DE69923460T2

DE69923460T2 - Verfahren zur herstellung von ring-modifizierten zyklischen peptidanalogen

Info

Publication number: DE69923460T2
Application number: DE69923460T
Authority: DE
Inventors: Stanley Peter BORROMEO; Daniel Jeffrey COHEN; Stuart George GREGORY; Kay Stacy HENLE; Andrew Stephen HITCHCOCK; Nickolaus Louis JUNGHEIM; Ray Daniel MAYHUGH; Alan Timothy SHEPHERD; Wilson William TURNER
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1998-08-20
Filing date: 1999-08-18
Publication date: 2007-01-11
Anticipated expiration: 2019-08-19
Also published as: AU765660B2; US20040068094A1; CA2340676A1; ATE287899T1; WO2000011023A3; AU5572699A; WO2000011023A2; EP1107981A2; DK1107981T3; ES2233070T3; US6653281B1; DE69923460D1; JP2002528388A; PT1107981E; US6939946B2; EP1107981B1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von ringmodifizierten cyclischen Peptidanaloga durch Ersetzen von einer oder mehreren Peptideinheiten in den cyclischen Peptidringkern von natürlichen Produkten oder halb synthetischen Derivaten davon, insbesondere Verbindungen vom Echinocandin-Typ. Neue halb synthetische cyclische Peptidverbindungen können daraus hergestellt werden.
STAND DER TECHNIK
Echinocandin B ist ein natürliches Produkt mit antifungaler Aktivität, welches in der Vergangenheit auf vielfache Art und Weise modifiziert worden ist. Zum Beispiel sind einfache Derivate hergestellt worden, einschließlich Dihydro- und Tetrahydroreduktionsprodukte und Modifikationen von aktiven Gruppen, welche dem Ringkern anhängen. Die gängigste Herangehensweise war der Ersatz der N-Acyl-Seitenkette. Zum Beispiel beschreiben die US-Patente Nr. 4 293 489; 4 320 052; 5 166 135; und 5 541 160; und EP 359529 ; 448353; 447186; 462631; und 561639 eine Vielzahl von N-Acyl-derivatisierten Verbindungen vom Echinocandin-Typ, welche einen variierenden Grad (Plural) antifungaler und antiprotozoaler Aktivitäten bereitstellen.
Andere Modifikationen haben die Acylierung der Hydroxylgruppe der anhängigen phenolischen Gruppe eingeschlossen. Zum Beispiel beschreiben die GB 2 242 194 ; und EP 448343 ; 448354; 503960 und 525889 die Einführung von Acyl-, Phosphono- und Sulforesten mit einer geladenen Gruppe bei neutralem pH, um Wasserlöslichkeit zu verleihen.
GB 2 241 956 und EP 448355 beschreiben Wasserstoffreduktionsprodukte von Cyclohexapeptidverbindungen.
Ein Überblick über die Echinocandinfamilien und ihre halb synthetischen Analoga können in Turner, W. et al., Current Pharmaceutical Design, 2, 209-224 (1996) gefunden werden. Der Überblick vergleicht die in-vitro- und in-vivo-Aktivitäten der natürlichen Echinocandinprodukte und ihrer halb synthetischen Analoga.
Jedes der oben beschriebenen Herangehensweisen ist beschränkt auf Reaktionen mit aktiven Gruppen, die dem cyclischen Peptidringkern anhängen. Einige haben versucht, den gesamten cyclischen Peptidkern synthetisch aufzubauen (siehe, d. h. US-Patent Nr. 5 696 084; J. Am. Chem. Soc., 108, 6041 (1986); Evans, D. A. et al., J. Am. Chem. Soc., 109, 5151 (1987); J. Med. Chem., 35, 2843 (1992); und Kurokawa, N. et al., Tetrahedron, 49, 6195 (1993)). Gleichwohl ist diese Herangehensweise nicht kostengünstig und kann zu racemischen Mischungen führen. Deshalb besteht ein Bedarf zur Bereitstellung eines flexibleren und kostengünstigen Verfahrens zum Modifizieren des cyclischen Hexapeptidkerns von natürlichen Produkten, um den Umfang von potenziellen antifungalen Kandidaten zu erweitern.
Mehrere Forscher haben die bevorzugte Spaltung einer Amidbindung in Verbindungen, die Hydroxylgruppen in den Delta- und Gamma-Positionen in Bezug auf die Amidbindung tragen, um asymmetrische Lactone bereitzustellen, unter Verwendung von Säuren wie Chlorwasserstoffsäure und Trifluoressigsäure beschrieben; gleichwohl hat keiner das Verfahren der Spaltung einer terminalen Aminosäuregruppe eines linearen Peptids angewandt. (Siehe, d. h. K. Tanaka et al., Tetrahedron Lett, 26(10), 1337 (1985); N. Baba et al., Chem. Lett. (5), 889 (1989); N. Yoda et al., Chem. Express, 4(8), 515 (1989); und Y. Yamamoto et al., J. Org. Chem., 56(3), 112 (1991).)
Hensen et al., J. Antibiotics, 45(12), 1875-1885 (1992) beschreiben Pneumocandin B₀ und sechs verwandte Lipotide von Mutanten von Zalerion arboricola, welche antifungale und Anti-Pneumocystic carinii-Mittel sind.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung sieht ein Verfahren zum Modifizieren des cyclischen Peptidringsystems von Verbindungen vom Echinocandin-Typ vor, um neue Analoga mit antifungaler Aktivität herzustellen. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht einem, Änderungen in der cyclischen Peptidstruktur von natürlichen und halb synthetischen Produkten hervorzurufen, welche vorher nicht möglich waren. Zum Beispiel kann man Merkmale wie Wasserlöslichkeit in den cyclischen Peptidringkern, Stellen für weitere Modifizierung, eine Zunahme oder Verringerung der Anzahl von Aminosäure- oder Peptideinheiten innerhalb des Ringkerns und eine Steigerung oder Abnahme der Gesamtanzahl von Gliedern (oder Atomen) in den Ringkern vornehmen.
Das Verfahren schließt die folgenden Schritte ein: (i) Bereitstellen einer cyclischen Peptidverbindung, umfassend eine Peptideinheit mit einer δ-Hydroxylgruppe und einer γ-Hydroxylgruppe; (ii) Öffnen des Rings der cyclischen Peptidverbindung, um ein erstes lineares Peptid bereitzustellen, wobei die Peptideinheit mit einer γ-Hydroxylgruppe die N-Terminus-Peptideinheit des ersten linearen Peptids ist; (iii) Abspalten der Peptideinheit mit einer γ-Hydroxylgruppe, um ein zweites lineares Peptid bereitzustellen (vorzugsweise durch Hinzusetzen von Trifluoressigsäure oder Chlorwasserstoffsäure zu dem ersten linearen Peptid in einem organischen Lösungsmittel); (iv) Verknüpfen mindestens einer Aminosäure, einer Dipeptideinheit oder einer synthetischen Einheit mit dem zweiten linearen Peptid, um ein drittes lineares Peptid herzustellen; (v) Cyclisieren des dritten linearen Peptids, um eine modifizierte cyclische Peptidverbindung mit einem modifizierten Ringkern herzustellen. Alternativ kann eine zweite Peptideinheit von dem zweiten linearen Peptid, welches im Schritt (iii) erzeugt wird, vor der Anbindung der Aminosäure-, Dipeptid- oder synthetischen Einheiten) in Schritt (iv) und nach der Cyclisierung in Schritt (v) abgespalten werden. Die Addition von zwei oder mehreren Einheiten in Schritt (iv) kann in einer stufenweisen Art bewerkstelligt werden (z. B. wird eine erste Einheit gebunden, dann wird eine zweite Einheit gebunden). Von besonderem Interesse ist die Modifizierung von Verbindungen des Echinocandin-Typs, um neue cyclische Hexapeptid- und Heptapeptidverbindungen herzustellen, welche eine Inhibierung von fungaler und parasitärer Aktivität zeigen. Das Verfahren sieht ebenfalls ein zweckdienliches Mittel vor, um cyclische Peptidverbindungen mit den Formeln I und II (einschließlich pharmazeutisch annehmbarer Salze, Ester und Hydrate davon) bereitzustellen.

worin
R eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe, eine Alkinylgruppe, eine Arylgruppe oder eine Heteroarylgruppe ist;
R2 -H oder -CH₃ ist;
R3 -H, -CH₃, -CH₂CONH₂ oder -CH₂CH₂NH₂ ist;
R4 -H oder -OH ist;
R5 -OH, -OPO₃H₂ oder -OSO₃H ist;
R6 -H oder -OSO₃H ist;
R7 -CH₃ oder -H ist;
(Y) durch die folgende Formel repräsentiert wird
worin
A -(CH₂)_a- ist, worin a = 1-4, -CHR'-CHR''-(CH₂)_b- ist, worin R' und R'' unabhängig -H, -OH, C₆H₅O-, -SH, -NH₂, C_nH_2n+1NH-, C_nH_2n+1O-, C_nH_2n+1S- oder -C_nH_2n+1 sind, worin n = 1-4 und b = 0, -(CH₂)_c-C(O)NH(CH₂)_d-, worin c = 1-2 und d = 1-2, -N=CH-(CH₂)_e-, worin e = 0-2, -NR'''(CH₂)_f-, worin R''' -H, -C(O)CH₂NH₂, -C(O)CH(NH₂)CH₂NH₂ oder -C_nH_2n+1 ist, worin n = 1-4 und f = 1-3, -(CH₂)_g-SO₂-(CH₂)_h, worin g = 1-2 und h = 1-2,
worin i = 1 oder 2, oder
worin j 1 oder 2 ist und Z eine Aminogruppe, eine Alkylaminogruppe oder Piperidylaminogruppe ist; und
B eine substituierte oder nicht substituierte C₁- bis C₆-Alkylgruppe (z. B. Isopropyl. P-Hydroxybenzyl, Hydroxymethyl oder α-Hydroxyethyl) ist.
Und W Wasserstoff oder C(O)R ist, worin R wie oben definiert ist.
Cyclische Peptidverbindungen werden bereitgestellt, welche die Formeln I und II (oben) aufweisen, worin
A -(CH₂)_a- ist, worin a = 1, 2 oder 4, -CHR'-CHR''-(CH₂)_b- ist, worin R' und R'' unabhängig -H, -OH, C₆H₅O-, -SH, -NH₂, C_nH_2n+1NH-, C_nH_2n+1O-, C_nH_2n+1S- oder -C_nH_2n+1 sind, worin n = 1-4 und b = 0-4, -(CH₂)_c- C(O)NH(CH₂)_d-, worin c = 1-2 und d = 1-2, -N=CH-(CH₂)_c-, worin e = 0-2, -NR'''(CH₂)_f-, worin R''' -H, -C(O)CH₂NH₂, -C(O)CH(NH₂)CH₂NH₂ oder -C_nH_2n+1 ist, worin n = 1-4 und f = 1-3, -(CH₂)_g-SO₂-(CH₂)_h, worin g = 1-2 und h = 1-2,
worin i = 1 oder 2, oder
worin j 1 oder 2 ist und Z eine Aminogruppe, eine Alkylaminogruppe oder Piperidyiaminogruppe ist.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung kann die oben beschriebenen Verbindungen I und II (einschließlich pharmazeutisch annehmbarer Salze, Ester und Hydrate davon) in einem pharmazeutisch inerten Träger umfassen. Die neuen Verbindungen und oben beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen können zur Inhibierung von fungalem Wachstum und parasitärer Aktivität sowie zur Behandlung einer fungalen Infektion bei einem Menschen in einem Verfahren eingesetzt werden, das die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der oben beschriebenen neuen antifungalen Verbindung an einen Menschen, welcher eine solche Behandlung bedarf, umfasst.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Verbindungen vom Echinocandin-Typ" auf Verbindungen mit der folgenden allgemeinen Struktur, einschließlich jedwede einfachen Derivate davon:
worin R eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe, eine Alkinylgruppe, eine Arylgruppe oder eine Heteroarylgruppe ist, R1 H oder -OH ist; R2 -H oder -CH₃ ist;
R3 -H, -CH₃, -CH₂CONH₂ oder -CH₂CH₂NH₂ ist;
R4 -H oder -OH ist; R5 -OH, -OPO₃H₂ oder -OSO₃H ist; R6 -H oder -OSO₃H ist und R7 -CH₃ oder -H ist.
Der Ausdruck "Alkyl" bezieht sich auf einen Kohlenwasserstoffrest der allgemeinen Formel C_nH_2n+1, welcher 1 bis 30 Kohlenstoffatome enthält, wenn nicht anders angegeben. Der Alkanrest kann gerade, verzweigt, cyclisch oder multicyclisch sein. Der Alkanrest kann substituiert oder nicht substituiert sein. In gleicher Weise kann der Alkylteil einer Alkoxygruppe oder eines Alkanoats die gleiche Definition wie oben aufweisen.
Der Ausdruck "Alkenyl" bezieht sich auf einen acyclischen Kohlenwasserstoff, welcher mindestens eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung enthält. Der Alkanrest kann gerade, verzweigt, cyclisch oder multicyclisch sein. Der Alkanrest kann substituiert oder unsubstituiert sein. Der Ausdruck "Alkinyl" bezieht sich auf einen acyclischen Kohlenwasserstoff, welcher mindestens eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindung enthält. Der Alkinrest kann gerade oder verzweigt sein. Der Alkinrest kann substituiert oder nicht substituiert sein.
Der Ausdruck "Aryl" bezieht sich auf aromatische Reste mit einzelnen (z. B. Phenyl) oder verschmolzenen Ringsystemen (z. B. Naphthalin, Anthracen, Phenanthren etc.). Die Arylgruppen können substituiert oder nicht substituiert sein. Substituierte Arylgruppen schließen eine Kette von aromatischen Resten (z. B. Biphenyl, Terphenyl, Phenylnaphthalyl etc.) ein.
Der Ausdruck "Heteroaryl" bezieht sich auf aromatische Reste, welche mindestens ein Heteroatom innerhalb des aromatischen Ringsystems enthalten (z. B. Pyrrol, Pyridin, Indol, Thiophen, Furan, Benzofuran, Imidazol, Pyrimidin, Purin, Benzimidazol, Chinolin etc.). Der aromatische Rest kann aus einem einzelnen oder verschmolzenen Ringsystem bestehen. Die Heteroarylgruppen können substituiert oder nicht substituiert sein.
Innerhalb des Gebiets der organischen Chemie und insbesondere innerhalb des Gebiets der organischen Biochemie besteht die allgemeine Ansicht, dass eine signifikante Substitution von Verbindungen toleriert wird oder sogar nützlich ist. In der vorliegenden Erfindung ermöglicht zum Beispiel der Begriff Alkylgruppe Substituenten, welche einem klassischen Alkyl, wie Methyl, Ethyl, Propyl, Hexyl, Isooctyl, Dodecyl, Stearyl etc., entsprechen. Der Ausdruck Gruppe zieht speziell Substituenten auf Alkylen in Betracht und ermöglicht jene, welche gängig im Fachbereich sind, wie Hydroxy, Halogen, Alkoxy, Carbonyl, Keto, Ester, Carbamat etc., wobei er auch den nicht substituierten Alkylrest einschließt. Gleichwohl versteht sich allgemein durch den Fachmann im Fachbereich, dass die Substituenten so gewählt werden sollten, dass die pharmakologischen Charakteristika der Verbindung nicht nachteilig beeinflusst werden oder die Verwendung des Medikaments nicht nachteilig gestört wird. Geeignete Substituenten für jedwede der oben definierten Gruppen schließen Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Halogen, Hydroxy, Alkoxy, Aryloxy, Mercapto, Alkylthio, Arylthio, Mono- oder Dialkylamino, quaternäre Ammoniumsalze, Aminoalkoxy, Hydroxyalkylamino, Aminoalkylthio, Carbamyl, Carbonyl, Carboxy, Glycolyl, Glycyl, Hydrazino, Guanyl und Kombinationen davon ein.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das unten skizzierte synthetische Schema veranschaulicht die allgemeinen Prozeduren zur Modifizierung des cyclischen Peptidringsystems von Verbindungen vom Echinocandin-Typ, wobei Chiralität beibehalten bleibt. Der cyclische Peptidring von einem beliebigen natürlichen Produkt vom Echinocandin-Typ oder einem halb synthetischen Derivat kann geöffnet werden und die endständige Ornithin-Peptideinheit gespalten werden, solange die γ-Hydroxylgruppe der Ornithin-Peptideinheit vorliegt und nicht geblockt wird. Der Ausdruck "natürliches Produkt" bezieht sich auf jene sekundären Metabolite, welche für gewöhnlich von relativ komplexer Struktur sind, welche von stärker beschränkter Verteilung sind und charakteristischer für eine spezifische Quelle in der Natur sind. Geeignete natürliche Ausgangsproduktmaterialien gehören zu der cyclischen Echinocandinpeptidfamilie, einschließlich Echinocandin B, Echinocandin C, Aculeacin Aγ, Mulundocandin, Sporiofungin A, Pneumocandin A₀, WF11899A und Pneumocandin B₀. Für veranschaulichende Zwecke beginnt das folgende synthetische Schema mit Cilofungin.
Wie oben gezeigt, wird der cyclische Hexapeptidring (1) zuerst unter Anwendung der Basenkatalyse geöffnet und dann mit Natriumborhydrid reduziert, um das lineare Hexapeptid (2) zu erhalten. Auf die Behandlung mit Triethylsilan in Trifluoressigsäure (TFA) wird das Benzylhydroxyl entfernt, und die Ornithineinheit wird gespalten, wodurch man das lineare Pentapeptid (3) erhält. Das lineare Pentapeptid (3) kann nun geschützt werden und das primäre Amid aktiviert werden, um ein Zwischenprodukt (4) zu erhalten, welches mit einer neuen Aminosäureeinheit oder einer anderen synthetischen Einheit erneut cyclisiert werden kann, um eine neue cyclische Verbindung (5) herzustellen. Die cyclische Verbindung (5) kann weiter durch Entschützen und Acylieren der anhängigen Aminogruppe (sofern vorhanden) modifiziert werden, um die modifizierte cyclische Verbindung (6) mit einer N-Acyl-Seitenkette bereitzustellen. Die im Fachbereich Erfahrenen werden erkennen, dass die N-Acyl-Seitenkette eine Vielzahl von Seitenkettenresten, die im Fachbereich bekannt sind, mit einschließt. Geeignete Seitenkettenreste schließen substituierte und nicht substituierte Alkylgruppen, Alkenylgruppen, Alkinylgruppen, Arylgruppen, Heteroarylgruppen und Kombinationen davon ein. Vorzugsweise enthält die Seitenkette sowohl einen linearen starren Abschnitt und einen flexiblen Alkylabschnitt, um die antifungale Potenz zu maximieren. Darüber hinaus können weitere Modifikationen bezüglich jeder beliebigen neuen Funktionalität, die durch die Einbringung der neuen Aminosäure-, Peptid- oder synthetischen Einheit bzw. der Einheiten, welche eine solche neue Funktionalität enthalten, vorgenommen werden.
Alternativ kann eine andere Peptideinheit vom Zwischenprodukt (3) gespalten werden, um ein Tetrapeptid (7) bereitzustellen, welches mit einer neuen Aminosäureeinheit, Dipeptideinheit oder anderen synthetischen Einheit erneut cyclisiert werden kann, um eine neue cyclische Verbindung (8) herzustellen. Wie die cyclische Verbindung (5) kann die Verbindung (8) ebenfalls weiter modifiziert werden, um die anhängige Aminogruppe (sofern vorhanden) zu entschützen und zu acylieren, um eine N-Acyl-Seitenkette anzuheften, oder durch Modifizieren einer beliebigen neuen Funktionalität, die durch die Einbringung der neuen Aminosäure-, Peptid- oder synthetischen Einheiten eingeführt worden ist.
Wie in dem obigen synthetischen Schema veranschaulicht, wird der Ringkern selektiv an der Verknüpfung des C-Endes vom L-Prolin und N-Endes vom R-Ornithin unter Verwendung der Basenkatalyse, die dem Fachmann im Fachbereich allgemein bekannt ist, geöffnet. Sobald das cyclische Hexapeptid geöffnet ist, kann dann die terminale Ornithin-Aminosäure gespalten werden und eine neue Aminosäure (oder eine andere synthetische Einheit) unter Anwendung von standardmäßigen Peptidbildungsverfahren (oder Kondensationsverfahren), die jenen im Fachbereich Erfahrenen allgemein bekannt sind, gebunden werden. Die terminate Ornithineinheit wird mit Trifluoressigsäure oder Chlorwasserstoffsäure in einem organischen Lösungsmittel wie Methylenchlorid, Toluol oder Dioxan gespalten. Die bevorzugte Reaktionsbedingung ist Trifluoressigsäure in Methylenchlorid.
Jede Aminosäure- oder Peptideinheit kann an das lineare Peptid gebunden werden. Theoretisch ist es auch möglich, andere synthetische Einheiten auf dem Peptid zu kondensieren, welche zu einer Cyclisierung in der Lage sind. Zum Beispiel kann eine Sulfonamidbindung zwischen einer terminalen Aminogruppe auf dem linearen Peptid und einer Sulfonylgruppe auf einer synthetischen Einheit gebildet werden. Jede beliebige Anzahl an anderen Bindungen kann ebenfalls in Betracht gezogen werden; gleichwohl ist die pharmazeutische Aktivität solcher Verbindungen derzeit unbekannt.
Der Einbau einer neuen Aminosäure, Dipeptideinheit oder anderen synthetischen Einheit ermöglicht einem, die Größe des Cyclopeptidrings zu verändern. Die Anzahl von Atomen in dem Ringsystem kann von der ursprünglichen 21-gliedrigen Echinocandinringstruktur in Abhängigkeit von der oder den besonderen Verbindungen, die in den Ring eingeführt werden, erhöht oder verringert werden. Theoretisch ist die Ringgröße nur durch die Konfiguration des linearen Peptids beschränkt. Wenn das lineare Peptid zu kurz oder zu lang ist, können die Enden nicht in eine ausreichende Nähe gebracht werden, damit sie reagieren können, und die Enden können eher mit einem anderen linearen Peptid polymerisieren als unter Bildung eines Ringes sich schließen. Die optimale Konfiguration des linearen Peptids zum Ringschluss kann von den besonderen Aminosäuren, welche die Peptidstruktur aufbauen, abhängen. Für Verbindungen vom Echinocandin-Typ enthält vorzugsweise die letztendliche Ringstruktur zwischen 19 bis 22 Gliedern, stärker bevorzugt ist die letztendliche Ringstruktur ein 21- bis 22-gliedriger Ring, am meisten bevorzugt ist die letztendliche Ringstruktur ein 21-gliedriger Ring.
Es ist allgemein bekannt, dass die Acylseitenkette, welche der Echinocandinringstruktur anhängig ist, eine wichtige Rolle bezüglich der Aktivität sowohl der natürlichen Produkte als auch der halb synthetischen Materialien vom Echinocandin-Typ spielt. Folglich kann jede Aminosäure- oder synthetische Einheit zum Einbau in den Ring zum Einsatz kommen, solange das letztendliche cyclisierte Produkt mindestens eine Aminogruppe enthält, die zur Acylierung in der Lage ist.
Wenn die eingeführte Verbindung mehr als eine Einheit enthält, können die Einheiten gleichzeitig an das lineare Penta- oder Tetra-Peptid gebunden werden, oder die Einzelleneinheiten können kombiniert werden und dann an das lineare Penta- oder Tetra-Peptid als eine Blockeinheit addiert werden. Vorzugsweise werden die Einheiten als eine Blockeinheit addiert, um eine Racemisierung zu minimieren.
Die Acylierung der Aminogruppe kann in einer Vielzahl von Wegen, die den Fachmann im Fachbereich bekannt sind, bewerkstelligt werden. Zum Beispiel kann die Aminogruppe durch die Reaktion mit einem in angemessener Weise substituierten Acylhalogenid, vorzugsweise in Gegenwart eines Säurefängers wie einem tertiären Amin (z. B. Triethylamin), acyliert werden. Die Reaktion wird typischerweise bei einer Temperatur zwischen etwa –20 °C bis 25 °C durchgeführt. Geeignete Reaktionslösungsmittel schließen polar aprotische Lösungsmittel wie Dioxan oder Dimethylformamid ein. Die Lösungsmittelwahl ist nicht kritisch, solange das angewandte Lösungsmittel für die stattfindende Reaktion inert ist und die Reaktanten ausreichend solubilisiert sind, um die gewünschte Reaktion zu bewirken.
Die Aminogruppe kann ebenfalls acyliert werden durch die Reaktion mit einer angemessenen substituierten Carbonsäure in Gegenwart eines Kupplungsmittels. Geeignete Kupplungsmittel schließen Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), N,N'-Carbonyldiimidazol, Bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)phosphinchlorid (BOP-Cl), N-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydrochinolin (EEDQ), Benzotriazol-1-yloxy-tripyrrolidinophosphoniumhexafluorphosphat (PyBOP) und dergleichen ein.
Alternativ kann die Aminogruppe mit einem aktivierten Ester einer Carbonsäure wie p-Nitrophenyl-, 2,4,5-Trichlorphenyl-, Hydroxybenzotriazolhydrat- (HOBT·H₂O), Pentafluorphenol- und N-Hydroxysuccinimidcarboxylatester acyliert werden. Bevorzugte acylierende Reste sind die 2,4,5-Trichlorphenyl- und HOBT-Carboxylatester.
Die Reaktion wird typischerweise in 1 bis 65 Stunden bei einer Temperatur von etwa 0°C bis 30°C in einem aprotischen Lösungsmittel betrieben. Die Reaktion ist im Allgemeinen nach etwa 24 bis 48 Stunden komplett, wenn sie bei einer Temperatur zwischen etwa 15°C und 30°C durchgeführt wird. Geeignete Lösungsmittel schließen Tetrahydrofuran und Dimethylformamid oder Mischungen davon ein. Die Aminogruppe liegt im Allgemeinen in äquimolaren Verhältnissen in Bezug auf den aktivierten Ester oder mit einem leichten Überschuss der Aminogruppe vor.
Die Verbindungen können isoliert werden und per se oder in Form ihres pharmazeutisch annehmbaren Salzes oder Hydrats verwendet werden. Der Ausdruck "pharmazeutisch annehmbares Salz" bezieht sich auf nichttoxische Säureadditionssalze, die von anorganischen oder organischen Säuren herrühren. Geeignete Salzderivate schließen Halogenide, Thiocyanate, Sulfate, Bisulfate, Sulfite, Bisulfite, Arylsulfonate, Alkylsulfate, Phosphonate, Monohydrogenphosphate, Dihydrogenphosphate, Metaphosphate, Pyrophosphonate, Alkanoate, Cycloalkylalkanoate, Arylalkonate, Adipate, Alginate, Aspartate, Benzoate, Fumarate, Glucoheptanoate, Glycerophosphate, Lactate, Maleate, Nictonate, Oxalate, Palmitate, Pectinate, Picrate, Pivalate, Succinate, Tartrate, Citrate, Camphorate, Camphorsulfonate, Digluconate, Trifluoracetate und dergleichen ein.
Die ringmodifizierten Verbindungen können in einer Vielzahl von pharmazeutischen Formulierungen verwendet werden. Eine typische Formulierung umfasst die ringmodifizierte Verbindung (oder ihr pharmazeutisch annehmbares Salz, Ester oder Hydrat) in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Exzipient. Der aktive Bestandteil wird typischerweise zu pharmazeutischen Dosierungsformen formuliert, um eine leicht kontrollierbare Dosierung des Arzneimittels bereitzustellen und dem Patienten ein elegantes und leicht zu handhabendes Produkt zu geben. Formulierungen können von 0,1 Gew.-% bis 99,9 Gew.-% eines aktiven Bestandteils, allgemeiner etwa 10 Gew.-% bis etwa 30 Gew.-%, umfassen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Einheitsdosis" oder "Einheitsdosierung" auf physikalisch diskrete Einheiten, welche eine vorbestimmte Menge an aktivem Bestandteil enthalten, die so berechnet ist, dass ein gewünschter therapeutischer Effekt hervorgerufen wird. Wenn eine Einheitsdosis oral oder parenteral verabreicht wird, wird sie typischerweise in Form einer Tablette, Kapsel, Pille, einem Pulverpaket, einer topischen Zusammensetzung, Zäpfchen, Wafer, von gemessenen Einheiten in Ampullen oder in Multidosis-Behältern etc. bereitgestellt. Alternativ kann eine Einheitsdosis in Form eines trockenen oder flüssigen Aerosols, welches inhaliert oder gesprüht wird, verabreicht werden.
Die zu verabreichende Dosierung kann in Abhängigkeit von den physikalischen Charakteristika des Patienten, dem Ausmaß der Symptome des Patienten und den für die Verabreichung des Arzneistoffes verwendeten Mitteln variieren. Die spezifische Dosis für einen bestimmten Patienten wird für gewöhnlich durch die Beurteilung des behandelnden Arztes eingestellt.
Geeignete Träger, Verdünnungsmittel und Exzipientien sind dem Fachmann im Fachbereich allgemein bekannt und schließen Materialien wie Kohlenhydrate, Wachse, wasserlösliche und/oder quellbare Polymere, hydrophile oder hydrophobe Materialien, Gelatine, Öle, Lösungsmittel, Wasser und dergleichen ein. Der besondere Träger, das besondere Verdünnungsmittel oder der besondere Exzipient, die verwendet werden, hängen von den Mitteln und dem Zweck, für welchen der aktive Bestandteil zur Anwendung kommt, ab. Die Formulierungen können ebenfalls Benetzungsmittel, Gleitmittel, Emulgiermittel, Suspendiermittel, Konservierungsstoffe, Süßungsstoffe, Stabilisatoren, Parfümierungsmittel, Geschmacksmittel und Kombinationen davon einschließen.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung kann unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren verabreicht werden. Geeignete Verfahren schließen die topische Anwendung (z. B. Salben oder Sprays), die orale Anwendung, Infektion und Inhalation ein. Das bestimmte zur Anwendung kommende Behandlungsverfahren hängt von dem anzugehenden Typ der Infektion ab.
Verbindungen vom Echinocandin-Typ besitzen erwiesenermaßen antifungale und antiparasitäre Aktivität, wie eine Wachstumsinhibierung gegenüber verschiedenen infektiösen Pilzen, einschließlich Candida spp. (d. h. C. Albicans, C. Parapsilosis, C. Krusei, C. Glabrata, C. Tropicalis oder C. Lusitaniaw); Torulopus spp. (d. h. T. Glabrata); Aspergillus spp. (d. h. A. Fumigatus); Histoplasma spp. (d. h. H. Capsulatum); Cryptococcus spp. (d. h. C. Neoformans); Blastomyces spp. (d. h. Dermatitidis); Fusarium spp.; Trichophyton spp., Pseudallescheria boydii, Coccidioides immits, Sporothnx schenckii etc.
Verbindungen dieses Typs inhibieren ebenfalls das Wachstum von bestimmten Organismen, die hauptsächlich für opportunistische Infektionen in immunosuppremierten Individuen verantwortlich sind, wie die Wachstumsinhibierung von Pneumocystis carinii (der verursachende Organismus von Pneumocystis pneumonia (PCP) bei AIDS und anderen immun geschwächten Patienten). Andere Protozoen, welche durch Verbindungen vom Echinocandin-Typ inhibiert werden, schließen Plasmodium spp., Leishmania spp., Trypanosoma spp., Cryptosporidium spp., Isospora spp., Cyclospora spp., Trichomonas spp., Microsporidiosis spp. etc. ein.
Diese Verbindungen sind brauchbar bei der Bekämpfung entweder von systemischen Pilzinfektionen oder Hautpilzinfektionen. Demzufolge kann die fungale Aktivität durch ein Verfahren inhibiert werden, das das Kontaktieren einer Verbindung der Formel I oder II (oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes, Esters oder Hydrats davon) mit einem Pilz umfasst. Ein bevorzugtes Verfahren schließt das Inhibieren der Candida albicans- oder Aspergillus fumigatis-Aktivität ein. Der Ausdruck "Kontaktieren" schließt eine Vereinigung oder Verbindung oder apparentes Berühren oder eine gemeinsame Vereinheitlichung einer Verbindung mit einem Parasiten oder Pilz ein. Der Ausdruck impliziert keine weitere Beschränkung beim Verfahren wie durch einen Mechanismus der Inhibierung. Die Verfahren sind so definiert, dass sie die Inhibierung der parasitären oder fungalen Aktivität durch die Wirkung der Verbindungen und ihren inhärenten antiparasitären und antifungalen Eigenschaften beinhalten.
Ein Verfahren zur Behandlung einer Pilzinfektion, welches die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Verbindung der Formel I oder II (oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes, Esters oder Hydrats davon) an einen Wirt, der einer solchen Behandlung bedarf, umfasst, wird ebenfalls beschrieben. Ein bevorzugtes Verfahren schließt die Behandlung einer Candida albicans- oder Aspergillus fumigatis-Infektion ein. Der Ausdruck "wirksame Menge" bezieht sich auf eine Menge an aktiver Verbindung, welche zur Inhibierung der Pilzaktivität in der Lage ist. Die verabreichte Dosis hängt von solchen Faktoren wie der Natur und dem Ausmaß der Infektion, dem Alter und der allgemeinen Gesundheit des Wirts und der Toleranz des Wirts gegenüber dem antifungalen Mittel ab. In entsprechender Weise kann das besondere Dosisregime entsprechend dieser Faktoren variieren. Das Medikament kann in einer einzelnen Tagesdosis oder in mehreren Dosen während des Tages verabreicht werden. Das Regime kann von etwa 2 bis 3 Tagen bis etwa 2 bis 3 Wochen oder länger andauern. Eine typische tägliche Dosis (verabreicht in einer einzelnen oder in aufgeteilten Dosen) enthält ein Dosisniveau von etwa 0,01 mg/kg bis 100 mg/kg Körpergewicht einer aktiven Verbindung. Bevorzugte Tagesdosen liegen im Allgemeinen zwischen etwa 0,1 mg/kg bis 60 mg/kg und stärker bevorzugt zwischen etwa 2,5 mg/kg bis 40 mg/kg.
Obgleich die hierin beschriebenen Verbindungen zur Inhibierung fungaler und parasitärer Aktivität in einer Vielzahl von Umständen (z. B. Menschen, Tiere, Landwirtschaft etc.) zur Anwendung kommen können, sind die Verfahren vorzugsweise auf die Anwendung bei der Behandlung von Menschen beschränkt, um das Potenzial zur Entwicklung einer Resistenz gegenüber dem Pharmazeutikum zu senken.
BEISPIELE
Wenn nicht anders angegeben, können alle Chemikalien von kommerziellen Vertreibern wie Aldrich Chemical (Milwaukee, WI), Sigma und anderen kommerziellen Quellen, die dem Fachmann im Fachbereich allgemein bekannt sind, erworben werden. Die folgenden Akronyme repräsentieren die entsprechenden funktionellen Gruppen oder Verbindungen:

BOC: = t-Butoxycarbonyl, (CH₃)₃C-O-C(O)-
CBZ: = Benzyloxycarbonyl, C₆H₅CH₂-O-C(O)-
o-Cl-CBZ: = Ortho-chlorbenzyloxycarbonyl
FMOC: = Fluorenylmethyloxycarbonyl
TBDMS: = t-Butyldimethylsilyl
TFA: = Trifluoressigsäure
AcN: = Acetonitril
DMF: = Dimethylformamid
THF: = Tetrahydrofuran
TDM: = 4,4'-Tetramethyl-diamino-diphenylmethan
CAM: = Cerammoniummolybdat

Der folgende Satz von Beispielen veranschaulicht die allgemeinen Reaktionsbedingungen zur Spaltung und Einführung einer neuen bzw. mehrerer neuen Einheiten) in einen Cyclohexapeptidkern.
Herstellung von Schlüssel-Zwischenprodukten Ringöffnung und Reduktion von Cilofungin (1) zum Erhalt des Zwischenproduktes I-2
Zu einer gerührten Lösung von Cilofungin (1) (100 g; 96 mMol) in 350 ml 55 Acetonitril/45% Wasser wurde 1 N Natriumhydroxidlösung (40 ml) gegeben. Die Reaktion wurde durch Hochdruckflüssigchromatographie (C-18-Säule, 50% AcN/-Wasser, 230 nm) überwacht. Nach 1 Stunde enthielt die Reaktionsmischung >90 des Aldehyd-Zwischenproduktes. Als Nächstes wurde Natriumborhydrid (1,8 g, 48 mMol) hinzugesetzt, und das Rühren wurde 20 Min. fortgesetzt. Die HPLC zeigte eine vollständige Umwandlung zu dem Alkohol-Endprodukt. Die Reaktion wurde durch tropfenweise Zugabe von Essigsäure solange gelöscht, bis die Gasentwicklung abgeschlossen war. Das meiste an Acetonitril wurde durch Rotationsverdampfung entfernt, gefolgt von einer Lyophilisierung, um den Rest zu erhalten, wodurch man 98,1 g einer Mischung des festen Produktes I-2 und anorganischen Salzen erhielt (93% rein gemäß HPLC).
Peptidspaltung und Deoxygenierung von 1-2 zum Erhalt des Pentapeptids (I-3)
Die ungereinigte Mischung von Verbindung I-2 (98,1 g), welche oben beschrieben ist, wurde in Trifluoressigsäure (300 ml) und Dichlormethan (100 ml) gelöst. Die Mischung wurde in einem Eisbad gekühlt. Triethylsilan (32 ml; 0,2 Mol) wurde hinzugesetzt, und die Reaktion wurde bei 0°C 1 Stunde lang gerührt. Das Eisbad wurde entfernt, und die Reaktion wurde bei Umgebungstemperatur 18 Stunden lang belassen. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde erneut in Methanol zur HPLC-Reinigung gelöst. Der Rückstand wurde durch Passieren durch eine C-18-Säule mit 50% Acetonitril/Wasser; 0,1% TFA zur Entfernung von weiteren lipophilen Nebenprodukten gereinigt. Die polaren Peaks wurden mit 10% Acetonitril/Wasser; 0,1% TFA gereinigt. Die Lyophilisierung ergab 57,8 g (98% Ausbeute) an reinem Pentapeptidtrifluoressigsäuresalz (I-3). FAB MS = 653,3 (M+1).
Herstellung vom CBZ-Pentapeptid (I-4)
Zu einer mittels eines Eisbades gekühlten Lösung von I-3 (50,3 g, 66 mMol) in Wasser (200 ml) und Tetrahydrofuran (100 ml) wurde überschüssiges festes Natriumbicarbonat solange hinzugesetzt, bis keine zusätzliche Schäumung mehr auftrat und der pH-Wert >8 lag. Carbobenzyloxychlorid (10 ml, 70 mMol) wurde hinzugesetzt, und die Reaktion wurde mittels HPLC (25% AcN/Wasser, 0,1% TFA, 230 nm) überwacht. Der pH-Wert wurde überwacht und gelegentlich wurde mehr Natriumbicarbonat hinzugesetzt, um die Lösung basisch zu Balten. Nach 1 Stunde war die Reaktion abgeschlossen, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in Methanol aufgeschlämmt, die festen anorganischen Stoffe wurde mittels Filtration entfernt, und die Lösung wurde durch eine präparative HPLC (25% Methanol/Wasser) geleitet. Die Entfernung von Lösungsmitteln ergab 25,2 g (49% Ausbeute) an I-4 als weißen Schaum. FAB MS = 787,38 (M+1). Herstellung vom Silyl-CBZ-Pentapeptid (I-5)
Die Verbindung I-4 (25,2 g, 32 mMol), Imidazol (20,6 g, 303 mMol) und t-Butyldimethylsilylchlorid (45,6 g, 303 mMol) in Dimethylformamid (250 ml) wurden gemischt, während die Reaktion mittels TLC (25% Ethylacetat/Hexan) verfolgt wurde. Nach 6 Stunden wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde aufgeschlämmt und in Ether ultrabeschallt. Die Etherlösung wurde mit 1 N HCl gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum reduziert, um einen Schaum zu erhalten. Das rohe Produkt wurde mittels Flash-Chromatographie (600 g Silica, 25% Ethylacetat/Hexan) gereinigt, wodurch man 32,9 g (70% Ausbeute) eines weißen Schaums erhielt. Die NMR-Daten waren konsistent mit der Struktur I-5. FAB MS = 1 472,9 (M). Herstellung vom DiBOC-CBZ-Silylpentapeptid (I-6)
De Verbindung I-5 (32,9 g, 22,3 mMol) wurde in Acetonitril (250 ml) und Tetrahydrofuran (50 ml) gelöst. Di-t-Butyldicarbonat (16,1 g, 7,36 mMol) und Dimethylaminopyridin (299 mg, 2,2 mMol) wurden unter Rühren hinzugesetzt. Die Reaktion wurde mittels TLC (20% Ethylacetat/Hexan) verfolgt, und zusätzliche 3 g Di-t-Butyldicarbonat wurden nach 2 Stunden hinzugesetzt. Nach weiteren 2,5 Stunden wurden mehrere ml Essigsäure hinzugesetzt, um das Dimethylaminopyridin zu löschen. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, wobei die Temperatur unter 40 °C gehalten wurde. Der Rückstand wurde chromatographiert (500 g Silica, 15% Ethylacetat/Hexan), wodurch man 33,6 g (89% Ausbeute) eines weißen Schaums erhielt. Die NMR-Daten waren konsistent mit der Struktur I-6. FAB MS = 1 672,0 (M). Herstellung des linearen Tetrapeptid-Zwischenproduktes (I-7):
Zu einer Lösung der Pentapeptidverbindung I-3 (5,75 g, 7,50 mMol) in wasserfreiem DMF (200 ml) wurden NaHCO₃ (690 mg, 8,25 mMol) und Phenylisothiocyanat (0,99 ml, 8,25 mMol) gegeben, und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 36 Stunden lang gerührt. Die Feststoffe wurden mittels Filtration entfernt, und das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert. Das resultierende Öl wurde in TFA (70 ml) gelöst und bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt, gefolgt von der Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum. Die resultierenden Feststoffe wurden mit Wasser (150 ml) behandelt, ultrabeschallt und die unlöslichen Materialien wurden mittels Filtration entfernt. Die Umkehrphasen-HPLC des Filtrats (unter Elution mit 4 AcN/0,1% TFA/H₂O), gefolgt von einer Lyophilisierung, ergab 3,20 g eines lockeren weißen Feststoffes, 64% Ausbeute. Das ¹H-NMR (300 MHz)-Spektrum war konsistent mit der Struktur I-7. FAB MS (M⁺ der freien Base) = 552.
Das Beispiel 1 veranschaulicht die allgemeinen Reaktionsbedingungen zur Umwandlung des Pentapeptid-Zwischenproduktes (I-6) zu einem cyclischen Hexapeptidanalog einer Verbindung vom Echinocandin-Typ. Beispiel 1 Herstellung vom DiBOC-Silyl-o-Cl-CBZ-Hexapeptid (E1-1)
Eine Lösung von N-α-BOC-N-γ-(2-chlor-CBZ)-L-ornithin (480 mg, 1,2 mMol), N-Hydroxysuccinimid (138 mg, 1,2 mMol) und Dicyclohexylcarbodiimid (247 mg, 1,2 mMol) in 4 ml Tetrahydrofuran wurde über Nacht gerührt, um den aktiven Ester zu bilden. Eine Lösung von I-6 (1,0 g, 0,598 mMol) in Ethanol (5 ml) wurde einer Lösung von 10% Pd/C (250 mg) in 5 ml Ethanol hinzugesetzt, gefolgt von 10 ml Eisessig. Die Mischung wurde unter einem Ballon von H₂ gestellt und nach 1 Stunde war das Ausgangsmaterial weg. Der Katalysator wurde mittels Filtration entfernt und die Lösung wurde vorsichtig unter hohem Vakuum reduziert, wobei die Temperatur unter 40 °C gehalten wurde. Das resultierende Öl wurde in Ether gelöst und die im Voraus hergestellte Tetrahydrofuranlösung an aktivem Ester wurde hinzugesetzt, gefolgt von überschüssigem Triethylamin, bis die Lösung für pH-Papier basisch war. Nach dem Rühren während 2 Stunden wurde die Lösung mit gesättigter NaHCO₃-Lösung extrahiert, gefolgt von verdünnter HCl-Lösung und anschließend einer weiteren Portion gesättigter NaHCO₃-Lösung. Die organische Schicht wurde über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum reduziert, wodurch man 0,85 g des rohen Produktes erhielt. Die Reinigung mittels Flash-Chromatographie (25 Ethylacetat/Hexan) ergab 0,53 g an gekoppeltem Produkt E1-1 (47% Ausbeute). Die NMR-Daten waren konsistent mit der Struktur E1-1. FAB MS = 1 922,2 (M+1). Cyclisierung von E-1 zum BOC-Silyl-Cyclohexapeptid (E1-2)
Eine Ethanol/Essigsäure-Lösung (jeweils 10 ml) von E1-1 (0,53 g, 0,27 mMol) mit 10% Pd/C (200 mg) wurde unter einen Ballon an Wasserstoff gestellt. Nach 2 Stunden zeigte die TLC (30% Ethylacetat/Hexan) eine vollständige Reaktion an. Der Katalysator wurde mittels Filtration entfernt, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum bei 40 °C solange reduziert, bis der Rückstand ein dickes Öl war. Der Rückstand wurde in Ethylether (150 ml) gelöst, und überschüssiges Triethylamin wurde solange hinzugesetzt, bis die Lösung gegenüber pH-Papier basisch war (~2 ml). Nach 18 Stunden zeigte die TLC einen einzelnen Produktfleck an. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde über einer Flash-Säule gereinigt, wodurch man 343 mg eines weißen Feststoffes (81 Ausbeute) erhielt. Die NMR-Daten waren konsistent mit der Struktur E1-2. FAB MS = 1 536,0 (M+1). Entfernung der Schutzgruppen und Koppeln der Seitenkette zum Erhalt von E1-3
Verbindung E1-2 (510 mg, 0,332 mMol) wurde in 5 ml Trifluoressigsäure bei 0 °C gelöst. Nach 0,5 Stunden wurde Wasser (0,5 ml) hinzugesetzt, und die Mischung wurde 0,5 Stunden länger gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde in 1 N HCl (2 ml) und Tetrahydrofuran (2 ml) gelöst. Die Lösung wurde 48 Stunden lang im Kühlschrank gekühlt, wonach die HPLC-Analyse (15% AcN/Wasser, 230 nm) einen einzelnen Produktpeak zeigte. Das Lösungsmittel wurde unter hohem Vakuum entfernt, wodurch man einen Schaumrückstand erhielt, welcher in Dimethylformamid (8 ml) gelöst wurde. Der aktive Terphenylhydroxyenzotriazolester (191 mg, 0,4 mMol) und Triethylamin (0,2 ml, 1,4 mMol) wurden der Lösung hinzugesetzt. Nach 4 Stunden zeigte die HPLC (60% AcN/Wasser, 230 nm) eine vollständige Umwandlung zu einem neuen Produktpeak. Das Lösungsmittel wurde unter hohem Vakuum entfernt und mittels präparativer HPLC unter Verwendung der analytischen Bedingungen gereinigt. Die Lösungsmittelentfernung von den reinen Fraktionen ergab 238 mg (66% Ausbeute) eines weißen Feststoffes. Die NMR-Daten waren konsistent mit der Struktur E1-3. FAB MS berechnet für C₅₈H₇₄N₇O₁₄ 1 092,5294; gefunden 1 092,5301 (M).
Die folgenden Beispiele tiefem weitere Veranschaulichungen der Umwandlung des Schlüssel-Zwischenproduktes (I-6) zu einem cyclischen Hexapeptidanalog. In entsprechender Weise wurde I-6 zu jedem der folgenden cyclischen Peptide umgewandelt:
Das Koppeln mit Nα-BOC-Nδ-CBZ-D-Ornithin und die anschließende Cyclisierung ergab 63,9 mg E1-4 (21-gliedriger Ring). FAB MS berechnet für C₅₈H₇₄N₇O₁₄ 1 092,5294; gefunden 1 092,5280.
Das Koppeln mit Nα-BOC-Nε-CBZ-L-Lysin und die anschließende Cyclisierung ergaben 44,1 mg E1-5 (22-gliedriger Ring). FAB MS berechnet für C₅₈H₇₆N₇O₁₄ 1 106,5450; gefunden 1 106,5464.
Das Koppeln mit Nα-FMOC-Nδ-CBZ-L-2,4-Diaminobuttersäure und die anschließende Cyclisierung ergaben 65,0 mg E1-6 (20-gliedriger Ring). FAB MS berechnet für C₅₇H₇₂N₇O₁₄ = 1 078,5137; gefunden 1 078,5128.
Das Koppeln mit Nα-BOC-Nβ-CBZ-L-2,3-Diaminopropionsäure und anschließende Cyclisierung ergaben 25,5 mg E1-7 (19-gliedriger Ring). FAB MS berechnet für C₅₆H₇₀N₇O₁₄ 1 064,4981; gefunden 1 064,4994.
Die Tabelle 1 fasst die Aktivitätsdaten für die Verbindung E1-3 bis E1-7 im Vergleich mit der folgenden zum Vergleich genommenen halb synthetischen Echinocandinverbindung C1 zusammen, welche ihre antifungale Aktivität in vitro und in vivo unter Beweis gestellt hat. In einem Mausmodell der Organerholung verringert die Verbindung C1 die Anzahl an A. Fumigatus, die von den Nieren gewonnen werden konnten und war genauso wirksam wie Amphotericin B auf einer mg/kg-Basis, wenn beide intraperitoneal verabreicht wurden. In einem Pneumocystis carinii-Model verringerte die Verbindung C1 die Anzahl von Zysten in den Lungen von stark infizierten immunosuppremierten Ratten um mehr als 99%, wenn es oral zu 5 mg/kg einmal täglich 4 Tage lang verabreicht wurde. Die prophylaktische orale Verabreichung von 1 mg/kg zweimal am Tag für 4 Wochen führte zu einer >90%igen Reduktion in allen Lebenszyklusformen (siehe Turner, W. W. und M. J. Rodriguez, Current Pharmaceutical Design, 1996, 2, S. 214).
Die antifungale Aktivität der Vergleichs- und Testverbindungen wurden in vitro bestimmt, indem man die minimale inhibitorische Konzentration (MIC) der Verbindung unter Verwendung eines standardmäßigen Agar-Verdünnungstests oder eines Scheibendiffusionstests erhielt. Tabelle 1
Das Beispiel 2 veranschaulicht die Umwandlung vom Zwischenprodukt I-6 zu einem azacyclischen Hexapeptidanalog einer Verbindung vom Echinocandin-Typ. Beispiel 2 Herstellung des N-BOC-, Benzyl-, Aldehyd-Derivats von L-Homoserin (E2-1)
Die folgende Prozedur, welche in Baldwin & Flinn, Tetrahedron Lett., 26(31), 3605, (1987) beschrieben ist, wurde verwendet, um E2-1 herzustellen. Eine Suspension von L-Homoserin (5 g, 42 mMol) in 20 ml Wasser wurde mit festem Natriumbicarbonat (3,5 g, 42 mMol) behandelt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur etwa 10 Minuten lang gerührt. Eine Lösung von Di-t-Butyldicarbonat (BOC-Anhydrid) (13,75 g, 63 mMol) in 20 ml p-Dioxan wurde der Mischung hinzugesetzt und dann kräftig bei Raumtemperatur etwa 60 Stunden lang gerührt. Die resultierende homogene Lösung wurde im Vakuum eingeengt, um ein farbloses Öl zu erhalten. Eine Lösung von Benzylbromid (10,8 g, 63 mMol) in 50 ml Dimethylformamid wurde dem Rückstand hinzugesetzt. Weitere 1,8 g (0,5 Äquiv. mehr) an festem Natriumbicarbonat wurden der Reaktion hinzugesetzt, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktion wurde mittels Dünnschichtchromatographie (1:1 Chloroform/Methanol, plus 1 Tropfen Eisessig, entwickelt unter TDM-Färbung) überwacht. Die flüchtigen Stoffe wurden im Vakuum entfernt, und Ethylacetat wurde dem resultierenden Rückstand hinzugesetzt. Die organische Schicht wurde mit Wasser (2-mal), dann Salzlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und konzentriert, wodurch man 14,7 g eines hellgelben Öls erhielt. Der Rückstand wurde in 50 ml Dimethylsulfoxid gelöst. Triethylamin (12,7 g, 126 mMol) wurde hinzugesetzt und die Mischung wurde in einem Eisbad gekühlt. Eine Suspension von Schwefeltrioxid/Pyridin-Komplex (20 g, 126 mMol) in 50 ml Dimethylsulfoxid wurde unter Rühren hinzugesetzt. Das Eisbad wurde entfernt, und die Mischung wurde zur Erwärmung auf Raumtemperatur stehen gelassen. Nach etwa 10 Minuten wurde die Reaktionsmischung in 200 ml Eiswasser gegossen. Die wässrige Schicht wurde zweimal mit Ethylacetat extrahiert, der Ethylacetatextrakt wurde einmal mit 0,1 N Natriumbisulfatlösung, einmal mit Wasser und dann schließlich mit Salzlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert, wodurch man ein gelbes Öl erhielt. Die Flash-Silicagel-Säulenreinigungschromatographie (etwa 250 g, 30% Ethylacetat/Hexan) ergab 11,1 g (86%) eines hellgelben Öls. Die NMR- und Elementaranalyse (C,H,N)-Daten wurden konsistent mit der Struktur E2-1. MS(FD+) = 308 (M+H). Herstellung des Dimethylacetals von Verbindung E2-1 (E2-2)
Die Verbindung E2-1 (4 g) wurde in 50 ml Methanol gelöst und dann in einem Eisbad gekühlt. Eine leichte Decke an HCl-Gas wurde über der Rührlösung (etwa 2-3 Sekunden lang wurde Gas eingelassen) eingeführt, und die Lösung wurde weiter kalt gerührt. Die Reaktion wurde mittels TLC (30% Ethylacetat/Hexan, CAM-Färbung) überwacht. Zusätzliche Mengen an HCl-Gas wurden nach Bedarf hinzugesetzt, um die Reaktion bis zur Vollständigkeit laufen zu lassen. Nach etwa 2 Stunden schien die Reaktion abgeschlossen zu sein. Die noch kalte Reaktionslösung wurde durch Zugabe von festem Natriumbicarbonat gelöscht, und der pH-Wert wurde leicht auf der basischen Seite gehalten. Die flüchtigen Stoffe wurden im Vakuum entfernt. Ether wurde dem Rückstand hinzugesetzt. Die Etherschicht wurde einmal mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Die wässrige Schicht wurde mit Ether rückextrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden dann einmal mit Salzlösung gewaschen und dann über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert, wodurch man 4,6 g (100%) eines klaren, farblosen Öls erhielt. Die NMR- und Elementaranalyse (CHN)-Daten waren konsistent mit der Struktur E2-2. MS(FD+) = 354 (M+H). Debenzylierung der Verbindung E2-2 (E2-3)
Die Verbindung E2-2 (4,2 g, 11,9 mMol) wurde in 50 ml Ethylacetat gelöst. Die Lösung wurde dreimal mit Stickstoff evakuiert/gespült, dann wurden 1,9 g 5 Palladium-auf-Aktivkohle-Katalysator hinzugesetzt. Der Kolben wurde noch einmal evakuiert, und dann wurde Wasserstoff in den Kolben eingeführt. Die Reaktion wurde mittels TLC (40% Ethylacetat/Hexan) überwacht und nach etwa 2 Stunden war die Reaktion beendet. Der Wasserstoff wurde im Vakuum entfernt, die Lösung wurde mit Stickstoff gespült, Celite-Filterhilfsstoff wurde hinzugesetzt, gerührt, durch ein kleines Bett an Celite auf einem Sinterglastrichter filtriert, mit Ethylacetat gespült, und das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert, wodurch man 3,1 g (100%) eines farblosen Öls erhielt. Die NMR-Daten waren konsistent mit der Struktur E2-3. MS(FD+) = 264 (M+H) Elementaranalyse (CHN): Theoretisch% (C – 50,18; H – 8,04; N – 5,32), gefunden% (C – 51,14; H – 7,56; N – 5,65). Koppeln der Verbindung 2-3 an das Di-BOC-Silyl-CBZ-Pentapeptid (I-6), wodurch man (E2-4) erhielt
Die Verbindung I-6 wurde in 5 ml Ethanol gelöst und zu einer Aufschlämmung von 200 mg 10% Palladium-auf-Aktivkohle in 10 ml Ethanol hinzugesetzt (alles unter einer Stickstoffatmosphäre). Eisessig (2 ml) wurde hinzugesetzt und dann wurde eine Wasserstoffatmosphäre über einen Ballon eingeführt.
Indessen wurde die Verbindung E2-3 (0,2 g, 0,76 mMol) in 2 ml Tetrahydrofuran (Sure Seal oder frisch destilliert über Lithiumaluminiumhydrid) gelöst, 96 mg (0,84 mMol) N-Hydroxysuccinimid wurden hinzugesetzt, gefolgt von 172 mg (0,84 mMol) Dicyclohexycarbodiimid. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur gerührt. Nach etwa 10 Minuten wurde ein schweres Präzipitat festgestellt. Beide Reaktionen ließ man bei Raumtemperatur etwa 2 bis 3 Stunden lang rühren und überwachte mittels TLC (25% Ethylacetat/Hexan, CAM-Färbung).
Nach Beendigung der Hydrierungsreaktion wurde die Mischung mit Stickstoff gespült, Celite-Filterhilfsstoff wurde hinzugesetzt, gerührt und dann durch ein Celitebett in einem Sinterglastrichter filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert, wobei die Badtemperatur nicht über 45 °C stieg. Der Rückstand wurde in 8 ml Tetrahydrofuran gelöst und dann wurden etwa 2 ml Triethylamin hinzugesetzt, um den pH-Wert auf 6 bis 7 zu bringen. Der neu gebildete aktive Ester von der zweiten Reaktion wurde direkt in das Gefäß filtriert und genügend Triethylamin wurde hinzugesetzt, um die Reaktionsmischung basisch zu halten (etwa pH 9-10). Die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde mittels TLC (25% Ethylacetat/Hexan, CAM-Färbung) überwacht.
Die flüchtigen Stoffe wurden im Vakuum entfernt, Chloroform wurde dem Rückstand hinzugesetzt, die organische Schicht wurde einmal 1 N Chlorwasserstoffsäure, einmal mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung, noch einmal mit 1 N Chlorwasserstoffsäure und schließlich einmal mit Salzlösung gewaschen. Die Lösung wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert, wodurch man 1 g E2-4 als einen weißen Schaum erhielt. Das Material wurde ohne weitere Reinigung in der nachfolgenden Reaktion verwendet. Gleichwohl kann eine Reinigung unter Verwendung der Flash-Silicagel-Reinigungschromatographie bewerkstelligt werden (etwa 100 g Silica, 20% Ethylacetat/Hexan). Ausbeute = 395 mg (37%) eines weißen Schaums. Die NMR-Daten waren konsistent mit der Struktur E2-4. MS(FAB) = 1 726 (M – t-Butyl). Herstellung des Acylhydrazons von Verbindung E2-4 (E2-5)
Ein Kolben wurde mit der Verbindung E2-4 (374 mg, 0,21 mMol) und 8 ml Tetrahydrofuran befüllt. Hydrazinhydrat (13,6 mg, 0,27 mMol) wurde hinzugesetzt und bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde mittels TLC (25% Ethylacetat/Hexan, CAM-Färbung) überwacht. Nach etwa 15 Minuten wurden die flüchtigen Stoffe entfernt, wodurch man einen weißen Schaum erhielt. Die Flash-Silicagel-Säulenchromatographie (etwa 25 g, 25% → 50% Ethylacetat/Hexan) ergab 250 mg (75%) eines weißen Schaums. Die NMR-Daten waren konsistent mit der Struktur E2-5. MS(FAB) = 1 541 (M – t-Butyl). Cyclisierung der Verbindung E2-5 (E2-6)
Zinn(II)-chlorid (1,5 g) und festes Natriumbicarbonat (400 mg) wurden in 800 ml Methylenchlorid suspendiert. Die Mischung wurde etwa 15 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. Eine Lösung der Verbindung E2-5 (3,2 g) wurde in 100 ml Methylenchlorid hinzugesetzt. Der die Verbindung E2-5 enthaltende Behälter wurde mit weiteren 100 ml Lösungsmittel gespült und dem Reaktionsgefäß hinzugesetzt. Die Reaktion wurde mittels TLC (40% Ethylacetat/Hexan, CAM-Färbung) überwacht. Nach etwa 3 Stunden wurden die zurückbleibenden Feststoffe abfiltriert, und das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert, wodurch man 3 g (100%) an E2-6 als einen blassgelben Feststoff erhielt. Jedweder Versuch der Reinigung misslang aufgrund der Instabilität. MS(FAB) = 1 534 (Stammion). Borhydridreduktion der Verbindung E2-6 (E2-7)
Die Verbindung E2-6 (6 g, 3,9 mMol) wurde in 400 ml Tetrahydrofuran gelöst, 425 mg (6,76 mMol) Natriumcyanoborhydrid wurden hinzugesetzt, gefolgt von 1 ml Eisessig. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur gerührt, während man mittels TLC (40% Ethylacetat/Hexan, CAM-Färbung) überwachte. Nach etwa 2 Stunden wurden die flüchtigen Stoffe im Vakuum entfernt, Ethylacetat wurde dem Rückstand hinzugesetzt, es wurde zweimal mit Wasser, einmal mit Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert, wodurch man 5,2 g eines weißen Schaums erhielt. Der Feststoff wurde in 125 ml Methanol gelöst und bei Raumtemperatur 6 Tage lang gerührt. Die flüchtigen Stoffe wurden im Vakuum entfernt, wodurch man 4,8 g eines weißen Schaums erhielt. Die Flash-Silicagel-Säulenchromatographie (etwa 200 g, 25% → 35% Ethylacetat/Hexan) ergab 2,2 g (37%) eines weißen Schaums. Die NMR-Daten waren konsistent mit der Struktur E2-7. MS(FAB+) = 1 537 (M+H). CBz-Schützung der Verbindung E2-7 (E2-8)
Eine Lösung der Verbindung E2-7 (650 mg, 0,4 mMol) in 15 ml Tetrahydrofuran und festes Natriumbicarbonat (67 mg) wurden einem Reaktionsgefäß, das mit einem Kautschukstopfen und einem Rührstäbchen versehen war, gegeben. Die Lösung wurde mit Stickstoff gespült und gerührt. Die Mischung wurde in einem Eisbad gekühlt und Benzylchlorformiat (144 mg, 0,8 mMol, 12 μl) wurde mittels einer Spritze hinzugesetzt. Die Mischung wurde etwa 1 Stunde lang kalt gerührt. Das Eisbad wurde entfernt und die Mischung wurde bei Raumtemperatur etwa 3 Stunden lang gerührt. Die Reaktion wurde mittels TLC (20% und 40% Ethylacetat/Hexan, CAM-Färbung) überwacht. Die flüchtigen Stoffe wurden im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in Ether gelöst, zweimal mit Wasser, einmal schnell mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure, einmal mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung, einmal mit Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert, wodurch man 700 mg eines weißen Schaumes erhielt. Die Flash-Silicagel-Säulenchromatographie (35 g Silica, 20% Ethylacetat/Hexan) ergab 460 mg (65%) eines weißen Schaums. Die NMR-Daten waren konsistent mit der Struktur E2-8. MS(FAB) = 1 670 (Stammion). Entschützung der Verbindung E2-8 (E2-9)
Die Verbindung E2-8 (1,2 g, 0,72 mMol) wurde in kalter Trifluoressigsäure (10 ml) gelöst, in ein Eisbad gestellt und etwa 1,5 Stunden lang gerührt. Kaltes Wasser (5 ml) wurde hinzugesetzt, und das Rühren wurde in dem Eisbad etwa 1 Stunde fortgesetzt. Die flüchtigen Stoffe wurden im Vakuum entfernt, 5 ml Tetrahydrofuran und 5 ml 1 N Chlorwasserstoffsäure wurden hinzugesetzt, und es wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Die flüchtigen Stoffe wurden im Vakuum entfernt, Toluol wurde dem Rückstand hinzugesetzt, und dann wurde abgedampft. Die Prozedur wurde zwei weitere Male wiederholt, um die überschüssige Trifluoressigsäure zu entfernen. Ether wurde dem Rückstand hinzugesetzt, und dann wurde ultrabeschallt, um einen weißen Feststoff zu erhalten. Der Ether wurde abfiltriert, und der Rückstand wurde mehrere Male mit Ether gespült. Der Rückstand wurde unter hohem Vakuum getrocknet, wodurch man 660 mg (100%) eines weißen Feststoffes erhielt. Die Analyse durch RP-HPLC (C18 Bondapak, 70:20:10 AcN/Wasser/1% TFA, 230 nm) ergab, dass das Material zu 97% rein war. Die NMR-Daten waren konsistent mit der Struktur E2-9. MS(FAB) = 885,5 (M+H). Herstellung der Verbindung (E2-10(b))
Die Verbindung E2-9 (600 mg, 0,68 mMol) wurde in 10 ml Dimethylformamid gelöst, und genügend Diisopropylethylamin wurde hinzugesetzt, um die Lösung gegenüber pH-Papier basisch zu machen (etwa 0,5 ml). Der aktive Hydroxybenzotriazolester der Terphenyl-Seitenkette (388 mg, 0,81 mMol) wurde dem Reaktionsgemisch hinzugesetzt und man rührte bei Raumtemperatur über Nacht. Die Reaktion wurde mittels RP-HPLC (60:40 AcN/Wasser, 230 nm) überwacht.
Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und eine 1:1-Mischung von Methanol/Acetonitril wurde dem resultierenden Rückstand hinzugesetzt, gefolgt von einem Rühren und einer anschließenden Filtration. Der resultierende weiße Feststoff wurde in Ether suspendiert, gerührt, filtriert und das Verfahren wiederholt. Die gleiche Prozedur wurde unter Verwendung von Methylenchlorid, dann schließlich ein weiteres Mal mit Ether durchgeführt. Der Rückstand wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch man 735 mg (88%) eines weißen Feststoffes – Verbindung E2-10(a) erhielt. MS(FAB) = 1 227,6 (Stammion).
Der weiße Feststoff (632 mg, 0,5 mMol) wurde in Essigsäure (100 ml) suspendiert und einer katalytischen Hydrierung unter einem Ballon von Wasserstoff über Nacht unterzogen (100 mg 10% Palladium-auf-Aktivkohle). Die Reaktion wurde mittels Umkehrphasen-HPLC (C-18 Bondapak, 60:30:10 AcN/Wasser/1% TFA, 230 nm) überwacht. Das Reaktionsgefäß wurde mit Stickstoff gespült, Celite-Filterhilfsstoff wurde hinzugesetzt, es wurde gerührt, es wurde durch ein Celitebett in einem Sinterglastrichter filtriert, der Katalysator wurde mit einer 1:1:1-Mischung von Methanol/AcN/Wasser gewaschen und das Filtrat wurde bis zur Trockne konzentriert. Toluol wurde hinzugesetzt und anschließend bis zur Trockne abgedampft, wodurch man 440 mg (81%) eines weißen Feststoffes – Verbindung E2-10(b) erhielt. MS(FAB) = 1 093,5 (Stammion). Alkylierung vom entschützten Acylhydrazidkern E2-10(b), wobei R Methyl, Ethyl oder n-Propyl ist (E2-11)
Die folgende Prozedur veranschaulicht eine typische Herstellung für die Alkylierungen. Die Verbindung E2-10(b) (100 mg, 0,086 mMol) wurde in 10 ml Dimethylformamid gelöst oder suspendiert. Zwei Äquivalente des entsprechenden Aldehyds (verwende für Formaldehyd 5,2 mg (15 μl)) wurden hinzugesetzt (für Acetaldehyd verwende 7,6 mg (10 μl) und für Propionaldehyd verwende 10 mg (12,5 μl), wobei alles 0,173 mMol ist), gefolgt von genügend Eisessig (etwa 3-4 Tropfen), um die Mischung sauer zu machen. Natriumcyanoborhydrid (11 mg, 0,173 mMol) wurde hinzugesetzt, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktion wurde mittels Umkehrphasen-HPLC (C-18 Bondapak, AcN/Wasser/1% TFA (55:35:10), 280 nm) überwacht. Die Reaktion wurde mit Wasser gelöscht, um eine klare Lösung und ein weißes gummiartiges Material am Boden des Kolbens zu erhalten. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt, Acetonitril wurde hinzugesetzt, filtriert und mit Ether gewaschen, wodurch man ein weißes Pulver erhielt (150 mg für Methyl, 250 mg für Ethyl und 250 mg für Propyl). Alle alkylierten Materialien wurden unter Verwendung der präparativen RP-HPLC (50:40:10 AcN/Wasser/1% HCl, 230 nm für Methyl und Ethyl und 55:35:10 AcN/Wasser/1% HCl, 230 nm für Propyl) isoliert.
Ausbeute: 64 mg für das Methylderivat E2-11(a) mit MS(FAB) = 1 107,54 (exakte Masse)
59 mg für das Ethylderivat E2-11(b) mit MS(FAB) = 1 121,55 (exakte Masse)
73 mg für das Propylderivat E2-11(c) mit MS(FAB) = 1 135,57 (exakte Masse) Herstellung des Produktes von der Kopplung von Glycin an die Verbindung E2-7 (E2-12)
CBz-Glycin (2 g, 9,6 mMol) wurde in 25 ml Tetrahydrofuran gelöst, Pentafluorphenol (2,2 g, 11,9 mMol) wurde hinzugesetzt, gefolgt von 1-[3-(Dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDAC) (2,2 g, 11,5 mMol). Die Mischung wurde bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Die Reaktion wurde mittels TLC (40 Ethylacetat/Hexan, UV- und CAM-Färbung) überwacht. Nach etwa 1 Stunde wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, der Rückstand wurde in Metnylenchlorid gelöst, die organische Schicht wurde einmal mit 1 M Natriumbisulfatlösung, dreimal mit 1 N Natriumhydroxid und schließlich einmal mit Salzlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert, wodurch man 3,3 g (92%) eines hellrosanen Feststoffes erhielt. Das Material wies konsistente NMR-Daten auf.
Die Verbindung E2-7 (700 mg, 0,45 mMol) wurde in 15 ml Tetrahydrofuran gelöst. Der aktive Ester von oben (505 mg, 1,3 mMol) wurde hinzugesetzt, plus einigen wenigen Tropfen Triethylamin. Die Mischung wurde nahe am Rückfluss etwa 4 Stunden lang erhitzt, dann auf Raumtemperatur gekühlt und über Nacht gerührt. Die flüchtigen Stoffe wurden im Vakuum entfernt, Ether wurde dem Rückstand hinzugesetzt, es wurde zweimal mit 1 N Natriumhydroxid, einmal mit Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert, wodurch man 1,1 g eines weißen Schaums erhielt. Die Flash-Silicagel-Säulenreinigung (20-mal 30% Ethylacetat/Hexan) ergab 0,75 g (95%) eines weißen Schaums. Das Material wies befriedigende NMR-Daten auf. MS(FAB): 1 727,9 (Stammion).
Die Silyl- und BOC-Schutzgruppen wurden entfernt, und zwar die vorausgehende Prozedur zur Herstellung der Verbindung E2-9 nachvollziehend. Die Reaktion wurde mittels RP-HPLC (25:65:10 AcN/Wasser/1% TFA, 230 nm) überwacht. Ausbeute = 490 mg eines weißen Pulvers.
Die Terphenyl-Seitenkette wurde an dem obigen Produkt gemäß dem Verfahren zur Herstellung der Verbindung E2-10(b) gekoppelt. Reaktionsmengen: 490 mg der obigen Verbindung, 260 mg (0,544 mMol) des aktiven Terphenylesters, 10 ml Dimethylformamid und genügend Diisopropylethylamin, um die Reaktion basisch zu machen. Die Reaktion wurde mittels RP-HPLC verfolgt (25:65:10 AcN/Wasser/1% TFA für Ausgangsmaterial, 230 nm und 60:30:10 AcN/Wasser/1% TFA für Produkt, 280 nm). Das Lösungsmittel wurde unter hohem Vakuum entfernt, wodurch man einen weißen, gummiartigen Rückstand erhielt. Die Triturierung aus Ether (2 Waschungen) ergab 800 mg eines blassgelben Pulvers.
Das obige Produkt wurde den gleichen Hydrogenolysebedingungen wie für die Verbindung E2-10(a) unterzogen. Reagenzmengen: 400 mg 10% Palladium-auf- Aktivkohle, 100 ml Eisessig. Die Reaktion über Nacht ergab 600 mg eines gebrochen weißen Feststoffes. Das Produkt wurde unter Verwendung von RP-HPLC (AcN/Wasser/1% TFA (50:40:10), 280 nm) isoliert.
Ausbeute = 188 mg eines weißen Pulvers. Die NMR-Daten waren konsistent mit der Struktur E2-12. MS(FAB) = 1 150,54 (exakte Masse). Herstellung des Produktes durch Kopplung von Diaminopropionsäure an die Verbindung E2-7 (E2-13)
Der obigen Prozedur zur Herstellung der Verbindung E2-12 folgend wurde der aktive Ester der L-di-CBz-Diaminopropionsäure hergestellt. Die Reaktionsstöchiometrien waren wie folgt: L-di-CBz-Diaminopropionsäure – 581 mg (1,56 mMol), Pentafluorphenol – 344 mg (1,87 mMol), 1-[3-Dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDAC) – 360 mg (1,87 mMol), Tetrahydrofuran – 12 ml. TLC-System: Chloroform/Methanol/Eisessig, 75:25:Tropfen, für das Ausgangsmaterial; 40 Ethylacetat/Hexan, TDM-Färbung fürs Produkt. Die gleiche Aufarbeitung ergab 720 mg (86%) eines weißen Feststoffes. Das Material besaß befriedigende NMR-Daten.
Erneut der obigen Prozedur zum Koppeln des aktiven Esters (710 mg, 1,32 mMol) an die Verbindung E2-7 (800 mg, 0,52 mMol) folgend und einem Refluxieren während 2 Tagen ergab eine standardmäßige Aufarbeitung 1,1 g eines weißen Schaums. Die Flash-Silicagel-Säulenchromatographie (100 g Silica, 20% Ethylacetat/Hexan) ergab 0,56 g (57% Ausbeute) eines weißen Schaums. MS(FAB) = 1 891 (Stammion).
Die Silyl- und BOC-Schutzgruppen wurden entfernt, wobei die vorausgehende Prozedur zur Herstellung der Verbindung E2-9 nachvollzogen wurde. Die Reaktion wurde mittels RP-HPLC (50:40:10 AcN/Wasser/1% TFA, 230 nm) überwacht. Ausbeute = 550 mg.
Die Terphenyl-Seitenkette wurde an das obige Produkt gemäß dem Verfahren zur Herstellung einer Verbindung E2-10(b) gekoppelt. Reaktionsmengen: 550 mg der obigen Verbindung, 239 mg (0,5 mMol) des aktiven Terphenylesters, 10 ml Dimethylformamid und genügend Diisopropylethylamin, um die Reaktion basisch zu machen. Nach der Reaktion folgte RP-HPLC (70:20:10 AcN/Wasser/1% TFA fürs Ausgangsmaterial, 230 nm und 40:50:10 AcN/Wasser/1% TFA fürs Produkt, 280 nm). Das Lösungsmittel wurde unter hohem Vakuum entfernt, wodurch man einen weißen, gummiartigen Rückstand erhielt. Die Triturierung aus Ether (2 Waschungen) ergab 850 mg eines gebrochen weißen Pulvers.
Das obige Produkt wurde den gleichen Hydrogenolysebedingungen wie bei der Verbindung E2-10(a) unterzogen. Reagenzmengen: 400 mg 10% Palladium-auf-Aktivkohle, 100 ml Eisessig. Die über Nacht laufende Reaktion führte zu 580 mg eines gebrochen weißen Feststoffes. Das Produkt wurde unter Anwendung von RP-HPLC (Gradient AcN/Wasser/1% TFA (45/45/10 → 55/10 Elutionsschema, 280 nm) isoliert. Zwei separate Produkte wurden isoliert, welche beide das gleiche Molekulargewicht besaßen. Es wurde niemals bestimmt, was die relativen Stöchiometrien der zwei Verbindungen waren. Die Ausbeute eines E2-13-Isomeren lag bei 76 mg, und die Ausbeute des anderen E2-13-Isomeren lag bei 116 mg.
MS(FAB) = 1 179,6 (Stammion) für beides.
Die Tabelle 2 fasst die Aktivitätsdaten für die Verbindungen E2-9 bis E2-13 im Vergleich zu der vergleichsmäßigen halb synthetischen Echinocandin-Verbindung C1 zusammen. Die gleichen Testprozeduren wurden angewandt, wie es oben in Beispiel 1 beschrieben ist. Tabelle 2
Das Beispiel 3 erläutert weiter die Einführung einer neuen Einheit, um ein analoges einer Verbindung vom Echinocandin-Typ zu erhalten.
Beispiel 3
CbzNHCH₂CH₂SH wurde hergestellt, wie es in I. Shinkai, T. Liu, R. Reamer, M. Sletzinger, Synthesis, 924, 1980 beschrieben ist.
N-BOC-O-Toluolsulfonylserinmethylester wurde hergestellt, wie es in N. A. Sasaki, C. Hashimoto, P. A. Potier, Tetrahedron Lett., 28, 6069-6072, 1987 beschrieben ist. Herstellung von (R)-2-[(tert-Butoxy-carbonyl)amino]-3-[(2'-N-benzylaxycarbonylamino)ethanthio]methylpropiolat (E3-1)
Natriumhydrid (72 mg, 1,8 mMol, 60%ige Suspension in Mineralöl) wurde mit Hexanen unter einer Stickstoffatmosphäre in einem 3-Hals-Rundkolben trituriert. Der Kolben wurde in ein 0 °C warmes Bad gestellt und eine Lösung von CbzNHCH₂CH₂SH (470 mg, 1,87 mMol, 85% rein) in DMF (5 ml) wurde hinzugesetzt. Die resultierende Mischung wurde bei 0 °C 20 Min. lang gerührt, was zu einer farblosen Lösung führte. N-BOC-O-Toluolsulfonylserinmethylester (671 mg, 1,8 mMol) wurde als ein Feststoff hinzugesetzt und innerhalb des Kolbens mit zusätzlichen 2 ml DMF gewaschen. Die resultierende Mischung wurde bei 0 °C 3 Stunden lang gerührt, dann in Wasser gegossen und zweimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Wasser, 1 N Natriumhydroxidlösung, Wasser und Salzlösung gewaschen, dann über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert, wodurch man 900 mg eines Öls erhielt. Die Radialchromatographie unter Elution mit 25% → 50% Ethylacetat in Hexanen ergab 570 mg an 76% des gewünschten (R)-2-[(tert-Butoxy-carbonyl)amino]-3-[(2'-N-benzyloxycarbonylamino)ethanthio]methylpropiolat. Anal. berechnet für C₁₉H₂₈N₂O₆S, C: 55,32, H: 6,84, N: 6,79; gefunden C: 55,2.6, H: 6,95, N: 6,94. [α]_D – 1,9⁰ (c = 10). Herstellung von (R)-2-[(tert-Butoxycarbonylamino]-3-[(2'-N-benzyloxycarbohylamino)- ethanthio]propio]säure (E3-2)
Die Verbindung E3-1 (520 mg, 1,26 mMol) in Dioxan (3 ml) wurde mit 0,5 M LiOH-Lösung (3 ml) behandelt und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Dioxan wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde zwischen 1 N Chlorwasserstoffsäurelösung und Ethylacetat aufgeteilt. Der organische Extrakt wurde mit Salzlösung gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert, wodurch man 500 mg eines farblosen Öls erhielt, welches der Verbindung E3-2 entsprach. Anal. berechnet für C₁₈H₂₆N₂O₆S + 0,4 H₂O, C: 53,29, H: 6,65, N: 6,90; gefunden C: 53,61, H: 6,82, N: 6,85. [α]_D – 0,9⁰ (c = 10). MS: (m + 1) 399. Herstellung von (R)-2-[(tert-Butoxycarbonyl)amino]-3-[(2'-N-benzyloxycarbonylamino)ethansulfonyl]propio]säure (E3-3)
Die Verbindung E-3-2 (0,95 g, 2,38 mMol) wurde in MeOH (15 ml) gelöst und auf 0°C gekühlt. Eine Lösung von Oxone^® (1,77 g, 5,7 mMol) in Wasser (15 ml) wurde hinzugesetzt, und die resultierende Mischung wurde bei 0 °C 1 Stunde lang, dann bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das MeOH wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde zwischen Ethylacetat und Wasser aufgeteilt. Die wässrige Phase wurde mehrere Male mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert, wodurch man 800 mg (78%) eines farblosen Schaums erhielt, was der Verbindung E3-3 entsprach. Anal. berechnet für C₁₈H₂₆N₂O₈S, C: 50,22, H: 6,09, N: 6,51; gefunden: C: 50,13, H: 5,86, N: 6,45. [α]_D – 7⁰ (c = 10). MS: (m + 1) 431. Herstellung von Verbindung E3-4
Zu einer Lösung der Verbindung E3-3 (160 mg, 0,37 mMol) und N-Hydroxysuccinimid (43 mg, 0,37 mMol) in trockenem THF (5 ml) wurden Dicyclohexylcarbodiimid (76 mg, 0,37 mMol) und zusätzliche 2 ml THF gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 3 Stunden lang gerührt, dann auf 0 °C gekühlt, um bei der Präzipitation von Dicyclohexylharnstoff zu helfen. In der Zwischenzeit wurde DiBOC CBZ-Silylpentapeptid I-6 (565 mg, 0,337 mMol) in absolutem Ethanol (10 ml) und Eisessig (95 ml) gelöst, entgast, und dann wurden 10% Pd/C (160 mg) der Mischung hinzugesetzt. Die Mischung wurde unter Atmosphäre von H₂ (Ballondruck) 3 Stunden lang gerührt. Der Katalysator wurde mittels Filtration entfernt, und das Filtrat wurde im Vakuum zu einem dicken Öl konzentriert. THF (10 ml) und Essigsäure (1 ml) wurden hinzugesetzt, und die Lösungsmittel wurden erneut im Vakuum entfernt, wodurch das gesamte restliche Ethanol entfernt wurde. Der oben hergestellte aktive NHS-Ester der Verbindung E3-3 wurde direkt in einen Kolben, der das entblockte Pentapeptid enthielt, durch einen Sinterglastrichter hineinfiltriert, das präzipitierte DCU wurde dann mit zusätzlichen 3 ml an THF gewaschen. Die resultierende Lösung wurde gegenüber Lackmus-Papier basisch gemacht, indem Triethylamin tropfenweise hinzugesetzt wurde. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur zusätzliche 3 Stunden gerührt, dann mit Ethylacetat verdünnt, mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung und Salzlösung gewaschen, dann über MgSO4 getrocknet und im Vakuum konzentriert. Die Flash-Chromatographie unter Elution mit 7:2:1 Hexan:Ethylacetat:Methylenchlorid ergab das gewünschte Kopplungsprodukt E3-4 als eine Isomerenmischung. Das weniger polare Isomer ergab 140 mg mit einem MS = 1 950,9 (m+). Gemischte Fraktionen: 224 mg. Das stärker polare Isomer ergab 155 mg mit einer MS = 1 951,9 (m + 1). Gesamtausbeute: 519 mg, 78%.
Diese Reaktion wurde im Maßstab von 0,6 mMol wiederholt, wodurch man 400 mg des gewünschten Produktes als eine Isomerenmischung erhielt. Anal. berechnet für C₉₃H₁₆₈N₈O₂₂SSi₆, C: 57,25, H: 8,68, N: 5,75; gefunden C: 57,55, H: 8,63, N: 5,79. (Das Stereozentrum der Säure E3-3 racemisierte in der Kopplungsreaktion.) Herstellung der Verbindung E-3-5
Eine Lösung der Verbindung E3-4 (390 mg, 0,2 mMol, Mischung von Diastereomeren) in absolutem Ethanol (10 ml) und Eisessig (10 ml) wurde entgast und dann mit 10% Pd/C (390 mg) behandelt. Die Mischung wurde unter einer Atmosphäre von H₂ (Ballondruck) 2 Stunden lang gerührt. Der Katalysator wurde mittels Filtration durch Celite entfernt, und das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert, wobei man vorsichtig war, damit etwas Essigsäure zurückblieb. Der Rückstand wurde mit Diethylether (175 ml) verdünnt und Triethylamin wurde solange hinzugesetzt, bis die Mischung gegenüber Lackmus-Papier (etwa 1 ml war erforderlich) basisch wurde. Die resultierende Lösung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt, dann mit 0,1 N Chlorwasserstoffsäure, Salzlösung, gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert, um einen Schaum zu erhalten. Die Flash-Chromatographie auf Silicagel unter Elution mit 30% Ethylacetat in Hexanen ergab das gewünschte ringgeschlossene Material E3-5. Das weniger polare Isomer ergab 105 mg eines Schaums mit einem Wert für MS: (m+) 1 599,9. Das stärker polare Isomer ergab 110 mg eines Schaums mit einem Wert für MS = 1 599,8 (m+). Die Gesamtausbeute lag bei 215 mg, 67%. Herstellung von Verbindung E3-6
Das stärker polare Isomer der Verbindung E3-5 (160 mg, 0,1 mMol) wurde in Trifluoressigsäure (5 ml) gelöst, welche auf 0 °C gekühlt worden war. Nach 30 Min. wurde Wasser (0,5 ml) hinzugesetzt und die Mischung wurde weitere 30 Min. bei 0°C gerührt. Die Mischung wurde im Vakuum konzentriert, der Rückstand wurde in THF gelöst und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde in THF (3 ml) gelöst, 1 N Chlorwasserstoffsäurelösung (1 ml) wurde hinzugesetzt und die Mischung wurde über Nacht in einen Kühlschrank gestellt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, zusätzliches THF wurde hinzugesetzt und die Mischung wurde erneut konzentriert, wobei das Wasser azeotrop entfernt wurde. Diese Behandlung ergab einen weißen Feststoff. Dieser weiße Feststoff wurde in DMF (5 ml) gelöst und aktiver Terphenylhydroxybenzotriazolester (58 mg, 0,12 mMol) wurde hinzugesetzt, gefolgt von Triethylamin (60 μl, 0,4 mMol). Die resultierende Lösung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt, dann wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde durch präparative RP-HPLC (Stufengradient 50%-70% AcN in Wasser über 45 Min.) gereinigt. Der Hauptpeak wurde mittels HPLC (C-18 u-Bondpak-Säule, 60% AcN, 0,1% TFA in Wasser) analysiert und die das Material enthaltenden Fraktionen, welche bei 4 Min. eluierten, wurden vereinigt und gefriergetrocknet, wodurch man 65 mg (56% Ausbeute) an E3-6 als ein weißes Pulver mit MS = 1 156,6 (m+) erhielt.
In einer analogen Weise wurde das weniger polare Isomer zu E3-7 (das Material eluierte in 7 Min. unter den oben beschriebenen analytischen Bedingungen) umgewandelt, wodurch man 13 mg (11% Ausbeute) des gewünschten E-3-7 erhielt.
FAB MS (M), berechnet für C₅₈H₇₄N₇O₁₆S 1 156,4913; gefunden = 1 156,4924.
Der folgende Satz an Beispielen veranschaulicht die weitere Spaltung des linearen Pentapeptids zu einem Tetrapeptid und die nachfolgende Einführung von neuen Einheiten auf der linearen Peptidkette vor dem Schließen.
Zu einer Lösung der Verbindung I-7 (732 mg, 1,1 mMol) in wasserfreiem THF (25 ml) wurde PyBOP^® (572 mg, 1,1 mMol), N-Cbz-L-Valin (304 mg, 1,21 mMol), Diisopropylethylamin (0,57 ml, 3,3 mMol) und wasserfreies DMF (1,0 ml) gegeben, um verbliebene Feststoffe zu lösen. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt, gefolgt von der Entfernung der Lösungsmittel im Vakuum. Der Rückstand wurde in wasserfreiem THF (40 ml) gelöst, gefolgt von der Zugabe von t-Butyldimethylsilylchlorid (1,66 g, 11,0 mMol) und Imidazol (750 mg, 11,0 mMol). Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 18 Stunden lang gerührt. Die Reaktion wurde im Vakuum konzentriert und der Rückstand wurde in Et₂O gelöst, zweimal mit 0,1 N HCl gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Die Flash-Chromatographie (Elution mit 35% EtOAc/Hexan) ergab 690 mg an Produkt, 46% Ausbeute. Das ¹H-NMR (300 MHz)-Spektrum war konsistent mit der Struktur E4-1. FAB MS (M⁺) = 1 356.
Zu einer Lösung der Verbindung E4-1 (700 mg, 0,51 mMol) in wasserfreiem THF (0,6 ml) und Acetonitril (4 ml) wurde N-t-Boc-Anhydrid (0,24 ml, 1,03 mMol) und Dimethylaminopyridin (7 mg, 0,05 mMol) gegeben. Die Lösung wurde 3 Stunden lang gerührt. Nach der Entfernung der Lösungsmittel im Vakuum ergab die Flash-Chromatographie (Elution mit 17% EtOAc/Hexan) 307 mg Produkt, 38% Ausbeute. Das ¹H-NMR (300 MHz)-Spektrum war konsistent mit der Struktur E4-2. FAB MS (M⁺ der freien Base) = 1 556.
Zu einer Lösung von 5% Pd/C (150 mg) in EtOH (15 ml) und AcOH (15 ml) unter einer N₂-Atmosphäre wurde die Verbindung E4-2 (307 mg, 0,20 mMol) gegeben. Die Lösung wurde mit H₂ (x8) gespült/gefüllt und einem konstanten H₂-Druck 2,4 Stunden lang unterzogen, dann über Celite filtriert, um den Katalysator zu entfernen. Die Lösung wurde im Vakuum konzentriert, um Lösungsmittel zu entfernen, der Rückstand wurde in wasserfreiem THF (30 ml) gelöst, gefolgt von der Zugabe von α-N-t-Boc-γ-N-Cbz-L-Ornithin (80 mg, 0,22 mMol), PyBOP^® (103 mg, 0,20 mMol) und Diisopropylethylamin (0,10 ml, 0,59 mMol). Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 18 Stunden lang gerührt, gefolgt von der Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum. Die Flash-Chromatographie (unter Elution mit 30% EtOAc/-Hexan) ergab 284 mg eines weißen Feststoffes, 81% Ausbeute. Das ¹H-NMR (300 MHz)-Spektrum war konsistent mit der Struktur E4-3. FAB MS (M⁺ der freien Base) = 1 771.
Zu einer mit N₂ gespülten Lösung der Verbindung E4-3 (279 mg, 0,16 mMol) in EtOH (13 ml) und AcOH (12 ml) wurde 5% Pd/C (150 mg) hinzugesetzt. Die Reaktion wurde mit H₂ (x10) gespült/gefüllt und unter einem konstanten H₂-Druck 2 Stunden lang stehen gelassen, gefolgt von der Entfernung des Katalysators durch Filtration über Celite und Entfernung der Lösungsmittel im Vakuum. Das resultierende Öl wurde in Et₂O (75 ml) gelöst, gefolgt von der Zugabe von Triethylamin (5 ml, 35,9 mMol). Nach 18 Stunden wurde die Reaktion im Vakuum konzentriert und die Flash-Chromatographie (unter Elution mit 34% EtOAc/Hexan) ergab 98 mg an Produkt, 43% Ausbeute. Das ¹H-NMR (300 MHz)-Spektrum war konsistent mit der Struktur E4-4. FAB MS (M⁺ der freien Base) = 1 420.
Eine Lösung der Verbindung E4-4 (93 mg, 0,07 mMol) in eiskaltem THF (2 ml) wurde in einen Gefrierschrank bei 0 °C 2 Stunden lang gestellt, gefolgt von der Zugabe an eiskaltem Wasser (2 ml) und dann wurde in einem Eisbad 2 Stunden lang gerührt. Die Lösung wurde im Vakuum konzentriert, wodurch man 66 mg weiße Feststoffe erhielt, welche in THF (1,5 ml) und HCl (1,5 ml, 1,0 N) gelöst wurden und es wurde bei Raumtemperatur 16 Stunden lang gerührt. Toluol wurde hinzugesetzt und die Lösung wurde im Vakuum dreimal konzentriert, um bei der Entfernung von TFA unterstützend zu wirken, wodurch man 44,5 mg eines gebrochen weißen Feststoffes, 91% Ausbeute erhielt. Das ¹H-NMR (300 MHz)-Spektrum war konsistent mit der Struktur E4-5. FAB MS (M⁺ der freien Base) = 748.
Zu einer Lösung der Verbindung E4-5 (44 mg, 0,06 mMol) in wasserfreiem DMF (2 ml) wurden Diisopropylethylamin (0,03 ml, 0,18 mMol) und der aktive Hydroxybenzotriazolester der Terphenyl-Seitenkette (34 mg, 0,07 mMol) hinzugesetzt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 40 Stunden lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde mit Et₂O (10 ml) behandelt, ultrabeschallt und ein brauner Feststoff wurde mittels Filtration isoliert. RP-HPLC (unter Elution mit 30-70% ACN/0,1% TFA/H₂O) und Gefriertrocknung ergaben 18,7 mg eines weißen Feststoffes, 29% Ausbeute. Das ¹H-NMR (300 MHz)-Spektrum war konsistent mit der Struktur E4-6. FAB MS (M⁺ der freien Base) = 1 090.
Beispiel 5
Das Beispiel 5 stellt weiter die Eindringung von neuen Einheiten auf einer Tetrapeptidkette, gefolgt von einem Ringschluss, dar, um eine neue cyclische Peptidstruktur vom Echinocandin-Typ herzustellen.
Zu einer Lösung vom Tetrapeptid I-7 (700 mg, 1,05 mMol) in wasserfreiem THF (20 ml) wurde PyBOP^® (547 mg, 1,05 mMol), N-Cbz-L-Tyrosin (364 mg, 1,16 mMol), N,N-Diisopropylethylamin (0,55 ml, 3,15 mMol) gegeben. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 3 Stunden lang gerührt, gefolgt von der Entfernung der Lösungsmittel im Vakuum. Dies wurde direkt in der nächsten Reaktion eingesetzt.
Der obige Rückstand E5-1 wurde in wasserfreiem DMF (10 ml) gelöst, gefolgt von der Zugabe von t-Bu-dimethylsilylchlorid (1,90 g, 12,6 mMol) und Imidazol (860 mg, 12,6 mMol) und die Lösung wurde bei Raumtemperatur 18 Stunden lang gerührt. Die Reaktion wurde im Vakuum konzentriert und der Rückstand wurde in Et₂O gelöst, zweimal mit kaltem 0,1 N HCl, einmal mit H₂O, 10%iger wässriger Natriumbicarbonatlösung, Salzlösung gewaschen und über MgSO₄ getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, wodurch man 2,0 g rohes Öl erhielt. Die Reinigung durch Radial-Chromatographie (unter Elution mit 35% EtOAc/-Hexanen) ergab 700 mg (43% Ausbeute) an Produkt. Das ¹H-NMR (300 MHz)-Spektrum war konsistent mit der Struktur E5-2. FAB MS (M⁺) = 1 534.
Zu einer Lösung der Verbindung E5-2 (700 mg, 0,46 mMol) in wasserfreiem THF (10 ml) wurde N-t-Boc-Anhydrid (0,41 ml, 1,78 mMol) portionsweise und Dimethylaminopyridin (7 mg, 0,05 mMol) hinzugesetzt, und die Lösung wurde bei 3 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Nach der Entfernung der Lösungsmittel im Vakuum ergab die Reinigung durch Radial-Chromatographie (unter Elution mit 20% EtOAc/Hexanen) 460 mg Produkt, 58% Ausbeute. Das ¹H-NMR (300 MHz)-Spektrum war konsistent mit der Struktur E5-3. FAB MS (M⁺ der freien Base) = 1 735.
Zu einer Lösung von 10% Pd/C (270 mg) in EtOH (10 ml) und AcOH (10 ml) unter einer N₂-Atmosphäre wurde die Verbindung E5-3 (460 mg, 0,27 mMol) gegeben. Die Lösung wurde mit H₂ (x4) gespült/gefüllt und einem konstanten H₂-Druck 2,0 Stunden bei Umgebungstemperatur unterzogen, dann über Celite zur Entfernung des Katalysators filtriert. Die Lösung wurde im Vakuum konzentriert, um Lösungsmittel zu entfernen, der Rückstand wurde in wasserfreiem THF (30 ml) gelöst, gefolgt von der Zugabe von α-N-t-Boc-γ-N-Cbz-L-Ornithin-N-hydroxysuccirimidester (172 mg, 0,37 mMol) und Triethylamin auf einen pH-Wert von 8 (≈5 ml). Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 3 Stunden lang gerührt. Dann verdünnte man die Reaktion mit Ether und wusch mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung, 0,1 N HCl, gesättigter Natriumbicarbonatlösung und trocknete über Magnesiumsulfat. Gefiltert und konzentriert wurde im Vakuum. Die Radial-Chromatographie (unter Elution mit 30 EtOAc/Hexanen) ergab 280 mg eines weißen Feststoffes, 54% Ausbeute. Das ¹H-NMR (300 MHz)-Spektrum war konsistent mit der Struktur E5-4. FAB MS (M⁺ der freien Base) = 1 949.
Zu einer mit N₂ gespülten Lösung der Verbindung E5-4 (280 mg, 0,14 mMol) in EtOH (10 ml) und AcOH (5 ml) wurde 10% Pd/C (200 mg) gegeben. Die Reaktion wurde mit H₂ (x4) gespült/gefüllt und unter konstantem H₂-Druck 2 Stunden lang stehen gelassen, gefolgt von der Entfernung des Katalysators durch Filtration über Celite. Das resultierende Öl wurde in Et₂O (10 ml) gelöst, gefolgt von der Zugabe von Triethylamin (4 ml, 28,7 mMol). Nach 18 Stunden wurde die Reaktion im Vakuum konzentriert und mittels Radial-Chromatographie (unter Elution mit 40% EtOAc/-Hexanen) gereinigt, wodurch man 130 mg Produkt, 57% Ausbeute, erhielt. Das ¹H-NMR (300 MHz)-Spektrum war konsistent mit der Struktur E5-5. FAB MS (M⁺ der freien Base) = 1 597.
Eine Lösung der Verbindung E5-5 (128 mg, 0,08 mMol} in eiskaltem TFA (2 ml) wurde 2 Stunden in einen Gefrierschrank bei 0 °C gestellt, gefolgt von der Zugabe von eiskaltem Wasser (2 ml), und wurde dann in einem Eisbad 2 Stunden gerührt. Die Lösung wurde im Vakuum konzentriert, dann in THF (1,5 ml) und 1 N HCl (1,5 ml) gelöst und bei Raumtemperatur 16 Stunden gerührt. Toluol wurde hinzugesetzt, und die Lösung wurde im Vakuum dreimal konzentriert, wodurch man 70 mg eines weißen Dihydrochloridfeststoffes, 100% Ausbeute, erhielt. Das ¹H-NMR (300 MHz)-Spektrum war konsistent mit der Struktur E5-6. FAB MS kalkuliert für M+H C₃₉H₅₄N₇O₁₂ = 812,3830; gefunden = 812,3837.
Zu einer Lösung der Verbindung E5-6 (65 mg, 0,08 mMol) in wasserfreiem DMF (5 ml) wurde N,N-Diisopropylethylamin (2,0 ml, 11,5 mMol) und der aktive Hydroxybenzotriazolester der Terphenyl-Seitenkette (50 mg, 0,11 mMol) gegeben, und die Lösung wurde bei Raumtemperatur 18 Stunden lang gerührt. Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mit Et₂O (10 ml) behandelt, ultrabeschallt und ein beiger Feststoff wurde isoliert. Der in Methanol lösliche Teil wurde mittels RP-HPLC (Waters Bondapak C-18, unter Elution mit 58% AcN/0,1% TFA/H2O bei einem Fluss von 20 ml/min) gereinigt, und das Gefriertrocknen ergab 35 mg eines weißen Feststoffes, 38% Ausbeute. Das ¹H-NMR (300 MHz)-Spektrum war konsistent mit der Struktur E5-7. FAB MS kalkuliert für M+H C₆₃H₇₆N₇O₁₄ = 1 154,5450; gefunden = 1154,5458.
Das Beispiel 6 veranschaulicht die Einführung einer Wasser-solubilisierenden Gruppe auf dem Tetrapeptid-Intermediat vor der Cyclisierung. Beispiel 6
N-α-Boc-L-α,β-Diaminopropionsäure (0,5 g, 2,45 mMol) (verfügbar von Bachem) und 1,3-Bis(benzyloxycarbonyl)-2-methyl-2-thiopseudoharnstoff (0,88 g, 2,45 mMol) wurden in 15 ml wasserfreiem DMF vereinigt. Triethylamin (1,0 ml, 7,3 mMol) wurde hinzugesetzt und 3 Tage bei Umgebungstemperatur gerührt. Die Reaktion wurde mit 100 ml 0,1 N NaOH verdünnt und in Ether extrahiert. Die wässrige Schicht wurde dann mit kalter gesättigter Zitronensäure angesäuert und mit Ethylacetat (3 × 200 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Stoffe wurden über MgSO4 getrocknet, filtriert und zu einer quantitativen Ausbeute eines dicken farblosen Öls konzentriert. Das ¹H-NMR (300 MHz)-Spektrum war konsistent mit der Struktur E6-1. FAB MS (M⁺ der freien Base) = 515.
Die obige Säure E6-1 (310 mg, 0,60 mMol) in wasserfreiem THF (10 ml) wurde N-Hydroxysuccinimid (69 mg, 0,60 mMol) und DCC (123 mg, 0,60 mMol) hinzugesetzt. Ein weißes Präzipitat begann sich nach etwa 1 Stunde zu bilden. Die Reaktion wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt. Die Reaktion wurde filtriert, und die rohe Lösung wurde direkt in der nächsten Kopplung eingesetzt.
Zu einer Lösung des obigen aktiven Esters E6-2 (366 mg, 0,60 mMol) in wasserfreiem THF (10 ml) und Ether (10 ml) wurde die Verbindung E5-3 (920 mg, 0,60 mMol) und Triethylamin (3 ml) gegeben. Die Lösung ließ man über Nacht (18 Stunden) bei Umgebungstemperatur rühren. Die Reaktion wurde mit Ether verdünnt und mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung (1 × 250 ml), 0,1 N HCl (1 × 250 ml), gesättigter Natriumbicarbonatlösung (1 × 250 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und zu 1,0 g rohem weißen Feststoff konzentriert. Das Produkt wurde mittels Radial-Chromatographie (unter Elution mit 30/70 Ethylacetat/Hexanen) gereinigt, wodurch man 550 mg (46% Ausbeute) eines weißen Feststoffes erhielt. Das ¹H-NMR (300 MHz)-Spektrum war konsistent mit der Struktur E6-3. FAB MS (M⁺ der freien Base) = 2 036.
Zu einer Lösung von 5% Pd/C (150 mg) in EtOH (15 ml) und AcOH (15 ml) unter einer N₂-Atmosphäre wurde die Verbindung E6-3 (550 mg, 0,27 mMol) gegeben. Die Lösung wurde mit H₂ (x4) gespült/befüllt und einem konstanten H₂-Druck während 2,0 Stunden ausgesetzt, dann über Celite zur Entfernung des Katalysators filtriert. Die Lösung wurde im Vakuum konzentriert, um die Lösungsmittel zu entfernen, der Rückstand wurde in Acetonitril (10 ml) und Ether (3 ml) gelöst, gefolgt von der Zugabe von 2 ml Triethylamin. Die Mischung wurde 4 Stunden lang ultrabeschallt und die Temperatur durfte 40 °C erreichen. Die Reaktionsmischung wurde durch Radial-Chromatrographie (unter Elution mit 40/60 Ethylacetat/Hexanen) konzentriert und gereinigt, wodurch man 57 mg der gewünschten Verbindung (14% Ausbeute) erhielt. Das ¹H-NMR (300 MHz)-Spektrum war konsistent mit der Struktur E6-4. FAB MS (M⁺ der freien Base) = 1 549.
Zu der obigen Verbindung E6-4 (77 mg, 0,05 mMol) wurden 3 ml reine Trifluoressigsäure hinzugesetzt, während auf 0 °C gekühlt wurde. Nach 45 Minuten wurden 0,5 ml Wasser hinzugesetzt, während die Reaktion bei 0 °C gehalten wurde. Nach 30 Minuten wurde die Mischung zu einem farblosen Öl konzentriert. Zu diesem Öl wurden 2 ml THF und 2 ml 1 N HCl gegeben, und es wurde über Nacht gekühlt. Toluol wurde von der Mischung abgestrippt, um eine quantitative Ausbeute des freien Amins als Trihydrochloridsalz zu erhalten. Das ¹H-NMR (300 MHz)-Spektrum war konsistent mit der Struktur E6-5. FAB MS (M⁺ der freien Base) = 764.
Zu einer Lösung der Verbindung E6-5 (50 mg, 0,06 mMol) in wasserfreiem DMF (5 ml) wurden N,N-Diisopropylethylamin (2 ml) und der aktive Hydroxybenzotriazolester der Terphenyl-Seitenkette (44 mg, 0,09 mMol) gegeben, und die Lösung wurde bei Raumtemperatur 18 Stunden lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mit einer Mischung aus Acetonitril und Ether trituriert. Der Feststoff wurde auf 25 mg eines rohen weißen Feststoffes getrocknet. Das Produkt wurde mittels RP-HPLC auf einer Waters Bondapak C-18-Säule unter Elution mit 55% AcN/0,1% TFA/H₂O bei einem Fluss von 20 ml/Min. gereinigt. Die geeigneten Fraktionen wurden gefriergetrocknet, wodurch man 10,0 mg eines weißen Feststoffes, 18% Ausbeute, erhielt. Das ¹H-NMR (300 MHz)-Spektrum war konsistent mit der Struktur E6-6. FAB MS kalkuliert für (M+H) C₅₇H₇₂N₉O₁₄ = 1 106,5199; gefunden = 1 106,5185.
Die Tabelle 3 fasst die Aktivitätsdaten für die Verbindungen E3-6, E4-6, E5-7 und E6-6 im Vergleich zu der vergleichen halb synthetischen Echinocandin-Verbindung C1 zusammen. Die gleichen Testprozeduren wurden angewandt, wie es oben in Beispiel 1 beschrieben ist. Tabelle 3
Beispiel 7
Das Beispiel 7 veranschaulicht die Bildung eines cyclischen Heptapeptids aus dem linearen Pentapeptidintermediat (I-6). Herstellung von N-α-BOC-D-2,3-Diaminopropionsäure (E7-1)
Zu einer 1:1-Dimethylformamid:Wasser-Lösung (170 ml) an [Bis(trifluoracetoxy)iod]benzol (12,89 g, 32,29 mMol, 1,5 Äquiv.) wurde N-α-BOC-D-Asparagin (5 g, 21,53 mMol, 1 Äquiv.) gegeben. Diese Lösung wurde bei Raumtemperatur 0,5 Stunden lang gerührt, bevor Pyridin (3,4 g, 43,06 mMol, 2 Äquiv.) hinzugesetzt wurde. Nach 18 Stunden wurde die Reaktion im Vakuum konzentriert, und der Rückstand wurde erneut in Wasser gelöst, bevor er mit Diethylether (2x, 50 ml) gewaschen wurde. Die wässrige Schicht wurde im Vakuum konzentriert, und das rohe Produkt wurde aus heißem Acetonitril umkristalisiert, wodurch man E7-1 erhielt (1,10 g, 25% Ausbeute). Herstellung von N-α-BOC-D-2,3-Diaminopropionsäure-N-CBZ-glycin-dipeptid (E7-2)
Eine wässrige Lösung (12 ml) an N-α-NOC-D-2,3-Diaminopropionsäure E7-1 (1,114 g, 5,45 mMol, 1 Äquiv.) und NaHCO₃ (0,458 g, 5,45 mMol, 1 Äquiv.) wurde 15 Minuten schnell gerührt, bis eine vollständige Solvation auftrat. Hierzu wurde eine 1,2-Dimethoxyethan-Lösung (22 ml) vom N-CBZ-O-N-Hydroxysuccinimidglycinester gegeben. Nach dem Rühren bei Raumtemperatur während 18 Stunden ^wurde ^die Reaktion im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde erneut in Wasser aufgelöst, mit wässriger 1 N HCl auf einen pH-Wert von 3 angesäuert und zwischen Ethylacetat und Wasser aufgeteilt. Die wässrige Schicht wurde 3x mit zusätzlichem Wasser gewaschen, bevor organische Stoffe vereinigt worden, über MgSO₄ getrocknet wurde und konzentriert wurde. Der rohe weiße Schaum wurde auf einer Umkehrphasen-C-18-Säule mittels präparativer HPLC (Gradient 5:95 AcN/0,01% TFA zu 100% AcN-Elutionsschema) gereinigt, wodurch man 1,46 g (3,69 mMol, 68% Ausbeute) an E7-2 erhielt. Herstellung von N-α-BOC-D-2,3-Diaminopropionsäure-N-CBZ-glycin-dipeptid-OH-NHS-aktivem Ester (E7-3)
Zu einer 1,2-Dimethoxyethanlösung (40 ml) an E7-2 (1,40 g, 3,54 mMol, 1 Äquiv.) und N-Hydroxysuccinimid (0,448 g, 3,89 mMol, 1,1 Äquiv.), gekühlt auf 0 °C, wurde Dicyclohexylcarbodiimid (0,804 g, 3,89 mMol, 1,1 Äquiv.) gegeben. Nach dem Rühren während 1 Stunde bei 0 °C wurde wie in dem Gefrierschrank 18 Stunden lang gehalten. Die Lösung wurde dann filtriert, und das Filtrat wurde bis zur Trockne gestrippt und einem hohen Vakuum während 2 Stunden ausgesetzt, wodurch man 2 g an Produkt (welches etwas DCU als Nebenprodukt enthielt) erhielt, welche ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
DiBOC Silyl N(α)BOC-D-2,3-Diaminopropionsäure-glycin-CBZ-heptapeptid (E7-4)
Eine Lösung eines linearen Peptidintermediats I-6 (1,0 g, 0,598 mMol) in Ethanol (5 ml) wurde einer Aufschlämmung von 10% Pd/C (250 mg) in 5 ml Ethanol hinzugesetzt, gefolgt von 10 ml Eisessig. Die Mischung wurde unter einem Ballon von H₂ gestellt, und nach 1 Stunde war das Ausgangsmaterial verschwunden (TLC 25% Ethylacet/Hexan). Der Katalysator wurde mittels Filtration durch einen Celite-Pfropfen entfernt, und die Lösung wurde vorsichtig eingeengt (jedoch nicht bis zur Trockne), und zwar unter hohem Vakuum, wobei die Temperatur unter 40 °C gehalten wurde. Das resultierende Öl wurde in 25 ml Ether aufgelöst, und 10 ml einer Tetrahydrofuranlösung vom aktiven Dipeptidester E7-3 (O-Suc-Nα-BOC-D-2,3-Diaminopropionsäure-N-CBZ-glycin) wurde hinzugesetzt, gefolgt überschüssigem Triethylamin, bis die Lösung gegenüber pH-Papier basisch war. Nach dem Rühren während 16 Stunden wurde die Lösung mit gesättigter NaHCO₃-Lösung gesättigt, gefolgt von verdünnter HCl-Lösung und dann einer weiteren Portion an gesättigter N_aHCO₃-Lösung. Die organische Schicht wurde über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum reduziert, wodurch man 1,194 g des rohen Produktes erhielt. Die Reinigung durch Flash-Chromatographie (30% Ethylacetat/Hexan) ergab 0,674 g (59 Ausbeute) eines gekoppelten Produktes E7-4. FAB MS = 1 916,5 (M+1). Cyclisierung von E7-4 zum BOC Silyl-cycloheptapeptid (E7-5)
Eine Ethanol/Essigsäure-Lösung (jeweils 10 ml) von E7-4 (0,665 g, 0,34 mMol) mit 10% Pd/C (200 mg) wurde unter einen Ballon von Wasserstoff gestellt. Nach 1,5 Stunden zeigte die TLC (30% Ethylacetat/Hexan) eine vollständige Reaktion an. Der Katalysator wurde mittels Filtration durch einen Celitepfropfen filtriert, und die Lösung im Vakuum (jedoch nicht bis zur Trockne) bei 40 °C so lange eingeengt, bis der Rückstand ein dickes Öl war.
Dieses Material wurde in Ethylether (150 ml) gelöst, und überschüssiges Triethylamin (~8 ml) wurde hinzugesetzt. Nach 18 Stunden zeigte TLC (30% Ethylacetat/Hexan) einen hauptsächlichen Produktfleck an. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in Ethylacetat erneut gelöst und mehrere Male mit Wasser gewaschen. Die organischen Stoffe wurden vereinigt und über MgSO₄ getrocknet, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, wodurch man 0,800 g an rohem Produkt erhielt. Dieses wurde über eine Flash-Säule (Silicagel unter Elution mit 30% Ethylacetat/Hexanen) gereinigt, wodurch man 293 mg (54 Ausbeute) an E7-5 als einen weißen Feststoff erhielt. FAB MS = 1 564,9. Entfernung von Schutzgruppen und Kopplung der Seitenkette zum Erhalt von E7-6
Die Verbindung E7-5 (288 mg, 0,181 mMol) wurde in Trifluoressigsäure (3 ml) gelöst und auf 0 °C gekühlt. Nach 0,5 Stunden wurde Wasser (0,5 ml) hinzugesetzt, und die Mischung wurde 0,6 Stunden länger gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in 1 N HCl (2 ml) und Tetrahydrofuran (3 ml) gelöst. Diese Lösung wurde bei Raumtemperatur 1,5 Stunden lang gerührt, wonach sie über Nacht in einen Kühlschrank gestellt wurde. Das Lösungsmittel wurde unter hohem Vakuum entfernt, wodurch man einen Schaumrückstand erhielt, welcher in wasserfreiem Dimethylformamid (3 ml) gelöst wurde. Aktiver Terphenylhydroxybenzotriazolester (108 mg, 0,276 mMol) und Triethylamin (0,11 ml, 0,78 mMol) wurden der Lösung hinzugesetzt. Nach dem Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wurden die Lösungsmittel unter hohem Vakuum entfernt, und das rohe Material (380 mg) wurde mittels präparativer RP-HPLC (C-18-Säule unter Elution mit einer wässrigen Lösung aus 50% AcN/0,01% TFA) gereinigt. Die Lyophilisierung der reinen Fraktionen ergab 97 mg (48% Ausbeute) an E7-6(a) als einen weißen Feststoff. FAB MS – 1 121,5 (M), berechnet für C₅₈H₇₂N₈O₁₅ = 1 121,21.
Herstellung von E7-6(b)
In einer ähnlichen Weise wurde N-α-BOC-L-Asparagin zu E7-6(b) umgewandelt.
Die H-NMR-Daten waren konsistent mit der Struktur E7-6(b). MS(FAB) = 1 121 (M⁺). Herstellung von N-α-CBZ-D-2,3-Diaminopropionsäure (E7-7)
Die Verbindung E7-7 wurde in einer ähnlichen Weise wie N-α-BOC-Diaminopropionsäure E7-1 hergestellt. MS FAB (M+1) = 239. Herstellung von N-α-CBZ-N-β-BOC-D-2,3-Diaminopropionsäure (E7-8)
Zu einer gerührten Lösung von Natriumhydroxid (148 mg, 3,69 mMol, 1,1 Äquiv.) in Wasser (5 ml) wurde N-α-CBZ-Diaminopropionsäure E7-7 gegeben. Die Reaktion wurde 10 Minuten gerührt, bevor der tert-Butylalkohol (4 ml) hinzugesetzt wurde. Die Reaktion wurde auf 0 °C gekühlt, und Di-tert-Butyldicarbonat (807 mg, 3,69 mMol, 1,1 Äquiv.) wurde langsam über 0,5 Stunden hinzugesetzt. Nach dem Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wurde die Reaktion mit Wasser (5 ml) verdünnt und 3x mit 10 ml Ethylether gewaschen. Die organischen Stoffe wurden dann vereinigt und mehrere Male mit gesättigter wässriger Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Die wässrigen Schichten wurden vereinigt, auf 0 °C gekühlt, und auf einen pH-Wert von 3 mit wässrigem Kaliumhydrogensulfat (30 g in 200 ml Stammlösung) angesäuert. Diese trübe Lösung wurde dann mehrere Male mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Stoffe wurden vereinigt, über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert, wodurch man nach hohem Vakuum über Nacht 0,990 g (2,9 mMol, 87% Ausbeute) an E7-8 erhielt. Das ¹H-NMR war konsistent mit der Struktur E7-8. MS FAB (M+1) = 339. Herstellung von N-β-BOC-D-2,3-Diaminopropionsäure (E7-9)
Zu einer Ethylalkohollösung (20 ml) an N-α-CBZ-N-β-BOC-D-2,3-Diaminopropionsäure E7-8 wurde 10% Palladium-auf-Kohlenstoff-Katalysator (etwa 200 mg) gegeben. Die Mischung wurde einer H₂-Atmosphäre gestellt und gerührt. Aufgrund der gelartigen Bildung erforderte die Reaktionsmischung zusätzlichen Ethylalkohol (Gesamtvolumen von 75 ml), um ein leichtes Rühren zu ermöglichen. Nach mehreren Stunden wurde die Reaktionsmischung durch einen Pfropfen an Celite filtriert und dann im Vakuum konzentriert, wodurch man 259 mg (1,27 mMol, 32% Ausbeute) an E7-9 erhielt. Herstellung vom N-β-BOC-D-2,3-Diaminopropionsäure-N-CBZ-glycindipeptid (E7-10)
Die Verbindung E7-10 wurde in einer ähnlichen Weise wie N-α-BOC-D-2,3-Diaminopropionsäure-N-CBZ-glycindipeptid E7-2 hergestellt.
Das ¹H-NMR war mit der Struktur E7-10 konsistent. Herstellung von aktivem N-β-BOC-D-2,3-Diaminopropionsäure-N-CBZ-glycindipeptid-O-NHS-ester (E7-11)
Die Verbindung E7-11 wurde in einer ähnlichen Weise wie aktiver N-α-BOC-D-2,3-Diaminopropionsäure-N-CBZ-glycindipeptid-O-NHS-ester E7-3 hergestellt. Herstellung von DiBOC-Silyl-N(β)BOC-D-2,3-diaminopropionsäure-glycin-CBZ-heptapeptid (E7-12)
Die Verbindung E7-12 wurde in einer ähnlichen Weise wie DiBOC-Silyl-N(α)BOC-D-2,3-diaminopropionsäure-glycin-CBZ-heptapeptid E7-4 hergestellt. MS FAB (M+1) = 1 917. Herstellung von BOC-Silylcycloheptageptid (E7-13)
Die Verbindung E7-13 wurde in einer ähnlichen Weise wie BOC-Silylcycloheptapeptid E7-5 hergestellt. Herstellung von Cycloheptapeptid E7-14(a)
Die Verbindung E7-14 wurde in einer ähnlichen Weise wie Cycloheptapeptid E7-6 hergestellt. MS FAB (M) – 1 121,6.
Herstellung von Cycloheptapeptid E7-14(b)
In einer ähnlichen Weise wie E7-14(a) wurde E7-14(b) aus N-α-CBZ-L-2,3-Diaminopropionsäure hergestellt.
Das ¹H-NMR war mit der Struktur E7-14(b) konsistent. MS(FAB) = 1 121 (M⁺).
Beispiel 8 Herstellung von (-L-)-(α)-N-CBZ-(β)-N-Trifluoracetyl-2,3-diaminopropionsäure (E8-1)
Die Prozedur von Curphey et al., J. Org. Chem., 44, 2805 (1979) wurde wie folgt verwendet. Eine Suspension von (-L-)-(α)-N-CBZ-2,3-Diaminopropionsäure (2,0 g, 8,39 mMol) und Triethylamin (0,84 g, 8,39 mMol) in Methanol (10 ml) bei Umgebungstemperatur wurde mit Ethyltrifluoracetat (1,49 g, 10,49 mMol) behandelt, und die Mischung wurde 48 Stunden lang gerührt. Die resultierende Lösung wurde mit Methanol (5 ml) verdünnt. auf 0 °C gekühlt und mit Dowex 50W-Harz (3,30 g) behandelt. Nach dem Rühren während 10 Min. wurde die Suspension filtriert, und das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert, wodurch man 2,74 g eines weißen Feststoffes (98% Ausbeute) erhielt, was ohne weitere Reinigung verwendet wurde. Die ¹H-NMR-Daten waren konsistent mit der Struktur E8-1. MS(FD) = 334 (M⁺). Herstellung des N-Hydroxysuccinimidesters (E8-2) aus E8-1
Zu einer Lösung von E8-1 (1,20 g, 3,59 mMol) und N-Hydroxysuccinimid (0,45 g, 3,95 mMol) in 1,2-Dimethoxyethan (20 ml) bei 0 °C wurde N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (0,81 g, 3,95 mMol) gegeben. Die Mischung wurde bei Kältebadtemperatur während 2 Stunden gerührt, gefolgt von der Lagerung im Kühlschrank über Nacht. Die Filtration der Suspension und die anschließende Konzentrierung des Filtrats ergaben ein rohes Feststoffprodukt, welches aus Ethylacetat/Hexanen umkristallisiert wurde, wodurch man 0,78 g eines kristallinen Feststoffes (50% Ausbeute, eine Ernte) erzeugte. Die ¹H-NMR-Daten waren konsistent mit der Struktur E8-2. MS(FD) = 431 (M⁺). Herstellung vom Dipeptid (E8-3) aus aktivem Aminosäureester E8-2
(-L-)-(α)-N-BOC-2,3-Diaminopropionsäure (0,52 g, 2,55 mMol) wurde in wässriger Natriumbicarbonatlösung (hergestellt durch das Auflösen von 0,22 g, 2,55 mMol in Natriumbicarbonat in 10 ml Wasser) aufgelöst. Diese Lösung wurde zu einer Lösung an aktivem Ester E8-2 (1,1 g, 2,55 mMol) in 1,2-Dimethoxyethan (23 ml) gegeben, und die Mischung wurde 24 Stunden lang gerührt. Nach der Konzentrierung im Vakuum zur Entfernung von 1,2-Dimethoxyethan wurde zurückbleibende Suspension auf einen pH-Wert von 5 mit wässriger 1 N Zitronensäure eingestellt, dann mit Ethylacetat (2x) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden der Reihe nach mit Wasser und Salzlösung gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum reduziert, wodurch man 1,4 g eines rohen Schaums erhielt. Die Triturierung mit Methylenchlorid ergab 1,05 g eines flockenartigen Feststoffes (75% Ausbeute). Zusätzliches Produkt in der Mutterlauge wurde nicht rückgewonnen.
Die ¹H-NMR-Daten waren konsistent mit der Struktur E8-3. MS (negatives Ionenelektrospray) = 519 (M-H). Herstellung vom aktiven Dipeptidester (E8-4) aus dem Dipeptid E8-3
Zu einer Lösung von E8-3 (0,65 g, 1,24 mMol) und N-Hydroxysuccinimid (0,16 g, 1,37 mMol) in Tetrahydrofuran (5 ml) bei 0 °C wurde N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (0,28 g, 1,37 mMol) gegeben. Die Mischung wurde bei Kühlbadtemperatur 2 Stunden gerührt, gefolgt von der Lagerung über Nacht im Kühlschrank. Die Filtrierung der Suspension und anschließende Konzentrierung des Filtrats ergaben 0,70 g eines rohen Schaums (89% Ausbeute). Die ¹H-NMR-Daten waren konsistent mit der Struktur E8-4. MS(FD) = 631 (M⁺). Herstellung von DiBOC-Silyl-(-L-)-(α)-N-BOC-2,3-Diaminopropionsäure-(-L)-(α)-N-CBZ-(β)-N-trifluoracetyl-2,3-diaminopropionsäure-lineares Heptapeptid (E8-5)
Eine Lösung von linearem Pentapeptid-Intermediat I-6 (2,0 g, 1,19 mMol) in Ethylacetat (10 ml) wurde zu einer Aufschlämmung von 10% Pd/C (400 mg) in Ethylacetat (15 ml) gegeben, gefolgt von 20 ml Eisessig. Die Mischung wurde einen Ballon von H₂ gestellt, und nach 1 Stunde war das Ausgangsmaterial verschwunden.
Der Katalysator wurde mittels Filtration entfernt, und die Lösung wurde vorsichtig unter hohem Vakuum eingeengt, wobei die Temperatur unter 40 °C gehalten wurde. Das resultierende Öl wurde in THF (15 ml) gelöst, und der aktive Dipeptidester N-(-L-)-(α)-CBZ-N-(β)-Trifluoracetyl-2,3-Diaminopropionsäure-N-(L)-(α)-BOC-2,3-diaminopropionsäure-Osu E8-4 wurde hinzugesetzt, gefolgt vom überschüssigen Triethylamin, bis die Lösung gegenüber pH-Papier basisch war. Nach 18-stündigem Rühren wurde die Lösung im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wurde zwischen Ethylether und Wasser aufgeteilt. Die Etherschicht wurde mit gesättigter NaHCO₃-Lösung gewaschen, gefolgt von aufeinander folgenden Waschungen mit Wasser, 1 N wässriger Zitronensäure, Wasser, gesättigter NaHCO₃ und Salzlösung. Die organische Schicht wurde über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum eingeengt, wodurch man 2,36 g des rohen Produktes erhielt. Die Reinigung mittels Silica-Flash-Chromatographie (25% Ethylacetat/Hexan) ergab 1,22 g gekoppeltes Produkt E8-5 als einen Schaum (56% Ausbeute). Die ¹H-NMR-Daten waren konsistent mit der Struktur E8-5. MS(FAB) = 2 041,5 (M⁺). Cyclisierung von E8-5 am BOC-Silyl-cycloheptapeptid (E8-6)
Eine Ethylacetat/Essigsäurelösung (jeweils 20 ml) an E8-5 (1,20 g, 0,58 mMol) mit 10% Pd/C (290 mg) wurde unter einem Wasserstoffballon gestellt. Nach 1,5 Stunden zeigte die TLC an, dass die Entschützung vollständig war. Der Katalysator wurde mittels Filtration entfernt, und das Filtrat wurde im Vakuum zu einer dicken Aufschlämmung konzentriert. Dieses Material wurde in Ethyiether (120 ml) gelöst, und überschüssiges Triethylamin wurde solange hinzugesetzt, bis die Lösung gegenüber pH-Papier basisch war (~5 ml). Nach 36 Stunden zeigte die TLC ein Hauptprodukt an. Die Lösung wurde der Reihe nach mit Wasser, wässriger 1 N Zitronensäure, Wasser und Salzlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum eingeengt, wodurch man 1,14 g rohes Produkt erhielt. Die Reinigung mittels Silica-Flash-Chromatographie (25% Ethylacetat/Hexan) ergab 0,69 g an E8-6 als einen Schaum (70% Ausbeute). Die ¹H-NMR-Daten waren konsistent mit der Struktur E8-6. MS(FAB) = 1 690,0 (M+H). Entfernung von Schutzgruppen und Koppeln der Seitenkette zur Erzeugung von E8-7
Eine Lösung von E8-6 (0,69 g, 0,40 mMol) in Trifluoressigsäure (23 ml) bei 0 °C wurde 0,5 Stunden lang gerührt, wonach Wasser (2 ml) hinzugesetzt wurde, und das Rühren für weitere 0,75 Stunden bei 0 °C fortgesetzt wurde. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in Tetrahydrofuran (9 ml) gelöst und mit 1 N HCl (4 ml) behandelt. Diese Lösung wurde bei Umgebungstemperatur 1,25 Stunden gerührt und dann 18 Stunden lang gekühlt. Die HPLC zeigte einen Produkthauptpeak. Die Konzentrierung im Vakuum erzeugte einen zurückbleibenden Schaum, welcher nach der Auflösung in Dimethylformamid (12 ml) mit dem aktivem Terphenylhydroxybenzotriazolester (0,25 g, 0,52 mMol) und Triethylamin (0,28 ml, 2,0 mMol) behandelt wurde. Nach dem Rühren bei Umgebungstemperatur während 17 Stunden wurde das Lösungsmittel unter hohem Vakuum entfernt, und der rohe Rückstand wurde mittels präparativer RP-HPLC (linearer Gradient 60%-100% AcN/0,1% TFA-Elutionsschema) gereinigt, wodurch man 0,37 g eines weißen Feststoffs (75% Ausbeute) erhielt. Die ¹H-NMR-Daten waren konsistent mit der Struktur E8-7. MS(FAB) = 1 246,7 (M⁺). Abschließende Entschützung von E8-7 zur Erzeugung von E8-8
Zu einer Lösung von E8-7 (250 mg, 0,20 mMol) in Methanol (12 ml) wurde eine Lösung von Kaliumcarbonat (138 mg, 1,0 mMol) in Wasser (6 ml) gegeben, und die resultierende Mischung wurde bei Umgebungstemperatur 20 Stunden gerührt. Die Lösungsmittelentfernung im Vakuum, gefolgt von einer Reinigung über präparative RP-HPLC (linearer Gradient 60-100% AcN/0,1% TFA-Elutionsschema) ergab 218 mg eines weißen Feststoffes (94% Ausbeute). Die ¹H-NMR-Daten waren konsistent mit der Struktur E8-8. MS(FAB) = 1 150,6 (M⁺). Reduktive Alkylierung von E8-8 zur Erzeugung von E8-9
Zu einer Lösung von E8-8 (40 mg, 0,0347 mMol) in Methanol (2 ml) bei Umgebungstemperatur wurden 1-Methyl-4-piperidon (7,85 mg, 0,0694 mMol) und Eisessig (2 μl, 0,0347 mMol) gegeben. Die Lösung wurde mit Natriumcyanoborhydrid (3,27 g, 0,0520 mMol) behandelt, und die Mischung wurde 16 Stunden lang gerührt. Nach der Konzentrierung im Vakuum wurde das rohe Produkt über präparative RP-HPLC (Stufengradient 40-100% AcN/0,1% TFA-Elutionsschema) gereinigt, wodurch man 19 mg eines weißen Feststoffes (45% Ausbeute) erhielt. Die ¹H-NMR-Daten waren konsistent mit der Struktur E8-9. MS(FAB) = 1 247,6 (M⁺).
Die Tabelle 4 fasst die Aktivitätsdaten für die Verbindungen E7-6(a), E7-6(b), E7-14(a), E7-14(b), E8-8 und E8-9 im Vergleich zu der vergleichenden halb synthe tischen Echinocandin-Verbindung C1 und Amphotericin B zusammen. Es wurden die gleichen Testprozeduren verwendet, wie es oben in Beispiel 1 beschrieben ist. Tabelle 4

Claims

Verfahren zum Modifizieren eines cyclischen Peptidringkerns, umfassend die folgenden Schritte: (i) Bereitstellen einer cyclischen Peptidverbindung, umfassend eine Peptideinheit mit einer ε-Hydroxylgruppe und einer γ-Hydroxylgruppe; (ii) Öffnen des Rings der cyclischen Peptidverbindung, um ein erstes lineares Peptid bereitzustellen, wobei die Peptideinheit mit einer γ-Hydroxylgruppe die N-Terminus-Peptideinheit des ersten linearen Peptids ist; (iii) Abspalten der Peptideinheit mit einer γ-Hydroxylgruppe, um ein zweites lineares Peptid bereitzustellen; (iv) Verknüpfen der mindestens einen Aminosäure, Dipeptideinheit oder synthetischen Einheit mit dem zweiten linearen Peptid, um ein drittes lineares Peptid herzustellen; (v) Cyclisieren des dritten linearen Peptids, um eine modifizierte cyclische Peptidverbindung mit einem modifizierten Ringkern herzustellen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Aminosäure, die Dipeptideinheit oder die synthetische Einheit von Schritt (iv) eine geschützte Aminogruppe umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 2, ferner umfassend (vi) das Entschützen der geschützten Aminogruppe, um eine entschützte Aminogruppe bereitzustellen; (vii) Acylieren der entschützten Aminogruppe.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, ferner umfassend das Abspalten einer anderen Peptideinheit von dem zweiten linearen Peptid in Schritt (iii) vor dem Verknüpfen der mindestens einen Aminosäure, Dipeptideinheit oder synthetischen Einheit in Schritt (iv).
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Schritt (iii) durchgeführt wird durch Zugeben von Trifluoressigsäure oder Chlorwasserstoffsäure zu dem ersten linearen Peptid in einem organischen Lösungsmittel.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das organische Lösungsmittel aus der Gruppe gewählt wird, die aus Methylenchlorid, Toluol und Dioxan besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei eine zweite Aminosäure, Dipeptid- oder synthetische Einheit an das dritte lineare Peptid in Schritt (iv) vor der Cyclisierung in Schritt (v) geknüpft wird.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei eine zweite Aminosäure, Dipeptid- oder synthetische Einheit an das dritte lineare Peptid in Schritt (iv) vor der Cyclisierung in Schritt (v) gebunden wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die cyclische Peptidverbindung ein cyclisches Hexapeptid ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die cyclische Peptidverbindung durch die folgende Struktur angegeben wird:
worin R eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe, eine Alkinylgruppe, eine Arylgruppe oder eine Heteroarylgruppe ist, R1 -OH ist; R2 -H oder -CH₃ ist; R3 -H, -CH₃, -CH₂CONH₂ oder -CH₂CH₂NH₂ ist; R4 -H oder -OH ist; R5 -OH, -OPO₃H₂ oder -OSO₃H ist; R6 -H oder -OSO₃H ist und R7 -CH₃ oder -H ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die modifizierte cyclische Peptidverbindung eine 19-, 20-, 21- oder 22-gliedrige Ringverbindung ist.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, in welchem die modifizierte cyclische Peptidverbindung durch die Formel 1 oder II angegeben wird:

worin R eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe, eine Alkinylgruppe, eine Arylgruppe oder eine Heteroarylgruppe ist; R2 -H oder -CH₃ ist; R3 -H, -CH₃, -CH₂CONH₂ oder -CH₂CH₂NH₂ ist; R4 -H oder -OH ist; R5 -OH, -OPO₃H₂ oder -OSO₃H ist; R6 -H oder -OSO₃H ist; R7 -CH₃ oder -H ist; (Y) durch die folgende Formel repräsentiert wird
worin A -(CH₂)_a ist, worin a = 1, 2 oder 4, -CHR'-CHR''-(CH₂)_b- ist, worin R' und R'' unabhängig -H, -OH, C₆H₅O-, -SH, -NH₂, C_nH_2n+1NH-, C_nH_2n+1O-, C_nN_2n+1S- oder -C_nN_2n+1 sind, worin n = 1-4 und b = 0-4, -(CH₂)_c C(O)NH(CH₂)_d-, worin c = 1-2 und d = 1-2, -N=CH-(CH₂)_c, worin e = 0-2, -NR'''(CH₂)_f-, worin R''' -H, -C(O)CH₂NH₂, -C(O)CH(NH₂)CH₂NH₂ oder -C_nN_2n+1 ist, worin n = 1-4 und f = 1-3, -(CH₂)_g-SO₂-(CH₂)_h, worin g = 1-2 und h = 1-2,
worin i = 1 oder 2, oder
worin j 1 oder 2 ist und Z eine Aminogruppe, eine Alkylaminogruppe oder Piperidylaminogruppe ist; und B eine substituierte oder nicht substituierte C₁- bis C₆-Alkylgruppe ist; W Wasserstoff oder C(O)R ist, worin R wie oben definiert ist; und pharmazeutisch annehmbare Salze, Ester oder Hydrate davon.
Verfahren gemäß Anspruch 12, worin R eine Terphenylgruppe ist, angegeben durch die folgende Struktur: