionelle gruppe i koblingsforbindelsen kan forbindes med denne under skånsomme betingelser i vandig opløsning. Fortrinsvis anvendes bærestoffer, der er hydrofile, let kvældbare, vidtgående ladningsfri samt stabile overfor mikroorganismer. Bærestoffet kan som sådan indføres i den vandige opløsning til fremstilling af bindingen med mellemproduktet, men fortrinsvis fremstilles bærestoffet i den vandige opløsning selv ved polymerisation af vandopløselige monomere. I denne foretrukne udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan omsætningen af proteinet med koblingsforbindelsen ske allerede i nærværelse af den eller de polymerisationsdygtige monomere, hvorved polymerisationen foretages bagefter, under indpolymerisation af mellemproduktet af koblingsforbindelse og protein, eller den polymerisationsdygtige monomere eller monomerblandingen først sættes til opløsningen efter omsætningen mellem protein og koblingsforbindelse, hvorefter polymerisationen udløses.

Som monomere indenfor rammerne af denne udførelsesform ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes sådanne vandopløselige forbindelser, som er egnede til polyaddition eller polykondensation. Foretrukne er polyadditionsdygtige monomere, især monomere der indeholder mindst én olefinisk umætning. I dette tilfælde udgør den yderligere funktionelle gruppe i koblingsforbindelsen ligeledes fortrinsvis en eopolymerisationsdygtig dobbeltbinding.

Typiske eksempler på koblingsforbindelser, der foretrækkes ifølge opfindelsen, er maleinsyreanhydrid og dens homologe, hvori hydrogen= atomerne ved C-C-dobbeltbindingen er erstattet med alkylgrupper med 1-6 kulstofatomer, allylhalogenider, især allylbromid og dens homologe, akrylsyreklorid og dens homologe, hvori H-atomerne er erstattet med en eller flere lavere alkylgrupper, maleinsyre eller fumarsyre= klorid og deres homologe svarende til ovenstående definition for maleinsyreanhydrid, maleinsyreazid, ætyleniminforbindelser såsom l-allyloksy-3-(M-ætylenimin)-propanol-(2) og lignende.

Den ved den foretrukne udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen tilsatte monomer skal, som allerede nævnt, være vandopløselig og samtidig indeholde en polymerisationsdygtig olefinisk kul- 7 14155$ stof-kulstof-dobbeltbinding. Fortrinsvis anvendes også her forbindelser med Michael-systemet, altså en kulstof-kulstof-dobbeltbinding i nabostilling til en kulstof-oksygen-dobbeltbinding. Særligt foretrukne som monomere er de vandopløselige derivater af akrylsyre eller metakrylsyre som f.eks. amiderne, nitrilerae og esterne af disse forbindelser. Ganske særligt gode resultater blev opnået under anvendelse af akrylamid. Forbindelserne kan også være substitueret med alkylrester, når blot forbindelsens vandopløselighed herved ikke sinkes for meget. Sådanne forbindelser med formindsket vandopløse-lighed er dog fordelagtige, hvis det bærerbundne enzym senere skal anvendes i ikke rent vandigt system, f.eks. i et vandigt-organisk medium. Også de tilsvarende derivater af maleinsyre eller fumarsyre er velegnede.

Alternativt kan der også anvendes ikke vandopløselige monomere. I dette tilfælde udføres polymerisationen ikke i opløsning, men i suspension. Sidstnævnte metode er fordelagtig, hvis der ønskes en findelt, perleformet grundmasse uden kvældbarhed i vandige systemer.

De på kendte måder for suspensionspolymerisation (perlepolymerisation) fremkomne polymerisatkugler får så polymeriseret på deres overflade tillejringsproduktet af protein og koblingsforbindelse.

Der kan anvendes en enkelt polymerisationsdygtig monomer eller en blanding af monomere. Det er også muligt at anvende et forpolymeri-sat, der endnu indeholder umættede grupper, sammen med en monomer.

Alt efter den ønskede konsistens af slutproduktet sættes der til den monomere tværbindingsforbindelser, som indeholder mere end én polymerisationsdygtig gruppe. Eksempler på sådanne tværbindingsmidler er Ν,Ν'-metylen-bis-akrylamid og ætylendiakrylat. Disse foretrækkes, når der arbejdes i vandig opløsning. Hvis der udføres en polymerisation i heterogen fase, altså en suspensionspolymerisation, kan der også anvendes vanduopløselige tværbindingsmidler som f.eks. divinyl= benzol og ætylen-di-metakrylat. Talrige andre tværbindingsmidler er kendt for fagmanden, og det ligger indenfor fagmandens domæne at træffe det egnede valg i hvert enkelt tilfælde. Det er også muligt senere at tværbinde bærerbundne proteiner fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, hvis bærer ikke er tværbundet.

8 14155®

Hvis der ikke anvendes noget tværbindingsmiddel, får man bærermaterialer, som er opløselige eller termoplastiske. En udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen i denne form fører til spinde-dygtige eller ekstruderbare opløsninger, hvoraf de bærerbundne proteiner kan fås på i og for sig kendte måder i trådform eller i form af folier. Sådanne tråde eller folier covalent bundne med aktive proteiner kan strækkes efter fremgangsmåder indenfor kunststofteknikken, spindes og forarbejdes til andre produkter, der indeholder de aktive proteiner bundne, og som kan anvendes til formål, hvor disse former frembyder særlige fordele, f.eks. til fremstilling af enzymatisk aktive sigter, vævede stoffer, implanterbare tråde og lignende .

Til spinding af vandig opløsning kan f.eks. anvendes vakuum-spinde-metoden, ved hvilken opløsningen udpresses gennem en spindedyse i et vakuum. Dette kan ske under betingelserne for en lyofilisering, som tåles uden aktivitetstab af de fleste aktive proteiner.

Til omsætningen af protein og koblingsforbindelser gælder det samme, som er anført i patent nr. 133.009. Omsætningen kan, som.også nævnt i den tidligere ansøgning, udføres allerede i nærværelse af bæreren eller udgangsproduktet for fremstilling af bæreren, når blot der er sikkerhed for, at omsætningen af protein og koblingsforbindelse kan forløbe,før bindingen til bæreren sker. Hvis der arbejdes i nærværelse af udgangsprodukter for bæreren, kan dette f.eks. bekvemt opnås ved, at igangsætteren for polymerisationsreaktionen under dannelse af bæreren først tilsættes, når protein og koblingsforbindelse er omsat med hinanden.

Opfindelsen gør det også muligt at opnå samme fordele som anført i patent nr. 133.009. I kraft af den væsentligt bredere skala for de anvendelige koblingsforbindelser forøges imidlertid de samlede anvendelsesmuligheder for fremgangsmåden. Især når der anvendes uorganiske bærere såsom glas og oksyder, f.eks. halogenider fra grundstoffernes sidegruppe som bærer, kan der nu i næsten ethvert tilfælde findes egnede koblingsforbindelser, der er i stand til at reagere både med proteinet og også med bæreren ved hjælp af den kendte reaktionsdygtighed af de funktionelle grupper.

9 U155B

Af de øvrige fordele er især forbedret udbytte, fjernelse af resterende reaktionsdygtige grupper på bæreren, som ikke kan udelukkes ved fikseringsmetoden over aktive bærere, mangel på uønskede ionbyt-teregenskaber og dermed også kvældning eller indskrumpning af proteiner bundet ifølge opfindelsen, undgåelse af heteropolare bindinger af proteinet til bæreren, undgåelse af uønskede adsorptionsegenskaber både med hensyn til substrat og reaktionsprodukt, ingen uønsket forskydelse af pH-optimet. Forbedrede udbytter opnås især ved fiksering af proteinerne med højere molekylvægte. F.eks. giver en inde-lukningspolymerisation af katalase en maksimal fiksering på 10# i akrylamidgel, men ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, f.eks. med akryloylklorid som koblingsforbindelse, et udbytte på 75#. Endvidere ligger der en særlig fordel ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen deri, at også proteiner bestående af underenheder, som på grund af deres følsomhed ikke eller kun vanskeligt kan bindes til bærere efter kendte metoder, kan fikseres med godt udbytte og høj stabilitet. Overraskende har det desuden vist sig, at enzymer fikseret ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er mere stabile end i ubundet opløselig form. F.eks. viste urease med en molekylvægt på 480.000, og som var bærerfikseret ifølge opfindelsen, sig endnu fuldt aktiv ved 70°0, medens den ved samme temperatur i ubundet tilstand inaktiveres irreversibelt på kort tid.

En yderligere væsentlig fordel ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen ligger i, at flere enzymer, f.eks. glukoseoksydase og katalase, selv med forskellig reaktionsdygtighed og forskellig molekylvægt i statistisk fordeling kan fikseres samtidigt på en bærer eller indesluttes i denne. Dette gælder også, når proteinerne har forskellige isoelektriske punkter. I særligt vanskelige tilfælde er det muligt at omsætte de forskellige proteiner adskilt med én eller forskellige koblingsforbindelser og så fiksere dem sammen på bæreren. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen egner sig naturligvis også til fiksering af proteiner på formede bærelegemer, f.eks. folier, slanger, stænger, klumper og lignende.

Opfindelsen belyses nærmere af følgende eksempler.

10 1415SS

Eksempel 1 100 mg glukoseoksydase (GOD, 220 TJ/mg) opløses i 10 ml 1 M triæta-nolaminstødpude med pH-værdi 8,0 ved 10°C under en nitrogenatmosfære. Derpå tilsættes 0,03 ml akryloylklorid i 3 ml æter, og blandingen omrøres i 30 minutter. Derpå dialyseres natten over overfor 2 liter 0,01 M triætanolaminstødpude med pH-værdi 8,0, hvorefter bundfaldet fracentrifugeres og kasseres. Den enzymatiske aktivitet er 16.000 U.

Til den således fremkomne opløsning sættes 0,4 ml 5$ig dimetylamino= propionitril og 0,4 ml 5$ig ammoniumperoksyddisulfat ved 5-10°C (enzymatisk aktivitet 14.500). Derpå tilsættes 3 g akrylamid, 0,015 g N, ET *-me tylen-bis-akrylamid i 9 ml vand under en nitrogenatmosfære. Polymerisationen, der begynder straks, fører til en gelagtig størkning af massen. Det fremkomne produkt bliver med henblik på granulering trykket gennem en 0,4 mm metalsigte og så vasket med 2 liter 0,2 M fosfatstødpude med en pH-værdi på 7,5. Den med vaskevandet fraskilte enzymatiske aktivitet andrager 600 U. Polymerisatet lyo-filiseres og giver 3 g tørt produkt med en enzymatisk aktivitet på 1500 U.

Premgangsmåden blev gentaget uden tilsætning af akryloylklorid. In-delukningspolymerisationen fører til 3 g af et produkt med en samlet aktivitet på 330 IT.

Eksempel 2 300 mg trypsin (1500) opløses under en nitrogenatmosfære i 10 ml 0,5 M fosfatstødpude med en pH-værdi på 8,0 ved 10°C. Til den fremkomne opløsning sættes 0,1 ml akryloylklorid i 10 ml æter, og der omrøres i 30 minutter. Derpå tilsættes 0,4 ml 5$ig dimetylaminopropionitril og 0,4 ml 5$ig ammoniumperoksyddisulfat og omrøres i 30 minutter. Derefter tilsættes 3 g akrylamid, 0,015 g 11,11 '-metylen-bis-akryl= amid i 10 ml vand under en nitrogenatmosfære ved en temperatur på 5-10°C, og disse betingelser opretholdes, indtil der har dannet sig en gelagtig fast masse. Sidstnævnte granuleres gennem en 0,4 mm metalsigte og vaskes med 3 liter 0,2 M fosfatstødpude med en pH-værdi på 7,5. I vaskevandet findes 23 IT. Det vaskede produkt frysetørres. Man får 3 g lyofilisat med en specifik aktivitet på 12,9 IT/g.

11 U155B

En gentagelse af fremgangsmåden under samme tie tingelser, men uden tilsætning af akryloylklorid gav en specifik: aktivitet på 0,5 U/g lyofilisat.

Eksempel 5-12

Som beskrevet i eksempel 1 under anvendelse af koblingsforbiadelserne akryloylklorid, maleinsyreazid, maleinsyreanhydrid, allylbromid og l-allyloksy-3-(N-setylenimin)-propanol-(2) blev fikseringen af enzymerne glukoseoksydase, trypsin, chymotrypsin, uricase og heiokinase udført. På samme måde blev fremgangsmåden gentaget uden anvendelse af koblingsforbindelseme. Følgende tabel viser de i disse eksempler og i sammenligningsforsøgene opnåede resultater.

u___ursst

Η H UD -3 UJ «S

ro M -· · P n

M I P CO

H 00 · * O on _ ω d a « Q 5* b cd * p· p h <^3.

Η H· 'S ^ H' o o E3 ό Pi ι-j <d h1 P O m o £ i Η- ω d- η· ω ^ r.

p Φ P P ® 2, m s a i Bl h. s Bl p § s & o «* ? ® 3

-------- H

g*'g S' g £ g £ g ω g Ko-blingsfortindelse ?.

p Pi P p P p. P P- P P* ch2=ch-ch2-o-ch2-oh ch2 h ur OH ,ΪΓ H S / \ „O « O o CH ch2

H O

l-allyloksy- 3- (H-ætylepimin) -propaiiol^2

CH = OH

-o H 0—0 0=0 o ON o o \0/

ON

Maleinsyreanhydrid H ro CH9=CH-CHp-Br H (Ti o o Allylbromid 0Hn=CH-0^ ro 4*. k \ O O ur ui ^ Cl V« V· \J -L.

\J1 UT

AJcryloylklorid _ N*-C-CH=CH-C-N* i—1 ro 3 || II 5 00 0-000 ® ® h ui ui oo Maleinsyreazid