CH644520A5

CH644520A5 - Verfahren zur herstellung eines die proliferation und differenzierung menschlicher granulopoetischer stammzellen stimulierenden faktors.

Info

Publication number: CH644520A5
Application number: CH550580A
Authority: CH
Inventors: Fumimaro Takaku; Katsuhiro Ogasa; Morio Kuboyama; Nobuya Yanai; Muneo Yamada; Yoshiteru Watanabe
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd; Green Cross Corp
Priority date: 1979-07-20
Filing date: 1980-07-18
Publication date: 1984-08-15
Also published as: FR2461500B1; GB2058081A; DE3027105A1; GB2058081B; FR2461500A1; US4342828A; CA1128881A; SE8005256L; DE3027105C2; SE451850B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines die Proliferation und Differenzierung menschlicher granulopoetischer Stammzellen stimulierenden Faktors, nachstehend als Colony stimulating factor (CSF) bezeichnet. Dieser Faktor ist ein Arzneistoff, der zur Behandlung von Granulozytopenie beim Menschen eingesetzt werden kann.

Es ist bekannt, dass CSF eine Schlüsselfunktion bei der Granulopoesis und der Bildung von Monozyten und/oder Makrophagen in vivo hat. CSF wirkt im menschlichen Körper auf die Blutstammzellen, welche die Mutterzellen für die Granulozyten, Monozyten und Makrophagen darstellen; vgl. D. Metealf, Expérimental Haematology, Bd. 1 (1973), S. 185 bis 201. Der Vorschlag der Verwendung von CSF als Arzneistoff zur Behandlung von Granulozytopenie stammt von T. Fumimaro, Igaku no Ayumi (Progress in Medicai Science), Bd. 95, Nr. 2 (1975), S. 41 bis 50. Bisher wurde jedoch CSF als Arzneistoff nicht eingesetzt, weil der Mechanismus der Bildung von Granulozyten, Monozyten und Makrophagen in vivo kompliziert ist, das Verhalten von CSF dabei noch teilweise unbekannt ist und es schwierig war, grosse Mengen CSF in pharmakologisch annehmbarer Qualität herzustellen.

CSF kann auch als Diagnostikum verwendet werden. Es ist bekannt, dass die Bestimmung der Anzahl von auf CSF-reagierenden Zellen in Knochenmarkzellen von erheblicher Bedeutung für die Prognose von Patienten ist, die an myelogener Leukämie leiden; vgl. Nakao und Takaku, Proliferation and Differantiation of Blood Cells - Fundamental and Clinical Aspects, S. 29, Verlag Kagaku Hyoron-sha Co., Japan, 1975. CSF eignet sich als Reagens (Bezugsstimulator) für diesen Zweck. Ebenso wie im vorstehenden Fall der Verwendung als Arzneistoff ist CSF auch zur Diagnose bis jetzt nicht eingesetzt worden, weil es schwierig war, grössere Mengen mit ausreichender Qualität für diagnostische Zwek-ke herzustellen.

Zur Herstellung von CSF, das unmittelbar auf die Stammzellen wirkt, sind verschiedene Verfahren bekannt, beispielsweise die Züchtung von Leukozyten aus menschlichem peripherem Blut (G.B. Price u. Mitarb., Biochemical Journal, Bd. 148 [1975}, S. 209 bis 217), menschlichen Plazentazellen (vgl. A.W. Burges u. Mitarb., Blood, Bd. 49, Nr. 4 [1977], S. 573 bis 583) oder bestimmten Krebszellen,

die CSF bilden (vgl. N. Osawa u. Mitarb., Acta Hematologi-ca Japonica, Bd. 42, Nr. 2 [1979], S. 237). Möglicherweise sind von den vorstehend beschriebenen Verfahren die Ver-30 fahren von Price u. Mitarb. und Burges u. Mitarb. zur Herstellung von CSF für pharmazeutische Zwecke geeignet. Die üblichen Verfahren unter Verwendung von Leukozyten oder menschlichen Plazentazellen sind jedoch lediglich Labormethoden zur Gewinnung kleiner Mengen CSF, und sie sind 35 zur technischen Herstellung von CSF ungeeignet. Weiterhin muss zur Herstellung von CSF nach dem bekannten Verfahren das Medium zur Züchtung der Zellen Serum enthalten. In Abwesenheit von Serum wird nämlich kein CSF gebildet. In der Regel wird Rinderserum oder fetales Kälberserum 40 verwendet. Zur Vermeidung von Nebenwirkungen (Sensibilisierung und anaphylaktischer Schock) durch diese Fremdproteine in den Medien ist es erforderlich, die Proteine nach der Vermehrung der Zellen abzutrennen oder menschliches Serum zu verwenden. Die Abtrennung dieser Proteine aus 45 dem gebildeten CSF jm Medium ist umständlich und schwierig, und die Verwendung von menschlichem Serum ist teuer.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von CSF zu entwickeln, das in technischem Umfang durchführbar ist und CSF liefert, das so sich zur Behandlung von Granulozytopenie in der Humanmedizin ohne Nebenwirkungen und als Reagens zur Diagnose von myelogener Leukämie eignet. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst. Die Erfindung betrifft somit den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand. 55 Das aus menschlichem Urin isolierte, erfindungsgemäss verwendete Glykoprotein, welches die Bildung von mensch-lischen Granulozyten stimuliert (nachstehend als Glykoprotein H bezeichnet), ist in der DE-OS 2 910 745 beschrieben. Ein Glykoprotein^ welches die Bildung von Mäu-60 semakrophagen und Granulozyten stimuliert, nachstehend als Glykoprotein M bezeichnet, das aus menschlichem Urin isoliert wird, ist als ein Sialinsäure enthaltendes Glykoprotein beschrieben; vgl. Stanley und Metealf, Australien Journal of Expérimental Biological Medicai Science, Bd. 47 65 (1969), S. 467 bis 483, Stanley u. Mitarb., Fédération Pro-ceedings, Bd. 34, Nr. 13 (1975), S. 2272 bis 2278 und Làukel et al., Journal of Cellular Physiology, Bd. 94 (1978), S. 21 bis 30.

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Das im erfindungsgemässen Verfahren verwendete Zellkulturmedium kann ein übliches synthetisches Medium für Gewebekulturen oder Zellkulturen sein, beispielsweise McCoy's 5A-Medium (T.A. McCoy, M. Maxwell und P.F. Kruse, Proc. Soc. Exper. Biol. and Med., Bd. 100 [1959], S. 115 bis 118), Nährgemisch HAMF-10 (R.G. Ham, Exp. Cell Res., Bd. 29, S. 515 bis 526), RPMI-1640 (vgl. S. Iwa-kata, J.T. Grâce Jr„ N.Y.J. of Med., Bd. 64 [1964], S. 2279 bis 2282) oder ein durch Aminosäuren ergänztes Eagle's MEM Medium (vgl. H. Eagle, Science Bd. 130 [1959], S. 432).

Das erfmdungsgemässe Verfahren wird nachstehend beispielsweise näher beschrieben.

(1) Isolierung der Monozyten und Makrophagen

Mittels einer heparinisierten Spritze wird venöses Blut von gesunden Versuchspersonen entnommen, in ein steriles Reagensglas abgefüllt und 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Sämtliche nachfolgenden Arbeitsschritte werden unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Nach dem Stehen wird die obere Leukozyten enthaltende Schicht abgetrennt, einmal mit einem synthetischen Gewebe-Kulturmedium gewaschen und danach einer Dich-te-Gradientenzentrifugation unterworfen (vgl. T. Mahmood und W.A. Robinson, Blood, Bd. 51, Nr. 5 [1978], S. 879 bis 887), um die Leukozytenschicht in eine Schicht zu fraktionieren, die Monozyten, Makrophagen und Lymphozyten sowie eine weitere Granulozyten enthaltende Schicht enthält. Die erstgenannte Schicht wird isoliert. Es wird eine Zellfraktion erhalten, die in einem synthetischen Gewebekulturmedium suspendiert wird. Nachstehend wird dieses Gewebekulturmedium kurz als Medium bezeichnet. Die Zellsuspension wird zentrifugiert und der erhaltene Überstand verworfen. Die erhaltenen sedimentierten Zellen werden mit dem gleichen Medium mindestens zweimal gewaschen. Hierauf werden die gewaschenen Zellen in einem geringen Volumen des gleichen Mediums suspendiert. Ein Teil der erhaltenen Suspension wird entnommen und die Zahl der Zellen mittels eines automatischen Blutzellenzählgeräts bestimmt. Das Zahlenverhältnis von Monozyten und Makrophagen zu Lymphozyten wird unter dem Mikroskop an einem Ausstrich bestimmt, der nach Wright-Giemsa gefärbt ist. Die Zellensuspension wird in einer Petrischale aus Glas oder Kunststoff so verteilt, dass die Zahl der Inokula (Monozyten und Makrophagen) dem vorgeschriebenen Wert entspricht, vorzugsweise IO5 bis 107 pro Petrischale. Sodann wird ein synthetisches Gewebekulturmedium zugegeben, das mit 5 bis 20 Volumprozent Serum ergänzt ist. Hierauf lässt man die Petrischale 2 Stunden an feuchter Luft mit 5% Kohlendioxid bei 37 °C stehen. Während dieser Zeit verankern sich die Monozyten und Makrophagen an der Bodenfläche der Petrischale, während die Lymphozyten im Medium suspendiert bleiben. Das Medium wird sodann verworfen und die Petrischale wird mehrmals mit einem Medium ohne Serum oder mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Nach dieser Behandlung ist der grösste Teil der Lymphozyten abgetrennt, während die Monozyten und Makrophagen am Boden der Petrischale haften. Die mikroskopische Untersuchung ergibt, dass mindestens 95% der Zellen, die am Boden der Petrischale haften, Monozyten und Makrophagen sind, und ihre Zahl IO5 bis 107 pro Petrischale beträgt.

(2) Züchtung bzw. Vermehrung der Monozyten und Makrophagen

Die Petrischale mit den Monozyten und Makrophagen wird mit einem synthetischen Medium versetzt, das gegebe nenfalls mit Serum ergänzt ist und das mindestens 0,1 (ig/ml

Medium Glykoprotein (H) oder eine Glykoprotein (H) enthaltende Fraktion oder mindestens 500 Einheiten/ml Medium Glykoprotein (M) oder eine Glykoprotein (M) enthaltende Fraktion enthält. Die Einsaatdichte der Monozyten und Makrophagen beträgt mindestens 105/ml Medium. Das beimpfte Medium wird 1 bis 7 Tage bei 37 C an feuchter Luft mit 5% Kohlendioxid inkubiert. Dabei wird CSF in das Medium abgegeben. Das verwendete synthetische Medium ist das vorstehend erwähnte Gewebekulturmedium.

Die optimalen Bedingungen zur Herstellung von CSF nach dem erfindungsgemässen Verfahren hinsichtlich Züchtungsdauer, Menge des zugesetzten Glykoproteins, Einsaatdichte, Menge des zugesetzten Serums und Art des verwendeten Mediums werden nachstehend in den Ausführungsbeispielen noch näher beschrieben.

Zur Herstellung von CSF für pharmazeutische Zwecke wird erfindungsgemäss ein Medium verwendet, das durch menschliches Serum ergänzt ist, oder es wird ein serumfreies Medium verwendet, um Sensibilisierung und anaphylakti-schen Schock durch Fremdproteine zu vermeiden. Zur Herstellung von CSF für diagnostische Zwecke kann anderseits ein Medium verwendet werden, das durch Rinderserum oder fetales Kälberserum ergänzt ist. Ferner ist es möglich, auch Kulturflaschen anstelle von Petrischalen zu verwenden. Schliesslich können die vermehrten Monozyten und Makrophagen auch wiederholt verwendet werden.

(3) Glykoproteine

Die im erfindungsgemässen Verfahren verwendeten Glykoproteine werden aus menschlichem Urin isoliert. Sie stimulieren die Bildung menschlicher Granulozyten oder Mäu-semakrophagen und Granulozyten. Es kann auch eine Fraktion verwendet werden, die diese Glykoproteine enthält.

Dass zur Stimulierung der Bildung menschlicher Granulozyten geeignete Glykoprotein kann nach der JP-OS 140 707/79 und der entsprechenden DE-OS 2 910 745 gewonnen werden. Das Verfahren ist nachstehend erläutert.

Frischer Urin von gesunden Versuchspersonen wird mit verdünnter Säure oder Base auf einen pH-Wert von 6 bis 9, vorzugsweise 7 bis 8, eingestellt und zur Abtrennung von Verunreinigungen zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wird mit einem Silicium enthaltenden Adsorptionsmittel, beispielsweise Kieselgel, Kieselgel-Magnesiumsilikat, Diatomeenerde, Quarzglas oder Bentonit, behandelt, und die adsorbierten Bestandteile werden mit einer alkalischen Lösung mit einem pH-Wert von mindestens 9 eluiert. Die zum Eluie-ren verwendete alkalische Lösung ist nicht kritisch. Vorzugsweise wird eine wässrige Lösung von Ammoniak oder Natriumhydroxid in einer Konzentration von 0,3- bis l,5molar verwendet. Das erhaltene Eluat wird auf einen pH-Wert von 7 bis 8 eingestellt und mit einem Neutralsalz, beispielsweise Ammoniumsulfat, bis zu einer Sättigung von 70% versetzt, um die aktive Substanz auszusalzen. Es wird eine das Glykoprotein enthaltende Rohfraktion gewonnen.

Die erhaltene Rohfraktion wird in einer geringen Menge einer alkalischen Lösung gelöst, durch Ultrafiltration von niedermolekularen Substanzen mit einem Molekulargewicht bis höchstens 10 000 befreit und sodann zur Abtrennung der in der Lösung enthaltenen Verunreinigungen mit einem Kationenaustauscher behandelt, beispielsweise mit Carboxyme-thyldextran, Carboxymethylcellulose oder Phosphorcellulo-se. Vor dieser Behandlung mit dem Kationenaustauscher werden sowohl die das Glykoprotein enthaltende Rohfraktion als auch der Ionenaustauscher mit einer vorzugsweise 0,01- bis 0,15molaren Pufferlösung auf einen pH-Wert von 6 bis 8 äquilibriert, damit die Behandlung mit dem Austauscher bei nahezu neutralem pH-Wert durchgeführt werden kann. Der grösste Teil des Glykoproteins wird vom Ionen5

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austauscher nicht adsorbiert. Nach dem Konzentrieren des Eluats wird das Konzentrat mit einer verdünnten Pufferlösung vom pH-Wert 6 bis 8 äquilibriert und in einen Anionenaustauscher, beispielsweise DEAE-Cellulose gegeben, der mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden ist, um das Glykoprotein an dem Anionenaustauscher zu adsorbieren. Hieraus wird das adsorbierte Glykoprotein mittels einer linearen Konzentrationsgradientenlösung einer 0,1- bis 0,3molaren Salzlösung, beispielsweise einer Natriumchloridlösung, eluiert. Das Glykoprotein wird bei einer Salzkonzentration von mindestens 0,lmolar eluiert, jedoch ist eine genaue Abtrennung schwierig. Die Eluatfraktionen bei 0,1- bis 0,3molarer Salzkonzentration werden vereinigt. Erforderlichenfalls wird die vereinigte Fraktion entsalzt und konzentriert. Diese Fraktion wird als Fraktion A bezeichnet. Die Fraktion A kann als solche im erfindungsgemässen Verfahren verwendet werden. Die Glykoproteinfraktion kann auch durch Adsorption an einem Anionenaustauscher und stufenweises Eluieren mit einer 0,1- bis 0,3molaren Salzlösung gereinigt werden, bevor man diese Fraktion der Eluierung mit einem linearen Konzentrationsgradienten unterwirft.

Zur weiteren Reinigung wird die Fraktion A der Gelchromatographie an einem stark vernetzten Polymergel mit einem Wasseraufnahmewert von 10 bis 20 ml/g, beispielsweise Sephadex G-150 oder Biogel P-100, unterworfen. Die aktiven Substanzen werden mit einem 0,05- bis 0,lmolaren Salzpuffer entwickelt und Fraktionen mit einem relativen Ausflusswert von 1,11 bis 1,60, vorzugsweise 1,11 bis 1,45, werden gesammelt, entsalzt und konzentriert oder gefriergetrocknet. Diese Fraktion wird als Fraktion B bezeichnet.

Die auf diese Weise erhaltene Fraktion B kann ebenfalls im erfindungsgemässen Verfahren verwendet werden. Das relative Ausflussvolumen ist das Verhältnis Ve: Vo, wobei Ve das erforderliche Volumen des Lösungsmittels ist, um die Substanz in der Säule zu eluieren, und Vo das Leervolumen der Gelsäule darstellt.

Zur weiteren Reinigung wird das erhaltene Präparat in einer verdünnten Pufferlösung mit einem Salzgehalt von 1,0-bis 2,0molar, beispielsweise einer Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,0 bis 8,0, vorzugsweise 6,0 bis 7,0, gelöst, die 1,0-bis 2,0molar an Natriumchlorid ist. Die Lösung wird der Affinitätschromatographie an einem Zucker-affinen Adsorptionsmittel, beispielsweise Concanavalin A - Sepharose 4 B, unterworfen, das mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert

Spezifische Aktivität =

Die spezifische Aktivität nimmt mit fortschreitender Reinigung zu. Das dem Medium zugesetzte Glykoprotein bzw. die Glykoproteinfraktion kann ein gereinigtes Präparat mit hoher spezifischer Aktivität sein. Vorzugsweise wird ein Präparat mit niedrigerer Aktivität eingesetzt, das während der Reinigung erhalten wird.

Das Glykoprotein (H) wird dem Medium in einer Menge von mindestens 0,1 \ig, vorzugsweise 10 bis 100 jxg/ml Medium zugesetzt, während das Glykoprotein (M) dem Medium in einer Menge von mindestens 500 Einheiten, vorzugsweise mindestens 1000 Einheiten pro ml Medium zugegeben wird.

(4) Gewinnung der aktiven Substanz aus dem Medium

Das CSF enthaltende Medium wird von der Petrischale entfernt und 5 bis 10 Minuten bei 1000 bis 2000 g zentrifugiert. Es wird ein Überstand erhalten, der hochaktives CSF enthält.

Dieser Überstand eignet sich zur Herstellung eines Rea-

worden ist. Das an der Affinitätssäule adsorbierte Glykoprotein wird mit einer verdünnten Pufferlösung vom pH-Wert 6,0 bis 8,0, vorzugsweise 6,0 bis 7,0, eluiert, die 1,0- bis 2,0molar an Salz ist und die 20 bis 100 mMol eines Sac-s charids, beispielsweise a-Methyl-D-glukosid, enthält. Die das Glykoprotein enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, erforderlichenfalls entsalzt und konzentriert oder gefriergetrocknet. Diese Fraktion kann ebenfalls im erfindungsgemässen Verfahren verwendet werden.

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Zur weiteren Reinigung wird die erhaltene Fraktion der präparativen Zonenelektrophorese unterworfen. Als Trägermedium wird beispielsweise ein Polyacrylamidgel oder Agar-gel vom pH-Wert 7,0 bis 9,0 verwendet. Es wird eine hochge-15 reinigte Glykoproteinfraktion aus dem Trägermedium durch Eluieren mit einer kalten verdünnten Salzlösung erhalten. Diese Fraktion wird entsalzt und konzentriert oder gefriergetrocknet. Dieses gereinigte Glykoprotein kann ebenfalls im erfindungsgemässen Verfahren verwendet werden. 20 Das im erfindungsgemässen Verfahren verwendete Glykoprotein, das die Bildung von Mäusegranulozyten und Makrophagen stimuliert, ist ebenfalls in den vorstehend erwähnten Druckschriften beschrieben. Die präparativen Verfahren von Stanley und Metealf, Stanley u. Mitarb. und 25 Laukel u. Mitarb. sind nachstehend in den Beispielen 6, 5 und 7 im einzelnen beschrieben.

Die biologische Aktivität der Glykoproteinpräparate gegenüber Knochenmarkzellen der Maus wird auf die nachstehend beschriebene Weise bestimmt und in Einheiten aus-30 gedrückt. 1 ml McCoy's 5A-Medium, ergänzt mit 20% fötalem Kälberserum, 0,3% Agar und 1 x 105 Knochenmarkzellen von Mäusen des Stammes C 57 B1/6J, wird mit 0,1 ml des zu bestimmenden Glykoproteins bzw. einer Glykoproteinfraktion versetzt. Das auf diese Weise hergestellte, das Gly-35 koprotein enthaltende Medium wird in eine Petrischale aus Kunststoff mit einem Durchmesser von 35 mm gegeben und 7 Tage bei 37 °C an feuchter Luft mit 5% Kohlendioxid inkubiert. Danach wird die Zahl der einzelnen Kolonien, die jeweils mindestens 50 Zellen enthalten, unter dem Mikro-40 skop bestimmt. Die biologische Aktivität einer Probe, die eine Kolonie bildet, entspricht einer Einheit. Zur Bestimmung des Reinigungsgrades einer Glykoproteinprobe wird die spezifische Aktivität nach folgender Gleichung berechnet:

Einheit der Probe

Menge des Glykoproteins oder der Glykoproteinfraktion in mg.

so gens oder eines Bezugsreagens zur Bestimmung der Bildung von Kolonien menschlicher granulopoetischer Stammzellen. Zu diesem Zweck wird die Aktivität des Überstandes derart eingestellt, das 0,1 ml des Überstandes eine CSF-Aktivität aufweist, die zur Bildung von mindestens 100 menschlichen 55 Granulozytenkolonien ausreicht. Die Lösung wird durch ein Membranfilter filtriert, aseptisch in ein Gefass abgefüllt und luftdicht verschlossen. Es wird ein flüssiges Reagens erhalten. Ein Reagens in Pulverform kann durch Gefriertrocknen des erhaltenen sterilen Filtrats unter aseptischen Bedingun-60 gen hergestellt werden.

Für pharmazeutische Zwecke wird das unter Verwendung eines serumfreien Mediums erhaltene konditionierte Medium oder ein durch menschliches Serum ergänztes Medium gegen Wasser dialysiert und durch Membranfiltration 65 sterilisiert. Erforderlichenfalls wird das Filtrat konzentriert, aseptisch in ein Gefass abgefüllt und luftdicht verschlossen. Es wird ein Präparat in flüssiger Form erhalten. Zur Herstellung von Präparaten in Pulverform wird die dialysierte Lö

sung durch Membranfiltration sterilisiert und unter aseptischen Bedingungen gefriergetrocknet.

Zur weiteren Reinigung von CSF für pharmazeutische Zwecke wird der vorstehend erwähnte Überstand in eine hochmolekulare Fraktion (Molekulargewicht oberhalb 5000 oder 10 000) und eine niedermolekulare Fraktion (Molekulargewicht unter 5000 oder 10 000) mittels einer Ultrafiltra-tionsmembran (Molekulargewichtschnitt 5000 oder 10 000) getrennt. Beide Fraktionen enthalten zwar CSF, doch liegen in der hochmolekularen Fraktion mindestens 90% des CSF vor.

Ein pharmazeutisches Präparat kann durch Konzentrieren der niedermolekularen Fraktion unter vermindertem Druck hergestellt werden. Das Konzentrat der hochmolekularen Fraktion wird in einer 0,01- bis 0,lmolaren Pufferlösung vom pH-Wert 6,0 bis 8,0 gelöst und mit einem Anio-nenaustauscherharz, beispielsweise DEAE-Cellulose, DEAE-Sephadex oder QAE-Sephadex behandelt, die mit dieser Pufferlösung äquilibriert worden sind. Das CSF wird am Austauscherharz adsorbiert und sodann mit einer 0,1-bis 0,3molaren Pufferlösung vom pH-Wert 6,0 bis 8,0 eluiert. Es wird ein gereinigtes Produkt erhalten.

Das erhaltene Eluat kann durch Konzentrieren und anschliessende Molekularsieb-Chromatographie durch Gelfiltration weiter gereinigt werden. Als Gel für die Gelfiltration kommen beispielsweise Sephadex G-150, Biogel P-100 und Ultragel AcA-44 in Frage.

Bei der Herstellung von CSF in einem serumfreien Medium kann die Behandlung mit einem Anionenaustauscher-harz entfallen, und die Reinigung erfolgt unmittelbar durch Gelchromatographie. Eine geeignete Entwickler-Pufferlösung bei der Gelchromatographie ist eine 0,01- bis 0,3molare Pufferlösung vom pH-Wert 6,0 bis 8,0. Die bei der Gelfiltration erhaltenen CSF-aktiven Fraktionen werden vereinigt und konzentriert, entsalzt und gefriergetrocknet. Es wird ein gereinigtes CSF-Präparat erhalten.

Die auf die vorstehend beschriebene Weise erhaltenen gereinigten CSF-Präparate werden durch Immunelektrophoro-se unter Verwendung von menschlichem Antiserum und Rinderantiserum auf verunreinigende Proteine untersucht. Spuren an menschlichen Globulin-ähnlichen Proteinen und Serumalbumin und Globulin-ähnlichen Proteinen, die vermutlich aus dem fetalem Kälberserum stammen, werden in CSF-Präparaten gefunden, die aus einem durch fetales Kälberserum ergänztem Medium stammen. Da praktisch keine derartigen Eiweisskörper in CSF-Präparaten feststellbar sind, die in dem serumfreien Medium hergestellt wurden, können diese Präparate unmittelbar als Arzneistoffe verwendet werden, da sie keine Nebenwirkungen verursachen.

Zur Injektion können die flüssigen Präparate als solche verwendet werden, während die pulverförmigen Präparate in sterilem pyrogenfreiem Wasser, steriler physiologischer Kochsalzlösung oder ähnlichen Lösungen zunächst gelöst werden müssen. Diese Präparate können Patienten zur Behandlung von Granulozytopenie gegeben werden. Die Tagesdosis beträgt normalerweise mindestens 77,8 mg/kg Körpergewicht.

Versuchsbeispiel 1 Bestimmung der Inkubationszeit

(1) Isolierung von Monozyten und Makrophagen und Herstellung des Glykoproteins Monozyten und Makrophagen werden auf die nachstehend in Beispiel 1 (1) beschriebene Weise isoliert. Die bei

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dem Experiment verwendeten Glykoproteine werden auf die nachstehend in Beispiel 1 (2) und Beispiel 5 (2) beschriebene Weise hergestellt. Das gemäss Beispiel 1 (2) hergestellte Glykoprotein (H) war ein stark gereinigtes Produkt der letzten Reinigungsstufe, während das gemäss Beispiel 5 (2) hergestellte Glykoprotein (M) ein Produkt von Standardreinheit (spezifische Aktivität 180 000) war.

(2) Inkubation der Monozyten und Makrophagen

Zwei Medien mit jeweils 100 |xg/ml Glykoprotein (H) und 2 glykoproteinfreie Medien werden hergestellt. Für die Medien wird serumfreies McCoy's 5A-Medium sowie ergänztes McCoy's 5A-Medium mit 20% fetalem Kälberserum verwendet.

Jede Petrischale, die am Boden haftende Monozyten und Makrophagen enthält, wird mit jeweils einem der vier genannten Medien in einer Menge von 106 Monozyten und Makrophagen pro ml Medium versetzt. Jedes Medium wird in gleicher Weise wie in Beispiel 1 (3) inkubiert. Vor der Inkubation sowie nach Inkubationszeiten von 1, 3, 5 und 7 Tagen werden vorbestimmte Volumina des Mediums jeder Petrischale entnommen.

Das vorstehend beschriebene Verfahren wird wiederholt, jedoch wird das Glykoprotein (M) in einer Menge von 1000 Einheiten/ml Medium anstelle des Glykoproteins (H) verwendet.

(3) Bestimmung von CSF im konditioniertem Medium

Die CSF-Aktivität jedes konditionierten Mediums wird anhand der Bildung von Kolonien menschlicher Knochenmarkzellen bestimmt. Das Knochenmark wird vom Brustbein (Sternum) einer gesunden Versuchsperson mittels einer heparinisierten Spritze nach Sternumpunktur entnommen. Sodann wird das entnommene Knochenmark 10 Minuten bei 1000 g zentrifugiert, um das buffy coat zu isolieren. Das buffy coat wird mit McCoy's 5A-Medium gewaschen, in McCoy's 5A-Medium, das 20% Serum enthält, suspendiert, in einer Petrischale ausgebreitet und mit mehreren mg/ml Medium pulverisiertem und sterilisiertem Carbonyleisen versetzt. Danach wird die Petrischale 1 bis 2 Stunden bei 37 °C in einen Inkubator eingestellt. Danach werden die phagozytischen Zellen, die die Carbonyleisenteilchen phagozytierten, am Boden der Petrischale mittels eines Magneten fixiert und die überstehende Zellsuspension wird isoliert. Die suspendierten Zellen sind nichtanhaftende, nichtphagozytierende Knochenmarkzellen, die zur Bestimmung der CSF-Aktivität benutzt werden. Diese Knochenmarkzellen werden durch Zentrifugieren gewaschen und in einem kleinen Volumen des Mediums suspendiert. Die Zahl der kernhaltigen Zellen in der Suspension wird nach Behandlung mit Essigsäure-Gen-tianaviolett-Farbstoff gezählt.

Die nichtanhaftenden, nichtphagozytierenden kernhaltigen Zellen werden in McCoy's 5A-Medium übertragen, das 0,3% Agar und 20% fetales Kälberserum enthält. Die Einsaatdichte beträgt 2 x 10s Zellen pro ml Medium. Nach Zugabe des konditionierten Mediums in einer Menge von 0,1 ml/ml Medium wird das beimpfte Medium 10 Tage bei 37 °C an feuchter, 5% Kohlendioxid enthaltender Luft inkubiert. Nach der Inkubation wird die Zahl der Kolonien unter den entstandenen Zellaggregaten unter einem Mikroskop gezählt. Der Ausdruck Kolonie bedeutet hier ein Zellaggregat, das mindestens 40 Zellen enthält. Die CSF-Aktivität wird ausgedrückt durch die Anzahl der Kolonien. Sie ist ein Mass für die Bildung von CSF. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefasst.

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Tabelle I

Ziichtungs- CSF-Aktivität (Zahl der Kolonien) pro 0,1 ml konditioniertes Medium bedingungen Medium mit 20% fetalem Kälberserum serumfreies Medium

Inkubationsdauer, mit ohne mit ohne

Tage Glykoprotein Glykoprotein Glykoprotein Glykoprotein

Glykoprotein (H)

vor der Inkubation 0

1 13 + 3

3 116+4

5 117+3

7 98 + 1

0

3 + 1 24+3 23 + 1 16+4

0

2+1 25+2 20+1 18 + 1

0

1 + 1 0

0

Glykoprotein (M)

vor der Inkubation 0

1 20+8

3 89 + 6

5 86+3

7 69+4

0

6+4 29 + 8 30+4 16+2

0 0

35+4 30+6 23+4

0 0

3+1 4+1 2+1

Aus Tabelle I ist ersichtlich, dass durch Zusatz des Glykoproteins die CSF-Bildung am dritten Tag der Inkubation ihr Maximum erreicht. Bei dem 20% fetales Kälberserum enthaltenden Medium ist die CSF-Bildung deutlich höher in Gegenwart des Glykoproteins als in Abwesenheit des Glykoproteins (übliches Verfahren). Im serumfreien Medium wird CSF nach Zusatz des Glykoproteins gebildet, während CSF in Abwesenheit des Glykoproteins kaum entsteht.

Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, dass bei der Herstellung von CSF durch Züchtung und Vermehrung von Monozyten und Makrophagen in vitro die Glykoproteine die Bildung von CSF stimulieren, unabhängig davon, ob das Medium Serum enthält. Es wurde ferner festgestellt, dass die Inkubationsdauer 3 bis 7 Tage, vorzugsweise 3 Tage beträgt. Wenn keine Monozyten und Makrophagen eingeimpft werden, kann keine CSF-Aktivität im konditionierten Medium beobachtet werden, unabhängig davon, ob das Glucoprotein vorliegt.

Versuchsbeispiel 2 Versuche mit unterschiedlichen Mengen Glykoprotein Durch Zusatz der Glykoproteine (H) und (M) wie im 25 Versuchsbeispiel 1 zu McCoy's 5A-Medium, ergänzt mit 20% fetalem Kälberserum sowie serumfreien McCoy's 5A-Medium werden Medien hergestellt. Im Fall des Glykoproteins (H) werden 0,1,1,0,10,0 bzw. 100 ng/ml Medium zugegeben. Im Fall des Glykoproteins (M) werden 100, 500, 30 1000 bzw. 2000 Einheiten/ml Medium zugegeben. Jedes Medium wird schliesslich in die Petrischale gegeben, die an ihrem Boden anhaftende Monozyten und Makrophagen enthält. Sodann werden die Petrischalen 3 Tage in gleicherweise wie in Versuchsbeispiel 1 inkubiert. Die CSF-Aktivität je-35 des konditionierten Mediums wird wie im Versuchsbeispiel 1 bestimmt, um die CSF-Bildung festzustellen. Zum Vergleich werden Proben verwendet, die durch Inkubieren jedes Mediums ohne Zusatz von Glykoprotein erhalten wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefasst.

Tabellen zugesetztes CSF-Aktivität (Zahl der Kolonien) pro

Glykoprotein 0,1 ml konditioniertes Medium

Medium mit 20% feta- serumFreies lem Kälberserum Medium

Glykoprotein (H)

(Hg/ml)

0 (Vergleich) 24 + 3 1 + 1

0,1 51+2 9+1

1,0 116+4 25 + 2

10,0 166+10 53 + 3

100,0 170 ± 8 80+4

Glykoprotein (M)

(Einheiten/ml)

0 (Vergleich) 21+6 2+1

100 28 + 3 6+3

500 96+10 13 +6

1000 129+8 49±6

2000 170 + 6 85 + 8

Aus Tabelle II ist ersichtlich, dass mit zunehmenden Mengen an Glykoprotein die CSF-Bildung ansteigt. Aus diesen Ergebnissen sowie den in Tabelle I mitgeteilten Ergebnissen (nach dreitägiger Inkubation) ist ersichtlich, dass die

65 CSF-Bildung durch die Gegenwart von 0,1 (ig Glykoprotein (H) oder 500 Einheiten Glykoprotein (M) pro 1 ml Medium deutlich erhöht ist. Im erfindungsgemässen Verfahren beträgt daher die Menge des zugesetzten Glykoproteins pro

1 ml Medium mindestens 0,1 (ig, vorzugsweise 10 bis 100 (ig bei Verwendung von Glykoprotein (H) und mindestens 500 Einheiten, vorzugsweise mindestens 1000 Einheiten Glykoprotein (M).

Versuchsbeispiel 3 Versuche mit unterschiedlicher Einsaatdichte an Monozyten und Makrophagen Das Versuchsbeispiel 1 wird wiederholt. Es wird eine Reihe von konditionierten Medien erhalten, jedoch beträgt die Einsaatdichte an Monozyten und Makrophagen 0,103, IO4, IO5 bzw. 106/ml. 1 ng Glykoprotein (H) bzw. 500 Einheiten Glykoprotein (M) werden zu 1 ml McCoy's 5A-Medium gegeben, das mit 20% fetalem Kälberserum ergänzt ist, bzw. zu 1 ml serumfreiem McCoy's 5A-Medium. Die Inkubationsdauer beträgt 3 Tage. Die erhaltenen konditionierten Medien werden auf CSF-Aktivität untersucht, um die Bildung von CSF in gleicher Weise wie im Versuchsbeispiel 1 zu bestimmen. Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle III zusammengefasst.

Tabelle III

Einsaatdichte CSF-Aktivität (Zahl der Kolonien) pro

0,1 ml konditioniertes Medium

Medium mit 20% feta- serumfreies lem Kälberserum Medium

Medium mit Glykoprotein (H)

0 0 0

103 13 + 1 0

104 20 + 2 6+1

105 116 + 4 25 + 2

106 185+7 69 + 5

Medium mit Glykoprotein (M)

0 0 0

103 19 + 6 0

104 29+10 8+4

105 98±6 31 + 3

106 169 ± 9 74 + 2

Aus Tabelle III ist ersichtlich, dass in jedem Fall grosse Mengen CSF gebildet werden, wenn die Einsaatdichte mindestens 105 Zellen/ml beträgt. Im erfindungsgemässen Verfahren beträgt daher die Einsaatdichte mindestens 10s Monozyten und Makrophagen pro 1 ml Medium.

Versuchsbeispiel 4 CSF-Produktion in verschiedenen Medien Hinsichtlich der CSF-Produktion werden vier verschiedene handelsübliche Gewebekulturmedien oder Zellkulturmedien miteinander verglichen. Als Medien werden McCoy's 5A-Medium, Nährgemisch HAMF-10, RPMI-1640 und Eagle's MEM Medium ergänzt mit Aminosäuren verwendet. Jedes dieser Medien, die nicht durch Serum ergänzt sind, wird mit 1,0 (ig/ml Glykoprotein (H) bzw. 500 Einheiten/ml Glykoprotein (M) versetzt. Die erhaltenen Medien werden 3 Tage in gleicher Weise wie in Versuchsbeispiel 1 inkubiert. Hierauf werden die, erhaltenen konditionierten Medien in gleicher Weise wie in Versuchsbeispiel 1 auf CSF-Bildung untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefasst.

644 520

Tabelle IV

Medium CSF-Aktivität (Zahl der Kolonien) pro

0,1 ml konditioniertes Medium mit Glyko- mit Glyko protein (H) protein (M)

McCoy's 5 A 69 + 5 83+6

HAMF-10 71+3 76 + 8

RPMI-1640 75 + 3 81 + 1

MEM 48+1 46+5

Aus Tabelle IV ist ersichtlich, dass sämtliche vier Medien für das erfindungsgemässe Verfahren geeignet sind. Die CSF-Bildung ist im MEM Medium etwas niedriger als in den anderen Medien.

Versuchsbeispiel 5 Versuche mit Medium mit unterschiedlichen Mengen Serum

Auf die gleiche Weise wie in Versuchsbeispiel 1 werden konditionierte Medien hergestellt, McCoy's 5A-Medium wird mit 0, 5,10,20 oder 30% menschlichem Serum oder fetalem Kälberserum versetzt. Beide Seren werden 30 Minuten auf 58 °C erhitzt. Sodann werden 1 ng/ml Medium des Glykoproteins (H) bzw. 500 Einheiten/ml Medium Glykoprotein (M) zugesetzt. Die Einsaatdichte der Monozyten und Makrophagen in jedes Medium beträgt 105/ml und die Inkubationsdauer 3 Tage. Die erhaltenen konditionierten Medien werden auf CSF-Aktivität in gleicher Weise wie in Versuchsbeispiel 1 untersucht, um die Bildung von CSF zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengefasst.

Tabelle V

Zugesetztes Serum CSF-Aktivität (Zahl der Kolonien) pro

(%) 0,1 ml konditioniertes Medium mit menschlichem mit fetalem

Serum Serum

Medium mit

Glykoprotein (H)

0 25 + 2 25 + 2

5 55± I 43± 1

10 120 + 5 98 + 3

20 150 + 3 116 + 4

30 141+2 108+2

Medium mit Glykoprotein (M)

0 21 + 8 21 + 8

5 49 + 6 51+4

10 109 + 5 89 + 2

20 124 + 7 102 + 6

30 123 + 8 92 + 5

Aus Tabelle V ist ersichtlich, dass mit zunehmender Menge an Serum die Bildung von CSF ansteigt. Erfindungs-gemäss kann CSF in einem serumfreien Medium gebildet werden, doch kann das Medium mit Rinderserum oder fetalem Kälberserum versetzt werden, um grössere Mengen CSF für diagnostische Zwecke herzustellen. Die wirksame Menge an zugesetztem Serum beträgt mindestens 5%, vorzugsweise mindestens 10%.

7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

644 520

Versuchsbeispiel 6 Versuche mit einer Glykoprotein-Fraktion und einer hochgereinigten Fraktion In den Versuchsbeispielen 1 bis 5 wird gereinigtes Glykoprotein als aktive Substanz mit einer stimulierenden Wirkung bei der Bildung menschlicher Granulozyten (Fall I) und anderseits Glykoprotein von Standardreinheit (spezifische Aktivität 180 000) als aktive Substanz mit stimulierender Wirkung bei der Bildung von Mäusemakrophagen und Granulozyten (Fall II) verwendet. Im vorliegenden Versuchsbeispiel soll gezeigt werden, dass im erfindungsgemässen Verfahren ein halbgereinigtes Präparat anstelle des gereinigten Glykoproteins im Fall I und eine weniger gereinigte Fraktion sowie ein hochgereinigtes Präparat anstelle des Glykoproteins von Standardreinheit im Fall II verwendet werden kann.

Die verwendeten glykoproteinhaltigen Fraktionen entsprechend Fall I sind die Fraktionen A und B, deren Herstellung nachstehend in Beispiel 1 beschrieben ist. Diese Fraktionen werden zu serumfreiem McCoy's 5A-Medium in Mengen von 0,0,5,1,0, 5,0 bzw. 10 mg/ml entsprechend 0, 8,3,16,6, 83,3 bzw. 166,6 jxg/ml Medium ausgedrückt als aktives Glykoprotein in der Fraktion und in Mengen von 0, 41,7, 83,4,417 und 834 |ig/ml Medium ausgedrückt als aktives Glykoprotein in der Fraktion B zugesetzt. Die Einsaatdichte an Monozyten und Makrophagen in jedes Medium beträgt 105/ml und die Inkubationsdauer 3 Tage. Es werden konditionierte Medien durch Inkubieren unter sonst gleichen Bedingungen wie im Versuchsbeispiel 1 erhalten.

Da die Fraktionen A und B menschliches Serumalbumin enthalten, das im Urin vorliegt, werden Vergleichsproben 5 durch Zusatz von menschlichem Serumalbumin zu McCoy's 5A-Medium in einer Menge entsprechend der Menge zugesetzt, die auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellten Medien enthalten ist. Die Inkubationsbedingungen sind die gleichen, wie sie vorstehend beschrieben sind.

io Jedes konditionierte Medium wird auf CSF-Aktivität in gleicher Weise wie im Versuchsbeispiel 1 untersucht, um die Bildung von CSF nachzuweisen. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengefasst.

Wie im Fall II ist das Glykoproteinpräparat im vor-15 liegenden Versuchsbeispiel die Fraktion C (spezifische Aktivität 21 000), die Fraktion D (spezifische Aktivität 54 000) sowie das hochgereinigte Präparat (spezifische Aktivität 1 240 000), dessen Herstellung in Beispiel 5 beschrieben ist. Die konditionierten Medien werden auf die vorstehend im 20 Zusammenhang mit Fall I beschriebene Weise hergestellt, jedoch werden die Fraktionen C und D sowie das hochgereinigte Präparat (vgl. Beispiel 5) den Medien jeweils in Mengen von 0,100,500,1000 und 2000 Einheiten/ml Medium anstelle der beschriebenen Mengen der Fraktionen A 25 und B (vgl. Beispiel 1) zugesetzt. Die Vergleichsversuche mit menschlichem Serumalbumin entfallen. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengefasst.

Tabelle VI

Zugesetzte Menge Glykoprotein von Beispiel 1 (mg/ml)

CSF-Aktivität (Zahl der Kolonien) pro 0,1 ml konditioniertes Medium Fraktion A Fraktion B Vergleich

0

0,5

60+1

59 + 1

4±1

1,0

121 + 1

114+1

6+2

5,0

170+3

103 + 3

14+2

10,0

148+2

98+4

26+1

Glykoprotein von Beispiel 5

Hochgereinig

(Einheiten/ml)

Fraktion C

Fraktion D

tes Präparat

0

2± 1

2+1

100

8 + 2

10+4

5+2

500

36 + 6

37 + 4

10+3

1000

74 + 5

66 + 5

21+4

2000

122 + 8

113 + 6

44+9

Einfluss des Reinheitsgrades des Glykoproteins mit stimulierender Wirkung auf die Bildung menschlicher Granulozyten.

Die CSF-Bildung in einem Medium, dem die Fraktion A oder B zugesetzt wird, ist höher als im Vergleichsmedium. Dies zeigt, dass das Glykoprotein die CSF-Bildung anregt. Im Vergleich mit dem in Tabelle II gezeigten Beispiel, bei dem 10[xg/ml Glykoprotein dem serumfreien Medium zugesetzt wurden, ist in dem in Tabelle VI gezeigten Beispiel die CSF-Bildung höher. In diesem Beispiel wurden 0,5 mg/ml der Fraktion A (8,3 jig/ml Glykoprotein) zugesetzt. Dies ist eine geringe Menge Glykoprotein. Dies scheint auf dem Einfluss von Serumalbumin und anderen unbekannten Bestandteilen des menschlichen Urins zu beruhen, die der Fraktion A vorliegen.

Wenn man das Medium mit zugesetzter Fraktion A mit dem Medium mit zugesetzter Fraktion B hinsichtlich der CSF-Bildung vergleicht, ist ersichtlich, dass bei einer zugesetzten Menge von 0,5 oder 1,0 mg/ml beide Fraktionen etwa vergleichbar sind, dass jedoch bei höheren Konzentrationen der Fraktion B die CSF-Bildung niedriger ist. Dies 55 beruht vermutlich darauf, dass der Gehalt an menschlichem Serumalbumin aus Urin in der Fraktion A grösser ist als in der Fraktion B und der Zusatz der Fraktion B in Mengen von mehr als 5 mg/ml eine zu starke Zugabe von Glykoprotein bewirkt. Unter Berücksichtigung aller dieser Ergeb-60 nisse bestehen Gründe zu der Annahme, dass unter das Serumalbumin, das im menschlichen Urin enthalten ist, und das Glykoprotein eine synergistische Wirkung bei der Bildung von CSF ausüben, und dass eine maximale CSF-Bildung erhalten wird, wenn das Medium mit etwa 100 (ig/ml 65 Glykoprotein versetzt wird.

Bei Verwendung des Glykoproteins mit stimulierender Wirkung bei der Bildung von Mäusemakrophagen und Granulozyten (Fall II) ist aus Tabelle VI folgendes ersichtlich:

9

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Die CSF-Bildung nimmt etwa proportional der Menge an dem Medium zugesetztem Glykoprotein zu. Im Vergleich mit den in Tabelle II gezeigten Ergebnissen unter Verwendung eines serumfreien Mediums ist die CSF-Bildung im vorliegenden Versuch höher, wenn die Fraktion C oder D verwendet wird, obwohl die Menge des dem Medium zugesetzten Glykoproteins die gleiche ist wie im vorhergehenden Fall. Dies beruht anscheinend auf dem Einfluss unter anderem des Serumalbumins, das in den Fraktionen C und D enthalten ist, die aus menschlichem Urin stammen. Aus den Ergebnissen, die bei Verwendung von hochgereinigtem Glykoprotein erhalten werden, ist ersichtlich, dass zwar die CSF-Produktion mit zunehmender Menge an Glykoprotein ansteigt, der Anstieg jedoch geringer ist als bei Verwendung der Fraktionen C und B und dem Präparat von Standardreinheit (Tabelle II). Aus den vorstehenden Ergebnissen kann man schliessen, dass in serumfreien Medien das Serumalbumin und andere Substanzen aus menschlichem Urin die gleiche Rolle spielen, wie das Serum im Hinblick auf die CSF-Produktion.

In jedem Falle ist es deshalb im erfindungsgemässen Verfahren vorteilhaft, dem Medium ein rohes Glykoprotein anstelle eines gereinigten Glykoproteins zuzusetzen. Bei Verwendung eines rohen Glykoproteinpräparats wird es in einer Menge von mindestens 0,1 (xg/ml Medium im Fall I oder in einer Menge von mindestens 500 Einheiten/ml Medium im Fall II eingesetzt.

Versuchsbeispiel 7 Bestimmung der wirksamen Dosis und der akuten Toxizität von CSF Die wirksame Dosis und die akute Toxizität (LD50) des erfindungsgemäss hergestellten CSF werden an Tieren fol-gendermassen bestimmt.

Ein gemäss Beispiel 3 hergestelltes konditioniertes Medium wird durch Membranfiltration sterilisiert und sodann durch eine Ultrafiltrationsmembran (molekulare Trenngrenze: 10 000) filtriert, hierauf konzentriert, entsalzt und gefriergetrocknet. Es wird CSF in Pulverform erhalten. Nach der im Versuchsbeispiel 1 beschriebenen Bestimmungsmethode s beträgt die Zahl der Koloniebildung bei menschlichen Knochenmarkzellen 4500/mg. Zum Vergleich wird der Versuch mit Knochenmarkzellen von Mäusen des Stammes C3H/He wiederholt. Die Zahl der Koloniebildung mit Knochenmarkzellen der Maus beträgt 7000/mg.

io 80 sechs Wochen alte männliche Mäuse des Stammes C3H/He mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 20 g werden willkürlich in 16 Untergruppen von jeweils 5 Tieren unterteilt. Die Untergruppen werden willkürlich zusammengestellt, und es werden vier Gruppen von jeweils vier i5 Untergruppen gebildet.

Das auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellte CSF wird in steriler physiologischer Kochsalzlösung gelöst. Es werden drei Lösungen mit 1 mg/0,1 ml (für die Gruppe I), 2 mg/0,1 ml (für die Gruppe II) und 4 mg/0,1 ml (für die 20 Gruppe III) hergestellt. Die Mäuse werden subkutan mit der Lösung in einer Tagesdosis von 0,1 ml/Maus an fünf aufeinanderfolgenden Tagen gespritzt. Nach 1, 3, 7 und 11 Tagen nach Beginn der Verabreichung werden Blutproben aus fünf Mäusen einer Untergruppe jeder Gruppe entnommen (die 25 Untergruppen, denen Blut entnommen wurde, wurden für den weiteren Versuch nicht mehr verwendet). Die Zahl der Leukozyten in den periphären Blutgefässen wird mittels eines automatischen Blutzellenzählgerätes bestimmt. Die Zahl der Granulozyten wird unter dem Mikroskop nach Wright-30 Giemsa-Färbung gezählt, um die Zunahme der Zahl der Leukozyten und Granulozyten nach CSF-Gabe zu bestimmen. Eine Gruppe (Gruppe I), der 0,1 ml sterile physiologische Kochsalzlösung ohne CSF gegeben wurde, wird in gleicher Weise wie vorstehend beschrieben behandelt und als 35 Kontrollgruppe verwendet. Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle VII zusammengefasst.

Tabelle VII

Gruppe Nr.

I (Vergleich

II

III

IV

Versuchsdauer,

Leuko

Granulo

Leuko

Granulo

Leuko

Granulo

Leuko

Granulo

Tage zyten zyten zyten zyten zyten zyten zyten zyten

1

55 + 20

14 + 7

53 + 4

13 + 8

51+5

16+4

59 + 8

20 + 5

3

59 + 7

12 + 8

63+9

18+4

98+10

40+10

123 + 6

60 + 8

7

41+8

12 + 4

74+8

28 + 6

140 + 8

60+9

201 + 5

102+14

11

58 + 8

15 + 6

102 + 9

45+10

185+14

75 + 13

260 + 19

121+21

Anmerkung: 1. Die Zahlenwerte bedeuten die Zahl der Blutzellen pro 1 mm3 Blut x 10 2.

2. Die angegebenen Werte sind die Durchschnittswerte von jeweils 5 Mäusen.

Im Vergleich zur Kontrollgruppe I zeigt die Gruppe II nach CSF-Gabe eine nahezu zweifache Zunahme der Zahl der Leukozyten und eine nahezu dreifache Zunahme der Zahl der Granulozyten 11 Tage nach Versuchsbeginn (6 Tage nach Beendigung der Gabe). Im Vergleich mit der Gruppe I zeigt die Gruppe IV eine etwa 4,5fache Zunahme der Zahl der Leukozyten und eine etwa 8fache Zunahme der Zahl der Granulozyten. Aus den vorstehenden Ergebnissen ist ersichtlich, dass die wirksame Tagesdosis bei Mäusen etwa 50 mg/kg Körpergewicht beträgt. Da die koloniebildende Aktivität des verwendeten CSF in im vorstehend beschriebenen Versuch um einen Faktor von 1,556 höher ist im Falle von Knochenmarkzellen der Maus als im Falle von menschlichen Knochenmarkzellen entspricht die wirksame Dosis bei einem Patienten mit Granulozytopenie, die bei menschlichen Knochenmarkzellen eine Wirkung zeigt, die dem Effekt bei Mäusen entspricht, etwa einer Tagesdosis von 77,8 mg/kg Körpergewicht. Die akute Toxizität wird 55 unter Verwendung des gleichen CSF untersucht, wie in dem vorstehend beschriebenen Test zur Bestimmung der Dosis und an Mäusen des gleichen Stammes (6 bis 8 Wochen alt, durchschnittliches Körpergewicht 20,4 g). Es werden keine Todesfälle beobachtet bei einer Versuchsgruppe von 5 6o männlichen und 5 weiblichen Mäusen, denen 4,0 g CSF/kg Körpergewicht gegeben wurden. Dementsprechend ist die akute Toxizität so gering, dass sie nach dem vorstehend beschriebenen Versuch nicht bestimmt werden kann.

65 Beispiel 1

(1) Isolierung von Monozyten und Makrophagen

200 ml Blut aus peripheren Gefassen von gesunden Versuchspersonen werden in einem Gefass aufgefangen, das

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10

1000 Einheiten Heparin enthält. E|er Inhalt des Gefässes wird durch vorsichtiges Bewegen vermischt. Hierauf wird das heparinisierte Blut in einen sterilen Glaszylinder mit einem Durchmesser von 20 mm und einem Fassungsvermögen von 200 ml verbracht und 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wird die obere, die Leukozyten enthaltende Schicht vorsichtig mit abpipettiert, mit serumfreiem McCoy's 5A-Medium auf das Doppelte des ursprünglichen Volumens verdünnt und 15 Minuten bei 1500 g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen. Die sedimentierten Leukozyten werden in 20 ml McCoy's 5A-Medium suspendiert und die Suspension wird über eine Natriummetrizoatlösung (Dichte 1,077) in einem Zentrifugenrohr beschichtet und 30 Minuten bei 400 g zentrifugiert. Die weisse Schicht, die Monozyten, Makrophagen und Lymphozyten am Boden der oberen Schicht enthält, wird mit einer Pipette aufgenommen, mit McCoy's 5A-Medium gewaschen und 10 Minuten bei 1500 g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen. Diese Behandlung wird noch zweimal wiederholt. Die auf diese Weise erhaltenen Zellen werden in 20 ml McCoy's 5A-Medium suspendiert. Ein Teil wird zur Zählung der Zellen mit einem automatischen Blutzellenzählgerät verwendet. Es wird ein Ausstrich der Suspension hergestellt, mit Wright-Giemsa-Farbstoff gefärbt, und die Zahl der Lymphozyten sowie die Zahl der Monozyten und Makrophagen wird morphologisch bestimmt, um das Zellenverhältnis festzustellen. Der Anteil der Monozyten und Makrophagen beträgt 25,5%.

Jeweils 5 ml der erhaltenen Suspension werden in vier Petrischalen mit einem Durchmesser von 15 cm gegeben. Sodann werden 30 ml McCoy's 5A-Medium zugesetzt, das mit 10% fetalem Kälberserum ergänzt ist. Danach werden die Petrischalen 2 Stunden bei 37 °C an feuchter Luft mit 5% Kohlendioxid stehengelassen. Hierauf wird das Medium abgegossen, und es werden 30 ml McCoy's 5A-Medium zugesetzt. Nach ziemlich kräftigem Schütteln wird das Medium zur Abtrennung der Lymphozyten verworfen. Der Anteil der verbleibenden Monozyten und Makrophagen wird auf die vorstehend beschriebene Weise bestimmt. In jeder Petrischale beträgt der Anteil 95%.

(2) Herstellung des Glykoproteins

Das Glykoprotein wird nach der JP-OS 140 707/79 und der entsprechenden DE-OS 2 910 745 hergestellt.

400 Liter frischer Urin von gesunden Versuchspersonen werden mit lOprozentiger Natronlauge auf einen pH-Wert von 8 eingestellt und bei 0 °C und 15 000 g zentrifugiert. Unlösliche Substanzen werden sedimentiert. Der Überstand wird mit lOprozentiger Salzsäure auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und auf eine Säule mit den Abmessungen 10 x 80 cm gegeben, die mit Kieselgel gefüllt ist. Die am Kieselgel adsorbierten Bestandteile werden mit 40 Liter 5prozentiger wässriger Ammoniaklösung eluiert. Das erhaltene Eluat wird mit In Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt, mit pulverisiertem Ammoniumsulfat bis zu 70prozentiger Sättigung versetzt und 15 bis 18 Stunden bei 0 C stehengelassen. Sodann wird die entstandene Fällung abfiltriert.

Die erhaltene Fällung wird in 2 Liter 5prozentiger wässriger Ammoniaklösung gelöst, in einen Dialyseschlauch gegeben und gegen 0,05molare Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,5 gründlich dialysiert. Danach wird die dialysierte Lösung, d.h. das Retentat, mit der genannten Pufferlösung auf 10 Liter aufgefüllt und auf eine Säule mit den Abmessungen 40 x 40 cm gegeben, die mit CM-Sephadex C-50 Ionenaustauscher gefüllt ist. Dieser Austauscher ist vorher mit 0,05molarer Phosphatpufferlösung äquilibriert worden. Die

Verunreinigungen werden durch Adsorption am Ionenaustauscher entfernt. Das Eluat wird gesammelt.

10 Liter des erhaltenen Eluats werden unter Verwendung eines «Diaflow» Hohlfaser-Konzentrators (Typ DC-30) 5 konzentriert. Das Konzentrat wird sodann 15 bis 18 Stunden bei 5 °C gegen eine 0,lmolare tris-HCI-Pufferiösung vom pH-Wert 7,0 dialysiert. Die dialysierte Lösung, d.h. das Retentat, wird mit der gleichen Pufferlösung auf 1 Liter aufgefüllt und auf eine Säule mit den Abmessungen 4,0 x 40 cm io gegeben, die mit DEAE-Cellulose gefüllt ist. Diese Cellulose ist vorher mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden. Nach dem Waschen mit 0,lmolarer cis-HCl-Pufferlösung werden die adsorbierten Bestandteile mit 0,1 molarer tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 eluiert, die 0,3molar an i5 Natriumchlorid ist. Das erhaltene Eluat wird gegen 0,1 molare tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 dialysiert.

Die erhaltene dialysierte Lösung wird erneut auf eine Säule mit den Abmessungen 4,0 x 40 cm gegeben, die mit 20 DEAE-Cellulose gefüllt ist, die vorher mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. Sodann wird die Säule mit einer linearen Konzentrationsgradientenlösung von Natriumchlorid (Chloridionenkonzentrationsgradient 0,1- bis 0,3molar) eluiert. Es werden die Fraktionen aufgefangen, die 25 bei Chloridionen Konzentrationen von 0,15- bis 0,25molar eluiert werden. Die Fraktionen werden vereinigt und mit pulverisiertem Ammoniumsulfat bis zu 70prozentiger Sättigung versetzt. Die entstandene Fällung wird abfiltriert, in einer kleinen Menge 0,lmolarer tris-HCl-Pufferlösung vom 30 pH-Wert 7,0 gelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert. Die erhaltene dialysierte Lösung wird als Fraktion A bezeichnet.

20 ml der erhaltenen dialysierten Lösung werden an einer mit Sephadex G-150 gefüllten Säule mit den Abmessungen 35 4,0 x 60 cm entwickelt. Die Säule ist vorher mit 0,lmolarer tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden. Die Fraktionen, die einem relativen Ausflusswert von 1,11 bis 1,45 entsprechen, werden aufgefangen. Die Fraktionen werden vereinigt und gegen destilliertes Wasser gründlich 40 dialysiert. Die erhaltene dialysierte Lösung wird gefriergetrocknet. Es werden etwa 500 mg eines Pulvers erhalten, das als Fraktion B bezeichnet wird.

200 mg des erhaltenen Pulvers werden in einer 0,02molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,0 gelöst, 45 die l,0molar an Natriumchlorid ist. Die Lösung wird auf eine 100 ml fassende Säule gegeben, die mit Konkanavalin A-Sepharose 4 B gefüllt, und die vorher mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. Die Säule wird gründlich mit einer 0,02molaren Phosphatpufferlösung vom pH-50 Wert 7,0 gewaschen, die l,0molar an Natriumchlorid ist. Sodann wird die Säule mit einer 0,02molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,0 eluiert, die 50millimolar an a-Me-thyl-D-glukosid und l,0molar an Natriumchlorid ist. Das Eluat wird gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die dialy-55 sierte Lösung wird sodann gefriergetrocknet.

Etwa 50 mg des erhaltenen gefriergetrockneten Pulvers werden in 1 ml einer 0,125molaren tris-Glycin-Pufferlösung vom pH-Wert 6,8 gelöst, die 10% Glycerin enthält. Die Lö-60 sung wird bei 10 Milliampère unter Kühlung in einer präparativen Elektrophoresevorrichtung der Elektrophorese unterworfen. Es wird ein 8prozentiges Acrylamidgel mit den Abmessungen 20 x 25 mm vom pH-Wert 8,9 verwendet. Die Fraktion mit einer relativen Beweglichkeit von 0,46 wird mit 65 einer 0,025molaren tris-Glycin-Pufferlösung vom pH-Wert 8,3 eluiert und sodann gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die erhaltene dialysierte Lösung wird gefriergetrocknet. Es werden etwa 10 mg Glykoprotein erhalten. Beim wieder

11

644 520

holen des vorstehend beschriebenen Verfahrens werden etwa 30 mg Glykoprotein erhalten.

(3) Züchtung der Monozyten und Makrophagen

Das auf die vorstehend beschriebene Weise erhaltene Glykoprotein wird zu 30 ml eines McCoy's 5A-Medium gegeben, das 20% fetales Kälberserum enthält, und zwar in einer Menge von 100 (xg/ml Medium. 30 ml des erhaltenen Mediums werden in jeweils eine Petrischale gegossen, die anhaftende Makrophagen und Monozyten enthält, wie dies vorstehend unter Ziffer (1) des Beispiels beschrieben ist. Die Populationsdichte der Monozyten und Makrophagen in dem Medium beträgt 10e/ml. Das hergestellte Medium wird 3 Tage bei 37 °C an feuchter Luft mit 5% Kohlendioxid inkubiert. Es wird ein CSF-enthaltendes konditioniertes Medium erhalten.

(4) Reinigung von CSF in dem konditionierten Medium

Die Medien aus den Petrischalen werden 10 Minuten bei

2 °C und 2000 g zentrifugiert. Es werden etwa 120 ml eines klaren Überstandes erhalten, der mittels einer Ultrafiltrationsmembran mit einer molekularen Trenngrenze von 10 000 konzentriert wird. Das erhaltene Konzentrat wird mit 100 ml einer 0,05molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,2 versetzt und erneut auf 5 ml konzentriert.

Die erhaltene Lösung wird auf eine Säule mit den Abmessungen 2,0 x 60 cm gegeben, die mit DEAE-Cellulose gefüllt ist und die vorher mit einer 0,05molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden ist. Sodann wird das CSF mit einer linearen Gradientenkonzentration von Kochsalz (0- bis etwa 3molar) eluiert. Die aktive Substanz enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und mittels der vorstehend genannten Ultrafiltrationsmembran konzentriert. Hierauf wird die konzentrierte Lösung auf eine Säule mit den Abmessungen 2,0 x 90 cm gegeben, die mit Sephadex G-150 gefüllt ist und die vorher mit einer 0,05molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden ist. Sodann wird die Säule mit der gleichen Pufferlösung entwickelt. Es werden diejenigen Fraktionen aufgefangen, die einem Molekulargewicht von 65 000 bis 90 000 sowie die Fraktionen, die einem Molekulargewicht von 30 000 bis 60 000 entsprechen. Diese Fraktionen werden vereinigt und mittels der Ultrafiltrationsmembran konzentriert. Die erhaltene konzentrierte Lösung wird mit destilliertem Wasser versetzt, entsalzt und konzentriert. Es werden etwa 5 ml einer Lösung erhalten, die gereinigtes CSF enthält. Diese Lösung besitzt eine Aktivität, bestimmt gemäss Versuchsbeispiel 1, entsprechend der Bildung von 41 000 Kolonien menschliche Granulozyten/ml.

Beispiel 2

Auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 werden Monozyten und Makrophagen aus menschlichem peripherem Blut isoliert und zur Herstellung des gereinigten Glykoproteins behandelt. Es wird ein Medium verwendet, das durch Zusatz des gereinigten Glykoproteins zu serumfreiem McCoy's 5A-Medium in einer Menge von 100 |xg/ml Medium hergestellt worden ist. Es werden etwa 5 ml einer gereinigtes CSF enthaltenden Lösung in ähnlicher Weise erhalten wie in Beispiel 1. Diese Lösung zeigt eine Aktivität entsprechend der Bildung von 16 000 menschlichen Granulozytenkolonien/ml Lösung.

Beispiel 3

In ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 werden Monozyten und Makrophagen aus menschlichem peripherem Blut isoliert und zur Herstellung der glykoproteinhaltigen Fraktion (Fraktion A) behandelt. Es wird ein Medium verwendet, das durch Zusatz dieser Fraktion zu serumfreiem McCoy's 5A-Medium in einer Menge von 5 mg (83,3 mg Glykopro-

tein)/ml Medium hergestellt worden ist. Es werden etwa 120 ml eines konditionierten Mediums erhalten. Dieses konditionierte Medium wird gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die dialysierte Lösung wird unter vermindertem Druck bei niedriger Temperatur konzentriert. Es werden etwa 5 ml einer CSF-enthaltenden Lösung erhalten. Diese Lösung zeigt eine Aktivität entsprechend der Bildung von 36 700 menschlichen Granulozytenkolonien/ml Lösung.

Beispiel 4

In ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 werden Monozyten und Makrophagen aus menschlichem peripherem Blut abgetrennt und zur Herstellung der glykoproteinhaltigen Fraktion (Fraktion B) behandelt. Es wird ein Medium verwendet, das durch Zusatz dieser Fraktion zu McCoy's 5A-Medium, das 10% menschliches Serum enthält, in einer Menge von 1 mg (83,3 Hg Glykoprotein)/ml Medium hergestellt worden ist. Es werden etwa 5 ml einer gereinigtes CSF enthaltenden Lösung in ähnlicher Weise erhalten wie in Beispiel 1. Diese Lösung hat eine Aktivität entsprechend der Bildung von 43 200 menschlichen Granulozytenkolonien/ml Lösung.

Beispiel 5

(1) Herstellung des Glykoproteins

Nach der Methode von Stanley u. Mitarb. a.a.O., werden Glykoprotein und glykoproteinhaltige Fraktionen fol-gendermassen hergestellt:

400 Liter frischer Urin von gesunden Versuchspersonen werden gegen Wasser durch eine Ultrafiltrationsmembran dialysiert. Die dialysierte Lösung wird auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt und auf eine Säule mit den Abmessungen 20 x 15 cm gegeben, die mit DEAE-Cellulose gefüllt ist, und die vorher mit einer 0,03molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,4 äquilibriert worden ist. Die aktiven Substanzen werden an der DEAE-Cellulose adsorbiert. Hierauf werden die aktiven Substanzen mit 20 Liter einer 0,1 molaren tris-HCl-Pufferlösung gewaschen, die 0,04molar an Natriumchlorid ist. Sodann werden die aktiven Substanzen mit 20 Liter einer 0,1 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 eluiert, die 0,15molar an Natriumchlorid ist. Das erhaltene Eluat wird gegen destilliertes Wasser dialysiert. Es wird die Fraktion C erhalten.

Die erhaltene dialysierte Lösung wird mit Calciumphos-phatgel in einer Menge von 58 ml Gel/g Protein versetzt. Die aktiven Substanzen werden am Gel adsorbiert. Sodann wird das Calciumphosphatgel abfiltriert, zweimal mit 20 Liter einer 0,005molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,5 gewaschen und mit 5 Liter einer 0,025molaren Phosphatpufferlösung eluiert. Das Eluat wird 10 Minuten bei 12 000 g zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wird gegen destilliertes Wasser dialysiert. Sodann wird die dialysierte Lösung unter vermindertem Druck auf etwa 50 ml eingedampft. Das erhaltene Konzentrat wird mit einer 0,lmolaren tris-HCl-Pufferlösung äquilibriert, auf eine Säule mit den Abmessungen 2,5 x 90 cm gegeben, die mit DEAE-Cellulose gefüllt ist und die vorher mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. Sodann wird mit einer 0,1 molaren tris-HCl-Pufferlösung eluiert, die Natriumchlorid in einem linearen Konzentrationsgradienten von 0- bis 0,15molar enthält. Die glykoproteinhaltigen Fraktionen werden aufgefangen und mittels einer Ultrafiltrationsmembran konzentriert (Fraktion D).

Das erhaltene Konzentrat wird der Gelfiltration an einer Säule mit den Abmessungen 2,5 x 110 cm unterworfen, die mit Biogel P-100 gefüllt ist, das vorher mit einer 0,03mo-laren tris-HCl-Pufferlösung äquilibriert worden ist. Es werden 230 mg Glykoprotein erhalten (Produkt von Standardreinheit).

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100 mg dieses Produktes werden in einer 0,1 molaren Acetatpufferlösung vom pH-Wert 6,0 gelöst, die l,0molar NaCl, 0,001molar MgCl2,0,001molar MnCl^ und 0,001 molar CaCl2 ist. Die Lösung wird auf eine Säule mit den Abmessungen 36 x 1,0 cm gegeben, die mit Konkanava-lin A-Sepharose 4 B gefüllt ist, die vorher mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. Es wird mit einer 0,1 molaren a-Methyl-D-glukosidlösung eluiert. Es werden 8 mg Glykoprotein (hochgereinigtes Produkt) erhalten.

Die biologische Aktivität gegenüber Knochenmarkzellen der Maus der Glykoproteinpräparate unterschiedlicher Reinheit werden nach der vorstehend beschriebenen Methode bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII zusammengefasst.

Tabelle VIII

Probe spezifische Aktivität halbgereinigtes Produkt

Fraktion A 21 000

Fraktion B 54 000

Produkt von Standardreinheit 180 000

hochgereinigtes Produkt 1 240 000

(2) Züchtung von Monozyten und Makrophagen und Reinigung von CSF im konditionierten Medium Die Verfahren von Beispiel 1 (3) und 1 (4) werden wiederholt, jedoch werden 1000 Einheiten/ml Medium des Glykoproteins von Standardreinheit anstelle des hochgereinigten Glykoproteins verwendet. Es werden etwa 5 ml einer gereinigten CSF-haltigen Lösung erhalten, die eine Aktivität entsprechend der Bildung von 35 000 menschlichen Granulozytenkolonien/ml Lösung besitzt.

Beispiel 6

Beispiel 5 wird wiederholt, und es werden etwa 5 ml einer gereinigtes CSF enthaltenden Lösung erhalten. Es wird jedoch ein Glykoprotein verwendet, das nach der Methode von Stanley und Metealf, a.a.O. anstelle der Methode von Stanley u. Mitarb. hergestellt worden ist. Die gereinigtes CSF enthaltende Lösung in diesem Beispiel zeigt eine Aktivität entsprechend der Bildung von 9800 menschlichen Granulozytenkolonien/ml der Lösung.

20 Liter menschlicher Urin wird gegen Leitungswasser bei Raumtemperatur während 8 bis 12 Stunden dialysiert. Sodann wird die dialysierte Lösung mit 75 g DEAE-Cellulose. versetzt, die mit Wasser und 100 ml einer l,0molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden ist. Das erhaltene Gemisch wird gründlich vermischt, damit sich das Glykoprotein an der DEAE-Cellulose adsorbiert. Nach der Abtrennung des Überstandes wird die DEAE-Cellulose dreimal mit einer 0,1 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 gewaschen, die 0,05molar an Natriumchlorid ist. Hierauf wird das adsorbierte Glykoprotein mit 300 ml einer 0,1 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 eluiert, die 0,5molar an Natriumchlorid ist. Dieses Verfahren wird sechsmal wiederholt. Das Eluat wird unter vermindertem Druck bei 40 C konzentriert und gegen eine 0,1 molare tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 dialysiert. Die dialysierte Lösung wird auf eine Säule mit den Abmessungen 2,3 x 44 cm gegeben, die mit DEAE-Cellulose gefüllt ist und die vorher mit einer 0,1 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden ist. Das Glykoprotein wird an der DEAE-Cellulose adsorbiert. Danach wird die Säule mit der gleichen Pufferlösung gewaschen, die 0,05molar an Natriumchlorid ist. Hierauf wird das adsorbierte Glykoprotein nach der Natriumchlorid-Konzentrationsgradienten-

Eluierungsmethode mit einem Gradienten von 0,1- bis 0,5molar Natriumchlorid im gleichen Puffer eluiert. Das Eluat wird gegen Wasser dialysiert. Die erhaltene dialysierte Lösung wird unter vermindertem Druck eingedampft und gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Material wird in einer 0,lmolaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 gelöst und auf eine Säule mit den Abmessungen 2,3 x 150 cm gegeben, die mitSephadex G-150 gefüllt ist und die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. Es wird die Glykoproteinfraktion aufgefangen. Diese Fraktion wird dialysiert und gefriergetrocknet. Es werden etwa 12 mg eines Pulvers mit einer spezifischen Aktivität von etas 36 000 bei Knochenmarkzellen der Maus erhalten.

Beispiel 7

Monozyten und Makrophagen werden aus menschlichem peripherem Blut auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise abgetrennt. Es wird eine Glykoprotein enthaltende Fraktion auf die nachstehend beschriebene Weise nach der Methode von Laukel u. Mitarb., a.a.O. hergestellt und zu serumfreiem McCoy's 5A-Medium in einer Menge von 2000 Einheiten/ml gegeben. Unter Verwendung dieses Mediums wird die Züchtung in ähnlicher Weise wie im Beispiel 5 durchgeführt. Es werden 120 ml eines konditionierten Mediums erhalten. Dieses Medium wird gegen destilliertes Wasser dialysiert. Sodann wird die dialysierte Lösung unter vermindertem Druck bei niedriger Temperatur auf etwa 5 ml konzentriert. Es wird eine CSF enthaltende Lösung erhalten, die eine Aktivität entsprechend der Bildung von 29 000 menschlichen Granulozytenkolonien/ml Lösung aufweist.

50 Liter menschlicher Urin werden gegen laufendes Leitungswasser mittels einer Ultrafiltrationsmembran (CL 100) dialysiert. Die erhaltene dialysierte Lösung wird auf eine Säule mit den Abmessungen 10 x 30 cm gegeben, die mit DEAE-Cellulose gefüllt ist, die vorher mit einer 0,06molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,3 äquilibriert worden ist. Das Glykoprotein wird an der DEAE-Cellulose adsorbiert. Danach wird die Säule mit einer 0,06molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,3 gewaschen, die 0,05molar an Natriumchlorid ist. Hierauf wird das Glykoprotein mit der gleichen Pufferlösung eluiert, die 0,3molar an Natriumchlorid ist. Das erhaltene Eluat wird gegen 0,05molare tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 8,0 dialysiert, die 0,5molar an NaCl, 2millimolar an CaCl2 und 2millimolar an MgCl2 ist. Die erhaltene dialysierte Lösung wird auf eine Säule mit den Abmessungen 2,6 x 40 cm gegeben, die mit Konkanava-lin A-Sepharose 4 B gefüllt ist, die vorher mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. Das am Säuleninhalt adsorbierte Glykoprotein wird mit der gleichen Pufferlösung gewaschen. Hierauf wird das Glykoprotein mit der gleichen Pufferlösung eluiert, die 0,l5molar an a-Methyl-D-mannosit ist. Das erhaltene Eluat wird durch Ultrafiltration konzentriert. Es werden etwa 7 ml einer Fraktion erhalten, die 6 mg Glykoprotein in 1 ml enthält. Die spezifische Aktivität dieser Fraktion beträgt etwa 20 000 bei Knochenmarkzellen der Maus.

Beispiel 8

Monozyten und Makrophagen werden aus menschlichem peripherem Blut gemäss Beispiel 1 abgetrennt. Es wird eine glykoproteinhaltige Fraktion (Fraktion D) in gleicher Weise wie in Beispiel 5 hergestellt und zu McCoy's 5A-Medium gegeben, das 10% menschliches Serum enthält. Die Fraktion D wird in einer Menge von 2000 Einheiten/ml Medium zugegeben. Unter Verwendung dieses Mediums werden etwa 5 ml einer gereinigtes CSF enthaltenden Lösung in ähnlicher Weise erhalten, wie in Beispiel 5. Diese Lösung zeigt eine Aktivität entsprechend der Bildung von 24 000 menschlichen Granulozytenkolonien/ml Lösung.

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Claims

644 520 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung eines die Proliferation und Differenzierung menschlicher granulopoetischer Stammzellen stimulierenden Faktors» dadurch gekennzeichnet, dass man Monozyten und Makrophagen aus menschlichem peripherem Blut in einem Gewebekulturmedium vermehrt, das ein Glykoprotein aus menschlichem Urin enthält, welches die Bildung von menschlichen Granulozyten oder Mäusema-krophagen und Granulozyten stimuliert, und den gebildeten Faktor aus der Kulturflüssigkeit isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Vermehrung der Monozyten und Makrophagen in Gegenwart von Serum durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Serum menschliches Serum verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man das Serum in einer Menge von mindestens 5%, bezogen auf das Volumen des Mediums, verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, s dass man ein Glykoprotein, welches die Bildung von menschlichen Granulozyten stimuliert, in einer Menge von mindestens 0,1 ng/ml Medium verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Glykoprotein, welches die Bildung von Mäuse-

io makrophagen und Granulozyten stimuliert, in einer Menge von mindestens 500 Einheiten/ml Medium verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man als Glykoprotein ein teilweise gereinigtes Material verwendet, das noch Harnproteine enthält.

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8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Anzahl der Monozyten und Makrophagen, die in das Gewebekulturmedium überimpft werden, mindestens 10s/ml beträgt.