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Technisches
Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft einen Mikroorganismus, der 5-Aminolävulinsäure in hoher
Konzentration erzeugt und anhäuft
und ein Verfahren zur Erzeugung von 5-Aminolävulinsäure unter Verwendung desselben.
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Stand der
Technik
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5-Aminolävulinsäure ist
eine Verbindung, die in der Biosphäre als Vorläufer von Tetrapyrrolverbindungen
weit verbreitet vorliegt und hat in vivo wichtige Funktionen. 5-Aminolävulinsäure ist
eine natürliche
Verbindung, die ausgezeichnete Funktionen z.B. als Herbizid, Insektizid,
Pflanzenwachstumsregulator, Pflanzensynthese verstärkendes
Mittel und ähnliches
zeigt und die auch vorteilhafte Eigenschaften aufweist, wie z.B.
keine Toxizität
für den
Menschen und Tiere und keine Restmülleigenschaften in der Umgebung
aufgrund der hohen Abbaufähigkeit
(siehe z.B. JP-A-61-502814, JP-A-2-138201).
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5-Aminolävulinsäure weist
jedoch das Problem auf, dass es bei der Verwendung bei den oben
erwähnten
Verwendungsarten aufgrund seiner hohen Produktionskosten schlecht
verwertbar ist (CHEMICAL WEEK, Oktober, 29 (1984)).
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Dementsprechend
wurden viele chemische Syntheseverfahren überprüft (siehe z.B. JP-A-2-76841), jedoch
wurden bis jetzt noch keine zufriedenstellenden Verfahren entwickelt.
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Andererseits
wurden auch Verfahren für
die Erzeugung von 5-Aminolävulinsäure unter
Verwendung von Mikroorganismen untersucht, die zur Gattung Rhodobakterium,
Propionibakterium, Methanobakterium, Methanosarcina und ähnlichen
gehören.
Die Verfahren unter Verwendung der Mikroorganismen, die zur Gattung
Propionibakterium, Methanobakterium, Methanosarcina und ähnlichen
gehören
(siehe z.B. JP-A-5-184376) sind jedoch nicht zufriedenstellend,
da ihr Ertrag sehr niedrig liegt. Von E. L. Neidle und S. Kaplan,
Journal of Bacteriology, April 1993, Seiten 2304–2313 ist ein Rhodobacter sphaeroides-Bakterium
bekannt, das 5-Aminolävulinsäure erzeugt.
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Es
ist bekannt, dass Nicht-Schwefel-Purpur-Bakterien, wie z.B. Mikroorganismen,
die zur Gattung Rhodobakterium und zur Gattung Rhodopseudomonas
und ähnlichen
gehören,
eine hohe Fähigkeit
zur Synthese von Tetrapyrrolverbindungen unter Verwendung von 5-Aminolävulinsäure als
Stoffwechselintermediat aufweisen. Die Verwendung dieser Mikroorganismen
weist jedoch das Problem auf, dass die erzeugte 5-Aminolävulinsäure zu Tetrapyrrolverbindungen
verstoffwechselt wird, so dass eine gewünschte Menge 5-Aminolävulinsäure nicht
angehäuft
wird.
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Da
daher die Biosynthese von 5-Aminolävulinsäure in vivo auf komplizierte
Weise reguliert wird, ist es nicht einfach, einen Stamm zu erhalten,
der 5-Aminolävulinsäure in hoher
Konzentration anhäufen
kann.
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Andererseits
wurde ein Verfahren unter Verwendung eines mutierten Stamms der
Gattung Rhodobakterium, der 5-Aminolävulinsäure in einer maximalen Menge
von 14,3 mM anhäufen
kann, wobei Glukose als Kohlenstoffquelle verwendet wird, vorgeschlagen
(JP-A-8-168391). Dieses Verfahren kann jedoch nicht als industriell
vorteilhaftes Verfahren angesehen werden, da es notwendig ist, eine
gelöste
Sauerstoffkonzentration auf einem sehr niedrigen Niveau während der
Kultivierung zu erhalten, so dass die Belüftung in dem Kulturgefäß durch
Zufuhr einer Mischung aus Luft und Stickstoffgas durchgeführt werden
muss.
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Dieses
Verfahren benötigt
außerdem
Sauerstoff, wenn 5-Aminolävulinsäure aerob
unter Verwendung von Glukose als Kohlenstoffquelle angehäuft wird.
Dementsprechend besteht eine Möglichkeit,
dass 5-Aminolävulinsäure effizient
selbst unter Bedingungen erzeugt wird, unter denen Sauerstoff ausreichend
vorliegt, da die gelöste
Sauerstoffkonzentration aufgrund des Verbrauchs von Sauerstoff durch
den Mikroorganismus reduziert ist. Es ist jedoch nicht möglich, 5-Aminolävulinsäure effizient
unter relativ hohen gelösten
Sauerstoff-Konzentrationsbedingungen zu erzeugen.
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Offenbarung
der Erfindung
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Mikroorganismus
bereitzustellen, der 5-Aminolävulinsäure effizient
selbst unter solchen Bedingungen erzeugen kann, dass eine gelöste Sauerstoffkonzentration
relativ hoch ist, ohne einen Bedarf einer Zufuhr von Stickstoffgas
oder ähnlichem.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der vorliegende Erfindung, ein Verfahren
zur Erzeugung von 5-Aminolävulinsäure unter
Verwendung des Mikroorganismus bereitzustellen.
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Unter
den oben geschilderten Bedingungen haben die Erfinder der vorliegenden
Erfindung intensive Untersuchungen mit dem Ziel durchgeführt, einen
Mikroorganismus zu erhalten, der 5-Aminolävulinsäure effizient erzeugen kann
und haben im Ergebnis ein Verfahren zur Selektion von 5-Aminolävulinsäure anhäufenden
Mikroorganismen mit hoher Produktivität gefunden und dann unter Verwendung
dieses Verfahrens einen Mikroorganismus gefunden, der 5-Aminolävulinsäure in hohen
Konzentrationen selbst bei einer relativ hohen gelösten Sauerstoffkonzentration
anhäufen
kann. So wurde die vorliegende Erfindung vervollständigt.
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Außerdem haben
die vorliegenden Erfinder ein sehr effizientes Verfahren zur Selektion
von 5-Aminolävulinsäure anhäufenden
Mikroorganismen gefunden, durch das eine große Anzahl von mutierten Stämmen durch
geeignete Veränderung
von Sacchariden, Glycin, Lävulinsäure und ähnliches
bewertet werden kann und eine wiederholte Mutantenbehandlung möglich wird.
So waren die vorliegenden Erfinder bei der Züchtung eines Stamms erfolgreich,
der 5-Aminolävulinsäure in hoher
Konzentration anhäufen
kann. Daraufhin wurde die vorliegende Erfindung durch Etablieren
eines Kultivierungsprozesses vervollständigt, worin Saccharide, Glycin,
Lävulinsäure, Eisenbestandteile
und ähnliches
auf geeignete Weise zugefügt
werden und der gelöste
Sauerstoff und das Oxidationsreduktionspotenzial in der Kulturbrühe kontrolliert
werden.
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Das
heißt,
die vorliegende Erfindung stellt einen 5-Aminolävulinsäure-erzeugenden Mikroorganismus mit
einer 5-Aminolävulinsäure-Synthaseaktivität von 2
bis 7 (nmol/min/mg Protein) unter aeroben Kulturbedingungen bei
einer gelösten
Sauerstoffkonzentration von 0,70 bis 6,60 ppm, wobei der Mikroorganismus
Rhodobacter sphaeroides CR-0072009 (FERM BP-6320) oder ein mutierter
Stamm davon ist, bereit.
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Außerdem stellt
die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung von 5-Aminolävulinsäure bereit,
umfassend das Kultivieren von mindestens einem solchen 5-Aminolävulinsäureproduzierenden
Mikroorganismen und Gewinnen der 5-Aminolävulinsäure aus der resultierenden
Kultur.
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Weiterhin
stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung von
5-Aminolävulinsäure bereit,
umfassend das Kultivieren des 5-Aminolävulinsäure-erzeugenden Mikroorganismus
in einem Medium, enthaltend einen Eisenbestandteil in einer Menge
von 5 bis 500 μM
und Gewinnen der 5-Aminolävulinsäure aus
der resultierenden Kulturmischung.
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Weiterhin
stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Kultivieren des
5-Aminolävulinsäure-erzeugenden
Mikroorganismus bereit, umfassend das Kultivieren eines 5-Aminolävulinsäure erzeugenden
Mikroorganismus in einem Medium, enthaltend einen Eisenbestandteil
in einer Menge von 5 bis 500 μM.
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Kurze Erklärung der
Zeichnung
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1 ist
eine Grafik, die eine Beziehung zwischen gelöstem Sauerstoff und der 5-Aminolävulinsäure-Synthaseaktivität darstellt.
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Beste Ausführungsform
der Erfindung
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Der
5-Aminolävulinsäure erzeugende
Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung wurde z.B. unter Verwendung
eines Wildtypstamms oder eines mutierten Stamms, d.h. Rhodobacter
spaeroides CR-002 (FERM P-15312) als Elternstamm, durch Durchführung einer
Mutationsbehandlung und Selektion eines Stammes mit einer 5-Aminolävulinat-Synthaseaktivität von 2
bis 7 (nmol/min/mg Protein) unter Bedingungen bei einer gelösten Sauerstoffkonzentration
von 0,70 bis 6,60 ppm erhalten, vorzugsweise mit einer 5-Aminolävulinsäure-Synthaseaktivität von 3,5
bis 5,6 (nmol/min/mg Protein) bei einer gelösten Sauerstoffkonzentration
von 1,46 bis 5,86 ppm.
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Spezifisch
wird das folgende Verfahren beschrieben:
Zunächst wird
ein Flüssigmedium,
in dem der Elternstamm wachsen kann, in einem Teströhrchen hergestellt und
sterilisiert und dann wird der Elternstamm in das Medium inokuliert
und unter Schütteln
kultiviert. Die so gezüchteten Zellen
werden mit einem Puffer gewaschen und einer Mutationsbehandlung
unterzogen.
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Als
Mutationsbehandlung können
allgemeine Mutationsmittel verwendet werden. Beispiele hierfür beinhalten
ein Verfahren, wobei die Zellen des Elternstamms, die auf einem
Agarmedium angezüchtet
wurden, mit einem physikalischen Mutagen bestrahlt werden, wie z.B.
UV-Strahlen, ionisierender Strahlung oder ähnlichen und ein Verfahren,
wobei der Elternstamm in einem in Puffer kultiviert wird, dem ein
chemisches Mutagen zugefügt
wurde, einschließlich
einem Alkylierungsmittel, wie z.B. Ethylmethansulfonat (EMS), N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin
(NTG), Ethylnitrosoharnstoff (ENU) oder ähnliche und einem Basenanalog,
wie z.B. Bromdeoxyuridin (BrdUrd) oder ähnlichen.
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Die
durch das oben beschriebene Mutationsmittel derartig behandelten
Zellen werden wiederum mit einem Puffer gewaschen und auf einem
Agarmedium für
die Kultivierung verteilt. Außerdem
wird eine Selektion eines Stammes mit den oben beschriebenen Eigenschaften
von den so gezüchteten,
durch diese Kultivierung erhaltenen mutierten Stämme durch die folgenden Schritte
durchgeführt.
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Jeder
der so erhaltenen mutierten Stämme
wird in einem Teströhrchen
oder ähnlichem
kultiviert und Lävulinsäure und
Glycin werden nach dem Zellwachstum hinzugefügt. Nach der Zugabe von dieser
Verbindungen wird die Menge der angehäuften 5-Aminolävulinsäure in der
Kulturbrühe
gemessen, um einen Stamm mit einer hohen 5-Aminolävulinsäure-Produktivität zu selektieren.
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Um
größere Zahlen
von Mikroorganismen zu kultivieren und zu beurteilen ist es effektiv
und bevorzugt, eine Mikrotiterplatte zu verwenden. Zusätzlich kann
die Selektion effizient durchgeführt
werden, wenn die Messung der 5-Aminolävulinsäure durch die Ehrlich-Reaktion
durchgeführt
wird, da die angehäufte
Menge 5-Aminolävulinsäure visuell
erkannt werden kann.
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Die
Selektion wird durchgeführt,
indem ungefähr
1 bis 100 Stämme
mit hoher 5-Aminolävulinsäure-Produktivität aus ungefähr 15.000
mutierten Stämme
selektiert werden, die durch die erste Mutationsbehandlung erhalten
werden und dann wird ein Stamm mit einer stabilen Wachstumsfähigkeit
und Produktivität aus
den so selektierten Stämmen
durch Subkultivieren in Teströhrchen
oder auf Agarplatten wiederum selektiert. Es wird auch in diesem
Fall bevorzugt, die Ehrlich-Reaktion und eine Mikrotiterplatte zu
verwenden.
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Unter
Verwendung des so erhaltenen Stammes als Elternstamm wird die oben
beschriebene Mutationsbehandlung und Selektion wiederholt. Wenn
die Produktivität
der 5-Aminolävulinsäure durch
Wiederholung der Mutation ansteigt, verändert sich die optimale Konzentration
der zuzufügenden
Lävulinsäure in einigen
Fällen,
so dass es bevorzugt wird, die Konzentration von Lävulinsäure, die
zugefügt
werden soll, in geeigneter Weise zu verändern.
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Der
so durch Wiederholung der Mutationszüchtung erhaltene Stamm mit
einer Fähigkeit
zur Anhäufung
einer beträchtlichen
Menge 5-Aminolävulinsäure unter
aeroben Bedingungen, weist das Merkmal auf, dass eines der mit dem
5-Aminolävulinsäure-Stoffwechsel in Beziehung
stehenden Enzyme, nämlich
die 5-Aminolävulinatsynthase,
erhöht
ist. Zusätzlich
tritt, anders als im Fall von Wildtyp-Stämmen der fotosynthetischen
Bakterien derselben Gattung eine Inhibition der 5-Aminolävulinat-Synthaseaktivität bei dem
so erhaltenen mutierten Stamm selbst unter solchen Bedingungen kaum
auf, unter denen die gelöste
Sauerstoffkonzentration im Kulturmedium 2 ppm übersteigt.
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Im
Hinblick auf den Elternstamm zur Verwendung in dem ersten Schritt
des oben beschriebenen Verfahrens wird ein Stamm verwendet, der
ein gutes Wachstum auf preisgünstigen
Kohlenstoffquellen zeigt, wie Glukose oder ähnlichen, unter aeroben Bedingungen
und der eine gute Fähigkeit
zur Synthese von Tetrapyrrolverbindungen aufweist, wie z.B. von
Bakteriochlorophyll oder ähnlichen.
Dieser Stamm ist Rhodobacter sphaeroides CR-002 (FERM P-15312).
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Außerdem ist
der durch die oben beschriebene Mutation und Selektion erhaltene
Stamm ein Stamm, der Rhodobacter sphaeroides CR-0072009 genannt
wurde und als FERM BP-6320 am 7. April 1998 im National Institute
of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science
and Technology, the Ministry of International Trade and Industry
(Higashi 1-1-3, Tsukuba, Ibaraki, Japan) hinterlegt wurde. Dieser
Stamm, der eine beträchtliche
Menge von 5-Aminolävulinsäure anhäufen kann,
wurde durch wiederholte Mutation und Selektion des oben beschriebenen
Rhodobacter sphaeroides CR-002 erhalten.
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Da
Rhodobacter sphaeroides CR-0072009 ein Stamm ist, der durch Mutation
von Rhodobacter sphaeroides CR-002, wie oben beschrieben, erhalten
wurde, sind die meisten seiner bakteriologischen Eigenschaften zu
denen des Stamms CR-002 identisch.
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Die
bakteriologischen Eigenschaften von Rhodobacter sphaeroides CR-0072009
werden unten beschrieben.
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(a) Morphologische Eigenschaften
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- • Größe und Form
der Zelle:
0,5 × 1
bis 2,5 μM,
Stäbchen,
etliche Zellen in Hauptachsenrichtung verbunden.
- • Sporen:
abwesend
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(b) Wachstum auf Agarmedium
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- • Glänzende,
rötlich
braune kreisförmige
Kolonie auf dem Medium der Tabelle 1
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(c) Physiologische Eigenschaften
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- • Gramfärbung: –
- • Nitratreduktion:
+
- • Oxidase:
+
- • Glukosefermentation: –
- • Wachstumsbereich:
pH 4,0 bis 9,0, 10°C
bis 40°C
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(d) Chemotaxonomische
Eigenschaften
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- • DNA-G/C-Gehalt
(mol%): 68
- • Chinonart:
Q-10
- • Karotinoid:
+ (Hauptbestandteile: Chloroxanthin, Methylchloroxanthin)
- • Bakteriochlorophyll:
+
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(e) Andere Wachstumsbedingungen
und ähnliche
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- • Fotosynthetisches
Wachstum:
Sehr schwach im Medium von Tabelle 1. Obwohl der
Ursprungsstamm ein fotosynthetisches Bakterium ist, ist seine Fähigkeit,
ein fotosynthetisches Wachstum durchzuführen, reduziert.
- • Assimilation
von Glukose (aerob): +
- • Assimilation
von Natriumacetat (aerob): +
- • 5-Aminolävulinat-Dehydratase-Aktivität:
1/3
oder weniger im Vergleich mit dem Ursprungsstamm (CR-002) durch
aerobes Kultivieren.
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Die
Produktionsbedingungen von 5-Aminolävulinsäure unter Verwendung von Rhodobacter
sphaeroides CR-0072009 werden unten beschrieben. Betreffend die
Produktionsbedingungen von 5-Aminolävulinsäure können allgemeine Mikroorganismus-Kultivierungsbedingungen
verwendet werden. Beispiele für
die Kohlenstoffquelle beinhalten Saccharide, wie z.B. Glukose und ähnliches
oder Säuren,
wie z.B. Essigsäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure und ähnliche
und die Saccharide sind im Hinblick auf den ökonomischen Standpunkt besonders
vorteilhaft. Beispiele für
die Stickstoffquelle beinhalten anorganische Stickstoffquellen,
z.B. Ammoniak-Stickstoffverbindungen,
wie z.B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und ähnliche und Nitrat-Stickstoffverbindungen,
wie z.B. Natriumnitrat und ähnliche;
und anorganische Stickstoffquellen, wie z.B. Glycin, Harnstoff,
Polypepton, Hefeextrakt, Casaminosäure und ähnliche. Unter diesen wird
Glycin vorzugsweise zur Verbesserung der Produktivität der 5-Aminolävulinsäure zugefügt. Die
zugefügte
Glycinmenge liegt vorzugsweise in einem Bereich von 10 bis 1.000
mM, noch bevorzugter 10 bis 400 mM. Es wird auch bevorzugt, Glycin
in einer Menge von 10 bis 200 mM pro Addition zu verwenden und diese
Menge mehrmals zuzufügen.
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Weiterhin
können,
falls nötig,
andere Bestandteile, wie z.B. Vitamine, anorganische Salze und ähnliche
dem Medium je nach Bedarf zugefügt
werden.
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Es
ist bekannt, dass Mikroorganismen, die zu den Nicht-Schwefel-Purpur-Bakterien
gehören,
wie z.B. zur Gattung Rhodobakterium, Rhodopseudomonas und ähnlichen,
im allgemeinen eine 5-Aminolävulinat-Dehydratase
aufweisen, die die erzeugte 5-Aminolävulinsäure verstoffwechselt. Da die
5-Aminolävulinat-Dehydratase-Aktivität jedoch
bei dem Stamm der vorliegenden Erfindung signifikant reduziert ist,
kann 5-Aminolävulinsäure extrazellulär angehäuft werden,
ohne einen 5-Aminolävulinsäure-Dehydratase-Inhibitor
zuzufügen, wie
z.B. Lävulinsäure, jedoch
ist die Addition einer geringen Menge des Inhibitors effektiv für die Verbesserung der
5-Aminolävulinsäure-Produktivität. In dem
Fall liegt die Menge des zuzufügenden
Inhibitors vorzugsweise in einem Bereich von 0,01 bis 20 mM, noch
bevorzugter 0,1 bis 10 mM. Alle Kultivierungsbedingungen können verwendet
werden, solange Rhodobacter sphaeroides CR-0072009 wachsen kann,
jedoch sind allgemein bevorzugte Bedingungen Kultivierungstemperaturen
von 10 bis 40°C,
noch bevorzugter 20 bis 35°C
bei einem pH des Mediums von 4 bis 9, noch bevorzugter 5 bis 8.
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Wenn
der pH des Mediums außerdem
während
der Kultivierung fluktuiert wird es bevorzugt, ihn in dem oben beschriebenen
Bereich mit einer Alkalilösung,
wie z.B. Natriumhydroxid, Ammoniak, Natriumhydroxid und ähnlichem
oder mit einer Säure,
wie z.B. Salzsäure,
Schwefelsäure,
Phosphorsäure
und ähnlichem
einzustellen.
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Die
Erzeugung der 5-Aminolävulinsäure kann
simultan mit oder unabhängig
von dem mikrobiellen Wachstum durchgeführt werden. In diesem Fall
handelt es sich bei dem zu verwendenden Mikroorganismus entweder
um wachsende Zellen oder um ruhende Zellen, die als solche für die Erzeugung
von 5-Aminolävulinsäure verwendet
werden können
oder nach Erhöhung
der Zelldichte, z.B. durch Gewinnung der Zellen unter Verwendung
eines Apparats, wie z.B. einer Zentrifuge oder ähnlichem und dann Resuspension
der gewonnen Zellen in einer geeigneten Lösung, wie z.B. einem Medium,
einem Phosphatpuffer oder ähnlichen.
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Um
die Produktivität
der 5-Aminolävulinsäure weiter
zu verbessern wird es bevorzugt, die gelöste Sauerstoffkonzentration
und das Oxidations-Reduktions-Potenzial
in der Kulturbrühe
in Bereiche von 0,001 bis 2 ppm und –220 mV bis 50 mV, noch bevorzugter
0,001 bis 1 ppm bzw. –200
mV bis 0 mV einzustellen. Beispiele für das Kontrollverfahren in
diesem Fall beinhalten ein Verfahren, worin die Rührgeschwindigkeit
oder Belüftungsrate
geändert
wird, ein Verfahren, wobei die Belüftung des Mikroorganismus durch
Zugabe von Sacchariden, Hefeextrakt oder ähnlichem aktiviert wird und
ein Kombinationsverfahren daraus.
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Um
außerdem
den gelösten
Sauerstoff und das Oxidations-Reduktions-Potenzial
stabiler zu kontrollieren ist es effektiv, einen Eisenbestandteil
dem Medium zum Zweck einer Erhöhung
der Wachstumsrate des Mikroorganismus zuzufügen und dadurch die Atmungsaktivität zu stabilisieren.
Der verwendete Eisenbestandteil ist vorzugsweise ein Eisensalz und
das Eisenvalenzeisen ist nicht besonders begrenzt. Beispiele für die Eisenverbindung
beinhalten Eisenchlorid, Eisen(III)sulfat, Eisencitrat und ähnliche.
Wenn eine natürliche
Substanz, wie z.B. Hefeextrakt, Maisquellflüssigkeit oder ähnliches
als Mediumbestandteil verwendet wird, die einen Eisenbestandteil
in erwünschter
Menge enthält,
kann dies als Eisenverbindung verwendet werden. Es wird bevorzugt,
den Eisenbestandteil dem Medium in einer Menge von 5 bis 500 μM als Eisen
zuzufügen.
Wenn die Menge geringer ist als 5 μM, kann keine Wirkung zur Beschleunigung
des mikrobiellen Wachstums oder Stabilisation der Atmungsaktivität erhalten
werden und wenn die Menge größer ist
als 500 μM,
kann das mikrobielle Wachstum inhibiert werden. Eine Konzentration
des Eisenbestandteils liegt vorzugsweise bei 10 bis 300 μM, noch bevorzugter
20 bis 200 μM.
Die Eisenverbindung kann auch dem Medium im Vorhinein zugefügt werden
oder in einer späteren
Stufe zugefügt
werden.
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Falls
nötig,
kann die so erzeugte 5-Aminolävulinsäure durch
in der Regel verwendete Techniken abgetrennt und gereinigt werden,
wie z.B. ein Ionenaustauschverfahren, ein Chromatographieverfahren,
ein Extraktionsverfahren und ähnliche.
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Beispiele
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Die
vorliegende Erfindung wird unten, basierend auf den Beispielen erklärt. Diese
werden jedoch nur für
illustrative Zwecke dargestellt und die vorliegende Erfindung ist
nicht darauf begrenzt.
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Beispiel 1
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In
ein Teströhrchen
mit einem Durchmesser von 21 mm werden 10 ml Glutamat/Glukosemedium
(Medium 1), wie dargestellt in Tabelle 1 gegossen, 15 Minuten bei
121°C sterilisiert
und dies läßt man dann
zum Abkühlen
stehen. Eine Schlaufe Rhodobacter sphaeroides CR-002 (FERM P-15312)
wurde in das Medium inokuliert und unter Schütteln im Dunkeln 2 Tage bei
30°C kultiviert.
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In
ein weiteres Teströhrchen
mit einem Durchmesser von 21 mm wurden 10 ml Medium 1 gegossen und
auf dieselbe Weise wie oben beschrieben, sterilisiert. Ein 0,5 ml
Teil der obigen Kulturbrühe
wurde in das Medium inokuliert und unter Schütteln im Dunkeln 18 Stunden
bei 32°C
kultiviert.
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Die
Kulturbrühe
wurde bei 3.000 × g
5 Minuten zum Waschen zentrifugiert, der resultierende Überstand
wurde verworfen und dann wurden die Zellen in denselben Volumen
eines Tris-Maleat-Puffers
(pH 6,0) suspendiert. Dieser Waschschritt wurde weiterhin zweimal
wiederholt.
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Danach
wurde die Suspension bei 3.000 × g
5 Minuten zentrifugiert, der resultierende Überstand wurde verworfen und
dann wurden die Zellen in einem Tris-Maleat-Puffer (pH 6,0), enthaltend
100 μg/ml
NTG, suspendiert und statisch bei Raumtemperatur 80 Minuten kultiviert.
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Die
so mutagenisierten Zellen wurden dreimal auf dieselbe Weise, wie
oben beschrieben, gewaschen und dann in ein Teströhrchen inokuliert,
das sterilisiertes Medium 1 enthielt und unter Schütteln im
Dunkeln 2 Tage bei 32°C
kultiviert.
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Die
so erhaltene Kulturbrühe
wurde verdünnt
und auf einem Agarplattenmedium verteilt, hergestellt durch Zugabe
von 15 g/l Agar zum Medium 1 und Sterilisieren der Mischung bei
121°C für 15 Minuten
und die Zellen wurden in Dunkeln für 4 Tage bei 32°C kultiviert.
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Im
Ergebnis wurden ungefähr
15.000 Kolonien erhalten.
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Als
nächstes
wurde sterilisiertes Medium 1 in sterilisierte Mikrotiterplatten
mit 96 Vertiefungen mit 0,2 ml pro Vertiefung gegossen und jeder
der oben beschriebenen, ungefähr
15.000 mutierten Stämme
wurde in das Medium inokuliert.
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Nach
einem Kultivieren unter Schütteln
im Dunkeln bei 30°C
für 48
Stunden auf einer Schüttelvorrichtung
für Mikrotiterplatten
wurden sowohl Glycin als auch Lävulinsäure jeder
Vertiefung zugefügt,
um eine Endkonzentration von 30 mM zu ergeben, gefolgt von einer
Kultivierung unter Rühren
unter denselben Bedingungen für
24 Stunden.
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5-Aminolävulinsäure in jeder
Vertiefungen wurde, wie unten beschrieben, nachgewiesen (Ehrlich-Reaktion).
- (1) Die Kulturbrühe in jeder Vertiefungen wurde
in eine andere Mikrotiterplatte übertragen
und mit 0,1 ml eines 1 M Acetatpuffers, enthaltend 1% Acetylaceton,
vermischt und die Mikrotiterplatte wurde versiegelt, bei 100°C für 15 Minuten
inkubiert und dann schnell auf Eis abgekühlt.
- (2) Als nächstes
wurden 0,1 ml einer Essigsäurelösung, enthaltend
2% p-Dimethylaminobenzaldehyd und 16% Perchlorsäure jeder Vertiefungen zugefügt und man
ließ die
Mischung bei Raumtemperatur 15 Minuten stehen, um eine Entwicklung
einer rötlich-lila
Farbe durch die Ehrlich-Reaktion zu beobachten.
- (3) Danach wurde ein Teil von jeder Reaktionslösung als
Probe genommen und einer DC-Analyse zum Ausschluss von Stämmen unterzogen,
die eine rötlich-lila
Farbe zeigten, die nicht von 5-Aminolävulinsäure abstammte, wodurch 6 mutierte
Stämme
selektiert wurden, die eine hohe Produktivität an 5-Aminolävulinsäure aufwiesen.
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Jeder
der so erhaltenen 6 Stämme
wurde im Dunkeln bei 30°C
48 Stunden unter Verwendung eines Teströhrchens kultiviert, das Medium
1 enthielt und die resultierende Kulturbrühe wurde auf einem Agarplattenmedium
mit einer Zusammensetzung von Medium 1 verteilt und zur Bildung
von Kolonien kultiviert.
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Als
nächstes
wurde sterilisiertes Medium 1 in Vertiefungen von sterilisierten
Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit 0,2 ml pro Vertiefung
gegossen und jede der optional selektierten 60 Kolonien, abstammend von
jedem der oben beschriebenen Stämme,
wurde in das Medium inokuliert.
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Nach
Kultivierung unter Schütteln
im Dunkeln bei 32°C
für 48
Stunden auf einer Schüttelvorrichtung für Mikrotiterplatten
wurde Glycin jeder Vertiefung zugefügt, um eine Endkonzentration
von 30 mM zu ergeben und 30, 15 oder 1 mM Lävulinsäure wurden den Vertiefungen
zugefügt,
korrespondierend zu 20 Kolonien der oben beschriebenen 60 Kolonien.
Kultivierung unter Rühren
wurde 24 Stunden unter denselben Bedingungen fortgesetzt und ein
Teil der Kulturbrühe
wurde von jeder Vertiefung zur Überprüfung der
Produktivität
an 5-Aminolävulinsäure als
Probe entnommen und einer optimalen Konzentration von Lävulinsäure durch
die Ehrlich-Reaktion. Dieses Verfahren wurde dreimal wiederholt
und ein mutierter Stamm mit einer stabil höheren Produktivität als CR-002
wurde unter Verwendung eines Anstiegs in der Produktivität und einer
Variation der Produktivität
unter den Kolonien als Indizes isoliert. Dieser Stamm wurde CR-150
genannt. Die optimale Konzentration der Lävulinsäure betrug 30 mM. Wenn die
angehäufte
Menge 5-Aminolävulinsäure im Fall
einer Zugabe von 30 mM Lävulinsäure durch
Messung der Absorption der Ehrlich-Reaktion bei 553 nm unter Verwendung
einer Mikrotiterplatten-Ablesevorrichtung
bestimmt wurde, zeigte der Stamm CR-002 eine Produktivität von 0,01
mM, während
die des Stamms CR-150 0,1 mM betrug.
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Beispiel 2
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Dasselbe
Verfahren wie in Beispiel 1 wurde wiederholt, außer dass der Stamm zu CR-150
verändert wurde,
um dadurch ungefähr
15.000 mutierte Stämme
zu erhalten. Indem sie den Selektiontests auf dieselbe Weise wie
in Beispiel 1 unterzogen wurden, wurde ein mutierter Stamm CR-268
mit noch weiter verbesserter Produktivität als bei CR-150 erhalten.
Wenn die angehäufte
Menge 5-Aminolävulinsäure durch
Messung der Absorption der Ehrlich-Reaktion bei 553 nm unter Verwendung
einer Mikrotiterplatten-Ablesevorrichtung bestimmt wurde, zeigte
der Stamm CR-268 eine Produktivität von 0,3 mM.
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Beispiel 3
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Dasselbe
Verfahren wie in Beispiel 1 wurde wiederholt, außer dass der Stamm zu CR-268
geändert wurde,
um dadurch ungefähr
15.000 mutierte Stämme
zu erhalten. Indem sie denselben Selektionstests wie in Beispiel
1 unterzogen wurden, wurde ein mutierter Stamm CR-368 mit noch weiter
verbesserter Produktivität als
CR-268 erhalten. Wenn die angehäufte
Menge 5-Aminolävulinsäure durch
Messung der Absorption der Ehrlich-Reaktion bei 553 nm unter Verwendung
einer Mikrotiterplatten-Ablesevorrichtung
bestimmt wurde, zeigte der Stamm CR-368 eine Produktivität von 0,5
mM.
-
Beispiel 4
-
Dasselbe
Verfahren wie in Beispiel 1 wurde wiederholt, außer dass der Stamm zu CR-368
geändert wurde,
um dadurch ungefähr
15.000 mutierte Stämme
zu erhalten. Indem sie denselben Selektionstests wie in Beispiel
1 unterzogen wurde, wurde ein mutierter Stamm CR-405 mit noch weiter
verbesserter Produktivität als
CR-368 erhalten. Wenn die angehäufte
Menge 5-Aminolävulinsäure durch
Messung der Absorption der Ehrlich-Reaktion bei 553 nm unter Verwendung
einer Mikrotiterplatten-Ablesevorrichtung
bestimmt wurde, zeigte der Stamm CR-405 eine Produktivität von 1,0
mM.
-
Beispiel 5
-
Dasselbe
Verfahren wie in Beispiel 1 wurde wiederholt, außer dass der Stamm zu CR-405
geändert wurde,
um dadurch ungefähr
15.000 mutierte Stämme
zu erhalten. Indem sie denselben Selektionstests wie in Beispiel
1 unterzogen wurde, außer
dass die angefügte
Lävulinsäuremenge
zu 15 mM geändert
wurde, wurde ein mutierter Stamm CR-405 mit noch weiter verbesserter
Produktivität
als CR-468 erhalten. Wenn die angehäufte Menge 5-Aminolävulinsäure durch
Messung der Absorption der Ehrlich- Reaktion bei 553 nm unter Verwendung
einer Mikrotiterplatten-Ablesevorrichtung
bestimmt wurde, zeigte der Stamm CR-405 eine Produktivität von 1,2
mM, während
diejenige des Stamms CR-502 bei 2,1 mM lag.
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Beispiel 6
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Dasselbe
Verfahren wie in Beispiel 1 wurde wiederholt, außer dass der Stamm zu CR-502
geändert wurde,
um dadurch ungefähr
15.000 mutierte Stämme
zu erhalten. Indem sie dem Selektionstest auf dieselbe Weise, wie
in Beispiel 1 beschrieben, unterzogen wurden, außer dass die Menge an Lävulinsäure auf
1 mM geändert
wurde, wurde ein mutierter Stamm CR-660 mit einer verbesserten Produktivität im Vergleich
mit CR-502 erhalten. Wenn die angehäufte Menge 5-Aminolävulinsäure durch
Messung der Absorption der Ehrlich-Reaktion bei 553 nm unter Verwendung
einer Mikrotiterplatten-Ablesevorrichtung
bestimmt wurde, zeigte der Stamm CR-502 eine Produktivität von 2,4
mM, während
diejenige des Stamms CR-660 bei 3,3 mM lag.
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Beispiel 7
-
Dasselbe
Verfahren wie in Beispiel 1 wurde wiederholt, außer dass der Stamm zu CR-660
geändert wurde,
um dadurch ungefähr
15.000 mutierte Stämme
zu erhalten. Indem sie dem Selektionstest auf dieselbe Weise, wie
in Beispiel 1 beschrieben, unterzogen wurden, außer dass die Menge an Lävulinsäure auf
1 mM geändert
wurde, wurden drei mutierte Stamm CR-0072001, CR-0072002 und CR-0072009
mit einer verbesserten Produktivität im Vergleich mit CR-660 erhalten.
Wenn die angehäufte
Menge 5-Aminolävulinsäure durch Messung
der Absorption der Ehrlich-Reaktion bei 553 nm unter Verwendung
einer Mikrotiterplatten-Ablesevorrichtung bestimmt wurde, zeigten
die Stämme
CR-0072001, CR-0072002 und CR-0072009 eine Produktivität von 5,9,
5,6 bzw. 4,6 mM.
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Beispiel 8
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Jeder
der mutierten Stämme
CR-0072001, CR-0072002 und CR-0072009, wie erhalten in Beispiel
7, wurde in einen Schüttelkolben
mit einem Fassungsvermögen
von 500 ml inokuliert, der 200 ml Medium 1 enthielt und unter Schütteln im
Dunkeln bei 32°C
48 Stunden auf einer reziproken Schüttelvorrichtung kultiviert. Nach
der Kultivierung wurden die resultierenden Zellen durch Zentrifugation
bei 5.000 × g
10 Minuten gewonnen und im Medium 2, wie dargestellt in Tabelle
2, suspendiert, um eine Dichte von 0,5 g Feuchtzellen/10 ml zu ergeben
und 3 ml der Suspension wurden in 21 mm Teströhrchen gegossen. Die Zellen
in den so hergestellten Teströhrchen
wurden unter Schütteln
im Dunkeln 20 Stunden bei 32°C
auf einer reziproken Schüttelvorrichtung
kultiviert und die Menge der 5-Aminolävulinsäure in der Kulturbrühe wurde
durch das Verfahren von Okayama et al. (CLINICAL CHEMISTRY, Band
36, Nr. 8, Seiten 1494, 1990) gemessen. Im Ergebnis betrugen die
Produktivitäten
der Stämme
CR-0072001, CR-0072002 und CR-0072009 19,0, 21,5 bzw. 31,0 mM.
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-
Beispiel 9
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Der
mutierte Stamm CR-0072009 wurde in einen konischen Schikanen-Kolben
mit einer 300 ml Kapazität,
enthaltend 50 ml Medium 3, wie dargestellt in Tabelle 3, inokuliert
und unter Schütteln
im Dunkeln bei 32°C
für 48
Stunden auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung kultiviert.
Die resultierende Kulturbrühe
wurde in einen 3 l Fermenter, enthaltend 1,8 l Medium 3, inokuliert
und unter Schütteln
bei 32°C
mit einer Belüftungsrate
von 0,36 l/min und 400 Upm kultiviert. Nach einer Kultivierung für 40 Stunden
unter Einstellung des Medium-pHs auf 6,5 bis 6,6 unter Verwendung
von Schwefelsäure
und Natriumhydroxid wurden 0,210 g Lävulinsäure, 8,1 g Glycin und 18 g
Hefeextrakt (D-3, hergestellt von Japan Pharmaceutical) dem Medium
zugefügt und
die Kultivierung wurde durch Veränderung
der Rührgeschwindigkeit
auf 325 Upm und Kontrolle des pHs des Mediums auf 6,3 bis 6,4 unter Verwendung
von Schwefelsäure
und Natriumhydroxid fortgesetzt. Ein 8,1 g Teil Glycin wurde 12,
26 und 38 Stunden später
zugefügt.
Die Kultivierung wurde 50 Stunden nach der Zugabe von Lävulinsäure beendet.
Die 5-Aminolävulinsäuremenge
in der Kulturbrühe
betrug 60 mM, wenn sie durch das Verfahren von Okayama et al. (CLINICAL
CHEMISTRY, Band 36, Nr. 8, Seite 1494, 1990) gemessen wurde. Die
durchschnittliche gelöste
Sauerstoffkonzentration in der Kulturbrühe nach Zugabe von Lävulinsäure betrug
0,01 ppm. Außerdem
verlagerte sich das Oxidations-Reduktions-Potenzial in der Kulturbrühe nach
Zugabe von Lävulinsäure in einen
Bereich von –180
mV bis –50
mV.
-
-
Beispiel 10
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Der
mutierte Stamm CR-0072009 wurde in einen 300 ml konischen Schikanen-Kolben,
enthaltend 50 ml Medium 3 inokuliert und unter Schütteln im
Dunkeln 48 Stunden bei 32°C
kultiviert. Die resultierende Kulturbrühe wurde in einen 3 l Fermenter, enthaltend
1,8 l Medium 3 inokuliert und unter Rühren bei 32°C mit einer Belüftungsrate
von 0,36 l/min und 400 Upm kultiviert. Nach Kultivieren für 40 Stunden
unter Kontrolle des pHs des Mediums auf 6,5 bis 6,6 unter Verwendung
von Schwefelsäure
und Natriumhydroxid wurden 0,210 g Lävulinsäure, 8,1 g Glycin und 18 g
Hefeextrakt dem Medium zugefügt
und das Kultivieren wurde durch Veränderung der Belüftungsrate
und der Rührgeschwindigkeit
auf 0,72 l/min bzw. 600 Upm fortgesetzt und wobei der pH des Mediums
unter Verwendung von Schwefelsäure
und Natriumhydroxid auf 6,3 bis 6,4 eingestellt wurde. Ein 8,1 g
Teil Glycin wurde 12, 26 und 38 Stunden danach zugefügt. Die
Kultivierung wurde 50 Stunden nach Zugabe von Lävulinsäure beendet. Die 5-Aminolävulinsäuremenge
in der Kulturbrühe
betrug 13 mM, wenn sie durch das Verfahren von Okayama et al. (CLINICAL
CHEMISTRY, Band 36, Nr. 8, Seite 1494, 1990) gemessen wurde. Die
durchschnittliche gelöste
Sauerstoffkonzentration in der Kulturbrühe nach Zugabe von Lävulinsäure betrug
2,3 ppm. Außerdem
lag das Oxidations-Reduktions-Potenzial in der Kulturbrühe nach
Zugabe von Lävulinsäure verlagert
in einem Bereich zu 50 mV bis 70 mV.
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Beispiel 11
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Der
mutierte Stamm CR-0072009 wurde in einen 300 ml konischen Schikanen-Kolben,
enthaltend 50 ml Medium 3 inokuliert und unter Schütteln im
Dunkeln 48 Stunden bei 32°C
kultiviert. Die resultierende Kulturbrühe wurde in einen 3 l Fermenter,
enthaltend 1,8 l Medium 3 inokuliert und unter Rühren bei 32°C mit einer Belüftungsrate
von 0,36 l/min und 400 Upm kultiviert. Nach Kultivieren für 40 Stunden
unter Kontrolle des pHs des Mediums auf 6,5 bis 6,6 unter Verwendung
von Schwefelsäure
und Natriumhydroxid wurden 0,210 g Lävulinsäure, 8,1 g Glycin und 18 g
Hefeextrakt dem Medium zugefügt
und das Kultivieren wurde durch Veränderung der Belüftungsrate
und der Rührgeschwindigkeit
auf 0,18 l/min bzw. 200 Upm fortgesetzt und wobei der pH des Mediums
unter Verwendung von Schwefelsäure
und Natriumhydroxid auf 6,0 bis 6,5 eingestellt wurde. Ein 8,1 g
Teil Glycin wurde 12 und 24 Stunden danach zugefügt. Die Kultivierung wurde
50 Stunden nach Zugabe von Lävulinsäure beendet.
Die 5-Aminolävulinsäuremenge
in der Kulturbrühe
betrug 15 mM, wenn sie durch das Verfahren von Okayama et al. (CLINICAL
CHEMISTRY, Band 36, Nr. 8, Seite 1494, 1990) gemessen wurde. Die
durchschnittliche gelöste
Sauerstoffkonzentration in der Kulturbrühe nach Zugabe von Lävulinsäure betrug
weniger als die Nachweisgrenze. Außerdem lag das Oxidations-Reduktions-Potenzial in der
Kulturbrühe
nach Zugabe von Lävulinsäure verlagert
in einem Bereich zu –220
mV bis –180
mV.
-
Wie
in Beispiel 7 beschrieben, ist der mutierte Stamm CR-0072009, erhalten
durch Wiederholung der Mutation unter Verwendung von Rhodobacter
sphaeroides CR-002 als Elternstamm ein Stamm, der 5-Aminolävulinsäure in sehr
hoher Konzentration unter Verwendung preisgünstiger Materialien wie Glukose,
Glycin und ähnlichen
erzeugen kann, so dass es möglich
ist, 5-Aminolävulinsäure in industriellem
Umfang unter Verwendung dieses Stamms zu erzeugen. Wie sich außerdem aus
den Ergebnissen von Beispiele 10 und 11 ergibt, wird es bevorzugt,
die gelöste
Sauerstoffkonzentration in der Kulturbrühe auf 2,0 ppm oder weniger
nach Zugabe der Lävulinsäure einzustellen
oder das Oxidations-Reduktions-Potenzial
in der Kulturbrühe
in einem Bereich von –220
mV bis 50 mV zu erhalten, um die Produktivität zu erhöhen und eine solche Kontrolle
kann einfach durch Verminderung der Rühr-Rotationsgeschwindigkeit bewirkt werden.
-
Beispiel 12
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Der
mutierte Stamm CR-0072009 wurde in jeden von drei 300 ml konischen
Schikanen-Kolben, enthaltend 50 ml Medium 3 inokuliert und unter
Schütteln
im Dunkeln 48 Stunden bei 32°C
kultiviert. Die resultierende Kulturbrühe wurde in einen von drei
3 l Fermentern, enthaltend 1,8 l Medium 3 inokuliert und bei 32°C kultiviert.
Die Kultivierung wurde 90 Stunden bei einer Belüftungsrate von 0,36 l/min fortgesetzt
sowie einer Rührgeschwindigkeit
von 400 Upm unter Einstellung des pHs des Mediums auf 6,5 bis 6,6
mit Schwefelsäure und
Natriumhydroxid, außer
dass die Rühr-Rotationsgeschwindigkeit
von einem der drei Gefäße auf 250
Upm 25 Stunden nach der Kultivierung geändert wurde. Während der
Kultivierung wurde die gelöste
Sauerstoffkonzentration und die 5-Aminolävulinat-Synthaseaktivität gemessen. Die 5-Aminolävulinat-Synthaseaktivität wurde,
wie unten beschrieben, gemessen.
-
Ein
ungefähr
30 ml Teil der Kulturbrühe
wurde genommen und zum Gewinnen von Zellen zentrifugiert. Die so
gewonnenen Zellen wurden mit einem Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,2)
gewaschen, in 5 ml desselben Puffers resuspendiert, durch eine French
Press auf die übliche
Weise aufgebrochen und dann bei 10.000 × g 30 Minuten zentrifugiert
und der so erhaltene Überstand
wurde als Rohenzymlösung
der 5-Aminolävulinsäuresynthase
verwendet.
-
Eine
Enzymreaktionslösung
wurde durch Zugabe von 50 mM Glycin, 0,1 mM Pyridoxalphosphat, 1 mM
EDTA und 1,0 mg Protein/ml der oben beschriebenen Rohenzymlösung zu
1 ml Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,2) hergestellt. Dieses wurde mit
Succinyl-CoA zum Erhalt einer Endkonzentration von 0,2 mM vermischt und
bei 37°C
inkubiert. Nach einer Inkubation für 15 Minuten wurde die Reaktion
durch Zugabe von 1 ml 10 Vol% Trichloressigsäure beendet.
-
Die
Reaktionslösung
wurde bei 3.500 Upm 10 Minuten zentrifugiert, 1 ml des resultierenden Überstandes
wurde mit 2 ml eines 1 M Acetatpuffers (pH 4,7) vermischt, enthaltend
1% Acetylaceton und man ließ die Mischung
15 Minuten bei 100°C
reagieren und sie wurde dann schnell mit Eis abgekühlt. Ein
3,5 ml Anteil Ehrlich's-Reagenz
wurde dazugefügt,
um 15 Minuten danach die Menge der erzeugten Pyrrolverbindung zu
messen, basierend auf der Absorption bei 553 nm, und dadurch die
erzeugte Menge 5-Aminolävulinsäure (a)
durch die Enzymreaktion zu berechnen.
-
Eine
Bildungsrate der 5-Aminolävulinsäure wurde
basierend auf der folgenden Formel berechnet und als 5-Aminolävulinsäure-Synthaseaktivität verwendet.
Die Beziehung zwischen der gelösten
Sauerstoffkonzentration in der Kulturbrühe und der 5-Aminolävulinsäure-Synthaseaktivität während der
Kultivierung ist in 1 und Tabelle 4 dargestellt.
-
Außerdem korrespondiert
in
1 eine 10%ige gelöste Sauerstoffkonzentration
zu 0,7 ppm und eine 90%ige gelöste
Sauerstoffkonzentration zu 6,6 ppm.
- v:
- Enzymaktivität (nmol/min/mg
Protein)
- a:
- 5-Aminolävulinsäure in 1
ml Enzymreaktionslösung
(nmol)
- p:
- Proteinmenge in 1
ml Enzymreaktionslösung
(= 1 mg)
- t:
- Reaktionszeit (= 15
min)
-
Vergleichsbeispiel 1
-
Das
Verfahren von Beispiel 10 wurde wiederholt, außer dass der Stamm zu CR-002
geändert
wurde. Die Ergebnisse sind in 1 und Tabelle
4 dargestellt.
-
Wie
aus 1 deutlich wird, tritt eine Inhibition der 5-Aminolävulinat-Synthaseaktivität, die den
Wildtypstämmen
der Fotosynthesebakterien gemein ist, bei dem Stamm CR-0072009 selbst unter
solchen Bedingungen kaum auf, dass die gelöste Sauerstoffkonzentration
in der Kulturbrühe
2 ppm überschreitet.
-
-
Beispiel 13
-
Der
folgende Test wurde unter Verwendung von dem in Beispiel 9 verwendeten
Medium 3 durchgeführt,
außer
dass der Hefeextrakt des Mediums auf 5,0 g/l Hefeextrakt B, hergestellt
von einem anderen Hersteller (B-2, hergestellt von Oriental Yeast)
verändert
wurde. Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 9 wurde der mutierte Stamm
CR-0072009 unter Rühren
für 48
Stunden in einem 300 ml konischen Schikanen-Kolben kultiviert, die resultierende
Kulturbrühe
wurde in 1,8 l Medium 3 inokuliert, hergestellt unter Verwendung
von Hefeextrakt B in einem 3 l Fermenter und bei 32°C mit einer
Belüftungsrate
von 0,36 l/min und 400 Upm kultiviert und die Kultivierung wurde
durch Zugabe von 0,210 g Lävulinsäure, 8,1
g Glycin und 18 g Hefeextrakt B fortgesetzt und durch Erniedrigung
der Rühr-Rotationsgeschwindigkeit
auf 325 Upm. Nach Zugabe von Lävulinsäure verblieb
die gelöste
Sauerstoffkonzentration auf einem Niveau von 0,5 ppm für ungefähr 4 Stunden,
stieg jedoch nach 5 Stunden wieder an. Nach 6 Stunden stieg sie
auf 4 ppm und die Produktion von 5-Aminolävulinsäure endete bei 10 mM. Wenn
Eisenchlorid zugefügt
wurde, um eine Endkonzentration von 20 μM zu ergeben, reduzierte sich
die gelöste
Sauerstoffkonzentration wieder auf 0,5 ppm oder weniger und die
Produktion von 5-Aminolävulinsäure begann
wiederum innerhalb von 2 Stunden nach der Zugabe, so dass Glycin
in 8,1 g Teilen 12, 26 und 38 Stunden danach zugefügt wurde.
Die Kultivierung wurde 50 Stunden nach Zugabe von Lävulinsäure beendet.
Die Menge der 5-Aminolävulinsäure in der
Kulturbrühe
betrug 40 mM, gemessen durch das Verfahren von Okayama et al. (CLINICAL
CHEMISTRY, Band 36, Nr. 8, Seite 1494, 1990).
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Wie
sich aus Beispiel 13 ergibt, hatte die Zugabe einer Eisenverbindung
die Wirkung, die Respiration wieder anzukurbeln.
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Referenzbeispiel 1
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Wenn
durch das ICP-Masseverfahren überprüft, betrugen
die Eisenmengen im Hefeextrakt, wie verwendet in Beispiel 9, dem
Hefeextrakt B, wie verwendet in Beispiel 13 und einem weiteren Hefeextrakt
C eines anderen Herstellers (Industrial Yeast Extract, hergestellt
durch Oriental Yeast), verwendet in den folgenden Beispielen 73 μg, 25 μg bzw. 155 μg pro Gramm
von jedem Hefeextrakt.
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Diese
Ergebnisse zeigen, dass die Eisenmengen im Medium 3, hergestellt
unter Verwendung dieser Hefeextrakte, 6,64, 2,27 bzw. 14,1 μM betrugen.
So wurde festgestellt, dass 20 μM
Eisen in der Kulturbrühe zum
Zeitpunkt der Produktion von 5-Aminolävulinsäure in Beispiel 9 enthalten
waren, und dass das Medium von Beispiel 13 6,8 μM Eisen vor Zugabe der Eisenverbindung
enthält
und 26,8 μM
nach Eisenzugabe.
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Beispiel 14
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Der
mutierte Stamm CR-0072009 (1 ml Kulturbrühe, erhalten durch Kultivierung
des Stamms für
48 Stunden unter Verwendung von 10 ml Hefeextrakt C in einem Teströhrchen mit
einem Durchmesser von 21 mm (optische Dichte bei 660 nm, 0,2)) wurde
in einen 300 ml konischen Schikanen-Kolben inokuliert, enthaltend
50 ml eines Mediums, hergestellt durch Zugabe von 0,5, 10, 20, 50,
200 oder 1.000 μM
Eisenchlorid zu Medium 3, worin der Hefeextrakt durch 3 g/l Hefeextrakt
C ersetzt worden war und der Stamm wurde mit Rotationsrühren im
Dunkeln bei 32°C
kultiviert. Wenn die in dem Hefeextrakt enthaltene Eisenkomponente
enthalten ist, enthält
dieses Medium den in Tabelle 5 dargestellten Gesamteisengehalt.
Die Ergebnisse der Messung der Zelldichte als optische Dichte bei
660 nm 30 Stunden nach Kultivierung sind ebenfalls in Tabelle 5 dargestellt.
-
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Wie
aus Tabelle 5 deutlich wird, hatte die Addition der geeigneten Menge
der Eisenkomponente die Wirkung, die Wachstumsrate zu erhöhen.
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Beispiel 15
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Dasselbe
Volumen des mutierten Stamms CR-0072009, wie beschrieben in Beispiel
14 wurde in einen 300 ml konischen Schikanen-Kolben inokuliert,
enthaltend 50 ml eines Mediums, hergestellt durch Zugabe von 20 μM Eisenchlorid
zu Medium 3, worin der Hefeextrakt durch 3 g/l Hefeextrakt C ersetzt
worden war und der Stamm wurde unter Rotationsschütteln im
Dunkeln bei 32°C
für 48
Stunden kultiviert. Ein Anteil der resultierenden Kulturbrühe wurde
in 1,8 l des oben beschriebenen Mediums in einen 3 l Fermenter inokuliert
und unter Rühren
bei 32°C
mit einer Belüftungsrate
von 0,36 l/min und 400 Upm kultiviert. Nach Kultivierung für 24 Stunden
wurden 0,210 g Lävulinsäure, 8,1
g Glycin und 9 g Hefeextrakt C dem Medium zugefügt und das Kultivieren wurde
durch Abnahme der Rühr-Rotationsgeschwindigkeit
auf 325 Upm fortgesetzt und durch Einstellung des pHs des Mediums
auf 6,3 bis 6,4 unter Verwendung von Schwefelsäure und Natriumhydroxid. Ein
8,1 g Anteil Glycin wurde weiterhin 12, 26 und 38 Stunden danach
zugefügt.
Die Kultivierung wurde 50 Stunden nach der Addition von Lävulinsäure beendet.
Die Menge der 5-Aminolävulinsäure in der
Kulturbrühe
betrug 55 mM, gemessen durch das Verfahren von Okayama et al. (CLINICAL
CHEMISTRY, Band 36, Nr. 8, Seite 1494, 1990). In diesem Fall betrug
die durchschnittliche gelöste
Sauerstoffkonzentration in der Kulturbrühe nach Zugabe von Lävulinsäure 0,01
ppm. Außerdem
verlagerte sich das Oxidations-Reduktions-Potenzial in der Kulturbrühe nach
Addition von Lävulinsäure in einen
Bereich von –180
mV bis –50
mV.
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Gewerbliche
Anwendbarkeit
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Der
Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung hat eine ausgezeichnete
Produktivität
von 5-Aminolävulinsäure und
das 5-Aminolävulinsäure-Produktionsverfahren
unter Verwendung des Mikroorganismus benötigt keine spezifischen Mittel,
wie z.B. die Zufuhr von Stickstoffgas oder ähnlichen, selbst unter Bedingungen,
unter denen die gelöste
Sauerstoffkonzentration relativ hoch ist, so dass dadurch 5-Aminolävulinsäure industriell
vorteilhaft erzeugt werden kann.
