DE69024965T2

DE69024965T2 - Dehydrodidemnin b

Info

Publication number: DE69024965T2
Application number: DE69024965T
Authority: DE
Inventors: A Universit Lithgow-Bertelloni; Kenneth Rinehart
Original assignee: Pharmamar SA
Current assignee: Pharmamar SA
Priority date: 1989-09-29
Filing date: 1990-10-01
Publication date: 1996-08-22
Anticipated expiration: 2010-10-02
Also published as: AU6441290A; US6153731A; DE69024965D1; AU642169B2; JPH05502441A; US5834586A; US6710029B1; USRE39887E1; ES2082003T3; GB8922026D0; DK0493480T3; ATE133181T1; WO1991004985A1; EP0493480A1; EP0493480B1; JP2919965B2

Description

Die Erfindung betrifft Dehydrodidemnin B und insbesondere die Isolierung von Dehydrodidemnin B, einem cyclischen Depsipeptid, aus einem Manteltier der Klasse Ascidiaceae. Es hat sich gezeigt, daß diese neue Verbindung antivirale, antitumorale und zytotoxische Wirkungen aufweist.
Die Didemnine bilden eine Klasse cyclischer Depsipeptide, die aus verschiedenen Arten der Gattung Trididemnum isoliert worden sind. Es ist ndchgewiesen worden, daß sie eine starke Wirksamkeit gegen Viren und Tumorzellen aufweisen (Rinehart. jr., K.L. u.a., J. Am. Chem. Soc. 103 (1981) 1857-59). Für Didemnin B, bisher die wirksamste Verbindung dieser Klasse, sind eine starke immunosuppressive Wirkung (Montgomery, D.W., Zukoski. C.F., Transplantation 40(1985) 49-56) sowie eine stärkere Hemmung der Bindung von Prolactin an humane Lymphozyten als bei anderen Didemninverbindungen nachgewiesen worden (Montgomery; D.W. u.a., Fed. Prac. 44 (1987) 634).
Die vorliegende Erfindung schafft eine neue und wirksamere Verbindung dieser Klasse, nämlich Dehydrodidemnin B (DDB), das unerwarteterweise aus dem mediterranen Manteltier Alpidium albicans isoliert wurde, und durch die folgende Formel, mit R = H, dargestellt wird:
sowie dessen mögliche Derivate, mit der gleichen biologischen Wirksamkeitsklasse, wobei R ein Acyl-, Alkyl- oder Arylrest sein könnte.
Diese Verbindung ist durch die folgenden Eigenschaften gekennzeichnet, wobei auch berücksichtigt wird, daß in Lösung mindestens zwei Konformere möglich sind:
TLC Rf = 0,4; 0,35 (Kieselgel, 2:3, CH&sub2;Cl&sub2;/EtOAc); 0,5; 0,44
(Kieselgel; 9:1, CHCl&sub3;/MeOH).
Umkehrphasen-HPLC tR = 10,7; 11,9 min (Spherisorb C&sub1;&sub8;-Säule, 250 mm x 10 mm. 10 µm Teilchengröbe, 9:1, MeOH/H&sub2;O; 2 ml/min).
[α]D25º = -86º (&epsi; 1, MeOH)
Hochauflösende (HR) FABMS (M + H) C&sub5;&sub7;H&sub8;&sub8;N&sub7;O&sub1;&sub5; m/z berechnet 1110,6366); (M - Seitenkette + H); C&sub4;&sub2;H&sub6;&sub6;N&sub5;O&sub1;&sub1; m/z berechnet 816,4781 (gefunden 816,4755); (M-Seitenkette): C&sub1;&sub5;H&sub2;&sub3;N&sub2;O&sub4; m/z berechnet 295,1657 (gefunden 295,1657).
IR (CHCl&sub3;) Vmax cm&supmin;¹: 3680, 3600. 2970, 2940, 2880, 1740, 1650, 1605, 1540, 1510.
RMN ¹H (CDCl&sub3;. δ, ppm): 7,82 (d, J=9 Hz, 1H); 7,79 (d, J=9 Hz, 1H); 7,62 (d, J=6 Hz, 1H; 7,21 (d, J=9 Hz, 1H); 7,19 (d, J=9 Hz, 1H); 7,08 (d, J=8,5 Hz, 2H); 6,85 (d, J=8,5 Hz, 2H); 3,77(s. 3H); 3,13 (s, 3H); 3,08 (s,
3H); 2,54 (s, 3H); 2,50 (5 3H); 2,1 (s, 3H); 2,02 (s, 3H); 0.82-0,88 (d und t überlappt, 30H).
RMN ¹³C (CDCl&sub3;. δ, ppm): 204,93 (s); 204,77 (s); 201,23 (s); 197,55 (s); 173,05 (s); 172,36 (s); 171,84 (5); 171,21 (5); 171,16 (s); 170,59 (s); 169,58 (s); 169,51 (s); 169,35 (s); 168,36 (5); 168,28 (s); 161,31 (5); 161,06 (5); 158,64 (s); 158,62 (s); 130,31 (d); 114,12 (d); 114,01 (d); 81,47 (d); 81,43 (d); 70,68 (d); 70,33 (d); 67,97 (d); 67,76 (d); 66,38 (d); 66,22 (d); 60,39 (t); 50,88 (d); 57,80 (d); 57,45 (d); 57,26 (d); 57,18 (d); 57,12 (d); 55,61 (d); 55,57 (d); 55,26 (q); 54,65 (d); 49,55 (d); 49,49 (d); 48,85 (t); 48,41 (t); 46,98 (t); 41,29 (t); 41,24 (t); 38,78 (q); 38,74 (q); 38,68 (q); 36,42 (t); 36,22 (t); 34,06 (d); 33,99 (d); 33,96 (t); 31,57 (d); 31,38 (q); 31,34 (q); 31,30 (q); 30,69 (d); 29,68 (t); 29,64 (d); 27,98 (t); 27,94 (t); 27,30 (t); 27,17 (t); 27,08 (t); 25,91 (t); 25,87 (t); 25,73 (d); 25,68 (d); 25,63 (d); 25,52 (d); 25,48 (d); 24,80 (q); 24,70 (q); 24,44 (q); 24,31 (q); 22,21 (q); 22,12 (q); 21,92 (q); 21,79 (q); 21,76 (q); 19,46 (q); 17.76 (q); 17,72 (q); 17,18 (q); 16,87 (q); 16,08 (q); 15,62 (q); 15,48 (q); 15,05 (q); 12,55 (q); 12,50(q).
Die Strukturbestimmung von DDB erfolgte durch Vergleich der Massenspektrometrie- [FABMS mit niedriger und hoher Auflösung (Rinehart jr., K.L. u.a., Pure and Appl. Chem. 54 (1982) 2409-2424)] und der NMR- Daten mit anderen Didemnin-Daten und wurde durch Synthese von DDB mit einer Bindung von natürlichem Didemnin A an die geeignete Seitenkette bestätigt. Die FAB-Massenspektren mit niedriger Auflösung zeigten Peaks bei m/z 1110 (M + H), 816 (M + 2H - Seitenkette) und 295 (Seitenkette). Das Fehlen von zwei Masseneinheiten in den Peaks des Molekülions und der Seitenkette ließ, neben dem gleichem m/z-Verhältnis für den Ring, darauf schließen, daß der Unterschied zwischen Dehydrodidemnin B und Didemnin B in einem um eins höheren Ungesättigtheitsgrad in der Seitenkette bestand. Die aus dem FABMS mit hoher Auflösung abgeleitete Molekülformel war C&sub5;&sub7;H&sub8;&sub8;N&sub7;O&sub1;&sub5; (M + H, 2,8 mmu); und die Formeln für die dem Ring bzw. der Seitenkette entsprechenden Fragmentionen waren C&sub4;&sub2;H&sub6;&sub6;N&sub5;O&sub1;&sub1; (0,4 mmu) bzw. C&sub1;&sub5;H&sub2;&sub3;N&sub2;O&sub4; (2,6mmu). Eine Tandem-Massenspektrometrie an diesen Peaks ergab das typische Aufspaltungsmuster von Didemninen.
Nach den NMR-Daten ließen Peaks in der Nähe von δ 8 ppm sowie die Methylsignale, die den Aminosäureresten entsprechen. das Vorhandensein von Peptidbindungen erkennen. Obwohl wegen des Vorhandenseins von mindestens zwei Hauptkonformeren in Lösung bei Raumtemperatur einige dieser Peaks doppelt oder dreifach auftreten, sind diese Peaks denjenigen von Didemninen sehr ähnlich. Der Hauptunterschied. der zwischen DDB und Didemnin B beobachtet wurde, ist der Methylsingulett-Peak bei 2,04 ppm, der einem Methylketon zugeordnet werden konnte, sowie das Fehlen des Signals. das dem α-Proton der Hydroxylgruppe in der Lactyl-Komponente bei 4,3 ppm entspricht.
Es ist gezeigt worden, daß die erfindungsgemäße Verbindung in vitro L1210- und P-388-Mäuse-Leukämiezellen; L-929-Mäuse-Areola- und Fettgewebe, B-16-Mäuse-Melanomzellen; humane A-549-Lungenkarzinomzellen; humane HeLa- Cervixepitheloid-Karzinomzellen und humane KB-Oralepidermoid-Karzinomzellen und in vivo P-338-Mäuse-Leukämiezellen, Levis-Lungenkarzinomzellen und B-16-Melanomzellen hemmt. Folglich ist DDB als Antitumormittel verwendbar und daher zur Wachstumshemmung von Tumorzellen bei Säugetieren brauchbar, die derartige Tumorzellen aufweisen.
In der nachstehenden Tabelle sind die IC&sub5;&sub0;-Werte für jede Zellinie in vitro zusammengefaßt. TABELLE 1 Zelllinien
Die nachstehende Tabelle zeigt die T/C in % in vivo nach der Verabreichung von DD8: TABELLE 2 WIRKSAMKEIT VON DEHYDRODIDEMNIN B IN VIVO Verbindung Kontrolle Dosis Verordnung und Applikationsweg mittlere Überlebensdauer Tage Levis-Lungenkarzinomzellen mittleres Tumorvolumen, mm³ Levis-Lungenkarzinomzellen B-16-Melanom, mittlere Überlebensdauer, Tage Melanom Signifikante Wirksamkeit
Dehydrodidemnin B ist ebenso wie Didemnin B (Montgomery, D. W., Zukoski, C. F., Transplantation 40 (1985) 49-56) ein leistungsfähiger Immunomodulator.
Dehydrodidemnin B hat sich auch als wirksam gegen das Herpes-simplex- Virus, Typ 1. in CV-1-Zellen (Affennierenzellen) erwiesen und ist somit auch als antivirales Mittel verwendbar. Die ermittelte IC&sub5;&sub0; betrug 60 ng/ml (das ist z. B. 10 mal größer als bei L-1210-Zellen) bzw. 1 µg/ml.
Die erfindungsgemäße Verbindung wird vorzugsweise zur Verabreichung an Menschen und Tiere in Form von Einheitsdosierungen in pharmazeutisch annehmbaren Trägern dargeboten, die den Wirkstoff in der geeigneten Menge enthalten.
Beispielsweise können die Dosierungswerte des verabreichten Wirkstoffs intravenös 0.05 bis etwa 50 mg/kg, intraperitoneal. subkutan und intramuskulär 1 bis 100 mg/kg; oral 1 bis 150 mg/kg Lebendgewicht (Körpergewicht) betragen.
Die Verabreichung von DDB ist zweckmäßig zur Wachstumshemmung von Karzinomzellen bei Tieren oder Menschen mit einem Tumorleiden, z. B. bei akuter myelozytärer Leukämie, akuter lymphozytärer Leukämie, malignem Melanom, Adenokarzinom der Lunge, kleinzelligem Karzinom der Lunge und dergleichen.
Eine solche Verbindung kann aus Manteltieren bzw. Tunicaten der Klasse Ascidiaceae. Unterstamm Urochordata, isoliert werden (Isolierungsschema), wie in dem folgenden Diagramm beschrieben wird. Diagramm 1 Manteltier Rückstand Lösung wäßrig organisch polar unpolar polares organisches Lösungsmittel Verdampfiing teilweise mischbare organische Lösungsmittel Salzlösung chloriertes organisches Lösungsmittel mittlerer Polarität flüssig-flüssig Verteilung in org. Lösungsmittel mittlerer Polarität/wasser Verteilung in teilweise mischbaren org. Lösungsmitteln Kieselgel-Stufengradienten-Chromatographie Umkehrphasen-HPLC
Im einzelnen kann die Verbindung aus Manteltieren der Gattung Aplidium. und insbesondere aus der Spezies Aplidium albicans, isoliert werden. Die Spezies ist an der iberischen Mittelmeerküste sowie auf den Balearen zu finden. Die Spezies ist außerdem in Großbritannien, im englischen Kanal sowie an der afrikanischen Küste und in Portugal gefunden worden. Sie bevorzugt anscheinend detritische, koralligene und Sciafilae- Algengemeinschaften. Sie ist außerdem in mehr photophilen Habitaten zu finden.
Kolonien der Manteltiere sind im allgemeinen flach und gelappt (2.5 cm Durchmesser). Eine Kolonie ist geleeartig, völlig mit Sand überkrustet, was der Kolonie eine sandartige Farbe verleiht. Zooide sind von weißlicher Farbe und 10 mm lang; der Mundsaugnapf besitzt 6 Lappen. und die Kloakenzunge ist dreigeteilt, was ein artspezifisches Merkmal darstellt. Im allgemeinen sind 10-11 Stigmenreihen vorhanden. Der Magen hat 6 ausgeprägte Falten. Die Gonaden enthalten familientypisch eine oder mehrere Eizellen unterhalb des Verdauungskanals und zahlreiche Hodensäckchen, die im Hinterleib eine Reihe oder eine Doppelreihe bilden. In der Atriumhöhle werden 1 bis 9 Larven ausgebrütet; sie weisen im Vorderteil 3 Saugnäpfe und verschiedene Bläschenbildungen auf.
In einer typischen erfindungsgemäßen Verfahrensvorschrift weist somit das Isolierungsverfahren im allgemeinen eine alkoholische Extraktion des homogenisierten Manteltiers und eine selektive Reinigung des gewünschten DDB auf.
In den im Diagramm 1 dargestellten Erläuterungsschema wurde das Manteltier mit MeOH extrahiert, filtriert und in MeOH:Toluol im Verhältnis 3:1 aufgelöst und mit 10% NaNO&sub3; verteilt. Die wäßrige Schicht wurde nacheinander mit CH&sub2;Cl&sub2;, EtOAc und n-BuOH extrahiert. Die organischen Fraktionen wurden nach Überwachung mittels Normalphasen-TLC vereinigt, mit CHCl&sub3;:MeOH im Verhältnis 9:1 entwickelt, was ein Volumenverhältnis von 2:1 ergab, und die Aktivität wurde in der Methanolschicht konzentriert. Diese polare Fraktion wird einer Kieselgel-Stufengradientenchromatographie unterworfen. Die letzte Fraktion wird durch Umkehrphasen- Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 2 ml/min weiter gereinigt. Es wurden zwei mittlere Peaks aufgefangen und mühelos in ein Gemisch aus I und II umgewandelt, um ein Verhältnis von annähernd 1:1 herzustellen.
Das DDB kann auch durch Totalsynthese oder durch Hemisynthese aus natürlichem Didemnin A hergestellt werden, woran sich in beiden Fällen normale Schutz- und Aktivierungsverfahren in der Peptidchemie anschließen. Brenztraubensäure + L-Pro ergibt Seitenkette Seitenkette + Didemnin A ergibt Dehydrodidemnin B
So wird z. B. Pro-OBzl in DMF mit Brenztraubensäure und HOBt vermischt und DCC (Dicyclohexylcarbodiimid) in CH&sub2;Cl&sub2; zugesetzt. Das Reaktionsprodukt kann gereinigt werden und weist die chemischen und physikalischen Eigenschaften auf, die Pyruvyl-Pro-OBzl entsprechen.
Einer Lösung dieses letzten Produkts in CH&sub2;Cl&sub2; wurde EDC und danach Didemnin A zugesetzt. Der eingedampfte Rückstand wird gereinigt und liefert DDB mit chemischen, physikalischen, spektroskopischen und biologischen Eigenschaften. die mit denen von natürlichem Dehydrodidemnin B übereinstimmen.
Abgesehen von DDB selbst erstreckt sich die vorliegende Erfindung auf Derivate von DDB. zu denen acylierte. alkylierte oder arylierte Derivate von DDB gehören, wobei R eine Gruppe COR' oder R' sein könnte, wobei R' die folgenden Substi tuenten darstellt:
-CH&sub3;, -CH&sub2;R&sub1;, -CHR&sub1;R&sub2;, CR&sub1;R&sub2;R&sub3; oder C&sub6;H&sub5;-,
wobei R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; ein Alkylrest (linear oder verzweigt), ein Aryl- oder Alkylarylrest sein könnte, wobei die Arylreste die unter R' beschriebenen Substituenten tragen oder nicht. Die Reste R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; könnten entweder gleich oder verschieden sein.
Im allgemeinen wird erwartet, daß derartige Derivate von DDB eine biologische Wirksamkeit aufweisen, die der von DDB selbst ähnlich ist, wozu insbesondere tumorhemmende, antivirale, zytotoxische und immunosuppressive Wirkungen gehören.
Die Derivate können vorzugsweise Alkyl-, Aryl- oder Acylderivate sein, wobei R' eine aliphatische oder aromatische Gruppe ist, vorzugsweise ein Rest mit 1-6 Kohlenstoffatomen.
Die Acylderivate können durch Behandlung der Ausgangsverbindung mit dem entsprechenden Carbonsäureanhydrid in Gegenwart von Pyridin oder einer anderen nitrogenierten organischen Base, durch Umsetzung von DDB mit dem entsprechenden Acylchlorid oder durch Dehydratisierung mit DCC (Dicyclohexylcarbodiimid) aus DDB und der entsprechenden Carbonsäure gewonnen werden.
Im Falle der Alkyl- oder Arylderivate mit R=R' können diese durch Umsetzung von DDB mit dem entsprechenden Halogenid in Gegenwart einer schwachen organischen Base oder durch Dehydratisierung zwischen DDB und einem Alkyl- oder Arylhydroxyderivat durch ein organisches Dehydratisierungsmittel gewonnen werden.

INSTRUMENTIERUNG, MATERIAL UND METHODEN

NMR-Spektren wurden mit einem General Electric QE-300 (300 MHz, ¹H). einem Nicolet NT-360 (360 MHz, ¹H) oder mit einem General Electric GN 500 (500 MHz, ¹H) an der University of Illinois bzw. mit einem Varian Unity 300 (300 MHz, ¹H und 75 MHz, ¹³C) bei der Pharma Mar, S.A. (Madrid, Spanien) aufgenommen. Chemische Verschiebungen werden in ppm angegeben, bezogen auf den Chloroform-Peak bei δ 7,26 ppm für ¹H. FABMS-Spektren wurden auf einem VG Analytical ZAB im Mass Spectrometry Laboratory der University of Iilinois gemessen. GC-Analysen wurden unter Verwendung eines Varian GC (Modell 3700) ausgeführt, der mit einer Chirasil-Val II - Kapillarsäule (25 m x 0,32 mm) von der Alltech Associates, Inc., mit Helium-Trägergas mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,2 ml /mi n und programmierter Ofentemperatur (90ºC. 4ºC/min, 180ºC) ausgestattet war. Die Umkehrphasen- HPLC wurde auf einer Anlage ausgeführt, die mit einer Altex-Pumpe (Modell 110 A) und einem Differentialrefraktometer (Modell R-401) von Waters Associates sowie einer Alltech Spherisorb C18-Säule (25 cm x 1 cm, Teilchengröße 10 µm) mit MeOH:H&sub2;O im Verhältnis 9:1 als Lösungsmittelsystem ausgestattet war.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.

BEISPIEL 1

1. STRUKTURBESTIMMUNG

Die Struktur von DDB wurde durch physikalische und spektroskopische Verfahren bestimmt.

1.1 SPEKTROSKOPISCHE DATEN

TLC Rf = 0,4; 0,35 (Kieselgel, 2:3, CH&sub2;Cl&sub2;/EtOAc); 0,5; 0,44 (Kieselgel, 9:1, CHCl&sub3;/MeOH).
Umkehrphasen-HPLC tR = 10,7; 11.9 min (Spherisorb C&sub1;&sub8;-Säule. 250 mm x 10 mm, 10 µm Teilchengröße, 9:1, MeOH/H&sub2;O; 2 ml/min).
[α]²&sup5;D = -86º (&epsi; 1, MeOH)
Hochauflösende FABMS (HR FABMS) (M + H): C&sub5;&sub7;H&sub8;&sub8;N&sub7;O&sub1;&sub5; m/z berechnet 1110,6382 (gefunden 1110,6366); (M-Seitenkette + H): C&sub4;&sub2;H&sub6;&sub6;N&sub5;O&sub1;&sub1; m/z berechnet 816.4781 (gefunden 816,4755); M - Seitenkette: C&sub1;&sub5;H&sub2;&sub3;N&sub2;O&sub4; m/z berechnet 295,1657 (gefunden 295,1657).
IR (CHCl&sub3;) Vmax. cm&supmin;¹: 3680, 3600, 2970, 2940, 2880, 1740, 1650, 1605, 1540, 1510.
RMN ¹H (CDCl&sub3;. δ, ppm): 7,82 (d, J=9 Hz, 1H); 7,79 (d, J=9 Hz, 1H); 7,62 (d, J=6 Hz, 1H; 7,21 (d, J=9 Hz, 1H); 7,19 (d, J=9 Hz, 1H); 7,08 (d, J=8,5 Hz, 2H); 6.85 (d, J=8,5 Hz, 2H); 3,77 (s, 3H); 3,13 (s, 3H); 3,08 (s,
3H); 2,54 (s, 3H); 2,50(s, 3H); 2,1 (s, 3H); 2,02 (s, 3H); 0,82-0,88 (d und c überlappt, 30H).
RMN ¹³C (CDCl&sub3;, δ, ppm): 204,93 (s); 204,77 (s); 201,23 (s); 197,55 (s); 173,05 (s); 172,36 (s); 171.84 (5); 171,21 (5); 171.16 (s); 170,59 (s); 169,58 (s); 169,51 (s); 169.35 (s); 168,36 (s); 168,28 (s); 161,31 (5); 161.06 (5); 158.64 (s); 158,62 (s); 130,31 (d); 114,12 (d); 114.01 (d); 81,47 (d); 81.43 (d); 70,68 (d); 70,33 (d); 67,97 (d); 67,76 (d); 66,38 (d); 66,22 (d); 60,39 (t); 50.88 (d); 57,80 (d); 57,45 (d); 57.26 (d); 57,18 (d); 57,12 (d); 55,61 (d); 55,57 (d); 55,26 (q); 54,65 (d); 49,55 (d); 49,49 (d); 48,85 (t); 48,41 (t); 46,98 (t); 41,29 (t); 41,24 (t); 38,78 (q); 38.74 (q); 38,68 (q); 36,42 (t); 36,22 (t); 34.06 (d); 33,99 (d); 33,96 (t); 31,57 (d); 31,38 (q); 31.34 (q); 31,30 (q); 30.69 (d); 29,68 (t); 29,64 (d); 27,98 (t); 27,94 (t); 27,30 (t); 27,17 (t); 27,08 (t); 25,91 (t); 25,87 (t); 25,73 (d); 25,68 (d); 25,63 (d); 25,52 (d); 25,48 (d); 24,80 (q); 24,70 (q); 24,44 (q); 24,31 (q); 22,21 (q); 22,12 (q); 21.92 (q); 21,79 (q); 21,76 (q); 19,46 (q); 17,76 (q); 17,72 (q); 17,18 (q); 16,87 (q); 16,08 (q); 15,62 (q); 15,48 (q); 15,05 (q); 12,55 (q); 12,50 (q).

1.2 ACETYLIERUNG VON DDB

Die Struktur von Dehydrodidemnin B konnte auch durch Vergleich des Acetylierungsprodukts mit dem Acetylderivat von Didemnin B bestätigt werden.
Die Acetylierung von DDB mit Essigsäureanhydrid und Pyridin ergab ein Monoacetylderivat.
Das Massenspektrum mit niedriger Auflösung zeigte Peaks bei m/z 1153,5 (M + H), 859,0 (M + 2H - Seitenkette) und 295,4 (Seitenkette). was auf den Verlust einer der zwei möglichen Acetylierungsstellen in Bezug auf Didemnin B sowie darauf hindeutet, daß die fehlende Stelle die Hydroxylgruppe der Lactylkomponente in der Seitenkette ist.

1.3 N-TRIFLUORACETYLMETHYLESTER VON AMINOSÄURERESTEN

Die Struktur von DDB kann außerdem durch Identifikation der einzelnen Untereinheiten mittels Totalhydrolyse und Umwandlung der Aminosäuren in ihre N-Trifluoracetylmethylester sowie Analyse mittels Gaschromatographie (GC) bestimmt werden.
Die Aminosäuren wurden durch ihre Retentionszeiten und durch Vergleich authentischer Proben identifiziert, die aus der Umwandlung von Didemnin B in N-Trifluoracetylmethylester der Aminosäuren gewonnen wurden.
tR (min): L-Threonin (1,23); D-N-Me-Leucin (1,70); L-Leucin (2,05); L-Prolin (2,38); (35, 4R, 55)-Isostatin (3,15, 4,13, 4,77); L-N,O-Me&sub2;- Tyrosin (6,75).
Ein Gemisch aus DDB und glasdestillierter HCl wurde in einer abgedichteten. mit Teflon ausgekleideten Phiole mit Schraubkappe 18 Stunden auf 110ºC erhitzt. Das Lösungsmittel wurde unter einem Stickstoffstrom getrocknet.
Das Hydrolysat wurde 1 Stunde bei 110ºC mit MeOH-Acetylchlorid behandelt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, das Lösungsmittel wurde unter einem Stickstoffstrom getrocknet. Der Feststoffanteil wurde 15 min bei 110ºC mit einem Gemisch aus TFAA/TFA behandelt. Die Lösung wurde abgekühlt und das Lösungsmittel wurde verdampft. Der Rückstand wurde für die GC-Analyse in 2-Propanol aufgelöst.

BEISPIEL 2

TESTS DER BIOLOGISCHEN WIRKSAMKEIT

2.1 TEST DER WIRKSAMKEIT GEGEN L-1210-ZELLEN (Aszitesflüssigkeit von DBA/2-Mäusen)

L-121-Zellen wurden in 16 mm-Mulden (Kavitäten) in einer Menge von 1 x 10&sup4; Zellen pro Mulde in 1 ml-Aliquoten von MEM 10C eingeimpft, welche die angegebenen Arzneimittelkonzentrationen enthielten. Die gesamte Bestimmung wurde dreifach ausgeführt. Nach dreitägiger Inkubation wurden die Zellen gezählt. Eine getrennte Gruppe von Kulturen ohne Arzneimittel wurde täglich gezählt, um sicherzustellen, daß das exponentielle Zellwachstum während des Beobachtungszeitraums anhielt. WACHSTUMSHEMMUNG VON L-1210-ZELLEN DURCH DDB Nettozunahme der Zellenzahl Hemmung in %

2.2 TEST DER WIRKSAMKEIT GEGEN P-388-ZELLEN (lymphoides Neoplasma von DBA/2-Mäusen)

P-388-Zellen wurden in 16 mm-Mulden in einer Menge von 1 x 10&sup4; Zellen pro Mulde in 1 ml-Aliquoten von MEM 10C eingeimpft. welche die angegebenen Arzneimittelkonzentrationen enthielten. Die gesamte Bestimmung wurde dreifach ausgeführt. Nach dreitägiger Inkubation wurden die Zellen gezählt. Eine separate Gruppe von Kulturen ohne Arzneimittel wurde täglich gezählt. um sicherzustellen, daß das exponentielle Wachstum der Zellen während des Beobachtungszei traums anhielt. WACHSTUMSHEMMUNG VON P-388-ZELLEN DURCH DDB Nettozunahme der Zellenzahl Hemmung in %

2.3 TEST DER WIRKSAMKEIT GEGEN L-929-ZELLEN (Areola-und Fettgewebe von Mäusen)

L-929-Zellen wurden in 16 mm-Mulden in einer Menge von 1 x 10&sup4; Zellen pro Mulde in 1 ml-Aliquoten von MEM 10C eingeimpft. Am folgenden Tag wurde das Medium durch 0.5 ml-Aliquote von MEM 10C ersetzt. Am nächsten Tag wurde das Medium durch 0.5 ml-Aliquote von MEM 10C ersetzt. welche die angegebenen Arzneimittelkonzentrationen enthielten. Die gesamte Bestimmung wurde dreifach ausgeführt. Eine separate Gruppe von Kulturen ohne Arzneimittel wurde täglich gezählt, um sicherzustellen, daß das exponentielle Wachstum der Zellen während des Beobachtungszeitraums anhielt. Die Zellen wurden 4 Tage nach dem Impfen mit Trypsin behandelt und gezählt. WACHSTUMSHEMMUNG VON P-929-ZELLEN DURCH DDB Nettozunahme der Zellenzahl Hemmung in %

2.4 TEST DER WIRKSAMKEIT GEGEN B-16-ZELLEN (Maus-Melanom)

B-16-Zellen wurden in 16 mm-Mulden in einer Menge von 1 x 10&sup4; Zellen pro Mulde in 1 ml-Aliquoten von MEM 10C eingeimpft. welche die angegebenen Arzneimittelkonzentrationen enthielten. Die gesamte Bestimmung wurde dreifach ausgeführt. Eine separate Gruppe von Kulturen ohne Arzneimittel wurde täglich gezählt, um sicherzustellen, daß das exponentielle Wachstum der Zellen während des Beobachtungszeitraums anhielt. Die Zellen wurden 4 Tage nach dem Impfen mit Trypsin behandelt und gezählt. WACHSTUMSHEMMUNG VON B-16-ZELLEN DURCH DDB Nettozunahme der Zellenzahl Hemmung in %

2.5 TEST DER WIRKSAMKEIT GEGEN A-549-ZELLEN (menschliche Lungenkarzinomzellen)

A-549-Zellen wurden in 16 mm-Mulden in einer Menge von 1 x 10&sup4; Zellen pro Mulde in 1 ml-Aliquoten von MEM 10C eingeimpft. Am folgenden Tag wurde das Medium durch 0,5 ml Aliquote von MEM 10C ersetzt, welche die angegebenen Arzneimittel konzentrationen enthielten. Die gesamte Bestimmung wurde dreifach ausgeführt. Eine separate Gruppe von Kulturen ohne Arzneimittel wurde täglich gezählt, um sicherzustellen, daß das exponentielle Wachstum während des Beobachtungszeitraums anhielt. Die Zellen wurden 4 Tage nach dem Impfen mit Trypsin behandelt und gezählt. WACHSTUMSHEMMUNG VON A-549-ZELLEN DURCH DDB Nettozunahme der Zellenzahl Hemmung in %

2.6 TEST DER WIRKSAMKEIT GEGEN HeLa-ZELLEN (menschliche Cervixepitheloid-Karzinomzellen)

HeLa-Zellen wurden in 16 mm-Mulden in einer Menge von 1 x 10&sup4; Zellen pro Mulde in 1 ml-Aliquoten von MEM 10C eingeimpft. Am folgenden Tag wurde das Medium durch 0,5 ml-Aliquote von MEM 10C ersetzt, welche die angegebenen Arzneimittel konzentrati onen enthielten. Die gesamte Bestimmung wurde dreifach ausgeführt. Eine separate Gruppe von Kulturen ohne Arzneimittel wurde täglich gezählt, um sicherzustellen, daß das exponentielle Wachstum der Zellen während des Beobachtungszeitraums anhielt. Die Zellen wurden 4 Tage nach dem Impfen mit Trypsin behandelt und gezählt. WACHSTUMSHEMMUNG VON HeLa-ZELLEN DURCH DDB Nettozunahme der Zellenzahl Hemmung in %

2.7 TEST DER WIRKSAMKEIT GEGEN KB-ZELLEN (menschliche Oralepidermoid-Karzinomzellen)

KB-Zellen wurden in 16 mm-Mulden in einer Menge von 1 x 10&sup4; Zellen pro Mulde in 1 ml-Aliquoten von MEM 10C eingeimpft. Am folgenden Tag wurde das Medium durch 0,5 ml-Aliquote von MEM 10C ersetzt, welche die angegebenen Arzneimittel konzentrationen enthielten. Die gesamte Bestimmung wurde dreifach ausgeführt. Eine getrennte Gruppe von Kulturen ohne Arzneimittel wurde täglich gezählt. um sicherzustellen, daß das exponentielle Wachstum der Zellen während des Beobachtungszeitraums anhielt. Die Zellen wurden 4 Tage nach dem Impfen mit Trypsin behandelt und gezählt. WACHSTUMSHEMMUNG VON KB-ZELLEN DURCH DDB Nettozunahme der Zellenzahl Hemmung in %

2.8 TEST DER WIRKSAMKEIT GEGEN HSV-1 (Herpes simplex-Virus Typ 1)

Mulden von 16 mm Durchmesser wurden jeweils mit 2 × 10&sup5; CV-1-Zellen in 1 ml-Aliquoten von MEM 10C beimpft. Vier Tage später wurden die Zellen mit HSV-1 in einer Menge von 10C PFU pro Mulde infiziert. Nach einer Adsorption über 1,5 Stunden wurde die Impfkultur in Muldenpaaren durch 0,5 ml-Aliquote von MEM 5C ersetzt, welche die angegebenen Arzneimittelkonzentrationen enthielten. Zellen von zwei Mulden ohne Arzneimittel wurden in das Medium geschabt und 4 Stunden nach der Infektion eingefroren, um eine Basis zur Berechnung der Netto-Virusproduktion zu erhalten. Der Mittelwert dieser Proben betrug 2.5 × 10&sup5; + 1.2 × 10&sup6; PFU/ml. Die übrigen Proben wurden 24 Stunden nach der Infektion gesammelt. HEMMUNG DER HSV-1-REDUPLIKATION DURCH DDB Nettoproduktion der Viren Hemmung in %

2.9 IMMUNOSUPPRESSIVE WIRKSAMKEIT

Dehydrodidemnin B ist als Immunosuppressivum wirksam. In der Lymphozytenmischkultur-Reaktion unterdrückt es die Immunreaktion muriner Zellen. Es hemmt auch das Wachstum muriner T-Zellen und B-Zellen.

BEISPIEL 3

EXTRAKTION UND ISOLIERUNG

Ein weißes, solitäres Manteltier (Tunicatum) wurde in der Nähe von Ibiza auf den Balearen (Spanien) gesammelt und von Dr. Xaver Turon von der Universität Barcelona, Barcelona (Spanien) als Aplidium albicans identifiziert. Eine Probe wird im Centre d'Etudes Avancats, Blanes (Gerona, Spanien) aufbewahrt. Vorläufige Tests an Bord des Schiffes ergaben Hinweise auf eine antivirale Wirksamkeit gegen VSV-1 (Vesikularstomatitis-Virus). Weitere Untersuchungen im Laboratorium bestätigten die antivirale Wirksamkeit gegen das Herpes simplex-Virus. Typ 1 (HSV-1) in Affennierenzellen (CV-1) und ergaben außerdem eine Zytotoxizität gegen Maus-Lymphoidleukämiezellen (Zellen der L1210-Linie) in vitro.
Das gefrorene Manteltier wurde mit Methanol extrahiert. Durch Lösungsmittelverteilung des Rückstandes erhielt man drei wirksame Fraktionen, die entsprechend ihrer Ähnlichkeit in der TLC (Dünnschichtchromatographie) vereinigt wurden. Die Rohwirkstofffraktion wurde durch Lösungsmittelverteilung aufbereitet, und die Aktivität wurde in der Methanolschicht konzentriert. Die Methanolschicht wurde durch eine Kieselgel-Schwerkraftsäule chromatographiert (Chloroform und Chloroform- Methanol-Gemische) und ergab eine wirksame Fraktion, die durch Umkehrphasen-Hochdruckflüssigchromatographie (RPC&sub1;&sub8;HPLC) weiter gereinigt wurde und 2 Peaks (I und II) ergab. Die Analyse mittels TLC ergab zwei identische Flecke (Spots) in jeder HPLC-Fraktion. Erneute Injektion jeder einzelnen Fraktion ergab zwei Peaks mit den gleichen Retentionszeiten wie I und II.
Gemeinsame Injektion von I und II bestätigte das Vorhandensein zweier identischer Peaks (mögliche Konformere) in jeder Fraktion, was auf eine schnelle gegenseitige Umwandlung von I in II und umgekehrt schließen läßt. Aplidium albitans Expedition von Pharma Mar im westlichen Mittelmeergebiet Oktober 1988 Rückstand Lösung Eindampfen MeOH-Toluol wäßrig Toluol Hexan polar gradient

BEISPIEL 4

HEMISYSNTHESE VON DDB AUS DIDEMNIN A

Dehydrodidemnin B kann auch als semisynthetische Probe gewonnen werden, die durch Bindung der geeigneten Seitenkette an natürliches Didemnin A hergestellt wird, und seine Struktur kann durch Vergleich mit dieser semisynthetischen Probe bestätigt werden. Die für die semisynthetische Probe erhaltenen Daten zeigten völlige Übereinstimmung mit den Daten für natürliches DDB.

4.1 SYNTHESE VON PYRUVYL-PRO-OBZL

Das Hydrochlond von Pro-OBzl (10.2 g. 42 mmol) wurde in trockenem DMF (30 ml) gelöst, mit NNM (N-Methylmorpholin. 4.7 ml. 42 mmol) bei 0ºC neutralisiert, und die Lösung wurde mit Brenztraubensäure (8.8 g. 100 mmol) und HOBt (1-Hydroxybenzotriazol, 16,8 g, 110 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2;-DMF (80 ml. 8:1) vermischt. DCC (Dicyclohexylcarbodiimid, 22,6 g, 110 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (35 ml) wurde dem obigen Gemisch bei 0ºC unter Rühren zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden bei 0ºC gerührt und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. DCCL wurde abfiltriert und mit CH&sub2;Cl&sub2; (20 ml) gewaschen. Das Filtrat wurde bis zur Trockne eingedampft. der Rückstand wurde in EtOAc aufgenommen und nacheinander mit 5%-iger Zitronensäure, Wasser, 5%-igem NaHCO&sub3; und schließlich mit Wasser bis zum Erreichen eines neutralen pH-Werts gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und eingeengt. Der Rückstand wurde auf SiO&sub2; mit Hexan-EtOAc (2:1) chromatographiert und lieferte die Titelverbindung (11 g. 95%):
[α]²&sup5;D = -78,57º (&epsi; 0,14, CHCl&sub3;)
Rf = 0,63 (19:1, CHCl&sub3;/MeOH)
Anal. ber. für C&sub1;&sub5;H&sub1;&sub8;N0&sub4; (M + H): 276,1235
gefunden: 276,1235 (M + H. Hochauflösende FABMS)

4.2 SYNTHESE VON PYRUVYL-PROLIN

Das geschützte Dipeptid aus der vorhergehenden Synthese (11.0 g. 40 mmol) wurde in EtOAc (75 ml) gelöst und 2 Stunden unter Wasserstoff über Pd/C gerührt. Der Katalysator wurde dann abfiltriert, und das Filtrat wurde bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde aus EtOAc-Hexan kristallisiert und ergab das ungeschützte Peptid (6.9 g. 93%):
[α]²&sup5;D = 103,990 (&epsi; 0,12, CHCl&sub3;)
Rf = 0,41 (19:1:0,5, CHCl&sub3;/MeOH/ACOH)
Anal. ber. für C&sub8;H&sub1;&sub2;NO&sub4; (M + H): 186,0766
gefunden: 186.0765 (M + H, Hochauflösende FABMS)

4.3 SYNTHESE VON DEHYDRODIDEMNIN B

EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid, 4,279, 22,3mmol) wurde einer Lösung von Pyruv-Pro (8,2 g, 44,5 mmol) in trockenem CH&sub2;Cl&sub2; (40 ml) bei 10ºC unter Rühren zugegeben. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei 10ºC gerührt und dann auf 0ºC abgekühlt. Didemnin A (1,4 g, 1,48 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; - DMF (10 ml, 4:1) wurde zugegeben, und die klare Lösung wurde 2 Stunden bei 0ºC gerührt und dann im Kühlschrank über Nacht stehengelassen. DMAP (4-(Dimethylamino)pyridin, 25 mg) wurde dem Reaktionsgemisch zugegeben, und es wurde nochmals 48 Stunden im Kühlschrank stehengelassen. Das Lösungsmittel wurde bis zur Trockne verdampft, und der Rückstand wurde in EtOAc aufgenommen und mit 5%-igem NaHCO&sub3; und Wasser bis zum Erreichen eines neutralen pH-Werts gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und eingeengt. Der so erhaltene Rückstand wurde auf Kieselgel unter Verwendung von CHCl&sub3;-MeOH (19:1) chromatographiert und ergab Dehydrodidemnin B (1,4 g, 84%. 2 Flecke bei der TLC):
[α]²&sup5;D = -95,384º (&epsi; 0,06, MeOH)
Rf = 0,51 und 0,44 (19:1, CHCl&sub3;/MeOH)
Anal. ber. für C&sub5;&sub7;H&sub8;&sub8;N&sub7;O&sub1;&sub5; (M + H): 1110,6338
gefunden: 1110,6355 (M + H, Hochauflösende FABMS)
Die gleiche Reaktionsserie kann mit leichten Modifikationen ausgeführt werden, insbesondere kann EDC durch DDC ersetzt werden, wodurch man eine etwas niedrigere Ausbeute erhält.

Claims

1. Dehydrodidemnin B mit der Formel:

2 Ein Dehydrodidemnin-B-Derivat mit der Formel:

wobei R eine Gruppe COR' oder R' ist. wobei R' -CH&sub3;, CH&sub2;R&sub1;, -CHR&sub1;R&sub2;, -CR&sub1;R&sub2;R&sub3; oder -C&sub6;H&sub5; bedeutet (wobei die Gruppen R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; gleich oder verschieden sind und eine Alkyl-, Aryl- oder Aralkylgruppe bedeuten, wobei die Arylgruppe wahlweise mit R' substituiert sein kann).

3. Pharmazeutische Zusammensetzung mit Dehydrodidemnin B oder einem wirksamen Derivat davon, zusammen mit einem pharmazeutisch verwendbaren Träger.

4. Verfahren zur Herstellung von Dehydrodidemnin B, mit Bindung von Pyruvylprolin an Didemnin A.

5. Verfahren zur Isolierung von Dehydrodidemnin B, mit einer Extraktion aus einem dehydrodidemnin-B-haltigen Tunicat.