DE69936527T2

DE69936527T2 - Verwendung von modifiziertem lysozyme c in der herstellung von pharmazeutika zur krankheitsbehandlung

Info

Publication number: DE69936527T2
Application number: DE69936527T
Authority: DE
Inventors: Paolo Alberto Veronesi; Pablo E. Rodriguez
Original assignee: Therapicon SRL
Current assignee: Therapicon SRL
Priority date: 1998-05-22
Filing date: 1999-05-20
Publication date: 2008-03-13
Anticipated expiration: 2019-05-21
Also published as: US20030129181A1; ATE366804T1; DE69936527D1; US20070086993A1; ES2292244T3; EP1105467B9; US20030124110A1; EP1105467B1; ITMI981148A1; JP2002516087A; PT1105467E; WO1999061593A1; EP1105467A1; US7229809B2; US7012062B2; AU4163199A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer modifizierten Lysozym-c-Verbindung oder ihrer pharmazeutisch akzeptablen Additionssalze, sowie ihre industrielle Herstellung für die Erzeugung von medizinischen, genauer gesagt oralen, parenteralen und topischen Zusammensetzungen für die Prophylaxe und Therapie von einigen schwerwiegenden Erkrankungen von Säugern.
Es ist bekannt, dass natürliches Lysozym ein Enzym peptidischen Ursprungs ist, das weithin in zahlreichen Arten der Tier- und Pflanzenwelt vorhanden ist, wobei es in den verschiedenen Arten eine/n vergleichbare/n aber nicht identische/n Struktur und enzymatischen Mechanismus aufweist. Das bekannteste Lysozym ist jenes, das im Hühnerei vorhanden ist (Hühnereiweiß-Lysozym c). Lysozym ist im Körper von Säugern weit verbreitet; es ist zum Beispiel im Speichel, in Tränen, in Milch, in Leukozyten, im zervikalen Schleim vorhanden. Im Jahr 1922 entdeckte Alexander Fleming eine Substanz, die in seiner eigenen Nasenschleimhaut vorhanden war, welche in der Lage war, einige Bakterien-Stämme zu lysieren. Diese Substanz wurde später als Lysozym bezeichnet (heute besser als menschliches Lysozym c bezeichnet). Im Jahr 1963 klärten Jolles und Canfield unabhängig die Primärstruktur von Lysozym auf, das aus Hühnereiweiß aufgereinigt worden war. Im Jahr 1965 beschreibt Phillips die dreidimensionale Struktur von Lysozym, auf der Grundlage von der Röntgenstrahl-Kristallographie. Ab seiner Entdeckung wurde natürliches Lysozym (genauer gesagt das Hühnereiweiß-Lysozym c) manchmal in der Medizin hauptsächlich wegen seiner antibakteriellen Eigenschaften verwendet, aber die rückblickende Analyse der veröffentlichten Studien hat noch nicht einmal heute seinen spezifischen Wirkungsmecha nismus vollständig aufgeklärt, und in einigen Fällen scheinen die experimentellen Ergebnisse sogar einander widersprechend zu sein (1, 2, 3).
Heutzutage glauben die Wissenschaftler, dass die biologische Wirkung von natürlichem Lysozym c in zwei verschiedene Arten aufgeteilt werden sollte: eine direkte Wirkung und eine indirekte Wirkung. Die direkte Wirkung wird durch den Abbau der Verknüpfung (β, 1 → 4) zwischen einer N-Acetylmuraminsäure und N-Acetylglucosamin (4) von Peptidoglycanen verursacht, welche in der Zellmembran von Bakterien vorhanden sind, wodurch die Lyse derselben verursacht wird (als eine Folge dieser Wirkung wird es häufig als "Muramidase" bezeichnet). Im Allgemeinen sind gram-positive Bakterien empfindlicher gegen die Wirkung von natürlichem Lysozym als gram-negative, wahrscheinlich weil die letzteren die externe Membran als eine weitere Barriere aufweisen. Diese direkte Wirkung von Lysozym ist unter Umständen für seine mögliche therapeutische Anwendung bei der Prophylaxe und der Behandlung von zahlreichen bakteriellen Erkrankungen wichtig, wie Pharingitis, Bindehautentzündung, Ohrenentzündung, Sinusitis, Adenitis, Harnröhrenentzündung, Vaginitis, Blasenentzündung, die im Wesentlichen von Mikroorganismen der Streptokokken-Familie verursacht werden. Im Gegensatz dazu scheinen die abgebauten mucopeptidischen Fragmente der Zellmembran, die durch die direkte Wirkung von Lysozym auf die Bakterien erzeugt werden, in der Lage zu sein, einen nicht klar bestimmten Vorgang einer immunologischen Stimulation auszulösen (indirekte Wirkung von Lysozym).
Einige Autoren haben vor kurzem auch die Fähigkeit von Hühnereiweiß-Lysozym c und von seinen Derivaten beschrieben, die Produktion von T-Lymphozyten anzuregen, die im lymphatischen Gewebe, das mit dem Darm verbunden ist (GALT), und in der Milz (GALT-spleen-Achse) vorhanden sind.
Jedoch haben in der Literatur einige Autoren auch die Verwendung anderer spezifischer lytischer Peptide für die Behandlung von vielen Krankheiten beschrieben. In einigen neueren Paten ten wurde die spezifische Kombination der Verabreichung von Cecropinen und Lysozym vorgeschlagen, um die Wirkung der beiden Verbindungen zu erhöhen. Tatsächlich schlagen einige Autoren vor, dass Cecropine viel wirksamer bei der Lyse der Zelle sind, während Lysozym bei deren vollständigem Abbau wirksamer ist.
Die neuen chemotherapeutischen Wirkstoffe, wie Cecropine, Sarcotoxine, Magainine, Lepidopterane, welche die gleichen physikalischen Eigenschaften mit einer α-helikalen Struktur und einem hydrophoben Charakter aufweisen, sind Proteine, die in der Lage sind, nicht nur die zelluläre Membran von Bakterien (Listeria monocitogenes und Brucella abortus) zu lysieren, sondern auch die Zellmembran von Protozoen (P. Falciparum) und von Viren (Parainfluenza und Herpes Simplex) und von eukaryotischen Zellen, die mit Bakterien infiziert wurden. Durch die Verwendung eines elektronischen Mikroskops wurde entdeckt, dass lytische Peptide große Poren in der Membran von Zellen erzeugen, was deren Tod verursacht. Im Gegensatz dazu werden gesunde Säuger-Zellen durch die oben genannten lytischen Peptide nicht zerstört, vermutlich auf Grund des Vorhandenseins eines Zytoskeletts, das sich im Kontakt mit verschiedenen Punkten der plasmatischen Membran befindet und es infolgedessen ermöglicht, die osmotische Integrität der Zelle zu erhalten.
Darüber hinaus sollen die lytischen Peptide auch bei niedrigen Konzentrationen als Modifikatoren der biologischen Antwort verwendet werden, um die Proliferation der Zellen des immunologischen Systems und der Haut anzuregen. Die oben genannte Wirkung wird vermutlich durch die Erzeugung von Poren in der plasmatischen Membran verursacht, was einen Fluss von Ionen und von nahrhaftem Material in die Zellen bestimmt, welcher das Wachstum der Zellen anregt.
ANTICANCER RESEARCH 16, 2559-2564 (1996); Pacor et al offenbaren "die Wirkungen von Lysozym (Hühner-Eiweiß-Lysozym) und seines modifizierten Derivats mPEG-Lyso" (Seite 2559, Spalte 1, Zeilen 1-2).
Die von Pacor et al. verwendete Verbindung wurde hergestellt "durch kovalente Bindung von Monomethoxypolyethylenglycol an die NH₂-Reste von Lysinen von Lysozyme. In Kürze, M-PEG wurde aktiviert, wie von Carnielli beschrieben" (siehe Seite 2560, Spalte 1, Zeilen 1-3).
Darüber hinaus beschreiben Pacor et al. die folgenden Ergebnisse (Seite 2560, Spalte 2, neben "Results", Zeilen 1-5):
"mPEG-Lyso modifizierte das Wachstum des Primärtumors nicht, sondern verursachte eine statistisch signifikante Verringerung der Ausbildung von spontanen Lungenmetastasen".
IMMUNOLOGY LETTERS 49 (1996) 91-97; Takanori et al. bewerteten den Effekt einer „mPEG-Modifikation auf die Kapazität von Hühner(ei)weiß-lysozym (HEL) zur Stimulation der T-Zellen" (Seite 91, neben "Abstract", Zeile 2).
Das von Takanori et al. verwendete m-PEG-HEL "wurde, wie von Jackson beschrieben, hergestellt" (neben 2.3, Zeile 1).
Das an einem HEL-Molekül durchgeführte Pegylierungsverfahren bewirkt, dass "mehr als sechs von sieben Aminogruppen eines HEL-Moleküls als mit mPEG gekoppelt gefunden wurden" (neben 2.3, Zeilen 12-14).
Die von Takanori erhaltenen biologischen Ergebnisse werden auf der letzten Seite, Spalte 1, Zeilen 16-23 zusammengefasst: "Die Ergebnisse in 5B, die zeigen, dass mPEG-HEL keine anti-HEL-T Zell-Antwortreaktion in H-2k-Mäusen induzierte, demonstrieren, dass mPEG-Moleküle, die in flankierende Bereiche eines T Zell-Epitops eingeführt werden, die Präsentation dieses Epitops inhibieren konnten. Dies legt nahe, dass eine mPEG-Modifikation in der Lage ist, die T Zell-stimulierenden Fähigkeiten von Proteinen zu reduzieren ...".
Dessen ungeachtet, obgleich viele Publikationen die positive Wirkung von natürlichem Lysozym (hauptsächlich Hühnereiweiß-Lysozym c) bei der Behandlung von Infektionen verschiedenen Ursprungs bescheinigen, war die mögliche Verwendung von Lysozym der Gruppe c in Kliniken bis heute auf Grund dreier Hauptfaktoren sehr begrenzt:

a) menschliches Lysozym c (welches der Typ ist, der in Menschen vorhanden ist) ist extrem schwierig in ausreichend großen Mengen für therapeutische Anwendungen zu erhalten;
b) andere Typen von Lysozym c, die von anderen Arten erhältlich sind, wie Rinder- und Hühnereiweiß, können einige negative Nebenwirkungen aufweisen (die erste sind mögliche allergische Reaktionen, und die zweite ist die mögliche Gefahr einer Kontamination von übertragbaren Rinder-Enzephalopathien oder TBE), welche ihre Anwendung in der Medizin beträchtlich einschränken;
c) Lysozym-Typen, verschieden von c, die von anderen Tierarten stammen, sind für medizinische Zwecke nicht geeignet, da sie eine sehr geringe Homologie mit menschlichem Lysozym c aufweisen.

Es wird eine Tabelle aufgeführt, worin die Homologie zwischen menschlichem Lysozym und den Lysozymen aus anderen Säugetieren, jedoch alle vom natürlichen c-Typ, angegeben ist:

LYSOZYMQUELLE HOMOLOGIE %

Ei(weiß) Huhn Ratte Kuh Kaninchen Pferd 56,8 % 76,4 % 82,3 % 82,3 % 50,8 %
Obwohl Rinder-Lysozym c eine Homologie aufweist, die höher ist als die von Hühnereiweiß, ist das letztere das am meisten in der klinischen Praxis verwendete, da jenes sehr verbreitet in ausreichenden Mengen zu günstigen Preisen erhältlich ist. Auf der Grundlage der obigen Einführung besteht ein beträchtliches Interesse daran, weiter neue Möglichkeiten der Verwendung von natürlichem Lysozym c, von seinen möglichen Derivaten zu erforschen und medizinische Zubereitungen herzustellen, die es erlauben, seine Anwendung auf einige schwere Erkrankungen bei Menschen auszuweiten und/oder neue und vorher nicht erforschte Verabreichungswege anzuwenden.
Trotz zahlreicher experimenteller Forschungen an Tieren und neuerer Veröffentlichungen über Lysozym c, blieben die medizinischen Anwendungen dieser Verbindung, wenn oral verabreicht, auf traditionelle Pathologien begrenzt, die den Experten bereits weithin bekannt sind.
Jedoch scheinen diese Untersuchungen sehr begrenzte und manchmal gegensätzliche Ergebnisse erzielt zu haben.
Folglich ist der Hauptzweck der vorliegenden Erfindung, medizinische Zusammensetzungen bereit zu stellen, die eine modifizierte natürliche Lysozym-c-Verbindung, genauer gesagt eine Monomethoxypolyethylenglycol-Lysozym-c-Verbindung (nachstehend für die praktische Ausführung der Beschreibung als <<MLc>> definiert) oder ihre Additionssalze mit pharmazeutisch akzeptablen Säuren enthalten, welche die folgende allgemeine Formel (I) darstellt: [CH₃O-(CH₂-CH₂-O)_n-CH₂-CH₂]_x-(NH)_y Lysozym c·(Z)_m worin
y = die Zahl der freien Aminogruppen der Lysin-Moleküle, die im Lysozym-c-Molekül vorhanden sind, die im Bereich von 5 bis 30 liegt;
x = die Zahl der Monomethoxypolyethylenglycol-Moleküle für jedes Molekül von Lysozym c, wobei der Wert von 1 bis y variieren kann;
n = die Zahl des Polymerisationsgrads des Polyethylenglycol-Teils, die im Bereich von 5 bis 1000 liegt;
Lysozym c = Lysozym c vom Menschen;
Z = eine pharmazeutisch akzeptable organische oder anorganische Säure, monovalent oder polyvalent, die in der Lage ist, Additionssalze mit dem in Frage kommenden Lysozym c zu erzeugen;
m = die Zahl von Molekülen der pharmazeutisch akzeptablen Säure, die für den Erhalt des MLc-Additionssalzes verwendet wird, welche von 1 bis zu dem Wert variieren kann, welcher der Gesamtzahl der Aminogruppen, die im Lysozym-c-Molekül vorhanden sind, entspricht.
Diese Verbindung ist überraschend und besonders nützlich und wirkungsvoll für die spezifische Behandlung einiger ernsthaften Erkrankungen von Säugern.
Genauer gesagt kann in der modifizierten Lysozym-c-Verbindung, die als Wirkstoff für die Zubereitung von medizinischen Zusammensetzungen zur Anwendung kommt, welche für die Behandlung einiger schwerwiegender Erkrankungen von Säugern nützlich sind, die Zahl der Monomethoxypolyethylenglycol-Gruppen (x) von 1 bis "y" variieren, der Polymerisationsgrad (n) des Polyethylenglycolteils von Monomethoxypolyethylenglycol sollte im Bereich von 5 (Molekulargewicht von etwa 161) und 1 000 (Molekulargewicht von etwa 32 206), stärker bevorzugt zwischen 120 (Molekulargewicht von 3 865) und 200 (Molekulargewicht von 6 441) liegen, während die Zahl der Moleküle der Aminosäure Lysin (y) mit einem -NH-Rest, der mit Monomethoxypolyethylenglycol verbunden ist, bei menschlichem Lysozym c von 5 oder noch mehr bis zu einem Maximum von 30 variieren kann.
Z bedeutet eine beliebige pharmazeutisch akzeptable organische oder anorganische Säure, mono- oder polyvalent, pharmazeutisch akzeptabel, die auf unterschiedliche Art und Weise kombiniert werden kann, wobei „m" die Zahl der Moleküle der pharmazeutisch akzeptablen Säure ist, die erforderlich sein können, um ein Additionssalz mit MLc zu ergeben, und die von 0 bis zu dem Wert variieren kann, welcher der Gesamtzahl der im Molekül des in Betracht kommenden Lysozym c vorhandenen Aminogruppen entspricht, wobei der Wert durch die Wertigkeit der selben Säure (Z) dividiert werden soll.
Vor kurzem haben einige Autoren veröffentlicht, dass Proteine im Allgemeinen durch ziemlich einfache chemische Reaktionen, die bereits den Fachleuten im Fachbereich bekannt sind, Derivate einer Kondensation mit Polyethylenglycolen hervorbringen können.
Auf dem gegenwärtigen Stand der Technik sind pegylierte Derivate von anderen Lysozymen der c-Gruppe unbekannt, und sie sollten daher als nicht beschrieben und neuartig betrachtet werden, wie auch ihre therapeutische Anwendung.
Es wurde auch beobachtet, dass diese pegylierten Derivate im Allgemeinen eine verringerte Immunreaktivität und eine bessere Stabilität gegen Erhitzen und Abbau während ihrer Lagerung aufweisen. Einige Autoren haben auch die Hypothese formuliert, dass diese pegylierten Derivate nach ihrer Aufnahme auch eine bessere Beständigkeit gegen proteolytische Mittel und daher eine bessere Halbwertszeit im Plasma zeigen könnten.
Diese pegylierten Derivate können auch durch ein Synthese-Verfahren erhalten werden, das eine kovalente Bindung des ausgewählten natürlichen Lysozym c mit den ausgewählten Monomethoxypolyethylenglycol-Resten bedingt, nachdem das Lysozym c bei Raumtemperatur während etwa 2 Stunden tresyliertem Monomethoxypolyethylenglycol in PBS (Phosphatpuffer-Kochsalzlösung) oder in einem Boratpuffer bei unterschiedlichem pH- Wert (fast immer in einem schwach basischen Medium) und in unterschiedlichen Verhältnissen ausgesetzt wurde. Das tresylierte Glycol-Reagenz kann üblicherweise aus Monomethoxypolyethylenglycol erhalten werden, das mit Tresylchlorid aktiviert wurde. Monomethoxypolyethylenglycol wird ausgewählt, um nur ein reaktives Ende in jedem Molekül vorzusehen, wodurch ungewünschte vernetzte Produkte vermieden werden, aber sich nur die gewünschte ausgewählte MLc-Verbindung ergibt. Die Reinigung von MLc wird unter Verwendung von Sephadex G-50 Säulen (12 cm × 1,3 cm) durchgeführt, die mit PBS stabilisiert sind, oder durch eine Ultrazentrifugation mit Amicon-Membranen der gewünschten Porosität. Im Fall, dass es erwünscht ist, die Additionssalze von MLc zu erhalten, zum Beispiel MLc-Hydrochlorid, ist es notwendig, eine Dialyse mit einer wässrigen Lösung von verdünnter HCl (10-100 mM) eine ganze Nacht lang bei 4°C, oder stärker bevorzugt während 6-8 Stunden bei Raumtemperatur durchzuführen, und anschließend die Reinigung mit einer Sephadex G-50-Säule durchzuführen. Das resultierende Salz sollte anschließend lyophilisiert und bei Temperaturen unter 0°C bis zur Verwendung gelagert werden.
Ein mögliches allgemeines Syntheseschema der Additionssalze von MLc ist hier nachstehend für ein besseres Verständnis von deren Syntheseverfahren gezeigt (MERKE: die Aminogruppen von Lysozym c sind für ein besseres Verständnis ausgewiesen):
A = Monomethoxypolyethylenglycol (MPEG) mit nur einer reaktiven Endgruppe;
B = Tresylchlorid (2,2,2-Trifluorethan-sulfonylchlorid);
C = tresyliertes Monomethoxypolyethylenglycol (TMPEG);
D = Lysozym c;
E = modifiziertes Lysozym c (MLc);
F = pharmazeutisch akzeptable Säure;
G = MLc-Additionssalz.
Die Proteinkonzentrationen werden dann direkt gemessen, indem die optische Dichte bei 280 nm bestimmt wird und durch eine Titration mit „Coomassie-Brillantblau". Für die kolorimetrische Reaktion werden 100 μl der Proteinprobe in Mikrotiterplatten aliquotiert und 200 μl „Coomassie Protein assay"-Reagenz werden hinzu gefügt. Die optische Dichte bei 555 nm wird mit Hilfe eines Mikrotiter-Lesegeräts nach 5 Minuten der Inkubation bei Raumtemperatur gemessen. Indem die beiden beschriebenen Methoden angewendet werden, wird die Konzentration der Proben mit Hilfe einer Kalibrationskurve ermittelt, die mit einer Stammlösung von Lysozym c bei einer bekannten Konzentration erhalten wurde.
Das erhaltene MLc wird dann untersucht, indem der Assay unter Verwendung dreier verschiedener Verfahren bestimmt wird: 1) SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese; 2) Molekulare Filtrations-Chromatographie; 3) Enzymatische Aktivität entsprechend dem herkömmlichen Verfahren.
1) SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Ein 15%-iges Polyacrylamidgel wird verwendet. Der Lauf wird normalerweise zwischen 100 und 150 V etwa 45 Minuten lang durchgeführt.
Konzentrierte Lösung von Acrylamid (30 %)/Bisacrylamid:
Löse 29,2 g Acrylamid und 0,8 g Bisacrylamid in 70 ml entionisiertem Wasser. Sobald das Acrylamid gelöst ist, füge Wasser hinzu, um ein Volumen von 100 ml zu erhalten. Filtriere die Lösung durch eine Membran von 0,45 μm Porengröße. Die erhaltene Lösung ist bei 4°C einen Monat lang stabil, wenn sie in einer dunklen Flasche gelagert wird.
Puffer A (1,5 M Tris-HCl-Puffer, pH-Wert 8,80):
Löse 18,2 g Tris-Base in etwa 80 ml destilliertem Wasser. Stelle den pH-Wert mit HCl auf 8,80 ein und erhalte ein Volumen von 100 ml durch Zugeben von destilliertem Wasser. Lagere den erhaltenen Puffer A bei 4°C.
Puffer B (0,5 M Tris-HCl-Puffer, pH-Wert 6,80):
Löse 6,1 g Tris-Base in 80 ml destilliertem Wasser. Stelle den pH-Wert mit HCl auf 6,80 ein und erhalte ein Volumen von 100 ml durch Zugeben von destilliertem Wasser. Lagere den erhaltenen Puffer B bei 4°C.
10 % (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS):
Löse 10 g SDS in 60 ml Wasser. Bringe das Volumen mit destilliertem Wasser auf 100 ml. Lösungspuffer der Probe (0,06 M Tris-HCl, pH-Wert 6,80, 2 % SDS, 10 % Glycerin, 0,025 % Bromphenolblau):

Wasser 4,80 ml

Puffer B 1,20 ml

SDS 10 % 2,00 ml

Glycerin 1,00 ml

Bromphenolblau 0,5 % 0,50 ml
Lagere die oben genannte Lösung bei Raumtemperatur. Der SDS-reduzierende Puffer wird hergestellt, indem 50 μl 2-Mercaptoethanol zu jeweils 0,95 ml der Pufferlösung der Probe hinzugefügt werden. Stelle diese Lösung im Moment ihrer Verwendung her.
Katalysator (10 % w/v Ammoniumpersulfat):
Löse 100 mg Ammoniumpersulfat in 1 ml destilliertem Wasser. Stelle diese Lösung im Moment ihrer Verwendung her.
TEMED:
Verwende direkt das Produkt, das in der Flasche vorhanden ist. Lagere es an einem nicht feuchten Ort, vor Licht geschützt.
Elutionspuffer (0,025 M Tris, 0,192 M Glycerin, 0,1 (w/v) SDS, pH-Wert 8,30 ± 0,20):

Löse 0,3 g Tris-Base, 1,4 g Glycerin, 1 ml des 10%-igen SDS in 100 ml destilliertem Wasser. Lagere diesen Elutionspuffer bei 4°C. Herstellung eines 15%-igen Polyacrylamidgels (0,375 M Tris, pH-Wert 8,80):

Destilliertes Wasser Puffer A 10 % SDS (w/v) Konzentrierte Lösung von: 30 % Acrylamid/Bisacrylamid 10 % (w/v) Ammoniumpersulfat TEMED	2,35 ml 2,50 ml 0,10 ml 5,00 ml 0,05 ml 0,005 ml
Gesamtvolumen	10,005 ml

Herstellung eines 4%-igen Polyacrylamidgels (0,125 M Tris, pH-Wert 6,80):

Destilliertes Wasser Puffer B 10 % SDS (w/v) Konzentrierte Lösung von: 30 % Acrylamid/Bisacrylamid 10 % (w/v) Ammoniumpersulfat TEMED	6,10 ml 2,50 ml 0,10 ml 1,30 ml 0,05 ml 0,005 ml
Gesamtvolumen	10,055 ml

Probenpräparation:
Löse die Probe mit 4 Volumina des reduzierenden SDS-Puffers und erhitze 4 Minuten lang auf 95°C (jede Bande des Gels sollte nicht weniger als 1 μg des Proteins enthalten). Die elektrophoretische Migration wird durch die Verwendung einer MiniProtean II-Anlage (BioRad, Kalifornien) bei Raumtemperatur durchgeführt. Die angelegte elektrische Spannung liegt bei 100-150 V während etwa 45 Minuten.
Gelfärbung mit Coomassie-Brillantblau R-250:
Löse 0,2 g Coomassie-Brillantblau R-250 in 1 Liter einer Lösung, die 50 % (v/v) Methanol, 10 % (v/v) Essigsäure und 40 % (v/v) destilliertes Wasser enthält. Filtriere die Lösung unter Verwendung eines Filterpapiers und lagere die Lösung in einer bernsteinfarbenen Flasche. Vor der Verwendung der erhaltenen Lösung ist es notwendig immer zu überprüfen, ob ein gefärbter Niederschlag vorhanden ist. Im positiven Fall filtriere erneut.
Lege das Gel während 10 Minuten in eine Lösung, die 50 % (v/v) Methanol, 10 % (v/v) Essigsäure und 40 % (v/v) destilliertes Wasser enthält, um vorhandenes SDS zu beseitigen.
Halte das Gel in der gefärbten Lösung unter einem konstanten und langsamen Rühren während 30 Minuten bei 50°C oder alternativ während 2 Stunden bei Raumtemperatur.
Mache das Gel in einem flüssigen Medium haltbar, das aus einer 10%-igen (v/v) Essigsäurelösung besteht. Alternativ trockne das Gel unter Verwendung einer Glycerin-Lösung und einer Zellophan-Folie und fahre in der folgenden Weise fort:
a) lege das Gel 10-15 Minuten lang in eine 10%-ige (v/v) Glycerinlösung; b) benetze die Zellophan-Folie in der gleichen Lösung; c) lege das Gel zwischen zwei benetzte Zellophan-Folien ohne Luftblasen einzubringen; d) lege das Gel auf eine Ablage und belasse es bei Raumtemperatur.
Bewertung der Ergebnisse:
Die Probenzusammensetzung wird durch eine Dichtemessung bei 595 nm am Gel bestimmt, wobei ein geeignetes Gerät, wie zum Beispiel ein Shimadzu UV/VIS CS 930 Scanner, verwendet wird.
Akzeptabilitätsgrenze:
Die Probe sollte einen einzigen Punkt nach der Färbung mit Coomassie Brillantblau R-250 enthalten.
Der MLc-Gehalt sollte nicht weniger als 95 % betragen.
2) Molekulare Filtrations-Chromatographie
Die Probe wird unter Verwendung einer Superose 12HR 10/30-Säule und eines Geräts für die FPLC (Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitschromatographie (Fast Performance Liquid Chromatography)), äquilibriert mit PBS, chromatographiert. Die Probe wird mit PBS verdünnt, bevor sie auf die Säule geladen wird. Injiziere 200 μl der Probe und eluiere mit PBS bei einer Flussrate von 0,3 ml/min. Sammle Fraktionen von 0,25 ml. Das Elutionsprofil wird durch Spektrophotometrie bei 280 nm be stimmt. Die Proteinkonzentration wird durch die Verwendung von Coomassie-Brillantblau quantitativ bestimmt.
Verwende Marker mit bekanntem Molekulargewicht in einer Konzentration von 3 mg/ml, wie zum Beispiel β-Amylase (200 KDa), Alkohol-Dehydrogenase (150 KDa), Rinderserumalbumin (66 KDa), Carbonsäure-Anhydrase (29 KDa), Cytochrom C (12,4 KDa), Aprotinin (6,5 KDa). MLc eluiert bei etwa 17,35 ml unter den angegebenen Bedingungen.
Akzeptabilitätsgrenze:
Der MLc-Gehalt sollte nicht weniger als 95 % betragen.
3) Enzymatische Aktivität
Dieses Verfahren wird gemäß der herkömmlichen Verfahren, die bereits in der Literatur (5, 6, 7) beschrieben sind, durchgeführt.
Testbedingungen:

A) Suspension von Micrococcus luteus (Micrococcus lysodeikticus) in einer Konzentration von 0,3 mg/ml in 0,2 M Phosphatpuffer (pH-Wert = 7,00) und 17 mM NaCl.
B) Lösung von MLc (1 mg/ml) in destilliertem Wasser.
C) Spektrophotometer, das geeignet ist, um Änderungen der optischen Dichte bei 450 nm zu bestimmen.

Vorgehensweise:
Bringe 2,9 ml einer Suspension von Micrococcus luteus (Micrococcus lysodeikticus) in eine spektrophotometrische Küvette ein. Belasse die Suspension 4-5 Minuten lang bei 25°C, um die Suspension die Reaktionstemperatur erreichen zu lassen.
Füge 0,1 ml der enzymatischen Lösung hinzu und erfasse jede Minute die Veränderung der optischen Dichte bei 450 nm.
Berechnung der enzymatischen Aktivität von MLc:
Eine enzymatische Einheit ist als die Enzymmenge definiert, die bei den Testbedingungen (pH-Wert = 7,00 bei 25°C) die optische Dichte der Micrococcus luteus-Suspension jede Minute um 0,001 verringert. Daher zeigt das oben Genannte, dass MLc auch die Haupt-Enzymaktivität, die bereits bei natürlichem Lysozym c bekannt ist, beibehält.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung haben die Autoren überraschend festgestellt, dass der Verabreichungsweg von MLc oder seiner pharmazeutisch akzeptablen Salze grundlegend und bestimmend ist, um unbekannte und beachtenswerte therapeutische Effekte auf einige schwere Erkrankungen von Säugern auszulösen.
In der Tat haben die Autoren überraschend festgestellt, dass eine orale Verabreichung von MLc hohe plasmatische Spiegel an freiem TNF-α (Tumor-Nekrose-Faktor alpha), biologisch verfügbar, induzieren kann, wodurch die Replikationsgeschwindigkeit des tumoralen proliferativen Ablaufs bei Säugern durch einen praktisch direkten Mechanismus und signifikant gehemmt wird (8, 9, 10).
In der Tat stellt eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Verwendung von MLc für die Erzeugung von medizinischen Zusammensetzungen dar, die auf oralem Weg zu verabreichen sind, oder dass in einer anderen Weise die orale Verabreichung von MLc dazu geeignet ist, eine signifikante plasmatische Zunahme von freiem TNF-α zu induzieren, was diese letzte Substanz zur Folge hat, welche, wenn sie bio logisch verfügbar ist, wegen ihres schützenden Effekts und für die spezifische Behandlung von tumoralen Abläufen im Allgemeinen, insbesondere wenn sich alles im Anfangsstadium befindet, besonders nützlich ist.
Es ist in der Tat aus den jüngsten Publikationen bekannt, dass TNF-α ein spezifischer Faktor ist, wie durch seinen Namen angedeutet, der in der Lage ist, die Hemmung, in der Tat die Nekrose, des Tumorprozesses in den Zellen, auch wenn sie in vitro gezüchtet wurden, zu induzieren.
Die tumoralen Vorgänge werden paradoxerweise von hohen Blutspiegeln an TNF-α begleitet, welches an lösliche Formen von Rezeptoren gebunden ist, und in Folge dessen ist es nicht frei und biologisch verfügbar. Es ist im Gegenteil sehr wichtig, hohe Spiegel an freiem TNF-α zu induzieren (11, 12, 13). Der Mechanismus, weswegen MLc nur durch eine orale Verabreichung in der Lage ist, die Erhöhung der plasmatischen Spiegel an freiem TNF-α in bemerkenswerter Weise zu induzieren, ist nach wie vor unbekannt, wobei es noch ein Gegenstand der Forschung durch die Autoren ist, aber es kann hypothetisch in vivo mit einer möglichen aktiven Anregung des Biosyntheseprozesses von TNF-α in Zusammenhang gebracht werden. Der Mechanismus kann in der Weise erklärt werden, dass die Gen-Transkription von TNF und die mRNA-Translation beide stark durch Peptidoglycane angeregt werden, was der direkteste und signifikanteste Ausdruck der enzymatischen und lytischen Aktivität von MLc, verabreicht auf oralem Weg, auf die Zellwände von Bakterien ist, normalerweise Komponenten der Darm-Flora (14), und somit im Gegensatz dazu demonstriert wird, dass MLc seine enzymatische Aktivität, die jener ähnlich ist, die natürlichem Lysozym c entspricht, beibehalten hat, was im reinen Widerspruch mit der Publikation anderer Autoren steht. Hinsichtlich des Mechanismus ist es notwendig in Betracht zu ziehen, dass eine neuere Untersuchung gezeigt hat, dass Homologe der MAP-Kinase in mit Peptidoglycanen stimulierten Zellen phosphoryliert werden, was somit auf ihre mögliche Beteiligung bei der Signal-Transduktion hindeutet.
Die meisten der pleiotropen biologischen Wirkungen von TNF können seiner Fähigkeit zugeschrieben werden, eine Vielzahl von Genen in einer Vielzahl von Zielzellen zu aktivieren. TNF-α und das funktionell verwandte Cytokin IL-1 sind die einzigen natürlichen Substanzen, von denen bekannt ist, dass sie ein solch großes Spektrum des Zielgens aufweisen. Eine unvollständige Liste von Proteinen, die durch TNF induziert werden, schließt ein: IL-1α und IL-1β, IL-6, IL-8, IFN-β, IL-2-Rezeptor α-Kette und viele andere.
Überraschenderweise haben die Autoren in der vorliegenden Erfindung auch festgestellt, dass die orale Verabreichung von MLc die plasmatischen Spiegel der Sialinsäure (Gesamt) ebenfalls verringert, welche ein "unspezifischer Marker" ist, der sich bei einigen ernstlichen degenerativen Vorgängen pathologisch erhöht, was unterschiedliche Arten von Tumoren einschließt. Das oben genannte Ergebnis unterstützt ferner, dass eine Stimulation von freiem TNF-α, welche aus einer oralen Verabreichung von MLc erhalten wird, wie beansprucht wird, therapeutische Inhibierungs-Effekte von neoproliferativen Abläufen bestimmt, welche ein Ausdruck von tumoralen Zellen bei Tieren sind. Folglich kann man den Schluss ziehen, dass die erste Zielsetzung der vorliegenden Erfindung die Verwendung von MLc oder seiner pharmazeutisch akzeptablen Salze für die Erzeugung von medizinischen Zusammensetzungen ist, die nur auf oralem Weg zu verabreichen sind, um eine bemerkenswerte Erhöhung des plasmatischen Spiegels an freiem TNF-α zu erreichen, das somit biologisch verfügbar und infolgedessen besonders nützlich bei der Prophylaxe und der Behandlung von tumoralen Vorgängen bei Säugetieren ist, wofür eine Zunahme von plasmatischem freiem TNF-α (nicht blockiert durch lösliche Formen von Rezeptoren) nutzbringende und therapeutische Effekte hervorrufen kann.
Eine andere bevorzugte und wichtige Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von MLc oder seiner pharmakologisch akzeptablen Salze für die Erzeugung von medi zinischen Zusammensetzungen, welche für die Behandlung von rheumatoider Arthritis, des erworbenen Immunschwächesyndroms, geläufiger unter der angelsächsischen Terminologie „AIDS" bekannt, der Psoriasis und des septischen Schocks besonders nützlich sind, wobei der am stärksten bevorzugte Verabreichungsweg, um die erwünschten pharmakologischen und therapeutischen Effekte auszulösen, der parenterale Weg, genauer gesagt der intravenöse Weg ist. Es wurde in der Tat experimentell bestätigt, dass, wenn MLc auf parenteralem Weg, stärker bevorzugt auf dem intravenösen Weg verabreicht wird, es die plasmatischen TNF-α-Spiegel stark hemmt und somit überraschenderweise eine pharmakologische Antwort verursacht, die gerade entgegengesetzt zu jener ist, die erzielt wird, wenn MLc auf oralem Weg verabreicht wird.
Der Hauptangriffspunkt der chronischen Entzündungsreaktion bei rheumatoider Arthritis (RA) ist das Synovium. Auch wenn es unbekannt ist, was diese körperlich behindernde Erkrankung verursacht, ist eine Charakterisierung der eingedrungenen Entzündungs-Zellen und ihrer Produkte von großer Wichtigkeit für das Verständnis ihrer Pathogenese.
Es gibt eine beachtliche Evidenz für die Einbeziehung von TNF-α in die Pathogenese von RA. Diese Evidenz stammt nicht nur aus der generalisierten Anwesenheit von TNF-α in arthritischen Gelenken, begeleitet von einer erhöhten Antwort von TNF-α-Rezeptoren, sondern auch aus den Effekten einer Neutralisation von TNF-α in Gelenkzell-Kulturen.
Daher löst eine Neutralisation von TNF-α in vitro die Hemmung der Produktion von Interleukin-1, ebenso wie TNF-α, aus, von dem man annimmt, dass es die Ursache ist, welche die Entzündung und die Erosion des Gelenks bestimmt.
Bei einer AIDS-Erkrankung ist TNF-α ein wirksamer Aktivator der Replikation des HIV-Virus in den infizierten Zellen. Bei symptomatischen Patienten sind die Spiegel von TNF-α höher als bei asymptomatischen Patienten. Vermutlich verursacht TNF-α eine transkriptionale Aktivierung eines HIV-Provirus, der im Genom der Wirtszelle integriert ist, indem es die Spiegel an viraler RNA erhöht. Darüber hinaus trägt TNF-α zur viralen Replikation bei, was wiederum die Zerstörung von CD₄ ^–-Lymphozyten erhöht und die immunologischen Funktionen des Körpers reduziert (15).
Infolgedessen ist bei den Pathologien, wie RA aber besonders AIDS, worin die Spiegel an TNF-α hoch sind, die Verabreichung von MLc auf dem oralem Weg nicht geeignet, sondern absolut selbstzerstörend und kontraindiziert, weil es eine Verschlimmerung der Krankheit verursachen kann, indem es die TNF-α-Spiegel, die bereits sehr hoch sind, erhöht. Im Gegensatz dazu hat die vorliegende Erfindung überraschend bewiesen, dass die parenterale Verabreichung von MLc oder seiner pharmazeutisch akzeptablen Salze, genauer gesagt auf dem intravenösen Weg bei AIDS und intraartikulär bei R.A eine bemerkenswerte und günstige therapeutische Abnahme der TNF-α-Spiegel in Flüssigkeiten (Plasma bei AIDS und Synovialflüssigkeit bei R. A.) induziert. Dieser wichtige therapeutische Effekt, Gegenstand der vorliegenden Erfindung, unterstützt die Hypothese, dass die Verringerung von TNF-α aufgrund der reflektierten inhibitorischen Wirkung („Rebound"-Effekt) auf zelluläre Organe oder auf den Mechanismus beim Ursprung dieser Pathologien zugeschrieben werden kann.
Darüber hinaus wurde eine experimentelle signifikante Verringerung von TNF-α im Plasma und in der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) in nicht kontrollierten Studien bei Menschen beobachtet, und daher werden die therapeutischen Indikationen der medizinischen parenteralen Zubereitungen von MLc oder seiner pharmakologisch akzeptablen Salze insbesondere auch auf die reverse schwere Zentralnervensystem-Schwäche („AIDS dementia complex" und andere verwandte ernsthafte motorische und kognitive Störungen) ausgeweitet.
Eine andere besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von MLc oder von seinen pharmakologisch akzeptablen Salzen für die Erzeugung eines topischen Medikaments, das in der Lage ist, eine bemerkenswerte antihistaminische Aktivität auszulösen, wenn MLc oder seine pharmazeutisch akzeptablen Salze lokal angewendet werden. Diese topischen medizinischen Zubereitungen von MLc oder seinen pharmakologisch akzeptablen Salzen haben in experimentellen, nicht kontrollierten Studien erwiesen, dass sie Blutflusszunahme, Gefäßpermeabilität, Ödem, Schmerz und Reizung, die durch die Wirkung von Histamin verursacht werden, verhindern.
Eine weitere besondere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die topischen medizinischen Zubereitungen von MLc oder seinen pharmakologisch akzeptablen Salzen sich als besonders wirksam erweisen, um auch auf dem transdermalen Weg die Verringerung der TNF-α-Spiegel zu veranlassen, was zur Folge hat, dass die oben genannten medizinischen Produkte besonders für die Behandlung von reaktiver Arthritis, rheumatoider Arthritis, Psoriasis-Arthritis und allgemein bei jenen kutanen oder subkutanen Bedingungen, bei denen eine Verringerung der TNF-α-Spiegel therapeutisch erforderlich ist, angezeigt sind.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die topischen Zubereitungen von MLc oder seinen pharmakologisch akzeptablen Salzen bei der topischen Behandlung von Akne und bei der Verhinderung von faulen Zähne besonders wirksam sind.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung von MLc oder seinen pharmazeutisch akzeptablen Salzen für die Erzeugung von medizinischen Produkten, worin sie, in unterschiedlichen Mengen und Anteilen, mit anderen Substanzen mit antibakterieller Wirkung, aus chemischem und antibiotischem Ursprung, wie semisynthetische oder synthetische Penicilline, Cephalosporine, Macrolide, Erythromycine und Chinolon-Derivate, um aber nur einige der wichtigsten zu erwähnen, assoziiert bzw. vereinigt sein können. Diese Vereinigungen, herkömmlich formuliert in geeigneten galenischen Zubereitun gen, die den Fachleuten im Fachbereich bekannt sind, sind besonders nützlich, um Infektionen oder Pathologien zu überwinden, die von Bakterien, einem Makrovirus, Virus oder Prionen verursacht werden, welche für den therapeutischen Synergieeffekt dieser Vereinigungen von MLc oder seinen Derivaten besonders sensitiv sind.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass bei nicht kontrollierten Studien, worin aus ethischen Gründen nur eine begrenzte Anzahl von gesunden Freiwilligen für jede Indikation zugelassen wurde, die medizinischen Zubereitungen von MLc oder seinen pharmakologisch akzeptablen Salzen überraschende therapeutische Effekte zeigten, die durch das gegenwärtige biologische Wissen nicht erklärt werden können, die aber Gegenstand weiterer Forschungen an anderen ernsthaften Pathologien, wie Anorexie, Multiple Sklerose, amyothrophe Lateralsklerose, Alzheimer Krankheit, Parkinson, Bovine Spongiforme Enzephalopathie (BSE), Bovine übertragbare Enzephalopathie (TBE), Creutzfeldt-Jacob-Erkrankungen, Herzinfarkt, Iktus und alle Pathologien, bei denen heutzutage eine mögliche Beteiligung von Bakterien, viralen Agentien und/oder ein ansteckendes proteinartiges Agens (Prionen) bei ihrer Ätiopathogenese nur vermutet wird, sein werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine geeignete pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung, die MLc oder seine pharmakologisch akzeptablen Salze, alleine oder in Verbindung mit einem oder mehreren Wirkstoffen der gleichen Gruppe oder mit einer beliebigen anderen verschiedenen medizinischen Substanz oder mit einer Mischung davon, die durch die Verwendung von inerten pharmazeutisch akzeptablen Trägern oder Verdünnungsmitteln oder einer Mischung davon, im festen, flüssigen oder Gaszustand, bei Zimmertemperatur hergestellt wurde, enthält.
Die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung, die MLc oder seine pharmakologisch akzeptablen Salze enthält, können beliebige Zubereitungen sein, die für den oralen Weg geeignet sind, wie Tabletten, mit sofortiger oder langanhaltender Freisetzung, Kapseln, Granulate, Pulver, Sirup, Suspension oder Emulsion, Tropfen und auch für eine parenterale Verabreichung geeignet sein, wie sterile wässrige Lösungen, steril konditionierte oder lyophilisierte Pulver für eine sofortige Erzeugung von sterilen, injizierbaren Lösungen oder Dispersionen und schließlich auch in Form von topischen Zubereitungen, wie Creme, Salbe, Lotion, Gel und medizinische Gaze und transdermale Pflaster. Die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung, die MLc oder seine pharmazeutisch akzeptablen Salze enthält, kann auch Systeme für die Anwendung auf endonasalem Weg, Spray unter Druck oder Inhalator und rektale und vaginale Zäpfchen und Zahnpasta umfassen, wobei alle entsprechend der allgemeinen Verfahren hergestellt wurden, die den Fachleuten im Fachbereich gut bekannt sind.
Im den medizinischen Zusammensetzungen der Erfindung, die oral zu verabreichen sind, werden MLc oder seine pharmazeutisch akzeptablen Salze alleine oder mit anderen Wirkstoffen, in geeigneten Mengen und Anteilen, in einem herkömmlichen pharmazeutisch akzeptablen Träger, fest oder flüssig oder einer Mischung davon, so gemischt, um geeignete pharmazeutische Formen zu erzeugen, welche die gewünschten Dosen enthalten. Die Einheit einer oralen Dosis enthält vorzugsweise von 5 bis 80 % des Wirkstoffs, stärker bevorzugt zwischen 40 % und 60 %.
Einige herkömmliche geeignete inerte feste Träger sind zum Beispiel Lactose, Stärke, Talk, mikrokristalline Cellulose, Calciumphosphat, Magnesiumstearat, Dextrine und/oder andere Trägerstoffe, Bindemittel, Auflösemittel, Verdünnungsmittel, Schmiermittel, Süß- und Aromastoffe, die bereits im Fachbereich bekannt sind, mit der oder ohne die Verwendung von Wasser oder einem anderen geeigneten zusätzlichen Lösungsmittel.
Herkömmliche wässrige Lösungen, die für eine orale Verwendung von MLc oder seinen pharmakologisch akzeptablen Salzen geeignet sind, können hergestellt werden, indem der Wirkstoff in Wasser oder in einem beliebigen anderen geeigneten flüssigen Lösungsmittel bei Raumtemperatur aufgelöst wird und unterschiedliche Mengen und Anteile von geeigneten Farbstoffen, Süßstoffen, Aromastoffen, Stabilisatoren, Tensiden und Verdickungsmittel, wie es gewünscht ist, hinzugefügt werden.
Die wässrigen Suspensionen, die für die orale Anwendung geeignet sind, können hergestellt werden, indem das fein pulverisierte MLc oder seine pharmazeutisch akzeptablen Salze in Wasser oder in einem beliebigen anderen pharmazeutischen geeigneten Träger mit suspendierenden Mitteln, wie natürliche oder synthetische Gummis, Harze, Methylcellulose, Natrium-Carboxymethylcellulose und anderen, die im Fachbereich gut bekannt sind, dispergiert wird/werden.
Die parenteralen Zubereitungen der Erfindung, welche MLc oder seine pharmazeutisch akzeptablen Salze enthalten, können entsprechend dem bekannten Stand der Technik unter Verwendung von geeigneten parenteral akzeptablen Lösungsmitteln oder Verdünnungsmitteln, genauer gesagt Wasser mit anderen zusätzlichen Exzipientien bzw. Hilfsstoffen, wie Natriumchlorid, Zucker, Puffer, Ethanol, Polyole (Glycerin, Propylenglykol), Konservierungsmittel und die Adsorption verzögernde Mittel, formuliert werden.
Die Verwendung dieser Agentien für geeignete pharmazeutisch akzeptable Zusammensetzungen von MLc oder seinen pharmakologisch akzeptablen Salzen, ist im Fachbereich bereits weithin bekannt. In der Tat kann in den medizinischen Zusammensetzungen der Erfindung ein beliebiger herkömmlicher Hilfsstoff oder eine Mischung davon enthalten sein, außer insofern, als beliebige herkömmliche Medien oder ein Agens mit dem Wirkstoff unverträglich sind.
Es ist besonders günstig, die parenteralen Zusammensetzungen der Erfindung in einer einheitlichen Dosisform zu formulieren, um ihre Verabreichung zu vereinfachen und eine Einheitlichkeit der Dosierung zu erzielen, wie Ampullen oder Phiolen, die gemäß der Verfahren, die den Fachleuten im Fachbereich bereits bekannt sind, unter sterilen und aseptischen Bedingungen zu produzieren und in der Atmosphäre eines inerten Gases (Stickstoff) zu verpacken sind, um mögliche Abbauvorgänge zu verhindern.
Die Konzentration des Wirkstoffs, als Lösung oder als Pulver, das zu rekonstituieren ist, kann von 0,5 % bis 10 %, vorzugsweise von 2 % bis 4 % variieren. Die Zubereitungen der Erfindung für eine topische oder lokale Anwendung werden mit herkömmlichen Verfahren, die den Fachleuten im Fachbereich bereits bekannt sind, hergestellt, welche für die Erzeugung dieser pharmazeutischen Formen für eine lokale Anwendung auf der Haut in therapeutisch effektiven Dosierungen geeignet sind.
Wenn die medizinischen Zubereitungen der Erfindung für eine orale Verabreichung angewendet werden, kann jede orale Einheitsdosis eine Menge von MLc oder seinen Salzen enthalten, welche von 50 mg bis 2000 mg, vorzugsweise von 250 bis 1000 mg variiert (oder jede 5 ml im Fall von flüssigen Formen), während im Falle von Zubereitungen, die parenteral anzuwenden sind, die Einheitsdosis von 100 mg bis 2000 mg in 50 ml, vorzugsweise von 500 mg bis 1000 mg enthalten kann, unabhängig davon, ob der Wirkstoff bereits in einer Lösung aufgelöst oder ein konditioniertes oder lyophilisiertes Pulver ist, das mit 50 ml des Lösungsmittels zu rekonstituieren ist. Für topische Zubereitungen der Erfindung kann der Gehalt an der Verbindung der Formel (I) in einer variablen Konzentration eingesetzt werden, die zwischen 0,5 % und 10 %, vorzugsweise zwischen 1 % und 5 % des Gesamtgehalts liegt.
Wenn die orale Einnahme angewendet wird, werden im Allgemeinen tägliche therapeutische Dosen von MLc oder seinen Salzen angewendet, die zwischen 150 mg und 6 g pro Tag liegen, stärker bevorzugt zwischen 500 mg und 2,5 g pro Tag liegen. Auf parenteralem Weg können die täglichen Gesamtdosen von MLc oder seinen Salzen von 200 mg bis 3 g täglich, vorzugsweise zwischen 500 mg und 2 g täglich variieren.
Diese Dosierungen können in Bezug auf die zu behandelnde Pathologie, den Grad ihrer Schwere und die erwünschte therapeutische Ansprechreaktion erhöht werden. Auch die Dauer der Behandlung kann beträchtlich variieren, immer im Bezug auf die zu behandelnde Erkrankung, auf ihre Schwere und auf die therapeutische Ansprechreaktion, die während der Behandlung erhalten wird.
Jedoch versteht man es, dass die spezifische Dosierung, die Dosierungshäufigkeit, die tägliche Gesamtdosis und insgesamt die Länge der Behandlung signifikanten Schwankungen bei jedem Patienten unterliegen können, was von einer Vielzahl von Faktoren und Bewertungskriterien abhängt, wie die Aktivität der spezifischen Verbindung, die zu behandelnde Schwere und Pathologie, das Alter, Körpergewicht, die allgemeine Gesundheit, das Geschlecht, die Ernährung, die Ausscheidungsrate, die Arzneimittelkombination und allgemeine Zustände der Person, die sich einer Therapie unterzieht.
Literaturhinweise

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Die Erfindung wird ferner für ein besseres Verständnis in den folgenden Beispielen beschrieben.
BEISPIEL 1 (nicht gemäß der Erfindung)
Bewertung von Serumspiegeln von Cytokinen, TNF-α, IL-1α und IL-1β, IL-6 und IL-8 in CBA-Mäusen nach einer oralen Verabreichung von MLc(Hühner-Eiweiß)-Hydrochlorid während 7 aufeinander folgender Tage.

Die Behandlung der Mäuse vom CBA-Stamm wurde durch eine orale Verabreichung von täglichen Dosierungen von MLc-Hydrochlorid (Hühner-Eiweiß) zu 25-100 mg/kg/Tag während 7 aufeinander folgender Tage durchgeführt (die Menge ist ausgedrückt als Äquivalent von Lysozym c von Hühner-Eiweiß). Die Verbindung in der Erprobung wurde sorgfältig der gepulverten Nahrung beigemischt. Der Spiegel von TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8 wurde am Tag 7 durch einen Enzym-Immunoassay (ELISA) bestimmt. Tabelle 1 zeigt die erhaltenen Ergebnisse, die den erhöhten Spiegel an plasmatischem TNF-α und folglich der anderen Cytokine, nach der Verabreichung von MLc (Hühner-Eiweiß) folgend, belegen: TABELLE 1

PLASMATISCHE SPIEGEL VON TNF-α UND CYTOKINEN (pg/ml) Nach 7 Tagen einer oralen Behandlung mit MLc (Hühner-Eiweiß)
Vorbehandlung (mg/kg/Tag)	TNF-α	IL-1α	IL-1β	IL-6	IL-8
0	6,14	7,16	1,51	3,52	2,81
25	11,14	10,74	2,42	5,24	4,50
100	11,80	11,07	2,57	5,63	4,06

BEISPIEL 2 (nicht gemäß der Erfindung)
Bewertung von Serumspiegeln von TNF-α, IFN-α (Alpha-Interferon) bei freiwilligen Patienten mit AIDS nach einer Verabreichung von MLc(Hühner-Eiweiß)-Hydrochlorid auf intravenösem Weg (Phleboclysis). Es wurde bestätigt, dass bei AIDS TNF-α und TNF-β eine äußerst wichtige Rolle zu spielen scheinen, indem sie die Replikation von HIV verstärken und auch ihre eigene Expression und die von anderen Cytokinen induzieren. Die plasmatischen Spiegel von TNF-α und IL-1 sind während des Fortschreitens von AIDS wesentlich erhöht. Folglich, indem man eine Kontrolle über die Induzierung von TNF-α erlangt, ist es möglich, eine effektive Therapie für AIDS zu schaffen.
MLc, wie es vorliegt oder als Salz, hemmt die Synthese von TNF-α und stimuliert gleichzeitig die Synthese von IFN-α.

Mit Blick auf die oben genannten Betrachtungen wurden 20 mg/kg/Tag MLc-Hydrochlorid (die Menge ausgedrückt als Äquivalent von Hühnereiweiß-Lysozym c) auf einem langsamen intravenösen Weg an gesunde Kontrollen, HIV-infizierte Patienten und HIV-infizierte asymptomatische Patienten während „n" aufeinander folgender Tage (n = nicht weniger als 120 Tage) verabreicht. Tabelle 2 zeigt die erhaltenen Ergebnisse, die eine Verringerung des plasmatischen TNF-α-Spiegels und eine Zunahme an IFN-α nach einer Verabreichung von MLc(Hühner-Eiweiß)-Hydrochlorid bestätigen: TABELLE 2

			Zahl	TNF-α plasmatisch	IFN-α plasmatisch
Kontrolle			20	10,30	1,60
HIV-infizierte Patienten	symptomatisch asymptomatisch	15 10	20,09 9,35	< 1 0,98
HIV-infizierte symptomatische Patienten + + MLc(Hühnereiweiß)-Hydrochlorid			9	11,30	3,57

BEISPIEL 3 (nicht gemäß der Erfindung)
Untersuchung des Effekts von intravenös verabreichtem MLc(Ratte)-Acetat bei DBA/1-Mäusen mit durch Kollagen induzierter Arthritis. DBA/1-Mäuse wurden wegen ihrer zahlreichen immunologischen und pathologischen Ähnlichkeiten zu menschlicher RA (rheumatoider Arthritis) ausgewählt. MLc(Ratte)-Acetat wurde in einer Dosis von 20 mg/kg Körpergewicht (Menge ausgedrückt als Äquivalent von Ratten-Lysozym c) erwachsenen Mäusen sowohl vor der Induktion der Arthritis oder nach dem Ausbruch der Krankheit intravenös injiziert. MLc(Ratte)-Acetat, das auf dem parenteralen Weg vor der Induktion der Krankheit verabreicht wurde, bedingt eine signifikante Verringerung von Schmerz und der histologischen Schwere der Arthritis. Indem man die Ziele der Studie mit der analogen humanen Erkrankung vergleicht, ist die Leistung des ausgewählten Produkts für die Verringerung von klinischen Zuständen, Gelenkschwellung und der histologischen Schwere der Erkrankung, selbst wenn es nach dem Einsetzen klinischer Anzeichen der Arthritis verabreicht wurde, von großer Signifikanz. Mononukleäre Zellen aus RA-Gelenken, die in Kultur gehalten wurden, produzieren viele Cytokine mit pro-inflammatorischer Aktivität, einschließlich TNF-α, was durch Elisa-Tests gemessen wurde. MLc-Acetat verringert in vitro die Erzeugung dieses pro-inflammatorischen Cytokins. Mononukleäre Zellen (10⁶ Zellen pro Test) wurden mit PHA bei der Konzentration von 1 μg/ml ab dem 1. Tag bis zum 5. aktiviert. Dann wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und in Komplettmedium (500 μl) in Gegenwart oder Abwesenheit von MLc(Ratte)-Acetat kultiviert. Nach zwei Tagen wurde der Kulturüberstand entfernt und auf seinen Gehalt an Cytokinen untersucht. Die Tabelle 3 bestätigt die Abnahme der TNF-α-Spiegel nach einer intravenösen Verabreichung bei jenen Gruppen, die zuvor mit MLc(Ratte)-Acetat behandelt wurden. TABELLE 3

CYTOKIN-SPIEGEL (pg/ml)

Behandlung TNF-α IFN-α IL-1α

Ohne MLc (*) 301,60 7,30 2,51

+ MLc (*) 0,1 mg/ml 55,79 9,76 3,42

+ MLc (*) 1 mg/ml 20,60 18,07 3,57

(*) MLc-Acetat (Ratte)

BEISPIEL 4 (nicht gemäß der Erfindung)
Erzeugung von 100 000 Tabletten, die 300 mg MLc-Hydrochlorid (Hühner-Eiweiß) enthalten.

Jede Tablette enthält:

Inhaltsstoffe	Menge (pro Tablette)
MLc-Hydrochlorid (Hühner-Eiweiß) Magnesiumstearat Mikrokristalline Cellulose Siliziumdioxid Natrium-Polycarboxymethylcellulose	300 mg 25 mg 250 mg 15 mg 20 mg
Gesamtgewicht	610 mg

Das Herstellungsverfahren wurde durch die direkte Verdichtung der Pulvermischung durch die Schritte, die den Fachleuten im Fachbereich für die Herstellung von Tabletten bereits bekannt sind, durchgeführt, wobei geeignete Räume und Gerätschaften für diese Art der Produktion zur Anwendung kamen.
1) 30 kg MLc-Hydrochlorid (Hühner-Eiweiß) und 25 kg mikrokristalline Cellulose wurden in einen geeigneten Mischer eingebracht, nachdem sie durch ein Sieb von 1,2 mm Maschenweite laufen gelassen wurden; 2) zu der zuvor hergestellten Pulvermischung wurden 2,5 kg Magnesiumstearat, 1,5 kg Siliziumdioxid und 2,0 kg Natrium-Polycarboxymethylcellulose in der geringstmöglichen Zeit hinzugefügt, um die Einheitlichkeit des Inhalts zu erhalten; 3) die erhaltene Mischung wurde vorübergehend in geeigneten Behältern gelagert und nach der Bestätigung durch eine Qualitätskontrolle des Wirkstoff-Gehalts wurde sie dann in die Kompressionseinheit überführt, worin das Pulver durch eine direkte Verdichtung in Tabletten umgewandelt wurde, indem eine Rotationsmaschine mit einem geeigneten Stempel des gewünschten Maßes verwendet wurde.

97 931 bikonvexe Tabletten, die jeweils die gewünschte Menge an MLc-Hydrochlorid enthielten, wurden erhalten.

Effektive Ausbeute (97 931 Tabletten)	: 97,93 %
(Theoretische Ausbeute 100 000 Tabletten	: 100,0 %)
Effektives mittleres Gewicht	: 612,50 mg
(Theoretisches mittleres Gewicht	: 610,00 mg)
Effektiver mittlerer Gehalt für jede Tablette	: 301,60 mg
	MLc-Hydrochlorid
Theoretischer Gehalt für jede Tablette	: 300,00 mg
	MLc-Hydrochlorid

BEISPIEL 5 (nicht gemäß der Erfindung)
Herstellung von 1 500 Ampullen von 10 ml (15 000 ml), die MLc-Hydrochlorid (Hühner-Eiweiß) (Konzentration von 50 mg/ml MLc-Hydrochlorid) enthalten.
1 ml der Lösung enthielt 50 mg MLc-Hydrochlorid.

Inhaltsstoffe Menge (pro ml)

MLc-Hydrochlorid (Hühner-Eiweiß) 50,0 mg

Natriumchlorid 8,0 mg

Wasser für injizierbare Zubereitungen q.s. zu 1,0 mg
Das Herstellungsverfahren wurde durch Schritte, die den Fachleuten im Fachbereich für die Herstellung von sterilen und apyrogenen Lösungen bereits bekannt sind, durchgeführt, wobei geeignete Räume und Gerätschaften für die Produktion von injizierbaren Lösungen zum Einsatz kamen.
1) In einem Edelstahl-Auflösungsgerät wurden etwa 12,0 kg Wasser für Injektionen eingebracht und unter konstantem und langsamem Rühren wurden 120,0 g Natriumchlorid hinzugefügt; 2) gesondert wurden in etwa 4,0 kg der Lösung, die beim vorherigen Punkt erzeugt wurde, 0,750 kg MLc-Hydrochlorid gelöst; 3) die Lösung bei Punkt (2) wurde zu Lösung (1) hinzu gegeben, und das Gesamtgewicht von 15,0 Litern wurde mit der Zugabe von Wasser für injizierbare Zubereitungen gewonnen; 4) die resultierende Lösung wurde dann durch sterilisierende Filter filtriert und in geeignete sterile Räume (Klasse 100) zu ihrer automatischen Verteilung in Glasampullen unter Stickstoffatmosphäre eingebracht, wobei die Verfahren zur Anwendung kamen, die im Fachbereich für die industrielle Herstellung von injizierbaren Zubereitungen bereits gut bekannt sind.
Nach den chemischen und biologischen (Sterilität und Pyrogene) Kontrollen, wurden die erhaltenen Ampullen den gewöhnlichen automatischen Tests, um Fremdteilchen nachzuweisen und den Glasunversehrtheits-Tests für Ampullen unterzogen, und anschließend geeignet einzeln in Kartons für den Vertrieb und ihre nachfolgende Anwendung in der Humanmedizin verpackt. 1 421 Ampullen von 10 ml (Konzentration von 50 mg/ml MLc-Hydrochlorid) wurden mit einer effektiven Ausbeute von 94,73 % (theoretische Ausbeute 1 500) erhalten.

Claims

Verbindung der allgemeinen Formel [CH₃O-(CH₂-CH₂-O)_n-CH₂-CH₂]_x-(NH)_y Lysozym c·(Z)_m, worin – y die Zahl der freien Aminogruppen der Lysin-Moleküle ist, die in dem Lysozym-c-Molekül vorhanden sind, die im Bereich von 5 bis 30 liegt; – x im Bereich von 1 bis y liegt; – n im Bereich von 5 bis 1000 liegt; – Z eine pharmazeutisch akzeptable Säure ist; – m im Bereich von 1 bis y liegt, und – das Lysozym c vom Menschen stammt.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei n im Bereich von 120 bis 200 liegt.
Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei der pharmazeutisch akzeptablen Säure um Chlorwasserstoffsäure handelt.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Krebs, rheumatoider Arthritis, AIDS, Psoriasis und des septischen Schocks ist.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung von rheumatoider Arthritis, AIDS, Psoriasis und des septischen Schocks und für die Verabreichung auf parenteralem Weg, vorzugsweise intravenösem Weg, vorgesehen ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff eine Verbindung nach den Ansprüchen 1 bis 3, optional in Kombination mit einem oder mehreren anderen Wirkstoffen, enthält, formuliert mit pharmazeutisch akzeptablen Bestandteilen und/oder Hilfsstoffen.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, die auf oralem Weg zu verabreichen ist, die 5 bis 80 Gew.-% und vorzugsweise 40 bis 60 % der Verbindung enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, die auf parenteralem Weg zu verabreichen ist, die 0,5 bis 10 Gew.-% und vorzugsweise 2 bis 4 % der Verbindung enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, die auf topischem Weg zu verabreichen ist, die 0,5 bis 10 Gew.-% und vorzugsweise 1 bis 5 % der Verbindung enthält.
Herstellungsverfahren für die Erzeugung einer Verbindung nach den Ansprüchen 1 bis 3, das die folgenden Schritte umfasst: 1. Umsetzen von Monomethoxypolyethylenglycol mit Tresylchlorid; 2. Umsetzen der resultierenden Verbindung mit Lysozym c in Phosphatpuffer-Kochsalzlösung oder in Boratpuffer in einem schwach basischen Medium.
Herstellungsverfahren nach Anspruch 10, wobei die Erzeugung des Additionssalzes über eine Dialyse mit einer wässrigen Lösung der Säure Z, vorzugsweise über einen Zeitraum von 6 bis 8 Stunden bei Raumtemperatur, erfolgt.