DE2024586B2 - Langsame a - und ß - Glykoproteine aus Mikrobenkörpern, Verfahren zu deren Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung - Google Patents
Langsame a - und ß - Glykoproteine aus Mikrobenkörpern, Verfahren zu deren Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische ZusammensetzungInfo
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Description
2. Verfahren zum Herstellen der langsamen λ- und
^-Glykoproteine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich an die Stufe c) eine zweite
Auslaugung mit einem anderen sauerstoffhaltigen Lösungsmittel anschließt
3. Verfahren zum Herstellen der langsamen <x- und
^-Glykoproteine nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reinigung der nach Stufe e)
erhaltenen langsamen <%- und j3-Glykoproteine durch
Dialyse mit einer Cellulosemembran und durch Chromatographie über Sephadex 200*, gefolgt von
der Eluierung, erfolgt.
4. Pharmazeutische Zusammensetzung zur perkutanen, transkutanen, perlingualen, topischen oder
permucosen Verabreichung, enthaltend die langsamen λ- und ^-Glykoproteine nach den Ansprüchen 1
bis 3.
In der Literatur ist bereits eine große Anzahl von
Präparationen mikrobiellen Ursprungs beschrieben, die durch Mikrobenkörper gebildet werden, die auf
chemische oder physikalische Weise lysiert wurden.
Dies ist z. B. beschrieben in den speziellen französischen Heilmittel-Patenten 5488 M (Canadian Patents
and Development Limited), 6495 M (Institut de Recherches Scientifiques) und 6513 M (Institut de Recherches
Scientifiques).
Diese Mikrobenlysate, die allein oder in Verbindung
mit einem Antibiotikum oder mit einem polaren Lösungsmittel vorliegen können, dienen dazu, eine
schnelle Immunisierungsreaktion in Gang zu bringen, oder dazu, die Abwehrkräfte des Organismus gegenüber
einem mikrobiellen Angriff zu steigern. Diese Lysate
stammen im allgemeinen von einer bestimmten
Mikrobenart und rufen eher eine spezifische als eine allgemeine Immunisierung hervor. Sie besitzen außerdem den Nachteil, daß sie im allgemeinen Allergien
hervorrufen. Zu ihrer wiederholten Anwendung kann aus. diesem Grunde nicht geraten werden.
Weiterhin stellen diese Lysate Mischungen proteinartiger Fraktionen dar, die sehr verschiedenartig sind, wie
Lipoproteine, Mucopolysaccharide, Nucleoproteine,
ίο von denen die einen immunaktiv sind und die anderen
inaktiv sind. Die Verabreichung derartiger Mischungen kann zu unerwünschten Nebenwirkungen führen.
Ils ist daher wünschenswert im Hinblick auf die
therapeutische Anwendung, nicht nur über ein mikro
bielles Lysat zu verfügen, das gleichwohl antigene
eigentliche aktive Fraktion darstellt
Vorteil, daß sie eine sehr starke, schnelle und genügend dauerhafte Immunität hervorrufen würde.
Ein erster Versuch zur Lösung dieses Problems wurde von p. Lalouette (Revue d'lmmunologie, 32, (1968),
S. 105 bis 150) unternommen, ausgehend von einem
sornatischen Antigenextrakt, der aus dem Stamm
Bacillus subtilis L herrührte. Das hierbei verwendete Verfahren umfaßt auch eine Lysierung und Fraktionierung der Mikrobenkörper. Die Glykoproteinfraktion,
die dieser Autor erhielt, besitzt eine gewisse nichtspezi-
jo fische antigene Aktivität Sie besitzt außerdem eine
antiinflammatorische Wirkung.
Die Erfindung soll demgegenüber eine zufriedenstellendere und allgemeinere Lösung dieses Problems
geben und die Gewinnung von langsamen <%- und
/J-'Glykoproteinen mit ausgeprägter Imrnunwirkung und
starker antiinflammatorischer Wirkung gestatten.
indem man erfindungsgemäß nicht mehr einen Extrakt eines speziellen nichtpathogenen Stamms
verwendet sondern einen Extrakt, der von einem oder
mehreren saprophyten oder pathogenen Stämmen
herrührte, kann man eine Glykoproteinfraktion erhalten, die eine ausgeprägtere und allgemeinere Immunwirkung und eine stärkere antiinflammtorische Wirkung
besitzt.
Gegenstand der Erfindung sind somit langsame a-
und /3-Glykoproteine aus Mikrobenkörpern, erhältlich
durch
a) Kultivierung eines Mikrobenstaturies, ausgewählt
w aus der Gruppe von Pneumokken, Streptokokken,
Neisseria, Staphylokokken, Mikrokokken, Klebsiel-Ia pneumoniae und Haemophilus influenzae oder
einer Mischung von zwei oder mehreren dieser Stämme oder einer Mischung von verschiedenen
Typen eines dieser Stämme, wobei man die Mikrobenkörper nach vollständiger Kultivierung
manuell oder automatisch sammelt und in einem wäßrigen Medium suspendiert,
b) in der Suspension die Mikrobenkörper chemisch, physikalisch und/oder enzymatisch lysiert und die
c) die so erhaltene klare Lösung eindampft, den Rückstand mit Lipoidlösungsmitteln behandelt,
d) das von Lipoiden befreite Produkt in einem (,-, wäßrigen Lösungsmittel löst, daraus die Eiweißkörper physikalisch fällt und entfernt und
e) aus der erhaltenen klaren, wäßrigen Lösung die langsamen Glykoproteine durch Zugabe eines mit
Wasser mischbaren Lösungsmittels oder einer Mischung derartiger Lösungsmittel ausfüllt und
gegebenenfalls durch in der Biochemie übliche Verfahren weiter reinigt.
Die erfindungsgemäßen Glycoproteine entfalten
neben den antiinflammatorischen Eigenschaften schnell wirkende und nicht spezifische immunisierende Eigenschaften. Sie besitzen außerdem den Vorteil, daß sie
weder Allergien hervorrufen noch hyperthermisch wirken und daß sie keine Unverträglichkeitserscheinungen an der Injektionsstelle hervorrufen.
Unter bestimmten experimentellen Bedingungen kann man somit eine oder mehrere Molekülarten
glykoproteinartiger Natur isolieren, die verantwortlich sind für die antigenen und antiinflammatorischen
Eigenschaften der mikrowellen Präparationen. Eine derartige Glykoproteinfraktion ist auf Grund des
unterschiedlichen Ursprungs der Mikrobenkulturen verschieden von jener, die P. Lallouette erhalten
hat
Die Erfindung erlaubt es somit, zu gereinigten standardisierbaren Fraktionen zu gelangen, deren
Immunwirkung gegenüber pathogenen Mitteln reproduzierbar ist und deren Gehalt an aktiven Glykoproteinen mit Präzision durch chemische, physikalische,
immunologische oder bakteriologische Untersuchungen bestimmt werden kann.
Die unter den genannten Bedingungen erhaltenen Glykoproteine sind eine Mischung aus langsamen a-
und 0-Glykoproteinen. Ihre Struktur kann durch das
Verhalten bei der Elektrophorese gegenüber Vergleichs-Glykoproteinen und insbesondere gegenüber
Serumglykoproteinen gezeigt werdui.
Die chemische Natur dieser Substanzen wird auch angegeben durch chemische Reaktionen, wie durch
ihren Gehalt an Hexosen, Pentosen, und durch die ungefähre Bestimmung des Molekulargewichts unter
Verwendung von selektiven chromatographischen Mitteln, wie modifizierte Cellulosen, Sephadex oder
Molekularsiebe, durch den Gehalt an Proteinfraktion des Moleküls, der bestimmt wird durch die biuretogene
Wirkung, berechnet im Vergleich zu der Serumalbumineichung, durch den Gehalt an Hexosaminen und an
Sialsäure. Die Fraktion, die durch Glykoproteine gebildet wird, die man ausgehend von einem oder
mehreren der erwähnten pathogenen Stämme erhalten hat, kann dadurch definiert werden, daß sie aus
langsamen λ- und 0-Glykoproteinen, die thermostabil,
säurelöslich und löslich in Lösungen von Ammoniumsulfat sind, besteht.
Das Molekulargewicht der «- und 0-Glykoproteine
wird bewertet durch die Chromatographie über SEPHADEX. Die Filtrationschromatographie gestattet
es, ein Molekularvolumen 5; zu definieren, das eine
Vo
Beziehung darstellt zwischen dem Volumen an Lösungsmittel, das notwendig ist zur Desorption der Glykoproteine (Ve) und dem Lösungsmittelvolumen, das notwendig ist, um ein großes Molekül zu eltiieren, das völlig aus
dem SEPHADEX-GeI G 100 (Vo) vertrieben ist.
Das Molekularvolumen Y1 für derartige Glykoproteine, wie man sie gemäß Beispiel 1 erhält, liegt
zwischen 2,5 und 3 im Vergleich zu einem Puffer von pH = 8, der gebildet wird durch die folgende Mischung:
Das Molekulargewicht der Λ- und ^p
kann auch bestimmt werden durch Chromatographie über SEPHADEX G 200.
für derartige Glykoproteine, wie man sie gemäß den Beispielen 2 bis 7 erhält, liegt zwischen 1 und 1,2,
bezogen auf den oben angegebenen Puffer b,iw. einen Puffer vom pH=8.
ίο Die Glykoproteine werden auch definiert durch ihren
Gehalt an gebundenen Hexosen, bestimmt durch eine spezifische Reaktion, wie z. B. durch die Färbereaktion
mit Methylresorcin. Gemäß diesen Bestimmungen haben die gemäß Beispiel i erhaltenen Glykoproteine
ein^n Gehalt an gebundenen Hexosen zwischen 4 und 20 g pro 100 g. Dieser Gehalt variiert mit dem Grad der
Reinigung der betrachteten Fraktion und mit der Menge der Mineralsalze, die in der Glykoproteinfraktion
enthalten sind.
Die gemäß Beispiel 2 erhaltenen Glykoproteine haben einen Gehalt an gebundenen Hexosen um 50%
bei einem Produkt, das unvollständig von Mineralsalzen befreit ist; er liegt in der Gegend von 60% bei einem
Produkt, das vollständig von Mineralsalzen befreit ist.
Die Glykoproteine lassen sich auch durch die folgende Beziehung definieren:
Gehalt an gebundenen Hexosen
Biuretbildungsvermögen
jo Der Gehalt an biuretogenen Substanzen, bestimmt im
Vergleich zur Serumalbumineichung, liegt für die Glykoproteine gemäß Beispiel 1 im Bereich von 10%.
Die Beziehung
gebundene Hexosen
Tris-(hydroxymeihyl)-aminomethan
Natriumchlorid
0,1 m 0.1 m
variiert zwischen 0,25 und 2 in Abhängigkeit vom
Reinheitsgrad.
Für die gemäß Beispiel 2 erhaltenen Glykoproteine ist die Beziehung
gebundene Hexosen
Biuretbildungsvermögen
kleiner oder gleich 3. Sie kann auch einen Wert
zwischen 2,8 und 3 annehmen.
Die Glykoproteine werden weiterhin definiert durch ihre Löslichkeitseigenschaften. Sie geben in destilliertem Wasser eine leicht opalisierende Lösung, die beim
Erwärmen nicht denaturiert wird.
w Die Glykoproteine sind löslich in Lösungen von Perchlorsäure, Trichloressigsäure und Phytinsäure.
Insbesondere kann man die Glykoproteine aus einer Lösung von Phytinsäure mit einem pH-Wert von 2,10
ohne Denaturierung zurückgewinnen.
Des weiteren werden die Glykoproteine definiert durch die Intensität ihrer antiinflammatorischen Wirkung, die durch Standardversuche, wie das experimenta-Ie Karragheen-Ödem, bestimmt wird. Die antiinflammatorische Aktivität läuft parallel der Reinheit der
bo Glykoproteinfraktion.
Weiterhin ist es nicht unmöglich, daß diese Glykoproteine eine spezifische Methylpentose und insbesondere
Fucose enthalten.
Die erfindungsgemäßen langsamen Glykoproteine
stammen her von Mikrobenkulturen auf festem oder
flüssigem Medium, wie z. B. auf angereicherter oder nicht angereicherter Nährgelose in einer Petrischale
oder durch Kultivierung in Schüttelvorrichtungen oder
in industriellen Fermentierungsvorrichuingen in einem
flüssigen Medium.
In der Stufe b) werden die Mikrobenkörper, gegebenenfalls in Anwesenheit eines Puffers, wie z. B,
eine Lösung von Dinatriumphosphat, oder in Anwesenheit eines Antiseptikums, wie Thimerosal, wieder in
Wasser in Suspension gebracht. Die so erhaltenen Suspensionen werden photometrisch titriert, um die
Konzentration an Bakterienkörpern zu bestimmen. Man kann diese Konzentration auf einen gewünschten
Wert einstellen. Die Suspension dieser Mikrobenkörper wird dann lysiert
Die Lysierung der Mikrobenkörper dieser Suspension kann auf verschiedene Art bewirkt werden, sei es auf
chemischem Wege, wie durch Zugabe eines oberflächenaktiven Mittels, z. B. eines Polyäthylenglykolsorbats,
oder eines Antiseptikums, insbesondere eines quecksilberhaltigen Antiseptikums, sei es auf physikalischem
Wege mit Hilfe von Ultraschall oder durch Erwärmen oder durch durchdringende Strahlung, sei es
auch auf diastatischem oder enzymatischem Wege durch Zugabe proteolytischer oder polymuco-saccharolytischer
Enzyme oder auch auf jede andere Weise, die es gestattet, den Zellinhalt der Mikroben ohne
Veränderung möglichst vollständig zu gewinnen.
Die Lysierung der Mikrobenkörper kann auch in gemischter Weise erfolgen, indem man zunächst eine
enzymatische Lysierung durchführt und dann eine chemische Lysierung durch Kombination eines oberflächenaktiven
Mittels mit einem quecksilberhaltigen Antiseptikum. Hierbei kann sie nacheinander mit Hilfe
eines proteolytischen Enzyms, wie Trypsin, Papain, Bromelain, ot-Chymotrypsin oder Pronase, oder mit
Hilfe eines polymuco-saccharolytischen Enzyms, wie Lysozym oder Hyaluronidase, bewirkt und dann mit
Hilfe eines chemischen Mittels, wie quecksilberorganische Antiseptika, Trichloressigsäure, Phytinsäure oder
Perchlorsäure, weitergeführt werden.
Anstelle von Trypsin kann man auch Pankreatin oder Streptokinase oder Streptodornase verwenden.
Der Grad und die Qualität der mikrowellen Lysierung kann photometrisch verfolgt werden.
Wenn man die Lysierung als zufriedenstellend ansieht, kann man ein Konservierungs- oder Stabilisierungsmittel
hinzugeben.
Die so erhaltenen bakteriellen Lysate liegen vor in Form einer wäßrigen Präparation, die gegebenenfalls
gepuffert ist, aus der die Reste der Mikrobenkömer ausfallen. Diese Reste können durch übliche Mittel, wie
Filtration oder Zentrifugierung entfernt werden.
Ausgehend von diesem von Mikrobenkörpern befreiten Lysat extrahiert man die Glykoproteine. Diese
Extraktion wird bewirkt an dem Rückstand, den man durch Eindampfen oder Lyophilisierung des Lysats
erhält. Der Rückstand wird von Lipoiden durch ein oder mehrere Lösungsmittel, insbesondere sauerstoffhaltige
Lösungsmittel, wie z. B. Äther oder Aceton, oder durch eine Mischung von Methylal und Methanol befreit.
Diese Operation kann gegebenenfalls wiederholt werden. Das so von Lipoiden befreite Pulver wird dann
wieder in wäßrige Lösung gebracht.
Die Befreiung von Lipoiden kann in zwei Stufen erfolgen. In einer ersten Stufe laugt man das
Mikrobenlysat durch eine Mischung von Methylal/Methanol
aus, die den größten Teil der Lipoide, Phospholipoide und Lipoproteine löst. Die Glykoproteinfraktion
it,t dagegen in dieser Mischung unlöslich und kann daher abgetrennt werden.
Die zweite Delipoidisierung wird am Rückfluß bewirkt durch ein sauerstoffhaltiges Lösungsmittel, das
die Auslaugung der aktiven Fraktion vervollständigt Die so isoliertes Glykoproteinfraktion ist nur noch
verunreinigt durch mehr oder weniger denaturierte Proteine und durch Mineralsalze.
Dann führt man die Befreiung dieser Lösung von Eiweiß durch auf physikalischem oder chemischem
Wege.
ίο Die Befreiung von Eiweiß kann bewirkt werden durch
Erhitzen, nachdem man den pH-Wert der Lösung auf einen Wert um 5 gebracht hat, und insbesondere auf
einen Wert zwischen 5 und 6. Die Eiweißentfernung kann auch bewirkt werden durch einfaches Erhitzen
oder durch Kälte oder durch die Zugabe von Lösungsmitteln, durch Zugabe einer wäßrigen Mineralsäure
oder einer wäßrigen organischen Säure bei einem pH-Wert zwischen einschließlich 5 und 6 oder durch
biochemische Reinigung.
Bevorzugt ist die Entfernung des Eiweißes durch Kälte hei einer Temperatur von wenig oberhalb Q0C.
Diese Arbeitsweise hat den V<y ieil, daß die Proteine
und der größte Teil der Mincra'salze gleichzeitig
entfernt werden.
Man eliminiert den Niederschlag der Eiweißkörper oder der Nucleoproteine durch Filtration oder Zentrifugieren.
Die klare Lösung wird abgetrennt. Sie besteht im wesentlichen aus einer Mischung von Glykoproteinen
und Mineralsalzen.
Man geht dann weiter vor mit selektiver Ausfällung der Glykoproteine, indem man der Lösung ein mit
Wasser mischbares Lösungsmittel oder eine Mischung von derartigen Lösungsmitteln zugibt. Man verwendet
zu diesem Zweck eine Mischung von Alkohol,
insbesondere Äthanol und Aceton, oder eine Mischung von Methylal und Methanol.
Der Niederschlag von Glykoproteinen, der bei diesen Bedingungen auftritt, wird abgetrennt, mit dem gleichen
Lösungsmittel oder der gleichen Lösungsmittelmischung gewaschen und dann getrocknet.
Die Glykoproteinfraktion wird schließlich gereinigt durch eine der selektiven biochemischen Methoden
(Dialyse, Chromatographie auf Siliciumdioxyd oder Cellulose, Elektrophorese, Uilrazentrifugierung). So
> kann man eine Glykoproteinfraktion erhalten, die stark angereichert ist und von Mineralsalzen befreit ist. Eine
letzte Reinigung wird bewirkt durch Filtration über eine Kolonne von chemisch modifizierter Cellulose (Äthylcellulose,
Dimethylaminoäthylcellulose) mit einer geaigneten Korngröße und geeignetem Molekulargewicht.
Die bevorzugte Methode besteht darin, daß man eino Lösung der Glykoproteinfraktion über eine Kolonne
von SEPHADEX G 200 filtriert. Die aktive Fraktion wird nicht adsorbiert und kann daher selektiv
abgetrennt werden. Die aktive Fraktion, die man so erhält, enthält nur eine geringe Menge an Verunreinigungen,
wie Mineralsalze oder Nucleoproteine. Eine Ausfällung dieser Verunreinigungen durch Zusatz von
Mangansalzen oder quaternären Ammoniumsalzen, wie Zephirol oder Cetavlon, gestattet es, eine noch reinere
Glykoproteinf. aktion zu erhalten.
So erhält man die erfindungsgemäßen Glykoproteine in praktisch reinem Zustand.
Die letzte Reinigung ist eine wünschenswerte, aber
Die letzte Reinigung ist eine wünschenswerte, aber
b5 nicht obligatorische Operation, wobei insbesondere eine
Fraktionierung über einem selektiven Träger geeignet ist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform
kann das Verfahren in folgender Weise definiert werden:
Der oder die verwendeten Mikrobenstämme werden aus der folgenden Gruppe ausgewählt:
Pneumokokkcn Siro vom Typ I. II. Ill, V
und VIII
Streptokokken der Gruppen A, C und G
Neisseria Catarrhalis
Staphylococcus aureus
Klcbscllü Pncumoniae
Hämophilus Infliicnzae.
Die l.ysicrung der Mikrobenkörper wird bewirkt
durch Zusatz, eines oberflächenaktiven Mittels:
die l.ysicrung der Mikrobenkörper wird bewirkt durch Zusatz eines quecksilberorganischen Antiseptikums:
die l.ysicrung der Mikrobenkörper wird bewirkt durch Zusatz eines quecksilberorganischen Antiseptikums:
die l.vsierung der Mikrobenkörper wird bewirkt
durch ein genischtes Verfahren, das zunächst eine
enzymatisch): l.ysicrung und dann eine chemische L.ysierung umfaßt, die bewirkt wird durch die
Verbindung eines oberflächenaktiven Mittels mit einem queeksilber-antiscptischcn Mittel, wie ζ. Β
Natriummercuriäthylthiosalicylat:
die l.vsierung wird bewirkt wählend einer Zeitdauer von 8 bis 15 Tagen bei einer mäßigen Temperatur um 40 C:
die l.vsierung wird bewirkt wählend einer Zeitdauer von 8 bis 15 Tagen bei einer mäßigen Temperatur um 40 C:
die l.ipoidentfernung wird bewirkt durch Auslaugen
mit Äther;
die l.ipoidentfernung wird bewirkt durch Auslaugen mit Aceton:
die l.ipoidentfernung wird bewirkt durch Auslaugen mit HiIIe einer Mischung aus Mcthylal und
Methanol:
die l.ipoidentfernung wird vervollständigt durch eine zweite Auslaugung mit Hilfe eines anderen
saucrstoffhaltigen Lösungsmittels, u ic /. B. Aceton;
die Entfernung der F.iwcißkörper des von Lipoiden
befreiten Produktes wird bewirkt durch physikalische Mittel, wie durch Hitze oder Kälte im
neutralen oder sauren Milieu:
die Eiweißkörperentfernimg wird bewirkt durch
Erhitzen auf 100 C;
die Eiweißentferrmng v.ird bewirk! durch Ansäuern
mit Hilfe von Trichloressigsäure:
die selektive Ausfällung von langsamen \- und ^-Giykoproteinen wird bewirkt durch Zusatz einer Mischung vor; Methylal/Methanol zur wäßrigen Lösung;
die selektive Ausfällung von langsamen \- und ^-Giykoproteinen wird bewirkt durch Zusatz einer Mischung vor; Methylal/Methanol zur wäßrigen Lösung;
die selektive Ausfällung der langsamen x- und /3-Glykoproteine wird bewirkt durch Zusatz einer
Mischung von Alkohol und Aceton zur wäßrigen Lösung:
die Mischung von Alkohol und Aceton wird in Mengen zugegeben, die variieren können zw ischen
i und 20 Volumen Lösungsmittel pro 1 Volumen wäßriger Lösung:
die erfindungsgemäßen langsamen «- und /?-GIykoproteine
werden durch Dialyse mit einer Cellulosemembran
und dann durch Chromatographie über SEPHADEX« 200. gefolgt von der Eluierung,
gereinigt.
Die Erfindung betrifft weiterhin pharmazeutische Zusammensetzungen zur perkutanen. transkutanen.
perlingualen, topischen oder permucosen Verabreichung,
die die langsamen λ- und 0-Glykoproteine enthalten, die durch das oben beschriebene Verfahren
erhalten werden. Ihre immunisierenden und antiinflammatorischen
Eigenschaften und ihre Reizwirkung auf das reticulo-cndotheliale System machen sie brauchbar
zur Steigerung der Abwehrkräfte des Organismus. Sie besitzen eine schnelle antigene Wirkung und steigern
dadurch die Widerstandskraft des Organismus gegenüber mikrowellen Angriffen.
Die antiinflammatorischen Eigenschaften dieser Zusammensetzungen machen sie besonders brauchbar zur
Behandlung von Knoehengelenkleidcn, Infektionen der Atemwcgc. chronischen Leiden der Luftwege. Infektionen
der oberen Atemwcge. gegen Venenlcidcn und in der Phlebologie, zur Behandlung von Störungen, die
hervorgerufen werden durch Infektion des Genitaloder Harntraktes. Auf Grund dieser Eigenschaften
werden sie auch in der iJermatoiogie angewandt.
Auf Grund ihrer antigenen Eigenschaften finden sie Verwendung bei der Behandlung von akutem Bronchialkatarrh,
bei Dermatitis. Verbrennungen, mikrowellen Infektionen des Uro-Genital-Traktes und in der
Stomatologie.
Die Kombination der antiinflammatorischen und antigenen Eigenschaften ist darüber hinaus besonders
vorteilhaft bei der Behandlung von Knochengelenkleiden. wo du. Phase der Entzündung oft begleitet wird von
einer A'.itolyse-Phase. die die Erscheinungen der
Autosensibilisation hervorruft.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die die langsamen \- und /i-Glykoproteinc enthalten, sind
bestimmt zur Injektion in allgemeiner oder lokaler Weise, zur perkutanen. lokalen, permucosen oder
pulmonalen Anwendung oder in Form von Perlingualtabletten oder Tabletten für Auflösung in dem Darm.
Die pharmazeutischen Formen, wie Salben, Nasentropfen.
Ohrentropfen, injizierbare Lösungen, sterile Ivophilisierte Pulver zur Injektin, Sublingualtabletten.
Aerosole. Suppositorien oder Kugeln, werden hergestellt durch übliche pharmakotechnische Verfahren. Sie
bestehen im allgemeinen datin, daß man die langsamen \- und /3-Glykoproteine in einem wäßrigen Lösungsmittel
in Lösung bringt und die Konservierung^- oder Verdickungsmittel oder Haftmittel oder Emulgiermittel
hinzugibt, so daß man die gewünschte pharmazeutische Form erhält.
Die Produkte können außerdem kombiniert werden mit einem Mittel, das eine bessere Verteilung in
Geweben sicherstellt, wie einem polaren Lösungsmittel.
Die Dosierung ist im wesentlichen abhängig von ovrr
Weg und der Form der Verabreichung.
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegend« Erfindung weiter erläutern.
Gewinnung der Glykoproteinfraktion
ausgehend von einem Mikrobeniysat
ausgehend von einem Mikrobeniysat
Das Lysat. das man erhält ausgehend von 1 I de; Konzentrats der Kulturen der folgenden Stämme
Pneumokokken | 5 χ | lO'/ccm |
Streptokokken | 5 χ | lOVccm |
Micrococcus Catarrhalis | 5 χ | 109/ccm |
Staphylokokken | 10«/ccm | |
Klebsellia Pneumoniae | lOS/ccm | |
Hämophilus Influenzae | IV/ccm | |
durch Zusatz von Natriummelhiolal wird im Vakuum eingeengt bis zu einer sirupartigen Konsistenz mit
einem Volumen von etwa 160 ecm.
Dieser Rückstand wird dann in etwa dem fünffachen Volumen von eisgekühltem Aceton aufgenommen. Man
gewinnt eine unlösliche Fraktion, die in die Hülse eines SOXHLET-Extraktors eingebracht wird. Man laugt
do.r-1 diese Fraktion während 8 Stunden mit siedendem
Aceton kontinuierlich aus.
Nach dem Auslaugen mit Aceton führt man eine erneute Extraktion mit Äthyläther Jureh. Die so
entfettete feste Fraktion wiegt 20 bis 50 g. Sie wird nus der Hülse entnommen und bei 37'C getrocknet. Man
bringt sie dann in destilliertem Wasser in Lösung, so daß
man eine 20%ige (Gewicht/Volumen) Lösung erhält. Diese Lösung, die 24 Stunden bei 4°C gehalten wird,
liefert einen starken kristallinen Niederschlag, der hauptsachlich aus Natriumphosphat und Natriumsulfat
besteh'.. Die überstehende Flüss^k?!· wirr! dun Ii
Filtration gewonnen.
Dann bewirkt man die Entfernung der Eiweißkörper aus dem Filtrat durch Erhitzen auf 1000C während JO
Minuten. Der proteinhaltige Niederschlag wird dann durch Zentrifugieren entfernt.
Die klare überstehende Flüssigkeit enthält im wesentlichen die Glykoproteinfraktion, die man durch
Zusatz einer Mischung aus gleichen Teilen Alkohol und Aceton ausfällt. Man erhält einen flockigen Niederschlag,
den man sich während 65 Minuten entwickeln läßt. Dieser Niederschlag wird dann durch Zentrifugierc
abgetrennt und bei 37°C getrocknet. Man gewinnt so 2 bis 4 g der Glykoproteinfraktion.
Diese Fraktion wird gereinigt durch Auflösen in Wasser, so daß man eine 20°/oige Lösung erhält, und
durch Dialyse gegen Wasser.
Die so erhaltene Lösung wird durch Lyophilisierung zur Trockne gebracht. Man erhält so eine sehr
gereinigte Fraktion, die 1,4 bis 1,5 g wiegt.
Durch Filtration einer wäßrigen Lösung dieser letzten Fraktion über Cellulose SEPHADEX G 200 und
Eluierung mit Hilfe einer Pufferlösung vom pH =8 erhält man etwa 0,15 g einer sehr reinen Glykoproteinfraktion.
Diese Fraktion, die durch langsame α- und /J-Glykoproteine gebildet wird, enthält 20% gebundene
Hexosen. Ihr Gehalt an biuretogenen Substanzen, bestimmt durch Vergleich mit Serumalbumin als
Vergleichssubstanz, beträgt 10%.
Herstellung der Glykoproteine ausgehend
von einer Kultur von Klebsellia Pneumoniae
von einer Kultur von Klebsellia Pneumoniae
Herstellung des Kulturmediums
Fleischextrakt | 5g |
Natriumchlorid | 5g |
Caseinpepton | 5g |
Hefeautolysat | 5g |
Bikaliumphosphat | 3,5 g |
Monokaliumphosphat | 1,5 g |
Glucose | 10g |
Phyton | 20 g |
Destilliertes Wasser | |
zur AuffüHung auf | 1000 CCT |
werden zu dem Medium gegeben im Moment des Ansetzens, nachdem sie vorher in der Hitze während 20
Minuten sterilisiert worden waren.
Der Stamm von Klebsellia, der auf einem Gelose-Nährboden kultiviert wurde, wird in 10 ecm Kulturbouillon,
die mit Glaskügelchen versehen ist, verdünnt. Dann vermischt man mit 50 ecm Bouillon. Diese Lösung
dient als Inokulum durch Ausheberung für den Rest der Kulturbouillon. Das Kulturmedium wird auf 37°C
gehalten. Der pH-Wert des Kulturmediums wird durch automatische Einstellung auf 7,4 bis 7,6 gehalten.
Vorsichtshalber gibt man ein Antischaummittel hinzu und regelt den I.uftverbrauch und die Rührgeschwindigkeit
in geeigneter Weise.
Das Wachstum der Keime wird verfolgt mit Hilfe des Photometers, und die Anzahl der Keime wird berechnet
als Funktion der optischen Dichte, die bestimmt wurde im Vergleich zu einer Eichkurve. Die Kultur erfordert
ptw:i 7 .Stunden. Nach vollständiger Entwicklung
enthalten die Kulturen ungefähr 120 Milliarden Keime pro ecm.
Lysierung
Nach Beendigung der Kultur fügt man 80 y/ccm Lysozymhydrochlorid, gelöst in einigen ecm sterilen
Salzwassers, zu.
Man läßt während I Stunde bei 56°C einwirken, und
nach Überprüfung der Sterilität fügt man eine 2,5%ige Lösung von Natriumäthylmercurithiosalicylat und eine
33°/oige Lösung von Polyäthylenglykolsorbat, im Handel
erhältlich als TWEEN 80, hinzu.
Man läßt die Lysierung bei diesen sterilen Bedingungen
während 8 bis 15 Tagen bei etwa 400C ablaufen.
Der pH-Wert des Mediums wird anfänglich auf 7,4 bis 7.6 eingestellt. Die Lösungen von Glucose und Fhyton
Extraktion
Der bei der Lysierung entstehende Saft wird im Vakuum in einem Rotationsverdampfer oder durch
Lyophilisierung bis zu einem Drittel seines ursprüngli-4(i
chen Volumens eingeengt. Man erhält so ein rohes Produkt von dunkler Färbung und sehr dicker
Konsistenz.
Man kann gewünschtenfalls vor der Konzentrierung durch Zentrifugieren die Mikrobenkörper abtrennen.
> Die überstehende Flüssigkeit wird dann konzentriert.
Lipoidentfemung
Der konzentrierte Saft wird in 5 Volumenteilen einer
ίο Mischung aus 1 Volumen Methanol und 4 Volumen
Methylal in Suspension gebracht, die man langsam bei Raumtemperatur unter heftigem Rühren hinzugibt.
Fortschreitend fällt ein dichter, manchmal zusammenhaftender, stark gefärbter Niederschlag aus. Die
überstehende Flüssigkeit selbst ist braun gefärbt
Man läßt den Niederschlag während 15 Minuten absitzen und zieht den größten Teil der überstehenden
flüssigen Phase ab.
Die feste Fraktion wird dann in einen Filtertrichter überbracht und im Vakuum abgesaugt. Anschließend
wäw:ht man zweimal mit 5 Volumen Aceton. Man bringt dann den Niederschlag in einem minimalen Volumen
Aceton in Suspension und führt ihn in die Hülse einer Vorrichtung zur kontinuierlichen Extraktion über.
Man laugt diese Fraktion während 3 Tagen mit Aceton aus. Nach Ablauf dieser Zeil beendigt man das
Erwärmen, nimmt die Hülse und isoliert die feste Fraktion. In diesem Stadium der Reinigung zeigt sich die
Glykoproteinfraktion in Form eines mehr oder weniger agglomerierten Pulvers von brauner oder gelbbrauner
Farbe.
Eiweißkörperentfernung
Die von Lipoiden befreite Glykoproteinfraktion wird in einer Menge Wasser, die dem Vierfachen seines
Gewichts entspricht, in Lösung gebracht und dann während 3 Ta£&n im Eisschrank bei etwa 4"C
aufbewahrt.
Es entsteht eine schlammige Masse, die durch proteinartige denaturierte Verbindungen gebildet wird,
und eine kristalline Masse, die durch Mineralsalze und im wesentlichen durch Alkaliphosphate gebildet wird.
Man filtriert den Niederschlag durch ein Papier- oder Gazefiltcr, um die feste Fraktion abzutrennen. Das
Filtrat wird dann zentrifugiert.
Ausfällung der Glykoproteine
Die überstehende klare Lösung wird mit 5 Volumen einer Mischung behandelt aus I Volumen Methanol und
4 Volumen Methylal, die im Verlauf 1 Stunde unter hefigem Rühren zugegeben wird.
Der gebildete sandgelbe Niederschlag wird gewonnen, schnell mit Aceton gewaschen und über Phosphorpentoxyd
im Vakuum während 24 bis 48 Stunden getrocknet.
Nach der fast vollständigen Entwässerung wird das Produkt verrieben und erneut bei 45"C während 3 bis 4
Tagen getrocknet.
Man erhält so 6 bis 12 g Glykoproteine, die leicht gelblich gefärbt sind, aus I I Kulturmedium.
Herstellung einer Glykoproteinfraktion
ausgehend von Pneumokokken
ausgehend von Pneumokokken
Die Verfahrensweise ist identisch, mit der einzigen Ausnahme, daß das Inoculum mit 3,5% einer zusätzlichen
Nährlösung versetzt wird. Man stellt eine Mutterlösung her aus:
Backhefe
Destilliertes Wasser
Destilliertes Wasser
250 g
2000 ecm
2000 ecm
Kulturdauer beträgt e'.wa 20 Stunden. Das Medium enthält dann 120 MiMiarden Keime pro ecm.
Herstellung einer Glykoproteinfraktion
ausgehend von einer Streptokokkenkultur
ausgehend von einer Streptokokkenkultur
Die Verfahrensweise ist identisch mit der, die in Beispiel 3 beschrieben ist. Die Züchtungsdauer beträgt
ίο 20 Stunden. Das Medium enthält dann 100 Milliarden
Keime pro ecm.
Herstellung einer Glykoproteinfraktion
ausgehend von Staphylokokkenkulturen
ausgehend von Staphylokokkenkulturen
Das Medium wird entsprechend dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren angesetzt.
Der pH-Wert des Kulturmediums wird auf 7,2 -'Ii gehalten. Die Zuchtungszeit beträgt 7 Stunden. Das
Medium enthält dann 80 Milliarden Keime pro ecm.
Die darauf folgenden Stufen sind identisch mit den in Beispiel 2 beschriebenen.
>"> Beispiel 6
Herstellung einer Glykoproteinfraktion
ausgehend von Neisseria Catarrhalis
ausgehend von Neisseria Catarrhalis
Die Verfahrensweise ist die gleiche, wie sie in Beispiel κι 2 beschrieben ist. Das Medium wird im Moment des
Ansetzens durch Zugabe von 3% steriler Bauchwassersucht-Flüssigkeit angereichert.
Der pH-Wert des Kulturmediums wird auf 7 eingestellt. Die Züchtungsdauer beträgt 25 Stunden,
π Die Kultur enthält am Ende dieser Zeit 80 Milliarden Keime pro ecm.
π Die Kultur enthält am Ende dieser Zeit 80 Milliarden Keime pro ecm.
Herstellung einer Glykoproteinfraktion
ausgehend von einer Mischung von Mikrobenstämmen, die aus
Man läßt während 5 Minuten unter dauerndem Rühren sieden. Man filtriert in der Wärme über ein
Papierfilter. Zu 100 ecm dieser Lösung gibt man 40 g Glucose und füllt mit destilliertem Wasser auf 1000 ecm
auf.
Der pH-Wert der Lösung wird auf 8 eingestellt. Man sterilisiert diese Lösung 1 Stunde bei 110° C. Die
Pneumokokken
Staphylokokken
Streptokokken
Pneumokokken
Neisseria Catarrhalis
Klebsellia pneumoniae
Staphylokokken
Streptokokken
Pneumokokken
Neisseria Catarrhalis
Klebsellia pneumoniae
120 · lO'Keime/ccm
80 · 109Keime/ccm
80 · 109Keime/ccm
100 · 109Keime/ccm
120 ■ 109Keime/ccm
80 · 109Keime/ccm
80 · 109Keime/ccm
120 · 109Keime/ccm
■jo besteht.
Die Verfahrensweise ist identisch mit der, die in Beispiel 2 beschrieben wurde. Die Ausbeute der aktiven
Fraktion beträgt etwa 8 g.
Claims (1)
1. Langsame α- und ß-Glykoproteine aus Mikrobenkörpern, erhältlich durch
a) Kultivierung eines Mikrobenstammes, ausgewählt aus der Gruppe von Pneumokokken,
Streptokokken, Neisseria, Staphylokken, Mikrokokken, KJebsiella pneumoniae und Haemophilus influenzae oder einer Mischung von zwei
oder mehreren dieser Stämme oder einer Mischung von verschiedenen Typen eines
dieser Stämme, wobei man die Mikrobenkörper nach vollständiger Kultivierung manuell oder
automatisch sammelt und in einem wäßrigen Medium suspendiert,
b) in der Suspension die Mikrobenkörper chemisch, physikalisch und/oder enzymatisch Iysiert und die Reste der Mikrobenkörper
physikalisch abtrennt
e) die so erhaltene klare Lösung eindampft, den
Rückstand mit Lipoidlösungsmitteln behandelt,
d) das von Lipoiden befreite Produkt in einem wäßrigen Lösungsmittel löst, daraus die Eiweißkörper physikalisch fällt und entfernt und
e) aus der erhaltenen klären, wäßrigen Lösung die
langsamen Glykoproteine durch Zugabe eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels oder
einer Mischung derartiger Lösungsmittel ausfällt und gegebenenfalls durch in der Biochemie
übliche Verfahren weiter reinigt
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Legal Events
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---|---|---|---|
C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) |