DE69929885T2

DE69929885T2 - Formaldehydedehydrogenase gene aus methylotrophen hefen

Info

Publication number: DE69929885T2
Application number: DE69929885T
Authority: DE
Inventors: M. James Portland CREGG
Original assignee: Research Corp Technologies Inc
Current assignee: Research Corp Technologies Inc
Priority date: 1998-07-03
Filing date: 1999-07-02
Publication date: 2006-11-02
Anticipated expiration: 2019-07-03
Also published as: WO2000001829A2; CA2331765A1; IL140553A0; EP1095150B1; WO2000001829A3; EP1095150A2; IL140553A; AU762727B2; DK1095150T3; JP2002519067A; JP4511728B2; CA2331765C; AU4966699A; WO2000001829A9; ATE317902T1; DE69929885D1

Description

Hintergrund der Erfindung
Pichia ist eine methylotrophe Hefe, die zur Herstellung heterologer Proteine von industriellem und akademischen Interesse verbreitet verwendet wird (Cregg, 1998: Higgins and Cregg, 1998). FLD ist ein wichtiges Enzym bei der Verwendung von Methanol als Kohlenstoff- und Energiequelle (Veenhuis et al., 1983). Bei methylotrophen Hefen geht man davon aus, dass der Methanol-Stoffwechsel nahezu gleich ist und mit der Oxidierung von Methanol in Formaldehyd durch die Alkoholoxidase (AOX) beginnt, einer Wasserstoffperoxid-herstellenden Oxidase, die in einer Organelle, die als Peroxisom bezeichnet wird, sequestriert ist. Wasserstoffperoxid wird dann mit Hilfe der Catalase in Sauerstoff und Wasser abgebaut, dem klassischen peroxisomalen Markerenzym. Ein Teil des erhaltenen Formaldehyds kondensiert mit Xylolose-5'-monophospat in einer Reaktion, die durch Dihydroxyacetonsynthase (DAS), dem dritten Enzym des peroxisomalen Methanol-Stoffwechselwegs katalysiert wird. Die Produkte dieser Reaktion, Glyceraldahyd-3-phospat (GAP) und Dihydroyaceton verlassen das Peroxisom und treten in eine zyklischen Stoffwechsel ein, der Xylolose-5'-monophosphat regeneriert und auch ein Nettomolekül GAP in jeweils 3 Runden des Zyklus erzeugt. GAP^– wird für die Biosynthese von Kohlenstoffskeletten des Zellwachstums verwendet. Ein weiterer Teil des Formaldehyds verlässt das Peroxisom und wird durch Formaldehyddehydrogenase (FLD) in Format oxidiert und dann durch Formatdehydrogenase (FDH) zu Kohlendioxid. Diese beiden Reaktionen stellen Reduktionskraft in Form von NADH bereit. Ein Modell der FLD-Funktion liegt darin, dass das durch FLD und FDH erzeugte NADH während des Wachstums auf Methanol als Primärquelle für Energie dient (Veenhuis et al., 1983). Das zweite Modell schlägt vor, dass die meiste Energie für das Methanol-Wachstum aus der Oxidation eines oder mehrerer der Xylolose-5'monophosphatzyklus-Zwischenprodukte durch die Enzyme des Tricarbonsäurezyklus stammt, und dass die primäre Rolle von FLD darin liegt, die Zelle vor toxischem Formaldehyd zu schützen, welches sich mit überschüssigem Methanol im Medium anhäuft (Sibirny et al. 1990).
Zusätzlich zum Methanol ist FLD auch an der Metabolisierung bestimmter methylierter Amine (z.B. Methylamin und Cholin) als einzigen Stickstoffquellen beteiligt (Zwart et al., 1980). Bei diesem Stoffwechselweg werden zuerst Aminogruppen durch die peroxisomale Aminoxidase freigesetzt, was Formaldehyd zurücklässt, welches durch FLD und FDH weiter oxidiert wird. Wenn sie auf Methylamin als einziger Stickstoffquelle wachsen, werden hohe Mengen an FLD, selbst in Gegenwart von überschüssiger Glucose, induziert. Deswegen scheint die Hauptrolle von FLD im Methylaminmetabolismus darin zu liegen, die Zellen vor den toxischen Wirkungen des Formaldehyds zu schützen und nicht in der Erzeugung von Kohlenstoff oder Energie.
Die FLD-Synthese wird unabhängig als Reaktion auf entweder Methanol als einziger Kohlenstoffquelle und Energiequelle oder Methylamin als einziger Stickstoffquelle reguliert. Daher werden beispielsweise nur niedrige FLD-Mengen in Zellen beobachtet, die auf Glucose- und Ammoniumionen-haltigem Medium wachsen, während sowohl auf Methanolammoniumionen- als auch auf Glucosemethylaminmedium FLD-Mengen hoch sind.
Im Pichia-System werden die meisten fremden Gene unter der transkriptionellen Kontrolle des P. pastoris-Alkoholoxidase-1-Genpromotors (P_AOX1), dessen regulatorische Eigenschaften für diesen Zweck gut geeignet sind, exprimiert. Der Promotor wird während des Wachstums der Hefe auf den meisten Kohlenstoffquellen, wie beispielsweise auf Glucose, Glycerol oder Ethanol, streng unterdrückt, aber während des Wachstums auf Methanol stark induziert (Tschopp et al., 1987; US Patent Nr. 4,855,231 von Stroman, D.W., et al.). Zur Herstellung fremder Proteine werden P_AOX1-kontrollierte Expressionsstämme anfänglich auf einer unterdrückenden Kohlenstoffquelle gezüchtet, um Biomasse zu erzeugen, und dann wird zu Methanol als einziger Kohlenstoffquelle und Energiequelle gewechselt, um die Expression des Fremdgens zu induzieren. Ein Vorteil des P_AOX1-Regulator-Systems liegt darin, dass P. pastoris-Stämme, die mit fremden Genen transformiert sind, deren Expressionsprodukte toxisch für die Zellen sind, am Wachsen gehalten werden können, wenn sie unter repressiven Bedingungen wachsen.
Obwohl viele Proteine erfolgreich unter Verwendung von P_AOX1 hergestellt worden sind, ist dieser Promotor nicht für alle Situationen geeignet oder günstig. Beispielsweise verdampft Methanol schnell in Schüttelkolbenkulturen und es ist ungünstig, die Methanolkonzentrationen zu überwachen und die Verbindung wiederholt zum Medium hinzuzugeben. Zusätzlich ist die Lagerung großer Mengen an Methanol, die für das Wachstum und die Induzierung von P_AOX1-kontrollierten Expressionsstämmen benötigt werden, in großvolumigen hochdichten Fermenterkulturen eine potentielle Feuergefahr. Es gibt daher die Notwendigkeit eines alternativen Promotors als P_AOX1, welcher sowohl transkriptionell effizient ist und durch weniger flüchtige und entflammbare Induktoren regulierbar ist. Die vorliegende Erfindung stellt den P. pastoris und Hansenula polymorpha-Formaldehyddehydrogenasegen(FLD)-Promotor mit beiden Eigenschaften bereit.
Zusätzlich gibt es eine Notwendigkeit für einen selektionierbaren Marker, der in methylotrophen Hefen arbeitet, welcher anders ist als ein selektierbarer Marker, der ein Antibiotikaresistenzgen ist. Zur Zeit kann nur das Zeo^R-Gen verwendet werden, um P. pastoris-Stämme unabhängig von ihrem Genotyp zu transformieren. Zusätzlich ist Zeo^R das einzige Gen, das verwendet werden kann, um direkt nach P. pastoris-Stämmen auszuwählen, die mehrere Kopien eines Expressionsvektors erhalten haben (durch Erhöhen der Konzentration an Zeocin im Selektionsmedium). Ein zweites Gen, das Resistenz gegen das Antibiotikum G418 (G418^R) verleiht, kann verwendet werden, um Multikopie-Expressionsstämme von P. pastoris zu durchmustern, aber dessen Verwendung macht notwendig, dass in den Vektoren ein auxotropher/biosynthetischer Gen-Selektionsmarker ebenfalls enthalten sein muss, um die Transformanten zu selektionieren. Das FLD-Struktur-Gen der vorliegenden Erfindung kann als selektionierbarer Marker in methylotrophen Hefezellen verwendet werden, und es verleiht keine Resistenz gegen Antibiotika.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf isolierte Nukleinsäuresequenzen, die ein Formaldehyddehydrogenase-Gen (FLD) methylotropher Hefen umfassen. Die Beschreibung beschreibt die isolierten Nukleinsäuren, welche Sequenzen umfassen, die unter niedrig stringenten Bedingungen mit mindestens einer der Nukleotidsequenzen, die in SEQ. ID. Nr. 1, SEQ. ID. Nr. 5 oder einer komplementären Sequenz zur in SEQ. ID. Nr. 1 oder 5 ausgeführten Sequenzen hybridisiert.
Ebenfalls bereitgestellt wird ein FLD-Gen von Pichia pastoris (FLD1) mit einer Restriktionskarte, die in 7 ausgeführt ist, und ein FLD-Gen von Hansenula polymorpha mit der Restriktionskarte, die im schraffierten Bereich der 10 gezeigt ist.
Die Beschreibung beschreibt eine isolierte Nukleinsäure umfassend ein FLD-Gen einer methylotrophen Hefe mit einer kodierenden Sequenz mit einer Sequenzhomologie von ungefähr 70% bis ungefähr 85%, wenn es mit der in SEQ. ID. Nr. 5 gezeigten Nukleotidsequenz verglichen wird.
Ebenfalls beschrieben wird eine isolierte Nukleinsäure, die ein FLD-Gen einer methylotrophen Hefe umfasst, mit einer kodierenden Sequenz, die eine Sequenzhomologie von ungefähr 85% bis ungefähr 95% hat, wenn sie mit der Nukleotidsequenz verglichen wird, die in SEQ. ID. Nr. 5 ausgeführt ist. Ebenfalls beschrieben wird eine isolierte Nukleinsäure, die ein FLD-Gen einer methylotrophen Hefe umfasst mit einer kodierenden Sequenz mit einer Sequenzhomologie von mehr als ungefähr 95%, wenn sie mit der Nukleotidsequenz verglichen wird, die in SEQ. ID. Nr. 5 gezeigt ist.
Isolierte Nukleinsäuren, die die in SEQ. ID. Nr. 1 oder SEQ. ID. Nr. 5 gezeigten Sequenzen umfassen, werden ebenfalls bereitgestellt.
Die Beschreibung beschreibt eine isolierte Nukleinsäure einer methylotrophen Hefe umfassend einen FLD-Promotor. Der Promotor ist stromaufwärts des Translationsstartkodons eines FLD-Gens mit einer kodierenden Sequenz lokalisiert, welche eine Sequenzhomologie von ungefähr 70% bis ungefähr 85% hat, wenn sie mit der Nukleotidsequenz der FLD-kodierenden Sequenz verglichen wird, die in SEQ. ID. Nr. 5 gezeigt ist. Ebenfalls beschrieben ist eine isolierte Nukleinsäure einer methylotrophen Hefe umfassend einen FLD-Promotor eines FLD-Gens mit einer kodierenden Sequenz mit einer Sequenzhomologie von ungefähr 85 bis ungefähr 95%, wenn sie mit der Nukleotidsequenz der FLD-kodierenden Sequenz verglichen wird, die in SEQ. ID. Nr. 5 gezeigt ist. Der Promotor stammt von einem FLD-Gen mit einer kodierenden Sequenz mit einer Sequenzhomologie von mehr als ungefähr 95%, wenn er mit der Nukleotidsequenz der FLD-kodierenden Sequenz verglichen wird, die in SEQ. ID. Nr. 3 gezeigt ist. Besonders wird beispielhaft ein Pichia pastoris FLD1-Promotor angegeben, der die Sequenz umfasst, die in SEQ. ID. Nr. 3 gezeigt ist.
In der Beschreibung wird ebenfalls eine isolierte Nukleinsäure beschrieben, die eine FLD 3'-Terminationssequenz einer methylotrophen Hefe umfasst. Die 3'-Terminationssequenz ist stromabwärts des Translationsstartkodons eines FLD-Gens mit einer kodierenden Sequenz lokalisiert, mit einer Sequenzhomologie von ungefähr 70% bis ungefähr 95%, wenn sie mit der Nukleotidsequenz der FLD-kodierenden Sequenz verglichen wird, die in SEQ. ID. Nr. 5 gezeigt ist. Ebenfalls beschrieben wird eine isolierte Nukleinsäure umfassend eine FLD3'-Terminationssequenz eines Gens mit einer kodierenden Sequenz mit einer Sequenzhomologie von ungefähr 85% bis ungefähr 95%, wenn sie mit der Nukleotidsequenz der FLD-kodierenden Sequenz verglichen wird, die in SEQ. ID. Nr. 5 gezeigt wird. Ebenfalls beschrieben wird eine isolierte Nukleinsäure umfassend eine FLD 3'- Terminationssequenz eines Gens mit einer kodierenden Sequenz mit einer Sequenzhomologie von mehr als ungefähr 95%, wenn sie mit der in SEQ. ID. Nr. 5 gezeigten Sequenz verglichen wird.
Ebenfalls beschrieben werden isolierte Nukleinsäuren umfassend ein FLD-Gen, wobei dieses FLD-Gen ein Produkt mit einer Aminosäuresequenzidentität von ungefähr 30% bis ungefähr 49%, oder ungefähr 50% bis ungefähr 90%, oder mehr als ungefähr 90% kodiert, wenn es mit der Aminosäuresequenz verglichen wird, die in SEQ. ID. Nr. 2 gezeigt ist.
Zusätzlich beschreibt die Beschreibung ebenfalls eine isolierte Nukleinsäure, die mindestens eines aus einem Promotor, einer kodierenden Sequenz oder einem 3'-Terminationssequenz eines FLD-Gens umfasst, wobei dieses FLD-Gen ein Produkt kodiert, das eine Aminosäuresequenzidentität von ungefähr 30% bis ungefähr 49%, oder ungefähr 50% bis ungefähr 90% oder mehr als ungefähr 90% hat, wenn sie mit der Aminosäuresequenz verglichen wird, die in SEQ. ID. Nr. 2 gezeigt wird.
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung Expressionskassetten, Vektoren und Wirtszellen, die die betroffenen isolierten Nukleinsäuren umfassen, dar.
Ebenfalls in der Beschreibung wird ein Verfahren zum Dirigieren der Expression eines heterologen Gens in einer methylotrophen Hefe beschrieben. Das Verfahren umfasst das Einschleusen einer isolierten Nukleinsäure in eine methylotrophe Hefezelle, welche einen FLD-Promotor umfasst, der aus einer methylotrophen Hefe isoliert wurde, wobei dieser Promotor funktionsfähig an dessen 3'-Ende an das 5'-Ende eines heterologen Gens gebunden ist, wobei dieses heterologe Gen funktionsfähig an seinem 3'-Ende an das 5'-Ende einer Terminationssequenz gebunden ist, die in einer methylotrophen Hefe funktioniert. Die methylotrophen Hefezellen werden in einem Medium gezüchtet, das eine geeignete Kohlenstoffquelle hat, wie beispielsweise Glycerol oder Glucose, und eine geeignete Stickstoffquelle, wie beispielsweise ein Ammoniumsalz oder Ammoniumhydroxid. Nachdem die Kohlenstoff- oder Stickstoffquelle depletiert worden ist, wird die Expression dieses heterologen Gens durch die Zugabe von Methanol oder Methylamin oder sowohl Methanol und Methylamin induziert. Die Expression kann ebenfalls durch die Zugabe von Formaldehyd, Format oder einem methylierten Amin induziert werden.
Ein Verfahren zum Selektionieren einer Formaldehyd-resistenten Wirtszelle wird ebenfalls in der Beschreibung beschrieben. Das Verfahren umfasst das Transformieren einer methylotrophen Hefezelle mit einem Vektor, der ein FLD-Gen umfasst, wobei dieses FLD-Gen operativ an seinem 5'-Ende an einen FLD-Promotor oder einen heterologen Promotor gebunden ist, welcher in dieser Hefezelle funktioniert, wobei dieses FLD-Gen operativ an seinem 3'-Ende an eine 3'-Terminationssequenz gebunden ist, die in dieser Hefezelle funktioniert. Wirtszellen werden in Gegenwart von Formaldehyd gezüchtet, und eine Hefezelle, die in Gegenwart von Formaldehyd wächst, wird selektioniert.
Die Beschreibung beschreibt auch einen Stamm einer methylotrophen Hefe, welcher hinsichtlich des FLD-Gens (fld) defekt ist, beispielsweise Pichia pastoris GS241 (fld1-1). Ebenfalls bereitgestellt wird ein Stamm einer methylotrophen Hefe, welcher in einem FLD-Gen defekt ist, und auxotroph für eine anderes biosynthetisches Gen ist.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt eine physiologische Karte der ausgewählten Plasmide pHW018, pSS050, pK321 und pSS040 bereit.
2 ist eine Restriktionsenzymkarte des FLD1-Gen-enthaltenden Vektors pYG1.
3A zeigt die Exonanalyse des FLD-Gens. Ein Diagramm der erwarteten Produkte der PCR nicht gespleißter (genomischer) und gespleißter (cDNA) DNAs wird angegeben. Die Stellen der hybridisierten Primer, die in den PCR-Reaktionen verwendet werden, werden als konvergente Pfeile gezeigt.
3B ist ein Elektrophoretogramm von PCR und RT-PCR-Reaktionsprodukten. Die PCR-Reaktionen wurden mit folgendem durchgeführt: Spur 1, genomische DNA-Matrize plus beide Primer; Spur 2, cDNA-Matrize plus beide Primer; Spur 3, cDNA-Matrize plus 5'-Primer allein; Spur 4, cDNA-Matrize plus 3'-Primer allein; Spur 5, beide Primer ohne DNA-Matrize. Die flankierenden Markerbanden werden in Basenpaaren angegeben.
4 ist die Nukleotid und abgeleitete Aminosäuresequenz von P. pastoris FLD1-Gen und dessen Produkt.
5 ist eine Vergleich der vorhergesagten Aminosäuresequenzen von P. pastoris und C. maltosa FLD-Proteinen. Die Sequenzen wurden aneinander gelagert, indem die PC-Gen-Software verwendet wurde. Das Symbol „*" zwischen den Sequenzen zeigt die Reste an, die identisch sind. Die Bezeichnung „." zeigt ähnliche Reste an. Ähnliche Reste werden definiert als: A, S, T; D, E; N, Q; R, K; I, L, M, V; F, Y, W.
6 stellt graphisch die Thermostabilität der Formaldehyddehydrogenaseaktivitäten in P. pastoris-Stämmen dar, die mit den putativen FLD1-Genen von P. pastoris und H. polymorpha transformiert sind.
Die gezeigten Stämme sind: Wildtyp P. pastoris (∎); Wildtyp H. polymporpha (•); P, pastoris MS105 (pYG1) (☐); und P. pastoris MS105 (pYG2) (o),
7a ist eine Restriktionskarte des Pichia pastoris-FLD1-gens.
8 ist die Restriktionskarte von P_FLD1.
9 ist eine Restriktionsenzymkarte des Hansenula polymorpha FLD-Gen-haltigen Promotors pYG2.
10 ist eine Restriktionskarte eines H. polymorpha DNA-Fragments, das das FLD-gen enthält.
11 ist ein Southern Blot, der genomische DNA von H. polymorpha zeigt, die entweder mit BglII(B2) verdaut wurde (Spuren 1–3), oder ClaI (C) (Spuren 4–6) und mit den folgenden Sonden hybridisiert wurde: pYG2 (Spuren 1 und 4), pYM8 (Spuren 2 und 5) oder pYG1 (Spuren 3 und 6).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegenden Erfindung richtet sich auf isolierte Nukleinsäuresequenzen umfassend Formaldehyddehydrogenasegene (FLD) von methylotrophen Hefen. Das Produkt des FLD-Gens, Formaldehyddehydrogenase, verleiht Resistenz gegenüber Formaldehyd. In einem Aspekt der Erfindung kann die FLD-kodierende Sequenz mit seinen eigenen 5'- und 3'-regulatorischem Bereich oder mit einer heterologen 5'- und 3'-regulatorischen Region verwendet werden, um als selektionierbarer Marker in einer methylotrophen Hefezelle zu funktionieren. Die betroffenen FLD-kodierenden Sequenzen sind dann vorteilhaft, wenn die Verwendung von Antibiotikaresistenzgen als selektierbarer Marker zu vermeiden ist.
Erfindungsgemäß kann ein betroffenes FLD-Gen als selektierbarer Marker verwendet werden, der wie Zeo^R unabhängig vom Genotyp des P. pastoris-Stammes selektioniert werden kann und wie Zeo^R und G418^R direkt verwendet werden kann, um Stämme zu selektionieren, die mehrere Kopien eines Expressionsvektor erhalten haben. Anders als Zeo^R und G418^R stammt das P. pastoris FLD1-Gen jedoch aus P. pastoris und verleiht keine Resistenz gegenüber einem Antibiotikum.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden FLD-Gene mit den Restriktionskarten von Pichia pastoris und Hansenula polymorpha bereitgestellt, die in den 7 bzw. der schraffierten Region der 10 gezeigt sind. Die FLD-Expression als Reaktion auf Methanol oder Methylamin wird auf transkriptionellem Niveau kontrolliert. Das FLD-Gen von Pichia pastoris (FLD1) kann weiter im Hinblick auf dessen Nukleotidsequenz beschrieben werden, wobei die Sequenz in 4 gezeigt ist (SEQ. ID. Nr. 1). Die Nukleotidsequenz der kodierenden Region des FLD1G ist in SEQ. ID. Nr. 5 gezeigt.
In einem anderen erfindungsgemäßen Aspekt werden induzierbare 5'-regulatorische Regionen von FLD-Genen bereitgestellt (hier abwechselnd als „FLD-Promotoren" verwendet), die aus methylotrophen Hefen isoliert wurden, wobei die 5'-regulatorischen Regionen für die effiziente Expression heterologer Gene in Zellen einer methylotrophen Hefe nützlich sind. Die betroffenen 5'-regulatorischen Regionen von FLD werden stark und unabhängig durch verschiedene Kohlenstoff- und/oder Energiequellen wie beispielsweise Methanol, Formaldehyd und Format induziert. Weder Formaldehyd noch Format sind Kohlenstoffquellen im eigentlichen Sinne, da Pichia pastoris keinen Kohlenstoff solcher Verbindungen nutzt, sondern nur Energie aus ihrer Oxidierung gewinnt. Die jeweiligen FLD 5'-regulatorischen Regionen werden ebenfalls stark und unabhängig voneinander durch verschiedene Stickstoffquellen wie Methylamin, Cholin und andere methylierte Amine induziert. Beispielsweise wird der Pichia pastoris FLD1-Promotor stark und unabhängig durch entweder Methanol als einzige Kohlenstoffquelle (mit Ammoniumhydroxid oder einem Ammoniumsalz als Stickstoffquelle) oder durch Methylamin als einziger Stickstoffquelle (mit einem Kohlenstoffzucker als Kohlenstoffquelle) induziert. Beispiele nicht induzierender Stickstoffquellen schließen Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid und Ammoniumhydroxid ein. Beispiele nicht induzierender Kohlenstoffquellen schließen Glycerol und Glucose ein.
Daher stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereit, das ungefähr 600 bp oder mehr einer Nukleotidsequenz umfasst, die stromaufwärts das Translationsstartkodon eines FLD-Gens einer methylotrophen Hefe umfasst. Besonders beispielhaft dargetan ist der Promotor des Pichia pastoris FLD-Gens (FLD1) mit der Restriktionskarte, die in 8 dargestellt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform hat der FLD1-Gen-Promotor die Nukleotidsequenz, die in SEQ. ID. Nr. 5 gezeigt ist. Ebenfalls beispielhaft angegeben wird der FLD-Promotor von Hansenula polymorpha mit den Restriktionskarten, die in dem schraffierten Bereich der 10 angegeben sind.
Die Beschreibung beschreibt ebenfalls FLD 3'-Terminationssequenzen von methylotrophen Hefen. Es gibt eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die ungefähr 300 Nukleotide oder mehr der Sequenz umfasst, die stromabwärts vom Translationsstopkodon des FLD-Gens lokalisiert ist. Beispielsweise kann die 3'-Terminationssequenz die Nukleotide 1255–1555 der 4 (SEQ. ID. Nr. 4) umfassen. Die 3'-Terminationssequenz stammt vom Hansenula polymorpha FLD-Gen, wobei dieses Gen als schraffierter Bereich in 10 gezeigt ist.
Modifizierungen des FLD1-Promotors, die in SEQ. ID. Nr. 3 gezeigt sind, welche die charakteristische Eigenschaft der Förderung der Expression entweder durch Methanol, Formaldehyd oder durch die Formatinduktion oder durch Methylamin, Cholin oder anderer methylierte Amininduktion bewahren, liegen innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung. Modifizierungen der 3'-Terminationssequenz, die in SEQ. ID. Nr. 4 gezeigt ist, welche die charakteristische Eigenschaft der Stabilisierung des mRNA-Transkriptionsproduktes eines Gens bewahren, werden ebenfalls beschrieben. Gleichermaßen liegen Modifizierungen der Pichia pastoris FLD-kodierenden Sequenz (4, SEQ. ID. Nr. 5), welche die charakteristische Eigenschaft des Kodierens einer biologisch aktiven Formaldehyd-Dehydrogenase bewahren, innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung. Solche Modifizierungen schließen Inversionen, Deletionen und Substitutionen von einem oder mehreren Nukleotiden ein.
Die Beschreibung beschreibt ebenfalls methylotrophe Hefestämme, die hinsichtlich des FLD-Gens defekt sind, d.h. FLD-Mutanten. Solche Stämme können durch das Exponieren methylotropher Hefezellen gegenüber einem Mutagen wie beispielsweise Nitrosoguanidin erzeugt werden und durch das Durchmustern auf Stämme, die nicht in der Lage sind, Methanol als einzige Kohlenstoffquelle und Methylamin als einzige Stickstoffquelle zu benutzen. Die Komplementierung oder andere genetische Techniken können dann verwendet werden, um zu bestätigen, dass ein methylotropher Hefestamm eine FLD-Mutante ist. Ein Pichia pastoris FLD-Stamm wird beschrieben und als GS241 (fldl1-1)-Stamm bezeichnet. Der FLD-mutierte methylotrophe Hefestamm kann mit einem anderen Stamm gekreuzt werden, welcher eine auxotrophe Mutante für ein Biosynthese-Gen ist oder einen anderen selektierbaren Marker hat. Beispielsweise wird ein Pichia pastoris-Hefestamm beschrieben, der defekt bezüglich der Methanolverwendung (MUT^–) und auxotroph für Histidin (His^–) ist, und als MS105 (fldl1-1 his4) bezeichnet wird.
Das FLD-Gen kann aus methylotrophen Hefen unter Verwendung klassischer funktionaler Komplementierungstechniken isoliert werden. Kurz gefasst wird eine genomische DNA-Bibliothek aus methylotrophen Hefen in einen Vektor kloniert, der sich in methylotrophen Hefen repliziert. Die Vektoren werden verwendet, um eine methylotrophe Hefe zu transformieren, die eine FLD-Mutante ist. Zellen, die in Gegenwart von Methanol wachsen (oder irgendwelche der oben beschriebenen induzierenden Mittel) werden als ein funktionales FLD-Gen enthaltend aus der genomischen Bibliothek selektioniert. Der Vektor wird aus den komplementierten Hefezellen isoliert und eine Restriktionskarte angefertigt. Fragmente des Vektorinserts können subkloniert werden und zum Transformieren einer FLD-Mutante verwendet werden, und ein kleineres Fragment, das immer noch die FLD-Mutante komplementiert, wird isoliert. Das Insert dieses Vektors kann sequenziert werden und das offene Leseraster (ORF) des FLD-Gens identifiziert werden. Wie in den Beispielen 2 und 3 beschrieben wird, wurden sowohl das Pichia pastoris FLD1-Gen und das Hansenula polymorpha FLD-Gen durch funktionale Komplementierung isoliert.
Nukleinsäuremoleküle, die den kodierenden Sequenzen, den Promotoren oder den 3'-Terminationssequenzen eines FLD-Gens einer methylotrophen Hefe entsprechen, können ebenfalls erhalten werden, indem das gesamte FLD-Gen, die gesamte kodierende Sequenz des FLD-Gens oder Teile der FLD1-kodierenden Sequenz (einschließlich von Fragmenten und Oligonukleotiden) als Sonde verwendet wird, und indem mit Nukleinsäuremolekülen einer methylotrophen Hefe hybridisiert wird. Nukleinsäuremoleküle, die mit dem gesamten Pichia pastoris FLD-Gen hybridisieren (SEQ. ID. Nr. 1) oder mit der FLD-kodierenden Sequenz (4, SEQ. ID. Nr. 5) oder mit Teilen der Nukleotidsequenz, die in SEQ. ID. Nr. 5 gezeigt ist, können z.B. aus genomischen Bibliotheken durch gut bekannte Techniken isoliert werden. Verfahren, die zum Erhalt genomischer DNA-Sequenzen durch Durchmustern einer genomischen Bibliothek als nützlich angesehen werden, welche dem Pichia pastoris FLD-Gen der vorliegenden Erfindung entsprechen, werden in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York beispielsweise als eines der Vielzahl von Laborhandbüchern über rekombinante DNA-Technologie, die weit verbreitet verfügbar sind, gewonnen.
Ein jeweiliges FLD-Gen kann aus einem Restriktionsendonukleaseverdau isolierter FLD-genomischer Klone stammen. So wird beispielsweise die bekannte Nukleotid- oder Aminosäuresequenz des Pichia pastoris FLD1-Gens (4, SEQ. ID. Nr. 1 und 2) mit der Nukleinsäure oder abgeleiteten Aminosäuresequenz eines isolierten möglichen FLD-genomischen Klons aneinander gelagert und die 5'-regulatorische Sequenz (d.h. die Sequenz stromaufwärts des Translationsstartkodons der kodierenden Region), die kodierende Sequenz und die 3'-regulatorische Sequenz (d.h. die Sequenz stromabwärts des Translationsstopkodons der kodierenden Region) des isolierten FLD-Genomklons werden lokalisiert.
Ein beliebiger FLD-Promotor, die 3'-Terminationssequenz oder die kodierende Sequenz können aus genomischen Klonen mit überschüssigen 5'-flankierenden Sequenzen, überschüssigen kodierenden Sequenzen oder überschüssigen 3'-flankierenden Sequenzen beispielsweise durch in vitro-Mutagenese erzeugt werden. Die in vitro-Mutagenese ist zum Einschleusen günstiger Restriktionsschnittstellen hilfreich. Es gibt zahlreiche kommerziell erhältliche Kits, die besonders für diese Anwendung geeignet sind, wie beispielsweise den T7-Gen-in vitro-Mutagenesekit (USB, Cleveland, OH) durch den QuikChange Site Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, San Diego, CA). Alternativ dazu können PCR-Primer definiert werden, die ermöglichen, eine Amplifizierung eines jeweiligen FLD-Promotors, der kodierenden Sequenz und der 3'-Terminationssequenz zu ermöglichen.
Unter Verwendung der gleichen Methoden kann der gewöhnlich begabte Fachmann eines oder mehrere Deletionsfragmente des FLD1-Promotors erzeugen, die in SEQ. ID. Nr. 3 gezeigt sind. Jedes und alle Deletionsfragmente, die einen zusammenhängenden Teil der Nukleotidsequenz umfassen, der in SEQ. ID. Nr. 3 gezeigt ist und welcher die Fähigkeit bewahrt, die Expression entweder durch Methanol, Formaldehyd oder Formatinduktion, oder aber welcher die Kapazität zur Förderung des Expression entweder durch Methylamin, Cholin oder andere methylierter Amininduktion zu fördern, wird durch die vorliegende Erfindung in Betracht gezogen. Gleichermaßen werden jedes und alle Deletionsfragmente, die einen zusammenhängenden Teil der Sequenz, die in SEQ. ID. Nr. 4 und 5 gezeigt wird, und welche die Fähigkeit zur Stabilisierung von MRNA-Transkriptionsprodukten eines Gens bewahren, oder die Fähigkeit bewahren, für ein biologisch aktives FLD zu kodieren, beschrieben.
Zusätzlich zum Pichia pastoris FLD-Promotor, dessen Nukleotidsequenz als Nukleotide –537 bis –1 in der 1 gezeigt ist (SEQ. ID. Nr. 3), richtet sich die vorliegende Erfindung auch auf andere Promotorsequenzen, die den FLD-Genen in anderen methylotrophen Hefen entsprechen. So wie es hier definiert wird, können solche verwandten Sequenzen, die die Expression durch Induktion durch Methanol, Formaldehyd oder Formatinduktion fördern oder aber die Expression entweder durch Methylamin, Cholin oder andere methylierte Amine fördern, im Hinblick auf ihre Lokalisierung stromaufwärts des Translationsstartkodons einer FLD-kodierenden Sequenz beschrieben werden, wobei die kodierende Sequenz im Hinblick auf die prozentuale Homologie auf Nukleotidniveau mit der Nukleotid-kodierenden Sequenz beschrieben wird, die in 4 gezeigt ist (SEQ. ID. Nr. 5).
Alternativ dazu können die FLD-kodierenden Sequenzen aus methylotrophen Hefen im Hinblick auf ihre Fähigkeit definiert werden, mit den beispielhaft angegebenen Pichia pastoris FLD1-Genen (SEQ. ID. Nr. 1) oder den FLD1-kodierenden Sequenzen (SEQ. ID. Nr. 5) unter niedrig stringenten Hybridisierungsbedingungen zu hybridisieren. Die vorliegende Erfindung schließt daher auch Nukleinsäuresequenzen ein, die isoliert wurden aus methylotrophen Hefen, welche einen Promotor umfassen, eine kodierende Region oder 3'-Terminationssequenzen, die einem FLD-Gen entsprechen, wobei die kodierende Region eines solchen FLD-Gens unter niedrig stringenten Bedingungen mit dem FLD-Gen mit der FLD-Gen-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die in SEQ. ID. Nr. 1 oder 5 gezeigt ist, oder mit Sequenzen, die komplementär mit Sequenzen sind, die in SEQ. ID. Nr. 1 oder 5 gezeigt sind. Der Promotor, die kodierende Region oder die 3'-Terminatiionssequenzen eines FLD-Gens mit kodierender Region hybridisieren mit einer Sequenz, die in SEQ. ID. Nr. 1 oder 5 gezeigt ist, und können in einer oder mehreren Nukleotidpositionen im Vergleich mit SEQ. ID. Nr. 1 bis 5 unterscheiden, sofern eine derartige kodierende Sequenz eines FLD-Gens für ein biologisch aktives FLD kodiert oder sofern ein derartiger FLD-Promotor jeweils entweder durch Methanol, Formaldehyd oder Format als Energiequelle oder durch Methylamin, Cholin oder andere methylierte Amine als einziger Stickstoffquelle induziert wird. Zusätzlich kann eine gegebene 3'-Terminationssequenz sich in einer oder mehrerer Nukleotidpositionen im Vergleich mit SEQ. ID. Nr. 5 unterscheiden, sofern eine derartige 3'-Terminationssequenz die Fähigkeit bewahrt, die mRNA-Transkripte zu stabilisieren, wenn sie operativ an eine kodierende Sequenz gebunden werden.
Durch „Hybridisieren" wird gemeint, dass solche Nukleinsäuremoleküle unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen hybridisieren, die denen entsprechen, die z.B. in Sambrook (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)) beschrieben sind.
FLD-Gene (genomische Sequenzen), und FLD-kodierende Sequenzen aus methylotrophen Hefen können durch Hybridisierung der kodierenden Region oder von Teilen davon mit FLD1 (SEQ. ID. Nr. 1 und 5, wie auch die komplementären Sequenzen zu SEQ ID. Nr. 1 und 5) unter Verwendung konventioneller Hybridisierungsbedingungen identifiziert werden. Bevorzugt werden niedrige Hybridisierungsbedingungen verwendet, wie beispielsweise 30% Formamide bei 37°C, gefolgt von Waschen in 1 × SSC bei Raumtemperatur und 1 × bei 60°C. Mögliche FLD-Gene, die in der Größe von ungefähr 2 kb bis ungefähr 3,5 kb oder ungefähr 2,5 kb bis ungefähr 3,5 kb reichen, die mit SEQ. ID. NR: 1 oder 5 unter niedrig stringente Bedingungen hybridisieren, können weiter durch das Anfertigen einer Restriktionskarte und Sequenzieren charakterisiert werden. Unter Verwendung des FLD1-Gens im Plasmid pYG1 als Sonde und das Hybridisieren unter solchen niedrig stringenten Bedingungen kann das H. polymorpha FLD-Gen identifiziert werden. Siehe Beispiel 3.
FLD-Promotoren und 3'-Terminationssequenzen können ebenfalls durch ihre Fähigkeit der entsprechenden kodierenden Sequenz des FLD-Gens definiert werden (von dem der Promotor der 3'-Terminationssequenz stammt), um unter niedrig stringenten Bedingungen mit der kodierenden Sequenz zu hybridisieren, die in 4 gezeigt ist (SEQ. ID. Nr. 1 und 5) wie auch mit den komplementären Sequenzen von SEQ. ID. Nr. 1 und 5.
Die FLD-Struktur-Gene, Promotorfragmente und Terminatorsequenzen der vorliegenden Erfindung können ebenfalls im Hinblick auf die prozentuale Homologie auf Nukleotidniveau mit der Nukleotidsequenz beschrieben werden, die hier bereitgestellt wird. Es gibt eine Anzahl an Computerprogrammen, die Nukleinsäuresequenzen anlagern und vergleichen, die jemand mit Fachwissen im Gebiet für die Zwecke der Bestimmung der Sequenzhomologien verwenden kann. Beispielsweise kann das PC/Gen-Programm verwendet werden (Ausgabe 6.6, IntelliGenetics, Inc., Mountainview, Ca.) mit einem open gap cost von 15 und einem unit gap cost von 10.
So wie es hier verwendet wird, schließt der prozentuale Sequenzhomologiewert nicht nur die prozentuale Homologie einer isolierten Nukleinsäure ein, wenn sie mit der Einzelstrangsequenz, die in einer bestimmten SEQ. ID. Nummer gezeigt wird, verglichen wird, sondern schließt auch die prozentuale Homologie einer isolierten Nukleinsäure ein, wenn sie mit dem komplementären Strang der Einzelstrangsequenz verglichen wird, die in der bestimmten SEQ. ID. Nummer gezeigt wird, wie beispielsweise SEQ. ID. Nr. 5.
D.h., dass unter Verwendung eines Computerprogramms wie beispielsweise des PC/Gen-Programms mit den oben beschriebenen eingestellten Parametern die betroffenen isolierten Nukleinsäuren wie folgt beschrieben werden können: Eine isolierte Nukleinsäure umfassend ein FLD-Gen einer methylotrophen Hefe, welche jeweils entweder durch Methanol als einziger Kohlenstoff quelle oder Methylamin als einziger Stickstoffquelle induzierbar sind, und eine kodierende Sequenz mit einer Sequenzhomologie von ungefähr 70% bis ungefähr 85% hat, wenn sie mit der Nukleotidsequenz des FLD-Gens verglichen wird, das in SEQ. ID. Nr. 5 gezeigt wird; eine isolierte Nukleinsäure, die ein FLD-Gen umfasst, welches jeweils entweder durch Methanol als einziger Kohlenstoffquelle oder Methylamin als einziger Stickstoffquelle induzierbar ist, und mit einer kodierenden Sequenz, mit einer Sequenzhomologie von ungefähr 85% bis ungefähr 95%, wenn es mit der kodierenden Sequenz des FLD-Gens verglichen wird, das in SEQ. ID. Nr. 5 gezeigt wird; einer isolierten Nukleinsäure umfassend ein FLD-Gen, welches jeweils entweder durch Methanol als einziger Kohlenstoffquelle oder Methylamin als einziger Stickstoffquelle induzierbar ist, mit einer kodierenden Sequenz mit Sequenzhomologie von mehr als ungefähr 95%, wenn sie mit der Sequenz der kodierenden FLD-Region verglichen wird, die in SEQ. ID. Nr. 5 gezeigt wird;
Eine isolierte Nukleinsäure, die einen Promotor eines FLD-Gens umfasst, welcher jeweils entweder durch Methanol als einziger Kohlenstoffquelle oder Methylamin als einziger Stickstoffquelle induzierbar ist, welche ungefähr 600 bp oder mehr einer Nukleotidsequenz umfasst, die stromaufwärts (5') vom Translationsstartkodon des FLD-Gens lokalisiert ist, dessen kodierende Sequenz eine Sequenzhomologie von ungefähr 70% bis ungefähr 85% hat, wenn sie mit der Nukleotidsequenz der FLD-kodierenden Sequenz verglichen wird, die in SEQ. ID. Nr. 5 gezeigt wird,
Eine isolierte Nukleinsäure umfassend einen Promotor eines FLD-Gens, welcher jeweils entweder durch Methanol als einziger Kohlenstoff quelle oder Methylamin als einziger Stickstoffquelle induzierbar ist, welcher ungefähr 600 bp oder mehr einer Nukleotidsequenz umfasst, die stromaufwärts (5') vom Translationsstartkodon des FLD-Gens lokalisiert ist, dessen kodierende Sequenz eine Sequenzhomologie von ungefähr 85% bis ungefähr 95% hat, wenn sie mit der Nukleotidsequenz der FLD-kodierenden Sequenz verglichen wird, die in SEQ. ID. Nr. 5 gezeigt ist;
Eine isolierte Nukleinsäure umfassend einen Promotor eines FLD-Gens, welcher jeweils entweder durch Methanol als einziger Kohlenstoffquelle oder Methylamin als einziger Stickstoffquelle induzierbar ist, umfassend ungefähr 600 bp oder mehr einer Nukleotidsequenz, die stromaufwärts (5') vom Translationsstartkodon eines FLD-Gens lokalisiert ist, dessen kodierende Sequenz eine Sequenzhomologie von mehr als ungefähr 95% hat, wenn sie mit der Nukleotidsequenz der FLD-kodierenden Sequenz verglichen ist, die in SEQ. ID. Nr. 5 gezeigt wird. Im Hinblick auf irgendeinen der oben beschriebenen Promotoren umfasst ein Promoter vorzugsweise ungefähr 600 bp oder mehr der Nukleotidsequenz, die direkt stromaufwärts (5') des Translationsstartkodons eines FLD-Gens lokalisiert ist.
Die Beschreibung beschreibt eine isolierte Nukleinsäure umfassend eine FLD 3'-Terminationssequenz einer methylotrophen Hefe umfassend ungefähr 300 bp oder mehr einer Nukleotidsequenz, die stromabwärts (3') des Translationsstopkodons eines FLD-Gens lokalisiert ist, dessen kodierende Sequenz eine Sequenzhomologie von ungefähr 70% bis ungefähr 85% hat, wenn sie mit der Nukleotidsequenz der FLD-kodierenden Sequenz verglichen wird, die in SEQ. ID. Nr. 5 gezeigt wird. Ebenfalls beschrieben wird eine isolierte Nukleinsäure umfassend eine FLD 3'-Terminationssequenz einer methylotrophen Hefe umfassend ungefähr 300 bp oder mehr einer Nukleotidsequenz stromabwärts (3') vom Translationsstopkodon eines FLD-Gens, dessen kodierende Sequenz eine Sequenzhomologie von ungefähr 85% bis ungefähr 95% hat, wenn sie mit der Nukleotidsequenz der FLD-kodierenden Sequenz verglichen wird, die in SEQ. ID. Nr. 5 gezeigt ist. Ebenfalls beschrieben wird eine isolierte Nukleinsäure umfassend eine FLD 3'-Terminationssequenz einer methylotrophen Hefe, die ungefähr 300 bp oder mehr einer Nukleotidsequenz umfasst, die stromabwärts (3') vom Translationsstopkodon eines FLD-Gens lokalisiert ist, dessen kodierende Sequenz eine Sequenzhomologie von mehr als ungefähr 95% hat, wenn sie mit der Nukleotidsequenz der FLD-kodierenden Sequenz verglichen wird, die in SEQ. ID. Nr. 5 gezeigt wird. Im Hinblick auf irgendeine der oben beschriebenen 3'-Terminationssequenzen umfasst eine 3'-Terminationssequenz vorzugsweise ungefähr 300 bp oder mehr einer Nukleotidsequenz, die direkt stromabwärts (3') vom Translationsstopkodon eines FLD-Gens lokalisiert ist.
Zusätzlich zu den oben erwähnten Nukleinsäuresequenzen berücksichtigt die vorliegende Erfindung auch isolierte Nukleinsäuren, die Promotoren, kodierende Sequenzen und 3'-Terminationssequenzen von einem FLD-Gen umfassen, deren Produkte eine Aminosäuresequenzidentität von ungefähr 30% bis ungefähr 49% haben, wenn sie mit der Aminosäuresequenz verglichen wird, die in der 4 (SEQ. ID. Nr. 2) gezeigt wird. Ebenfalls beschrieben wird eine isolierte Nukleinsäure umfassend einen Promotor, eine kodierende Sequenz oder eine 3'-Terminationssequenz eines FLD-Gens, die von einem FLD-Gen stammt, dessen Produkt eine Aminosäuresequenzidentität von ungefähr 50% bis ungefähr 90% hat, wenn sie mit der Aminosäuresequenz verglichen wird, die in 4 (SEQ. ID. Nr. 2) gezeigt wird. Ebenfalls beschrieben wird eine isolierte Nukleinsäure umfassend einen Promotor, eine kodierende Sequenz oder eine 3'-Terminationssequenz eines FLD-Gens, die von einem FLD-Gen stammt, dessen Produkt eine Aminosäuresequenzidentität von mehr als ungefähr 90% hat, wenn sie mit der Aminosäuresequenz verglichen wird, die in 4 (SEQ. ID. Nr. 2) gezeigt wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform hat eine isolierte Nukleinsäure, die einen Promotor, eine kodierende Sequenz und eine 3'-Terminationssequenz eines FLD-Gens ein FLD-Gen umfasst, deren Produkt die Aminosäuresequenz besitzt, die in 4 (SEQ. ID. Nr. 2) gezeigt ist.
Ein gesamtes FLD-Gen (d.h. eine genomische Sequenz, die die FLD-kodierende Sequenz funktionsfähig mit dem nativen FLD-Promotor und mit der nativen 3'-Terminationssequenz verbinden) kann ebenfalls durch Sequenzidentität mit dem Produkt der kodierenden Region beschrieben werden. D.h., dass ein FLD-Gen beschrieben wird, dessen Aminosäuresequenz des Produktes des FLD-Gens eine Sequenzidentität von ungefähr 30% bis ungefähr 49%, wenn es mit der Aminosäuresequenz verglichen wird, die in 4 (SEQ. ID. Nr. 2) gezeigt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein FLD-Gen bereitgestellt, welches die Aminosäuresequenz des Produktes des FLD-Gens mit einer Sequenzidentität von ungefähr 50 bis ungefähr 90% hat, wenn es mit der Aminosäuresequenz verglichen wird, die in 4 (SEQ. ID. Nr. 2) gezeigt wird. Ebenfalls beschrieben wird eine isolierte Nukleinsäure umfassend ein FLD-Gen, die ein Produkt mit einer Aminosäuresequenz mit einer Sequenzidentität von mehr als ungefähr 90% kodiert, wenn sie mit der Aminosäuresequenz verglichen wird, die in 4 (SEQ. ID. Nr. 2) gezeigt wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kodiert ein FLD-Gen für ein Produkt mit einer Aminosäuresequenz, die in 4 (SEQ. ID. Nr. 2) gezeigt wird.
Zum Zwecke der Bestimmung des Grads an Sequenzidentität zwischen einer putativen FLD-Aminosäuresequenz einer methylotrophen Hefe und der FLD-Aminosäuresequenz, die hier bereitgestellt wird in SEQ. ID. Nr. 2, kann das BLAST 2.0 Programm (GenBank, National Center for Biotechnology Information) mit allen Parametern, die auf Standardparameter gestellt sind, verwendet werden.
Um die Nukleotidsequenz eines isolierten FLD-Nukleinsäuremoleküls zu bestimmen, kann jede der zahlreichen gut bekannten Techniken verwendet werden. Beispielsweise können Restriktionsfragmente, die ein FLD-Gen von Pichia pastoris oder anderer methylotropher Hefen enthalten, in die Polylinkerstelle eines Vektors, wie pBluescript (Stratagene) subkloniert werden. Diese pBluescript-Subklone können dann durch das Doppelstrang-Dideoxyverfahren (Chen et al. (1985) DNA, 4; 165) sequenziert werden. 5'-regulatorische Sequenzen, kodierende Sequenzen und 3'-Terminationssequenzen eines methylotrophen Hefe-FLD-Gens, welche den Pichia pastoris FLD-Gensequenzen entsprechen, können ebenfalls durch Anwenden einer Nukleinsäureamplifikationstechnik wie beispielsweise der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primer-Oligonukleotiden isoliert werden, die aus den Sequenzen stammen, die in den SEQ. ID. Nr. 1, 3, 4 und 5 gezeigt werden.
Die Bestätigung einer unabhängigen Induzierbarkeit eines FLD-Promotors (einschließlich von Modifikations- oder Deletionsfragmenten) einer methylotrophen Hefe kann durch die Konstruktion eines Transkriptions- und/oder Translationsfusion spezifischer Sequenzen mit den kodierenden Sequenzen eines heterologen Genes, dem Transfer des chimeren Genes in einen geeigneten Wirt und den Nachweis der Expression des heterologen Gens erreicht werden. Der Test, der verwendet wird, um die Expression nachzuweisen, hängt von der Art der heterologen Sequenz ab. Beispielsweise können Reportergene, die beispielhaft durch β-Lactamase (β-lac), β-Galactosidase (β-gal), Luciferase und Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) angegeben werden, für gewöhnlich verwendet werden, um transkriptionelle und translationelle Fähigkeiten chimerer Konstrukte zu untersuchen. Standardverfahren sind verfügbar, um das Reporterenzym in einer transformierten Wirtszelle sensitiv nachzuweisen.
Der FLD-Promotor, die 3'-Terminationssequenz und isolierte Fragmente davon sind nützlich zur Konstruktion von Expressionskassetten (ebenfalls hier als „chimere Gene" bezeichnet) und Expressionsvektoren zur Expression heterologer Proteine in einer methylotrophen Wirtszelle. So wie es hier verwendet wird, betrifft „heterologes Protein" oder „heterologes Polypeptid" jedes Protein oder Polypeptid, das keine Formaldehyddehydrogenase ist. So wie es hier verwendet wird, bedeutet „heterologes Gen" ein Gen, das nicht FLD ist.
So wie es hier verwendet wird, bedeutet der Begriff „Kassette" eine Nukleotidsequenz, die in der Lage ist, ein besonderes Gen zu exprimieren, wenn dieses Gen so inseriert ist, dass es operativ mit einer oder mehreren regulatorischen Sequenzen verbunden sind, die in der Nukleotidsequenz vorhanden sind. D.h. beispielsweise, dass die Expressionskassette ein heterologes Gen umfassen kann, von dem gewünscht wird, dass es durch Methanol oder Methylamininduktion exprimiert wird. Die Expressionskassetten und Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung sind daher nützlich zum Unterstützen der Expression jeder Anzahl heterologer Gene durch Methanol oder Methylamininduktion.
Einige Beispiele heterologer Gene zur Expression von Fremdproteinen unter Kontrolle des betroffenen FLD-Promotors und zur Verwendung in den Expressionskassetten und Vektoren der vorliegenden Erfindung schließen menschliches Serumalbumin, Invertase, Rinderlysozym, menschlicher EGF, Maus-EGF, Aprotinin, Kunitz-Proteaseinhibitor, Hepatitis B-Oberflächenantigen, Tumornecrosefaktor, Tetanustoxidfragment C, Pertussisantigen P69, Streptokinase, β-Galactosidase und Bacillus sp. Kristallproteintoxin ein. Für eine Liste anderer nützlicher Proteine, die in Pichia pastoris exprimiert werden können, siehe Higgins, D.R. und Cregg, J.M. (1998) Methods in Molecular Biology: Pichia Protocols, Humana Press, Totowa, New Jersey, Kapitel 17, S. 249-261. Jede und alle kodierenden Sequenzen werden als heterologe Gene zur Verwendung in Expressionskassetten und Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung einbezogen.
Die Expressionskassetten der vorliegenden Erfindung umfassen von 5'- nach 3'-Richtung einen FLD-Promotor, der funktionsfähig mit einer Nukleotidsequenz verbunden ist, die für ein heterologes Gen kodiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die kodierende Sequenz eines heterologen Gens weiter funktionsfähig an dessen 3'-Ende an eine 3'-Terminationssequenz gebunden. Falls gewünscht, sind zusätzliche regulatorische Elemente von Genen, die nicht FLD sind, oder Teile solcher Elemente, die ausreichend sind, um eine Expression zu verursachen, welche zur Produktion einer effektiven Menge des Polypeptids führen, das durch das heterologe Gen kodiert wird, in die chimeren Konstrukte eingeschlossen. Beispielsweise können Signalsequenzen, die für den Transit von Peptiden kodieren, verwendet werden, wenn die Sekretion eines Produktes eines heterologen Genes gewünscht wird. Solche Sequenzen sind gut bekannt, leicht erhältlich und schließen Saccharomyces cerevisiae alpha mating faktor pre pro (αmf), Pichia pastoris saure Phosphatase (PHO1), Signalsequenz und die native Signalsequenz eines Proteins ein, das durch das heterologe Gen kodiert wird.
Die Expressionskassette kann in einen Mikroorganismuswirt über einen Vektor wie beispielsweise ein zirkuläres Plasmid oder einen linearen ortsspezifischen integrativen Vektor inseriert werden. Der Begriff „operativ verbunden" bezeichnet eine Gegenüberstellung, wobei der FLD-Promotor, das strukturelle Gen und die 3'-Terminationssequenz verbunden sind und so konfiguriert sind, dass sie ihre normale Funktion ausüben können. 3'-Terminationssequenzen sind Sequenzen 3' des Stopkodons eines Strukturgens, die so wirken, dass sie das MRNA-Transkriptionsprodukt des Gens stabilisieren, an dessen Sequenz sie operativ gebunden wurden, wie beispielsweise Sequenzen, die eine Polyadenylierung hervorrufen. 3'-Terminationssequenzen können aus Pichia oder Hansenula polymorpha gewonnen werden oder aus anderen methylotrophen Hefen. Beispiele für 3'-Terminationssequenzen aus Pichia pastoris, die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen Terminationssequenzen des AOX1-Gens, des P40-Gens, des HIS4-Gens und des FLD1-Gens ein.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können das Pichia pastoris FLD1-Gen, das Hansenula polymorpha FLD-Gen und andere FLD-Gene, die aus methylotrophen Hefen isoliert werden, als selektierbare Marker in Wirtszellen verwendet werden. Entweder können das gesamte FLD-Gen, einschließlich der nativen 5' und 3'-regulatorischen Sequenzen oder die FLD-kodierende Region, die operativ mit dem 5'- und dem 3'-regulatorischen Bereichen verbunden ist, die anders sind, als die des FLD-Gens, verwendet werden.
Die isolierten Nukleinsäuren, die einen FLD-Promotor, eine FLD-kodierende Sequenz und/oder FLD 3'-Terminationssequenzen enthalten, die betroffenen Expressionskassetten, die solche isolierten Nukleinsäuren umfassen, wie auch ein gesamtes FLD-Gen (genomische Sequenz) oder die FLD-kodierende Sequenz, die operativ an 5'- und 3'-regulatorischer Regionen gebunden ist, die nicht das FLD-Gen sind, können in einen Vektor, beispielsweise ein Plasmid inseriert werden. Der Vektor enthält vorzugsweise ein selektierbares Markergen, das in einer methylotrophen Hefe funktioniert. Der selektierbare Marker kann irgendein Gen sein, dass einen selektierbaren Phenotyp auf eine methylotrophe Hefe überträgt und ermöglicht, dass eine solche Hefe identifiziert und aus untransformierten Zellen ausgewählt werden kann. Der selektierbare Markersystem kann eine auxotrophe Mutante vom Pichia pastoris-Wirtsstamm und ein Wildtypgen einschließen, welches den Defekt des Wirts komplementiert. Beispiele solcher Systeme schließen das Saccharomyces cerevisiae- oder Pichia pastoris HIS4-Gen ein, welches verwendet werden kann, um HIS4-Pichia-Stämme zu komplementieren, oder das S. cerevisiae oder Pichia pastoris ARG4-Gen, das verwendet werden kann, um Pichia pastoris ARG-Mutanten zu komplementieren. Andere selektierbare Markergene, die in Pichia pastoris funktionieren, schließen das Zeo^R-Gen, das G418^R-Gen und natürlich die erfindungsgemäßem FLD-Gene ein.
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung können ebenfalls selektierbare Markergene enthalten, die in Bakterien funktionieren. Die zugegebenen bakteriellen selektierbaren Marker erlauben die Amplifizierung des Vektors in bakteriellen Wirtszellen. Beispiele bakterieller selektierbaren Markergene schließen Ampicillinresistenz (Amp^r), Tetracyclineresistenz (Tet^r), Neomycinresistenz, Hygromycinresistenz und Zeozinresistenz (Zeo^R) ein.
Zusätzlich können die erfindungsgemäßen Vektoren Sequenzen einschließen, die für die Replizierung und extrachromosomale Bewahrung in Bakterien wie beispielsweise E. coli verantwortlich sind. Die Verwendung solcher Sequenzen ermöglicht die Amplifizierung des Vektors in Bakterien und daher die Produktion großer Mengen an Vektor-DNA. Beispiele von bakteriellen Ursprüngen der Replikation schließen Colisin, col D1, col E1 und andere dem Fachmann bekannte ein.
Die erfindungsgemäßen Vektoren können ebenfalls auf autonome Replikationssequenzen (ARS), wie beispielsweise in US Patent Nr. 4,837,148 beschrieben, welches am 6. Juni 1989 an James M. Cregg erteilt wurde. Die Offenbarung des US Patents Nr. 4,837,148 wird hier eingeschlossen, als wäre es vollständig aufgeführt. Die autonomen Replikationssequenzen, die von Cregg offenbart werden, bieten ein geeignetes Mittel zum Bewahren von Plasmiden in Pichia pastoris.
Alternativ können integrative Vektoren statt zirkuläre Plasmide verwendet werden. Solche integrativen Vektoren werden offenbart in US Patent Nr. 4,882,279, erteilt am 21. November 1989 an James M. Cregg. Das 279er Patent wird ebenfalls hier durch Bezugnahme eingeschlossen, als wäre es vollständig ausgeführt. Integrative Vektoren, die die zur Verwendung der betroffenen Promotoren, 3'-Terminationssequenzen, FLD1-Markergenen und Expressionskassetten umfassen, haben eine seriell angeordnete Sequenz mindestens eines der ersten inserierbaren DNA-Fragmente, eines selektierbaren Markergens und eines zweiten inserierbaren DNA-Fragments. Eine Expressionskassette, die ein heterologes Strukturgen enthält, wird in diesen Vektor inseriert zwischen das erste und zweite inserierbare DNA-Fragment, ob vor oder nach dem Markergen. Alternativ dazu kann eine Expressionskassette in situ gebildet werden, falls der FLD-Promotor in einem der inserierbaren Fragmente enthalten ist, an das das Strukturgen operativ gebunden werden kann.
Die ersten und zweiten inserierbaren DNA-Fragment sind jeweils mindestens 200 Nukleotide lang und haben die Nukleotidsequenzen, die homolog zu Teilen der genomischen DNA der Spezies sind, die transformiert werden soll. Inserierbare Fragmente können ebenfalls bis zu 50 Nukleotide klein sein, wenn ein diploider Stamm von Pichia pastoris verwendet wird. Die zahlreichen Bestandteile des integrativen Vektors werden seriell angeordnet, um ein lineares DNA-Fragment zu bilden, so dass die Expressionskassette und das selektierbare Markergen zwischen dem 3'-Ende des ersten inserierbaren DNA-Fragments und dem 5'-Ende des zweiten inserierbaren DNA-Fragments positioniert sind. Das erste und zweite inserierbare DNA-Fragment werden in dem seriell angeordneten linearen Fragment so orientiert, wie sie im Parentalgenom orientiert sind.
Nukleotidsequenzen, die als erste und zweite inserierbare DNA-Fragmente nützlich sind, sind Nukleotidsequenzen die homolog mit separaten Teilen der nativen genomischen Stelle sind, an der die genomische Modifizierung auftreten soll. Beispielsweise, wenn die genomische Modifizierung am Locus des Alkoholoxidasegens auftreten soll, werden die ersten und zweiten inserierbaren DNA-Fragmente, die benutzt werden, homolog zu separaten Teilen des Alkoholoxidasegenlocus sein. Beispiele für Nukleotidsequenzen, die als erste und zweite inserierbare DNA-Fragmente verwendet werden können, sind Deoxyribonukleotidsequenzen wie beispielsweise das Pichia pastoris-Alkoholoxidase(AOX1)-Gen, das Dihydroxyacetonsynthase(DAS1)-Gen, das P40-Gen und das HIS4-Gen. Das AOX1-Gen, DAS1-Gen, P40-Gen und HIS4-Gen werden in US Patent Nr. 4,855,231 und 4,885,242 offenbart, welche hier beide durch Bezugnahme eingeschlossen sind. Die Bezeichnung DAS1 entspricht der DAS-Bezeichnung, die ursprünglich in den US Patentnummern 4,855,231 und 4,885, 242 benutzt wurden. Das erste inserierbare DNA-Fragment kann einen FLD-Promotor enthalten, wobei der FLD-Promotor ebenfalls ein Teil der Expressionskassette ist. Das zweite inserierbare DNA-Fragment kann 3'-flankierende Sequenzen enthalten, die ungefähr 300 bp stromabwärts des Translationsstopkodons eines FLD-Gens beginnen.
Die erfindungsgemäßen Vektoren und chimeren Gene können mit Standardtechniken konstruiert werden, die einem gewöhnlichen Fachmann bekannt sind, und beispielsweise in Sambrook et al. (1989) in Molecular Cloning: A Laboratory Manual gefunden werden, oder in irgendeinem der unzähligen Labvorhandbücher über rekombinante DNA-Technologie, welche überall verfügbar sind. Eine Vielzahl an Strategien sind zum Ligieren von Fragmenten von DNA verfügbar, deren Wahl von der Art der Enden der DNA-Fragmente abhängt und durch den Fachmann leicht bestimmt werden kann.
Wenn die methylotrophen Hefewirtszellen mit einem linearen DNA-Fragment transformiert werden, welches ein heterologes Gen unter Kontrolle des FLD-Promotors umfasst, wird die Expressionskassette in das Wirtszellgenom durch irgendeines der Genersatzverfahren integriert, welches in der Art bekannt ist wie beispielsweise durch einen 1-Schritt-Genaustausch. Rothstein, 1983 Methods Enzymol. 101:202 und Cregg et al., 1987 Bio/Technology 5:479. Wenn der DNA-Vektor ein zirkuläres Plasmid ist, können solche Plasmide linearisiert werden, um die Integration zu erleichtern, und dann in das methylotrophe Hefegenom an der gleichen oder verschiedenen Loci durch Zugabe integriert werden. Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3376.
Die erfindungsgemäßen Vektoren können in die Zellen methylotropher Hefe unter Verwendung von bekannten Verfahren wie der Spheroplastentechnik transformiert werden, welche beschrieben wird von Cregg et al. 1985, oder durch Ganzzell-Lithiumchlorid-Hefetransformationsystem, Ito et al. Agric. Biol. Chem- 48/341, welches zur Verwendung von Pichia modifiziert wurde, wie beschrieben in EP 312 934 . Andere veröffentlichte Verfahren, die zur Transformation von Plasmiden oder linearen Vektoren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen das US Patent Nr. 4,929,555 an Cregg und Barringer; Hinnen et al. (1978) Proc. Nat. Acad. Sci. 75:1929; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153: 163; US Patent Nr. 4,879,231 an D.W. Stroman et al., Sreekrishna et al (1987) Gene 59: 115 ein. Die Elektroporation und PEG1000-Ganzzelltransformationsverfahren können ebenfalls verwendet werden. Cregg und Russel (1985) Methods in Molecular Biology: Pichia Protocols, Kapitel 3, Humana Press, Totowa, N.J.m S. 27-29.
Erfindungsgemäß werden Wirtszellen bereitgestellt, die die jeweiligen Expressionskassetten und Expressionsvektoren umfassen. Der Hefe-Wirt zur Transformation kann irgendeine geeignete methylotrophe Hefe sein. Geeignete methylotrophe Hefen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Hefen, die fähig sind, auf Methanol zu wachsen, wie beispielsweise Hefen der Genera Candida, Hansenula, Torulopsis und Pichia. Eine Liste an Arten, die exemplarisch angegeben werden für diese Klasse an Hefen, kann gefunden werden in C. Anthony (1982), The Biochemistry of Methylotrophs, 269. Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia anomola, Hansenula polymorpha und Nadida boidinii sind Beispiele methylotropher Hefen, die zur Umsetzung der vorliegenden Erfindung nützlich sind. Bevorzugte methylotrophe Hefen stammen aus dem Genus Pichia. Besonders bevorzugt werden die Pichia pastoris-Stämme GS115 (NRRL Y-15851); GS190 (NRRL Y-18014), offenbart im US Patent Nr. 4,818,700; und PPF1 (NRRL Y-18017) offenbart im US Patent Nr. 4,812,405. Auxotrophe Pichia pastoris Stämme wie beispielsweise GS115, GS190 und PPF1 sind zur Umsetzung der vorliegenden Erfindung auf Grund ihrer Selektionsleichtigkeit vorteilhaft. Wildtyp-Pichia pastoris-Stämme wie beispielsweise NRRL Y-11430 und NRRL Y-11431 können mit gleichem Erfolg verwendet werden, wenn ein geeignetes Transformationsmarkergen gewählt wird, so dass die Verwendung von SUC2 zur Transformierung von Pichia pastoris in einen Stamm, der in der Lage ist, auf Succhrose zu wachsen, oder falls ein Antibiotikaresistenzmarker verwendet wird, beispielsweise eine Resistenz gegenüber G418 und Zeocin möglich ist.
Zur Produktion im großen Maßstab von heterologen Proteinen in Pichia pastoris, in dem die Vektoren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, kann eine 2-Schritt-, Hochzelldichte-Batchfermentierung verwendet werden. Während des ersten Stadiums (Wachstumsstadiums) können Pichia-Wirtszellen in einem definierten Minimalmedium mit einer geeigneten Kohlenstoffquelle wie beispielsweise Glycerol oder Glucose und einer geeigneten Stickstoffquelle wie beispielsweise Ammoniumsulfat und Ammoniumnitrat oder anderen Ammoniumsalzen kultiviert werden. Ammoniumhydroxid kann ebenfalls verwendet werden. In diesem ersten Stadium wird die heterologe Genexpression unterdrückt, was ermöglicht, dass eine Zellexpansion und Erzeugung von Zellmasse möglich ist. Sobald die unterdrückende Kohlenstoff- oder Stickstoffquelle depletiert ist, werden entweder Methanol oder Methylamin oder beide hinzugegeben, um die Expression des heterologen Gens im zweiten Stadium (Produktionsstadium) zu initiieren. Erfindungsgemäß bietet die Induktion unter Verwendung mit sowohl Methanol als auch Methylamin eine synergistische Wirkung. D.h., dass die Niveaus der Genexpression höher sind, wenn sowohl Methanol und Methylamin verwendet werden, um zu induzieren, verglichen damit, wenn Methanol allein oder Methylamin allein zur Induzierung verwendet wird.
Alternativ dazu kann die Genexpression unter Verwendung von Formaldehyd oder Format als Energiequelle oder von Cholin oder anderer methylierter Amine als Stickstoffquelle induziert werden. Wenn Methanol verwendet wird, um zu induzieren, wird es in einer Konzentration von 1% oder weniger verwendet. Sehr geringe Mengen, bis herunter zu fast gar nichts, sind, was zur Induktion der Expression benötigt wird. Falls Formaldehyd zum Induzieren verwendet wird, wird eine Menge von ungefähr 10 mMol bis fast gar nichts verwendet, wobei berücksichtigt wird, das Formaldehyd in Mengen von 10 mMol oder mehr sehr toxisch für P. pastoris ist. Formiat ist für P. pastoris in Mengen über 100 mMol ebenfalls sehr toxisch. Wenn Methylamin, Cholin oder andere methylierte Amine verwendet werden, um die Genexpression zu induzieren, wird eine Menge von 0,5% bis fast gar nichts verwendet.
Die Wirtszellen können in einem Temperaturbereich von ungefähr 35°Celsius (C) bis zu 4°C gezüchtet werden. Die bevorzugte Temperatur fürs Wachstum von Zellen ist 30°C. Der pH-Bereich zum Wachstum von Zellen beträgt 2,8 bis 7,5, mit einem bevorzugten Bereich von 3,0 bis 6,5. Die Bedingungen und Methoden zum Wachstum methylotropher Hefezellen werden in Higgins und Cregg (1998), Methods in Molecular Biology: Pichia protocols, Humana Press, Totowa, New Jersey, gut diskutiert und werden hiermit als vollständig ausgeführt, eingeschlossen.
Transformierte Pichia pastoris-Zellen können unter Verwendung geeigneter Techniken selektioniert werden, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, das Kultivieren von zuvor auxotrophen Zellen nach Transformierung in Abwesenheit des gewünschten biochemischen Produktes (auf Grund der Auxotrophie der Zelle) der Selektion auf und der Nachweis eines neuen Phenotyps („Methanol slow") oder das Kultivieren in Gegenwart eines Antibiotikums, das toxisch für Hefen ist, in Abwesenheit eines Resistenzgens, das in der Transformante enthalten ist.
Wie oben diskutiert worden ist, kann ein beliebiges FLD-Gen als selektierbarer Marker verwendet werden, um eine methylotrophe Hefezelle für die Zwecke der direkten Selektion auf Formaldehydresistenz zu verwenden. Zusätzlich beschreibt die Beschreibung ein Verfahren zur direkten Selektion einer transformierten Wirtszelle, die das Einschleusen eines Vektors in eine Wirtszelle umfasst, welche eine FLD-kodierende Sequenz umfasst, die operativ mit einem FLD-Promotor verbunden ist, wie hier definiert wurde, oder operativ mit einem heterologen Promotor verbunden ist. Optimalerweise wird die kodierende FLD-Sequenz ebenfalls operativ an dessen 3'-Ende an eine 3'-Terminationssequenz gebunden. Transformierte Wirtszellen werden in Gegenwart von Formaldehyd gezüchtet und resistente Stämme werden ausgewählt.
Die Mengen an Formaldehyd, die zum Selektionieren resistenter Stämme verwendet werden, hängen von dem Hefestamm ab, der als Wirtszelle verwendet wird, und vom Promotor, der verwendet wird, um die Expression des FLD-Gens anzutreiben. Beispielsweise kann, wenn eine Wildtyp-Pichia pastoris-Stamm verwendet wird und ein nativer FLD-Promotor verwendet wird, eine Konzentration von ungefähr 7 mMol Formaldehyd genug sein, um eine direkte Selektion zu ermöglichen. Wird ein FLD mutierter Pichia pastoris-Stamm mit entweder einem nativen FLD-Promotor oder einem heterologen Promotor (d.h. ein Promotor, der nicht der FLD-Promotor ist) verwendet, dann kann eine Menge von ungefähr 2 mMol ausreichend sein, um die direkte Selektion zu ermöglichen. Positive Transformanten können durch Southern Blot-Analyse (Sambrook et al. 1989) charakterisiert werden, welche zum Identifizieren der Stelle der DNA-Integration besonders nützlich ist. Northern-Analyse (Sambrook et al. 1989) kann verwendet werden, um die Methanol-reaktive und Methylamin-reaktive Genexpression nachzuweisen. Das Produkt des heterologen Gens kann ebenfalls unter Verwendung gut bekannter Methoden getestet werden, und Isolate, die das gewünschte Genprodukt in der gewünschten Menge herstellen, können identifiziert werden. Immunblotting unter Verwendung polychlonaler oder monochlonaler Antikörper gegen das Produkt des heterologen Gens können ebenfalls verwendet werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur direkten Expression eines heterologen Gens in einer methylotrophen Hefe bereit, welche das Einschleusen einer isolierten Nukleinsäure in eine methylotrophe Hefezelle umfasst, welche einen FLD-Promotor umfasst, der aus einer methylotrophen Hefe isoliert wurde, wobei der Promotor operativ mit dessen 3'-Ende an das 5'-Ende eines heterologen Gens gebunden ist. Optimalerweise wird das heterologe Gen an seinem 3'-Ende ebenfalls operativ an das 5'-Ende einer 3'-Terminationssequenz gebunden, die in einer methylotrophen Hefe funktioniert. Eine solche isolierte Nukleinsäure ist bevorzugt in einen Vektor, der sich innerhalb einer methylotrophen Hefe repliziert oder der sich in das Genom einer methylotrophen Hefe integriert, wie zuvor beschrieben wurde. Eine methylotrophe Hefezelle wird mit der Expressionskassette oder dem Expressionsvektor transformiert und dann wird die Zelle in einem Medium gezüchtet, das einen Zucker enthält, wie beispielsweise Glycerol oder Glucose als Kohlenstoffquelle und Ammoniumhydroxid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, oder ein anderes Ammoniumsalz als Stickstoffquelle. Nachdem die reprimierende Kohlenstoff- oder Stickstoffquelle depletiert ist, wird die Expression des heterologen Gens durch Zugabe von Methanol oder Methylamin induziert. Alternativ dazu kann die Genexpression mit Formaldehyd oder Format als Energiequelle oder durch Cholin oder andere methylierte Amine als Stickstoffquelle induziert werden. Routineverfahren werden verwendet, um das heterologe Protein aus dem Kulturmedium zu isolieren (wenn das heterologe Protein aus den Wortszellen sezerniert wird) oder aus der methylotrophen Hefezellen (wenn das heterologe Protein nicht sezerniert wird).
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden spezifischen Beispiele dargestellt, die nicht beabsichtigen, den Schutzbereich der Erfindung in irgendeiner Weise zu beschränken.
Beispiele
Die Stämme, Plasmide und Medien, die in den folgenden Beispielen benutzt werden, haben die unten angegebenen Zusammensetzungen:
Der verwendete Wildtyp P. pastoris-Stamm war NNRL Y-11430. P. pastoris-FLD1-Mutantenstämme wurden erzeugt, indem Nitrosoguanidin benutzt wurde, und wurden von Dr. George Sperl of Phillips Petroleum Company (Bartlesville, OK, USA) bezogen. Der Pichia pastoris-FLD1-Stamm GS241 (fldl1-1) wurde beim Northern Regional Research Center of the US Department of Agriculture (NRRL) hinterlegt, Peorie, Illinois am ______ und ihm wurde die Zugangsnummer ______ zugesprochen. MS105, ein P. pastoris-FLD1-HIS4-Stamm wurde durch Kreuzen von GS241 (fld1-1) mit GS115 (his4) konstruiert. MS105 wurde ebenfalls beim NRRL am ______ hinterlegt und ihm wurde die Zugangsnummer ______ zugesprochen. Die Plasmide pYG1 und pYG2 sind beim NRRL am ______ hinterlegt worden und ihnen wurden die Zugangsnummern ______ und ______ zugesprochen. Der Hansenula polymorpha-Stamm, der verwendet wurde, war CBS4732. Die Manipulation an rekombinanter Bakterien-DNA wurden entweder am Escheria coli-Stamm MC1061 oder DH5α durchgeführt. Hefestämme wurden in einem reichen YPD-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 0,4% Glucose) oder einem Minimalmedium kultiviert, zusammengesetzt aus 0,17% Hefe-Stickstoffbasis ohne Ammoniumsulfat und Aminosäuren, einer Kohlenstoffquelle (0,4% Glucose oder 0,5% Methanol) einer Stickstoffquelle (0,5% Ammoniumsulfat oder 0,25% Mtehylaminchlorid). E. coli-Stämme wurden in Luria Broth-Medium kultiviert, falls gewünscht supplementiert mit entweder 100 μg/ml Ampicillin oder 50 μg/ml Zeocin (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA).
Beispiel 1
Isolierung von Formaldehyddehydrogenase-defekten Mutanten von P. pastoris
Als erster Schritt der Klonierung des P. pastoris-Formaldehyddehydrogenase-Gens (FLD1) wurden Mutanten gesucht, die spezifisch hinsichtlich der FLD-Aktivität defekt waren. Vorhergehende biochemische Studien methylotropher Hefen zeigten, dass FLD am Metabolismus sowohl von Methanol als Kohlenstoffquelle und Methylamin als Stickstoffquelle beteiligt ist (Zwart et al., 1983). Um nach P. pastoris-fld1-Mutanten zu suchen, wurden Nitrosoguanidin-mutierte Kulturen auf Stämme durchmustert, die in der Lage waren, Methanol als Kohlenstoffquelle und Methylamin als Stickstoffquelle zu verwenden. Komplementierungsanalyse und andere klassische genetische Techniken wurden durchgeführt, wie beschrieben in Cregg und Russell (1998). Fünf Mutanten, die zu einer einzelnen Komplementierungsgruppe gehören, wurden identifiziert.
Diese fünf Stämme wurden weiter durch Messung der Aktivitätsniveaus von Methanol-Stoffwechselweg-Schlüsselenzymen in Extrakten untersucht, die aus Methanol induzierten Kulturen jedes Stammes präpariert wurden. Diese Enzyme schließen ein: Alkoholoxidase (AOX), Catalase, Dihydroxyacetonsynthase, Dihydroxyacetonkinase, FLD und Formatdehydrogenase. Für die Enzymuntersuchungen wurden die Hefestämme in Schüttelkolben bei 30°C in YNB-Medium (ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat, DIFCO) unter Verwendung von 0,5% Methanol als Kohlenstoffquelle und 0,5% Ammoniumsulfat als Stickstoffquelle gezüchtet. Die Kulturen wurden in der späten logarithmischen Phase geerntet und die zellfreien Extrakte wurden unter Verwendung von Glaskügelchen hergestellt, wie beschrieben in Waterham et al. (1996).
Die Proteinkonzentration in den zellfreien Extrakten wurde entweder unter Verwendung des Verfahrens von Bradford (1976) oder des Pierce BCA-Protein-Assay-Kit (Rockford, IL) mit Rinderserumalbumin als Standard bestimmt. Alkoholoxidase- (van der Klei et al., 1990), Catalase- (Lück, 1963), Dehydroxyacetonsynthase- (Waites und Quayle, 1981), Dehydroxyacetonkinase- (van Dijken et al., 1978) und Formatdehydrogenase- (van Dijken, 1976) -Aktivitäten wurden durch veröffentlichte Verfahren bestimmt. Formaldehyddehydrogenaseaktivität wurde spektrophotometrisch gemessen, indem der Rate der NADH-Bildung bei 340 nm in Gegenwart sättigender Mengen an Formaldehyd, Glutathion und NAD gefolgt wurde, wie beschrieben von Schutte et al. (1976). Reaktionsgemische enthielten 33 mMol Natriumphosphatpuffer (pH 7,9–8,0), 2 mMol Glutathion, 1 mMol NAD, 1 mMol Formaldehyd und limitierende Mengen an Enzym in einer Endmenge von 1,0 ml. Der Absorptionsraten-Veränderung bei 340 nm wurde über mindestens 2 Minuten gefolgt, und die Aktivitäten wurden unter Verwendung der Konstante Σ = 6,22 cm²/nmol für NAD berechnet. Die Alkoholoxidaseaktivitäten wurden in μmol/mg/min ausgedrückt, und die Formaldehyddehydrogenase-Aktivitäten wurden in μmol pro Minute ausgedrückt. β-Lactamase-Aktivität, ausgedrückt als nMol/mg/min, wurde spektrophotometrisch bei 569 nm und bei 30°C in 25 mMol Tris-Hcl (pH 7,5) unter Verwendung von 11,1 mMol PADAC als Substrat untersucht (Extinktionskoeffizient 44,403 cm^–1M^–1).
Wie in Tabelle 1 gezeigt wird, induzierte das Wachstum von Wildtyp-P. pastoris auf Methanol als einziger Kohlenstoffquelle und Ammoniumsulfat als einziger Stickstoffquelle spezifisch hohe Niveaus der FLD-Aktivität (Tabelle 1). Die Ergebnisse waren im Wesentlichen die gleichen bei jeder der 5 Mutanten und werden in Tabelle 1 bei einem der Mutantenstämme GS241 gezeigt. Jede Mutante enthielt signifikante Niveaus der Aktivität bei allen untersuchten Enzymen, ausgenommen FLD, welches nicht nachweisbar war. Als Kontrollen hatten Methanol-gezüchtete Wildtyp-P. pastoris normale Mengen an FLD-Aktivität und Methanol-induzierte Zellen eines P. pastoris-Stammes, der hinsichtlich seines AOX-Genes deletiert ist und als Folge nicht auf Methanol wachsen kann, ebenfalls substantielle Mengen an FLD-Aktivität.
Die phenotypischen biochemischen Eigenschaften der Mutanten waren in Übereinstimmung mit den Befunden, dass sie spezifisch im P. pastoris-FLD1-Gen defekt waren. Ein möglicher FLD1-Stamm, GS241 (fld1-1) wurde für alle weiteren Manipulierungen ausgewählt.
Beispiel 2
Isolierung und Charakterisierung des P. pastoris-FLD1-Gens
Um das potenzielle FLD1-Gen durch funktionale Komplementierung zu klonieren, wurde der GS241-Stamm zuerst mit dem P. pastoris-Stamm GS115 (his4) gekreuzt, um ein Derivat zu erhalten, das sowohl defekt für die Methanolverwendung (Mut1) und auxotroph für Hystidin (His-) war. Ein Mut^– His^–-Stamm, der aus dieser Kreuzung resultierte, MS105 (fld1-1 his4), wurde dann mit 5 bis 10 μg einer P. pastoris-Genom-DNA-Blibliothek transformiert, die in den P. pastoris-E. coli-Shuttle-Vektor pYM8 konstruiert worden war, in dem das Spheroplastenverfahren verwendet wurde (Cregg et al., 1985; Liu et al., 1995). Das Plasmid pYM8 setzt sich aus dem Saccharomyces cerevisiae Histidinoldehydrogenasegen (SHIS4) und einer P. pastoris-spezifischen autonomen Replikationssequenz (PARS1) zusammen, welche in das E. coli Plasmid pBR322 inseriert sind. Ungefähr 50.000 Bibliotheks-Transformanten wurden für die HIS⁺-Prototophy auf YND-Mediumagar selektioniert und die erhaltenen selektionierten Klone wurden weiter auf YNM-Platten auf den MUT⁺-Phenotyp selektioniert. Gesamt-DNA wurde aus einem Pool mehrerer 100 HIS⁺ MUT⁺-Kolonien extrahiert und verwendet, um E. coli zu transformieren. Das Plasmid, das aus diesem Verfahren gewonnen wurde, pYG1, war in der Lage, den Stamm MS105 mit sowohl HIS⁺ und MUT⁺ zu retransformieren, und wurde weiter untersucht.
Um die Lokalisierung des möglichen FLD1-Gens auf pYG zu bestimmen, wurde von dem Plasmid eine Restriktionskarte angefertigt, und die ausgewählten Fragmente aus dem Vektor wurden subkloniert und auf ihre Fähigkeit getestet, den Stamm MS105 zu komplementieren. Die rekombinanten DNA-Verfahren wurden im Wesentlichen wie in Sambrook et al. (1989) beschrieben durchgeführt. Oligonukleotide wurden synthetisiert und es wurde eine DNA-Sequenzierung beim Oregon Regional Primate Research Center, Molecule Biology Core Facility (Beaverton, OR, USA) durchgeführt. Es wurde gefunden, dass das Plasmid 14,5 kb groß ist und eine Insertion von 6,8 kb enthält (2). Das 2,7 kb SphI-BamHI-Fragment wurde als ausreichend zur Komplementierung des Mut^–-Defekts in MS105 befunden und wurde sequenziert. Die DNA-Sequenz identifizierte ein langes offenes Leseraster (ORF), dessen vorhergesagtes Produkt eine starke Ähnlichkeit mit anderen Alkoholdehydrogenasen hat. Die Sequenz lässt ebenfalls vermuten, dass ein Intron in der Nähe des 5'-Terminus des Gens vorhanden ist.
Um das Vorliegen eines Introns zu bestätigen, wurde dieser Bereich des ORF aus mRNA mit dem reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktionsverfahren (RT-PCR) amplifiziert, und die Größe und Sequenz des Produktes wurde mit der verglichen, die in PCR des genomischen Fragments vom Plasmid pYG1 gewonnen wurde (3). PCR-Reaktionen wurden wie von Kramer und Coen (1995) beschrieben durchgeführt. Gesamte P. pastoris-RNA wurde gemäß Schmitt et al. (1990) isoliert. Die RT-PCR-Reaktion wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Frohman et al., 1988; Stewart et al., 1992) unter Verwendung der folgenden Oligonukleotidprimer: 5''-CACAATGTCTACCGAAGGTC-3'' (5'-Primer) und 5'-CCAGAAAGCGTGTAAGCATCAG-3' (3'-Primer).
Während das genomische Produkt 284 bp lang war, war das cDNA-Produkt mit 170 bp signifikant kürzer. Die Anlagerung der cDNA und der genomischen Sequenzen bewies, dass ein Segment von 114 bp, das in der genomischen DNA vorhanden war, in der cDNA fehlte. Desweiteren zeigt die Untersuchung der möglichen Intron/Exon-Verbindungen typische Hefespleissverbindungen (5'-Verbindung, 5'-GTAAGT-3''; 3'-Verbindung, 5'-YAG-3'') und einen Verzweigungspunkt (5'-TACTAAC-3') (Domdey et al., 1984; Sasnauskas et al., 1992). Daher ist an dieser Position des ORF ein einzelnes Intron vorhanden. Schließlich wiesen Southern Blots ausgewählter Restriktionsverdaue von Wildtyp-genomischer DNA unter Verwendung eines Fragments aus dem ORF als Hybridisierungsprobe darauf hin, dass das P. pastoris-Genom nur eine Kopie des Gens enthält.
Die DNA und die vorhergesagte Aminosäuresequenz des ORF werden in 4 gezeigt. Die Sequenzdaten sind erhältlich von EMBL/GenBank/DDBJ unter der Zugangsnummer AF066054. Der ORF ist 1137 bp lang und es wird vorhergesagt, dass er ein Protein von 379 Aminosäuren mit einer berechneten Molmasse von 39870 kodiert. Das Intron beginnt an der Position 18 bp (6 Aminosäuren) 3' vom A des vorhergesagten Methionin-Initiators ATG und ist 114 bp lang. Northern Blots von Gesamt-RNA, die aus Glucose- und Methanol-gezüchteten Wilttyp-P. pastoris-Zellen extrahiert wurden, indem ein DNA-Fragment aus der ORF-Region verwendet wurde, zeigten eine einzelne mRNA-Spezies von ungefähr 1,3 kb, die in großen Mengen in Methanol-, aber nicht in Glucose-gezüchteten Zellen vorhanden war (Daten nicht gezeigt). Insgesamt war die Kodonverwendung des möglichen FLD1-Gentyps typisch für andere stark exprimierte P. pastoris-Gene (Sreekrishna, 1993).
Die GenBank/NCBI-Datenbank wurde nach anderen Proteinen mit Aminosäurensequenzähnlichkeit mit dem ORF-Produkt recherchiert. Die Sequenz des möglichen FLD1-Proteins (Fld1p) zeigt die höchste Identität (71%) mit der Glutathion-abhängigen Formaldehyddehydrogenase der Hefe Candida maltosa (Sasnauskas et al., 1992) (5). C. maltosa ist eine n-Alkanassimilierende Hefe und von FLD wird vermutet, dass es wichtig beim Schützen der Hefe vor den toxischen Wirkungen von Formaldehyd ist (Sasnauskas et al., 1992).
Die starke Ähnlichkeit des vorhergesagten C. maltosa-FLD-Produktes zu dem des klonierten ORF stellt eine weitere Stütze bereit, dass dieser ORF das P. pastoris-Fld1p kodiert. Die P. pastoris Fld1p-Sequenz zeigte auch eine starke Identität mit den Alkoholdehydrogenase III (ADHIII)-Proteinen höherer Eukaryonten (65% Mensch; 63% Pferd; 64% Ratte) und eine niedrige, aber signifikante Identität mit anderen höheren eukaryontischen ADHs (Holmquist und Vallee, 1991; Koivusalo et al., 1998; Rathnagiri et al., 1998). Schließlich zeigte die Fld1p-Sequenz geringe Ähnlichkeit mit den vorhergesagten Aminosäuresquenzen von S. cerevisiae ADHs. Die naheste, bei 19% Identität liegende, war S. cerevisuia ADHI (Jornvall et al., 1987).
Beispiel 3
Isolierung und Charakterisierung des Hansenula polymorpha FLD-Gens
Das potenzielle H. polymorpha-FLD1-Gen wurde unter Verwendung der gleichen funktionalen Komplementierungsstrategie isoliert, die oben für das P. pastoris-Gen beschrieben wurde. Eine genomische DNA-Bibliothek von H. polymorpha wurde in den P. pastoris-Vektor pYM8 in gleicher Weise wie die P. pastoris-Bibliothek hergestellt (Liu et al., 1995). Kurz gefasst wurde die H. polymorpha-genomische DNA teilweise mit Sau3A verdaut und größenmäßig auf Fragmente von 5 bis 30 kb selektioniert. Diese Fragmente wurden in die BamHI-Schnittstelle des pYM8 ligiert. Die Bibliothek setzte sich aus ungefähr 100.000 unabhängigen E. coli-Transformanden mit mehr als 90% zusammen, die eine Insertion enthielten. Die durchschnittliche Größe der inserierten DNA betrug ungefähr 10 kb. Unter der Annahme, dass die Größe des H. polymorpha-Genoms 10.000 kb ist, enthielt die Bibliotehk ungefähr 100 Genomäquivalente der H. polymorpha-Genom-DNA. Es wurden Plasmide gewonnen und auf solche analysiert, die in der Lage waren, simultan MS105 (fld1-1 his4) für beide His⁺ und Mut⁺ zu transformieren. Das Plasmid pYG2 (9), das diese Kriterien, wurde zur Verwendung in diesen Studien ausgewählt. Dieses Plasmid enthielt ein H. polymorpha-DNA-Insertion von 7,2 kb und die Fähigkeit, Mut zu komplimentieren, und wurde als in dem 2,4 kb-SphI-Fragment residieren befunden (10). Southern Blot-Studien zeigten, dass die Vektoren pYG1 und pYG2 homologe FLD-Gene enthielten. Ein Beispiel eines solchen Blots ist in 11 gezeigt. In diesem Experiment wurde genomische DNA von H. polymorpha entweder mit BglII (B₂) (Spuren 1–3) oder ClaI (C) (Spuren 4–6) verdaut und mit den folgenden markierten Sonden hybridisiert: pYG2 (Spuren 1 und 4), pYM8 (Spuren 2 und 5), oder pYG1 (Spuren 3 und 6). Die pYG2-Sonde, die das mögliche H. polymorpha-FLD1-Gen enthielt, rief größere Banden von ungefähr 10 kb und ungefähr 7 kb hervor, wenn sie bei hoher Stringenz mit den jeweiligen BglII- und ClaI-verdauten H. polymorpha-genomischen DNAs hybridisiert wurde. Die Hybridisierung von pYG1 zeigte, dass das P. pastoris-FLD1-Gen bei niedriger Stringenz (30% Formamyd, 37°C Hybridisierung, 1 × SSC, Raumtemperaturwaschen) stärkere Hybridisierungsbanden der gleichen Größe hervorrief. Diese Banden lagen nicht an der Hybridisierung der Vektorsequenzen von pYM8, da die pYM8-Sonde keine größeren Hybridisierungsbanden mit H. polymorpha-genomischer DNA unter den gleichen Bedingungen niedriger Stringenz zeigte.
Beispiel 4
Vergleich der thermischen Stabilität von FLD1p von P. pastoris und H. polymorpha
Weitere Beweise, dass das klonierte P. pastoris-Gen tatsächlich eine FLD kodiert, wurde durch Vergleichen der thermischen Stabilität von dessen Produkt mit der FLD von H. polymorpha gewonnen. H. polymorpha ist eine verwandte methylotrophe Hefe, die eine signifikant höhere optimale Wachstumstemperatur als P. pastoris hat (42°C gegenüber 30°C). Von FLD aus H. polymorpha kann daher erwartet werden, dass sie einen signifikant höhere thermische Stabilität als P. pastoris-FLD aufweist. Ein Vergleich der thermischen Stabilitätseigenschaften der möglichen FLDs von den zwei Hefen bietet eine starke Unterstützung bezüglich der Identität des Genprodukts. In diesem Experiment wurden die möglichen P. pastoris- und H. polymorpha-FLD1-Gene in Methanol gezüchteten Zellen des P. pastoris-fld1-1 his4-Stamms MS105 exprimiert und die thermische Stabilität der FLD-Aktivität in jeder davon wurde durch Inkubieren von Extrakten bei 60°C über ausgewählte Zeiträume untersucht, welche aus den Stämmen präpariert wurden, und indem die Verlustrate der FLD-Aktivität bestimmt wurde. Wenn die Gene tatsächlich FLD1p kodieren, sollte die FLD-Inaktivierungsrate von H. polymorpha-FLD1p, welche in P. pastoris exprimiert wird, ähnlich der von Wildtyp-H. polymorpha-FLD1p sein, und die Inaktivierungsrate des P. pastoris-Genprodukts sollte ähnlich der sein vom Wildtyp P. pastoris-FLD1p.
Um diesen Vergleich durchzuführen, war es zunächst notwendig, festzustellen, dass die thermische Stabilität der FLDs von P. pastoris und H. polymorpha signifikant voneinander verschieden waren und die möglichen H. polymorpha-FLD1-Gene zu klonieren. Die thermische Stabilitäten wurden durch Herstellen zellfreier Extrakte aus in Methanol gezüchteten Kulturen von Wildtyp-P. pastoris und H. polymorpha und durch das Inkubieren derselben bei 60°C bestimmt. Zu ausgewählten Zeitpunkten während der Inkubation wurden Proben des Extrakts entfernt und hinsichtlich der FLD-Aktivität untersucht. Wie in der 6 gezeigt wird, war die H. polymorpha-FLD-Aktivität signifikant wärmestabiler als die P. pastoris-Aktivität.
Die thermische Stabilität von FLD, die in dem H. polymorpha-Vektor pYG2 exprimiert wird, wurde dann mit der von FLD verglichen, die aus dem P. pastoris-Vektor pYG1 stammt. Wie in der 6 gezeigt wird, hat die FLD in MS105 (pYG2) eine thermische Inaktivierungsrate, die ähnliche der ist von Wildtyp-H. polymorpha ist, während MS105 (pYG1) eine Rate hatte, die ähnlich der von P. pastoris ist. Diese Ergebnisse zusammengenommen mit den Ergebnissen, die die spezifische Abwesenheit von FLD-Aktivität im P. pastoris-Stamm GS241 (und MS105) zeigen, und die nahe Ähnlichkeit der primären Aminosäuresequenzen des klonierten P. pastoris-ORF und der C. maltosa-FLD darauf hinwiesen, dass der klonierte ORF P. pastoris-FLD1p kodiert.
Beispiel 5
Analyse von P_FLD1 und Vergleich mit P_AOX1
Um die Genexpression unter der transkriptionellen Kontrolle von P_FLD1 zu untersuchen, wurden zwei Vektoren hergestellt (1). Beide Vektoren enthielten identische Expressionskassetten, die sich aus einem 0,6 kb MunI-BamHI-Fragment zusammensetzen, mit Sequenzen, die aus genau dem 5' des Methionin-Inititiator-ATG-Kodons der FLD fusioniert an das bakterielle bla-Gen, welches die β-Lactamase kodiert (β-lac), gefolgt von einem Fragment, das den Transkriptionsterminator von AOX1 enthält. MunI ist künstlich und wurde durch PCR unter Verwendung eines Oligonukleotids installiert, das die MunI-Schnittstelle zusammen mit den Sequenzen von genau dem 5' des Methionininitiators ATg von FLD1 enthielt. Eine Restriktionsstelle an diesem Ort wurde benötigt, um dem Inserieren des Promotors 5' des β-Lactamase-Reportergens zu ermöglichen. Die MunI-Schnittstelle wurde gewählt, da die DNA-Termini, die durch MunI erzeugt werden, mit denen von EcoRI kompatibel sind und da eine EcoRI-Stelle genau 5' von dem β-Lactamase-Reporter in den Testvektoren bereits vorhanden war. Die EcoRI-Stelle konnte nicht an das 3'-Ende des FLD1-Gens gesetzt werden, da die FLD1-Promotorregion eine natürliche EcoRI-Stelle hat.
Der Vektor pSS040 enthielt eine einzigarte NsiI-Restriktionsschnittstelle innerhalb des P_FLD1-Fragments. Wenn an dieser Stelle geschnitten wurde und in P. pastoris transformiert wurde, integrierte sich der Vektor effizient an den P_FLD1-Locus. Das Ergebnis dieses Integrationsereignisses war die P_FLD1-bla-Expressionskassette, die auch native FLD1-Sequenzen stromaufwärts des P_FLD1-Fragments einschloss (WT-P_FLD1-bla). Unter der Annahme, dass alle Sequenzen, die für die transkriptionelle Kontrolle von FLD1 benötigt werden, 5' vom FLD1-ORF lokalisiert sind, sollte die Regulierung von bla und FLD1-Expression in diesem Stamm nahezu identisch sein. Wie in der Tabelle 2 gezeigt wird, schien das wahr zu sein, da die relativen Niveaus von β-lac und FLD-Aktivität in dem Stamm ähnlich in Zellen waren, die in vier Expressions-Testmedien gezüchtet wurden. Diese vier Medien enthielten als Kohlenstoff- und Stickstoffquellen jeweils: (1) Glucose und Ammoniumsulfat (G/NH₄ ⁺), (2) Glucose und Methylamin (G/MA), (3) Methanol und Ammoniumsulfat (G(NH₄ ⁺), und (4) Methanol und Methylamin (M/MA). Wie erwartet, wurden β-lac und die FLD-Aktivitäten in Zellen stark reprimiert, die im G/NH₄ ⁺-Medium gezüchtet wurden. Zellen, die entweder in G/MA oder M/NH₄ ⁺-Medien gezüchtet wurden, enthielten mindestens 10 mal mehr β-lac und FLD und das höchste Niveau beider Enzyme wurde in Zellen beobachtet, die in M/MA-Medium gezüchtet wurden.
Der zweite Vektor pSS050 enthielt das P. pastoris his4-Gen als selektionierbaren Marker. Wenn an der einzigartigen SalI-Stelle in his4 geschnitten wurde und P. pastoris transformiert wurde, integrierte sich dieser Vektor effizient an dem P. pastoris-his4-Locus. Das Ergebnis dieser Integrationsereignisses war eine P_FLD1-bla Expressionskassette mit Sequenzen von pBR322 genau 5' vom 0,6 kb-P_FLD1-Fragment (pB-P_FLD1-bla). Der Vergleich der β-lac-Aktivitätsniveaus in diesem Stamm mit denen, die in dem WT-P_FLD1-bla-Stamm beobachtet wurden, ermöglichten die Untersuchung, ob das 0,6 kb-Fragment alle stromaufwärts liegenden regulatorischen Sequenzen enthielt, die für die normale Regulierung benötigt werden. Tabelle 2 zeigt, dass die β-lac-Aktivitätsniveaus in dem pB-P_FLD1-bla-Stamm ungefähr zweimal höher waren als solche, die in dem WT-P_FLD1-bla-Stamm beobachtet wurden, wenn sie in jedem der vier Expressionstestmedien gezüchtet wurden. Diese Ergebnisse weisen daraufhin, dass die meisten Sequenzen, die für eine normale Regulierung benötigt wurden, innerhalb des P_FLD1-Fragments vorhanden waren, aber dass die Sequenzen, die konstitutiv FLD mit einem Faktor von ungefähr zweifach reprimieren, irgendwo 5' vom P_FLD1-Fragment vorhanden sind und im 0,6 kb-Fragment fehlten.
Schließlich wurden die Niveaus der β-lac-Aktivität, die unter Kontrolle von P_FLD1 hergestellt wurde, mit denen eines Stammes verglichen, bei dem die bla-Expression unter transkriptioneller Kontrolle von P_AOX1 war (Waterham et al., 1997). Wie zuvor beschrieben, wird die P_AOX1-Expression stark in Glucose-haltigen Medien reprimiert und wird hoch und spezifisch in Methanol-haltigen Medien induziert (Tschopp et al., 1987; Waterham et al., 1997) (Tabelle 2). Vergleichbare Niveaus an β-lac waren in Zellen des WT-P_FLD1-bla-Stammes vorhanden, die entweder in M/NH₄ ⁺ oder M/MA-Medien gezüchtet wurden, während Zellen des pB-P_FLD1-bla-Stammes β-lac-Mengen enthielten, die signifikant höher waren als die in dem P_AOX1-bla-Stamm. Besonders bemerkenswert waren die β-lac-Mengen in dem pB-P_FLD1-bla-Stamm in M/NH₄ ⁺- und M/MA-Medien, welche konsistent ungefähr doppelt so hoch waren als die, die in dem P_AOX1-bla-Stamm im gleichen Medium beobachtet wurden.
Beispiel 6
Das FLD1-Gen verleiht Resistenz gegenüber Formaldehyd.
Das P. pastoris-FLD1-Gen wurde in den pPICZ-Vektoren enthaltend Ueo^R (Invitrogen, Carlsbad, CA) eingeschlossen. Zwei solche pPIZC-FLD-Vektoren wurden konstruiert. In einem wurde das gesamte FLD1-Gen, das den FLD1-Promotor, das Strukturgen und den Transkriptionsterminator einschließt, inseriert (pP_FLD1-FLD1). Im anderen wurde das FLD-Strukturgen (und der Transkriptionsterminator) unter die Kontrolle des P. pastoris-Glyceraldehyd-3-phosphate-dehydrogenase-Gens (GAP)-Promotor (pP_GAP-FLD1) gesetzt. Diese zwei Plasmide wurden mit ihren entsprechenden Promotorfragmenten linearisiert (P_FLD1, P_GAP) und durch Elektroporation in Wildtyp- und MS105 (fld1-1 his4)-P. pastoris-Stämme durch Selektion auf Resistenz gegenüber Zeocin bei 100μm/ml und 1 mg/ml transformiert. Die niedrigere Zeocin-Konzentration selektioniert P. pastoris-Transformanten, die eine integrierte Kopie eines Zeo^R-Vektors haben, während die hohe Zeocin-Konzentration Transformanten auswählt, die mehrere integrierte Zeo^R-Vektorkopien haben. Ausgewählte Transformanten jeder Art wurden auf YPD-Mediumplatten aufgestrichen, die entweder Zeocin zu 100mg/ml oder 1mg/ml enthielt, und auf Reihen von YPD-Platten, die Formaldehyd in Konzentration enthalten, die von 0 bis 30 mMol reichen. Als Kontrolle wurden Wildtyp- und GS241-Stämme, die mit dem pPICZ-Vektor allein transformiert waren (d.h. ohne ein FLD-Gen) ebenfalls auf den Platten verstrichen.
Es wurde beobachtet, dass MS105-Stämme, die mit pPICZ alleine transformiert waren, resistent gegenüber 1 mMol Formaldehyd waren. Von MS105 abstammende Stämme, die eine einzelne Kopie von pP_FLD1-FLD1 und pP_GAP-FLD1 enthielten, waren resistent gegenüber 10 mMol bzw. 5 mMol Formaldehyd, während MS105-Derivatstämme, die mehrere Kopien pP_FLD1-FLD1 und pP_GAP-FLD1 enthielten, resistent gegen 30 mMol bzw. 10 mMol Formaldehyd waren. D.h., dass entweder das pP_FLD1-FLD1 und pP_GAP-FLD1-Vektoren eine erhöhte Resistenz gegen Formaldehyd verliehen. Zusätzlich wurde ein additiver Effekt klar, da die erhöhten Anzahlen an Kopien jedes Vektors zu einem erhöhten Resistenz-Niveau gegen Formaldehyd gegenüber dem führten, welche durch eine Kopie jedes Vektors verliehen wurde.
Wildtyp-P. pastoris-Stämme, die mit pPICZ alleine transformiert wurden, waren gegenüber 5 mMol Formaldehyd resistent. Da Wildtypstämme eine native Kopie des FLD1-Gens enthalten, war die Konzentration an Formaldehyd, gegen die dieser Stamm resistent war, signifikant höher als erwartet. Von Wildtypen abstammende Stämme enthielten eine einzelne Kopie von pP_FLD1-FLD1 und pP_GAP-FLD1, die waren resistent gegenüber 10 bzw. 5 mMol Formaldehyd, während vom Wildtyp abstammende Stämme, die mehrere Kopien von pP_FLD1-FLD1 und pP_GAP-FLD1 enthielten, resistent waren gegenüber 30 mMol Formaldehyd. D.h., dass pP_FLD1-FLD1, aber nicht der pP_GAP-FLD1-Vektor eine verstärkte Resistenz gegenüber Formaldehyd verlieh. Ein additiver Effekt wurde ebenfalls mit steigenden Kopienzahlen jedes Vektors offensichtlich, welche ein erhöhtes Resistenzniveau gegenüber Formaldehyd gegenüber einer Kopie jedes Vektors verliehen.
Diese Transformationsexperimente wurden mit den pP_FLD1-FLD1 und pP_GAP-FLD1-Vektoren und Wildtyp- und MS105-P. pastoris-Stämmen wiederholt, wobei nur direkt auf Resistenz gegenüber Formaldehyd selektioniert wurde (zusammen mit der Selektion auf die Zeocin-Resistenz als Kontrolle). Beim Stamm MS105 waren 2 mMol Formaldehyd optimal für die Selektion von Transformanten. Diese Konzentration an Formaldehyd ergab ungefähr die gleiche Anzahl an Transformanten, die bei 100 μg/ml Zeocin-Selektionskontrolle beobachtet wurde. Bei der Wildtyp-P. pastoris waren 7 mMol Formaldehyd optimal für die Selektion von Transformanten mit dem pP_FLD1-FLD1-Vektor. Diese Konzentration ergab ungefähr die gleiche Anzahl an Transformanten, wie mit dem 100 μg/ml Zeocin-Selektionskontrollmedium beobachtet wurde. Die Transformation wurde nicht dem pP_GAP-FLD1-Vektor beobachtet.
Auf Grundlage dieser positiven Ergebnisse wurde ein P. pastoris Expressionvektor hergestellt. Der Vektor enthält eine heterologe Genexpressionkassette, die sich aus DNA-Fragmenten zusammensetzt, die den AOX-Promotor enthalten und den Transkriptionsterminator, welcher durch eine multiple Klonierungsstelle (MCS) getrennt ist, in die heterologe Gene inseriert werden können. Die Expressionskassette wird von einem DNA-Segment gefolgt, das das P_GAP-FLD1-Genkonstrukt enthält, und diesem Segment folgt ein DNA-Fragment, das aus den Sequenzen 3' vom AOX1-Gen stammt. Dieser Satz an DNA-Fragmenten wird in das Bakterienplasmid pBluscript (Stratagene, San Diego, CA) inseriert, so dass der Vektor in E. coli propagiert werden kann.
Nach der Inserierung des heterologen Gens in die MCS wird der erhaltene Vektor mit dem Restriktionsenzym NotI geschnitten, um aus dem bakteriellen Plasmid ein DNA-Fragment freizusetzen, das in der Lage ist, P. pastoris zu transformieren. Das Fragment wird durch Elektroporation entweder in Wildtyp- oder MS105 (fld1-1)-Stämme von P. pastoris transformiert, und die Transformanten wurden auf YPD-Mediumplatten selektioniert, die entweder 7 mMol Formaldehyd für Wildtypstämme oder 2 mMol für MS105 FLd1-Stämme enthielten. Das Vektorfragment inseriert sich in einer von 2 Formen selbst in das P. pastoris-Genom. Die erste erfolgt durch ein Genaustauschereignis, wobei das AOX1-Gen ersetzt wird. Zusätzlich zur erhöhten Resistenz gegenüber Formaldehyd können solche Genaustauschtransformanten auf Grund ihrer sehr langsamen Wachstumsrate auf Methanol auf Grund der Abwesenheit des AOX1-Gens leicht phenotypisch identifiziert werden.
In einem weiteren Verfahren inseriert der Vektor sich selbst in das P. pastoris-Genom, und schließt die Zirkularisierung des transformierenden Fragments vor der Integration ein. Nach der Zirkularisierung kann sich die transformierende DNA durch ein einzelnes Crossover-Ereignis an irgendeine Stelle des P. pastoris-Genoms integrieren, welcher durch den Vektor repräsentiert wird. Diese genomische Region schließen FLD1-, AOX1-Promotor und AOX1-3'-flankierende Loci ein. Die Integration an irgendeiner dieser Stellen führt zu keiner Änderung des Phenotyps des Stammes, abgesehen von erhöhter Resistenz gegenüber Formaldehyd. Es ist wichtig anzumerken, dass die Integration dieses Fragments in irgendeiner Weise nicht zur Inkorporierung eines Antibiotika-Resistenzgens oder eines anderen Genes führt, das für P. pastoris fremd ist, mit der Ausnahme des heterologen Gens, dessen Proteinprodukt gewünscht wird.
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Tabelle 1 Relative Enzymaktivitätsniveaus bei Methanol-verwendenden defekten Mutanten von P. pastoris

^a Die Aktivität jedes Enzyms wird als Prozentsatz dessen ausgedrückt, was bei Extrakten beobachtet wird, welche aus in Methanol gezüchteten Kulturen von Wildtpy-P. pastoris hergestellt werden. Die Abkürzungen sind: AOX, Alkoholxodase; CAT, Catalase; FLD, Formaldehyddehydrogenase; FDH, Formatdehydrogenase; DAS, Dihydroxycatonsynthase; DAK, Dihydroxyacetonkinase.
^b Nicht bestimmt

Tabelle 2 Vergleich der β-Lastamase-Aktivität in Exatrakten von P. pastoris-Stämmen, die bla unter Kontrolle von P_FLD und P_AOX1 exprimieren

^a Jeder Stamm wurde in einem Medium gezüchtet, das entweder Glucose (G) oder Methanol (M) als Kohlenstoffquelle und Ammoniumsulfat (NH₄ ⁺) oder Methylamin (MA) als Stickstoffquellen enthält.
^b β-Lactamase-Aktivitäten werden exprimiert als nMol/mg je Minute, in Klammern, als Prozent der Aktivität, die in dem auf Methanol und Methylamin gezüchteten WT-P_FLD1-bla-Stamm beobachtet werden. Die Aktivitäten stellen den Mittelwert von drei Experimenten unter Verwendung von zwei unabhängig transformierten Stämmen dar.

Sequenzliste

Claims

Isolierte Nukleinsäure, umfassend einen Promotor, der durch Methanol, Methylamin und ein Gemisch aus sowohl Methanol als auch Methylamin in einer methylotrophen Hefe induzierbar ist, worin die isolierte Nukleinsäure aus Pichia pastoris ableitbar ist.
Isolierte Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, umfassend die in SEQ ID NO: 3 angeführte Sequenz.
Isolierte Nukleinsäure, umfassend einen Promotor gemäß Ansprüchen 1 oder 2, ferner umfassend eine für Formaldehyddehydrogenase kodierende Sequenz (FLD), welche aus Pichia pastoris ableitbar ist, worin diese kodierende Sequenz ausreichend ist, um einen fld-Defekt in einem Pichia-pastoris-Stamm zu komplementieren.
Isolierte Nukleinsäure gemäß Anspruch 3, umfassend eine Sequenz, welche für die in SEQ ID NO: 2 angeführte Aminosäuresequenz kodiert.
Isolierte Nukleinsäure gemäß Ansprüchen 3 oder 4, umfassend die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 5 angeführte Sequenz, oder eine Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 5 angeführten Nukleotidsequenz komplementär ist.
Isolierte Nukleinsäure, umfassend eine für eine Formaldehyddehydrogenase kodierende Sequenz (FLD), aus einer methylotrophen Hefe, worin diese kodierende Sequenz eine Sequenz, die für die in SEQ ID NO: 2 angeführte Aminosäuresequenz kodiert, umfasst.
Isolierte Nukleinsäure, umfassend die in SEQ ID NO: 5 angeführte Sequenz.
Isolierte Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1–7, mit einer Länge von 2,7 kb.
Isoliertes Polypeptid, umfassend die in SEQ ID NO: 2 angeführte Aminosäuresequenz.
Vektor, umfassend die isolierte Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1–8.
Nukleinsäureexpressionskassette, umfassend den Promotor gemäß einem der Ansprüche 1–3, worin der Promotor funktionell mit einer Nukleinsäure, welche für ein heterologes Protein kodiert, verknüpft ist.
Expressionskassette gemäß Anspruch 11, ferner umfassend eine 3'-Terminationssequenz.
Expressionskassette gemäß Ansprüchen 11 oder 12, worin die 3'-Terminationssequenz jene des AOX1-Gens ist.
Expressionsvektor, umfassend eine Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 11–13.
Pichia-pastoris-Zelle, welche mit einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 10–14 transformiert ist.
Verfahren zur Regelung der Expression einer heterologen kodierenden Sequenz in Pichia pastoris, umfassend: a) Das Einführen in eine Pichia-pastoris-Zelle einer isolierten Nukleinsäure, umfassend einen Promotor gemäß Ansprüchen 1 oder 2, worin der Promotor an seinem 3'-Ende funktionell mit dem 5'-Ende einer heterologen kodierenden Sequenz verknüpft ist, wobei die heterologe kodierende Sequenz an ihrem 3'-Ende mit dem 5'-Ende einer Terminationssequenz, die in Pichia pastoris funktioniert, funktionell verknüpft ist; b) das Heranwachsenlassen der Pichia-pastoris-Zelle in einem Medium mit einer geeigneten Kohlenstoffquelle, wie beispielsweise Glycerin oder Glukose, und mit einer geeigneten Stickstoffquelle, wie beispielsweise einem Ammoniumsalz oder Ammoniumhydroxid, und nachdem die Kohlenstoff- oder Stickstoffquelle aufgebraucht ist; c) das Induzieren der Expression der heterologen kodierenden Sequenz durch Hinzugabe von Methanol oder Methylamin oder sowohl Methanol als auch Methylamin.
Verfahren zur Regelung der Expression einer heterologen kodierenden Sequenz in Pichia pastoris, umfassend: a) Das Einführen in eine Pichia-pastoris-Zelle einer isolierten Nukleinsäure, umfassend einen Promotor gemäß Ansprüchen 1 oder 2, worin der Promotor an seinem 3'-Ende funktionell mit dem 5'-Ende einer heterologen kodierenden Sequenz verknüpft ist, wobei die heterologe kodierende Sequenz an ihrem 3'-Ende mit dem 5'-Ende einer Terminationssequenz, die in Pichia pastoris funktioniert, funktionell verknüpft ist; b) das Heranwachsenlassen der Pichia-pastoris-Zelle in einem Medium mit einer geeigneten Kohlenstoffquelle, wie beispielsweise Glycerin oder Glukose, und mit einer geeigneten Stickstoffquelle, wie beispielsweise einem Ammoniumsalz oder einem Ammoniumhydroxid, und nachdem die Kohlenstoff- oder Stickstoffquelle aufgebraucht ist; c) das Induzieren der Expression der heterologen kodierenden Sequenz durch die Hinzugabe von Formaldehyd, Format oder eines methylierten Amins.
Verfahren gemäß Anspruch 17, worin das methylierte Amin Cholin ist.