DE69915437T2

DE69915437T2 - Plasmasammlungen von mehr als 200 gesunden Patienten und davon abgeleiteter Kalibrierstandard

Info

Publication number: DE69915437T2
Application number: DE69915437T
Authority: DE
Inventors: Ruth Laub; Jean Duchateau; Mario Giambattista
Original assignee: S C R L Department CENTRAL DE FRACTI; Scrl Departement Central De Fractionnement de la Croix-Rouge; Universite Libre de Bruxelles ULB
Current assignee: S C R L Department CENTRAL DE FRACTI; Scrl Departement Central De Fractionnement de la Croix-Rouge; Universite Libre de Bruxelles ULB
Priority date: 1998-12-07
Filing date: 1999-12-07
Publication date: 2005-03-03
Anticipated expiration: 2019-12-08
Also published as: DK1008854T3; US6635484B1; ES2215372T3; EP1008854A1; ATE261584T1; DE69915437D1; BE1012448A3; EP1008854B1

Description

Gegenstand der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betriff einen Standard, der in Diagnose- und/oder Quantifizierungstests von Antikörpern, die aus einer Infektion durch einen bakteriellen oder viralen Erreger oder einer Autoimmunreaktion oder allergischen Reaktion stammen, aufzunehmen ist.
Stand der Technik und technologischer Hintergrund, auf denen die Erfindung beruht
Die Bezugsmaterialien und -standards auf biologischem Gebiet sind Präparate von Substanzen, die eine komplexe Molekularzusammensetzung aufweisen und in den Mechanismen zur Qualitätskontrolle, Diagnose und Forschung zur Anwendung gelangen.
Für die Diagnose der bakteriellen Erreger, die für verschiedene Infektionen verantwortlich sind, die Säuger, inklusive des Menschen, befallen, wurden verschiedene Methoden vorgeschlagen, um einen Referenzstandard in einer solchen Diagnose zu erhalten.
Die Organisationen zur Rückerstattung von medizinischen Kosten (INAMI) führen an, dass eine Quantifizierung von Immunglobulinen, insbesondere die Quantifizierung einer Hypogammaglobulinämie, vorhanden ist, wenn der Gesamtgehalt an Immunglobulin geringer als der Normwert des Labors ist. Dieser Normwert muss als zwei Standardabweichungen unter dem messbaren Durchschnitt berechnet werden, der mit Kontrollen pro Altersklasse oder mit 95% Vertrauensbereich einer mit dem Alter gekoppelten Kontrollpopulation verbunden ist. Folglich muss die Charakterisierung eines gewissen Typs von Antikörpern, die eventuell gegen einen bakteriellen Erreger gerichtet sind, in einem Diagnose- oder Quantifizierungstest in Bezug auf einen Standard erfolgen, der vom Wert der Norm des Labors gebildet ist. Folglich variieren diese Normen sehr stark von einem Labor zu einem anderen, was die Ergebnisse verfälschen kann.
Quataert et al. ((Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology Band 2, Nr. 5, Seiten 590–597 (September 1995) beschreiben eine Methode zur Identifizierung von Antikörpern, die für jeden der Serotypen von S. pneumoniae spezifisch sind. Jedoch die vorgeschlagene Standardreferenzmenge wird aus einem Pool von 17 Erwachsenen, die mit einem Impfpräparat geimpft wurden, erhalten, die untereinander eine zu große Varianz aufweisen können, und erfordert den Einsatz von besonders komplexen mathematischen Extrapolationen für die Diagnose dieser bakteriellen Infektion. Ferner kann eine Cross-Reaktivität zwischen den verschiedenen kapsulären Antigenen der verschiedenen Serotypen vorhanden sein (Coughlin et al., Vaccine 16, Nr. 18, Seiten 1761–1767, 1998).
EP 0 787 989 und US 5 798 267 zeigen die Präparation eines Standards durch „pooling" von 1000 bzw. 1200 Plasmas. Diese Dokumente betreffen keine Antikörper.
Ziele der Erfindung
Die vorliegende Erfindung soll einen verbesserten Standard in Diagnosevorrichtungen liefern, der nicht die Nachteile des Standes der Technik aufweist und verwendet werden kann, um die Diagnose, die Quantifizierung und/oder das Monitoring von Immunreaktionen, die von Infektionen stammen, die Säuger, inklusive des Menschen, betreffen, insbesondere von Infektionen durch einen bakteriellen oder viralen Erreger, oder die von einer Autoimmunreaktion oder einer allergischen Reaktion stammen.
Ein besonderes Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen Standard in einer solchen Diagnosevorrichtung zu liefern, der in der Ausführung einfach und kostengünstig ist und es ermöglicht, die Diagnose solcher Infektionen zu vereinfachen, ohne den Einsatz von Veränderungen der Betriebsprotokolle der üblicherweise verwendeten Diagnosen zu erfordern, und der insbesondere nicht den Einsatz von komplexen mathematischen Extrapolationen erfordert.
Charakteristische Elemente der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Diagnose und/oder Quantifizierung (inklusive des Monitorings oder der Verlaufskontrolle) einer Immunreaktion, die durch das Vorhandensein eines gewissen Typs von Antikörpern gekennzeichnet ist, das mit einer Infektion, wie beispielsweise einer bakteriellen oder viralen Infektion oder einer Reaktion des Typs Autoimmunreaktion oder allergische Reaktion, insbesondere einer Nahrungsmittelallergie, die einen Patienten, insbesondere einen Säuger (inklusive des Menschen), befallen kann, verbunden ist.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ermöglicht die Erfassung und/oder Quantifizierung der Antikörper, die in einer biologischen Flüssigkeit des Patienten vorhanden sind, wie beispielsweise eine Blutprobe des besagten Patienten, wobei die Antikörper gegen den für die Infektion verantwortlichen Erreger oder Teile desselben (insbesondere Polysaccharid C, das auf der Wand der Bakterien vorhanden ist) gerichtet sind oder für eine Immunreaktion oder allergische Reaktion bezeichnend sind, wobei die erfindungsgemäße Vorrichtung dadurch gekennzeichnet ist, dass sie als Standard (nachstehend auch als „Referenz" oder „Kalibrator" bezeichnet) ein biologisches Muster umfasst, das einen definierten Antikörpertiter aufweist, der aus einem Pool (d. h. einer Mischung) von Blutplasmen ausgewählt wird, die von mehr als 200 gesunden Patienten oder Individuen gewonnen wurden.
Unter „Patient" ist jeder Säuger, inklusive des Menschen, zu verstehen, der durch den Mikroorganismus, der für diese Infektion verantwortlich ist oder eine allergische Reaktion oder Autoimmunreaktion aufweist, infiziert werden kann und in der Lage ist, Antikörper zu bilden, die spezifisch gegen den Mikroorganismus gerichtet sind, oder der in der Lage ist, Antikörper aufzuweisen, die mit dieser Autoimmunreaktion oder allergischen Reaktion verbunden sind.
Unter „gesunder Patient (oder Individuum)" ist ein Patient zu verstehen, der mit dem Mikroorganismus, der für die Infektion verantwortlich ist, in Kontakt war und die Infektion nicht oder nicht mehr aufweist. Beispielsweise würden unter „gesunde Patienten oder Individuen" gesunde Erwachsene einer Population verstanden, die sogar vorübergehend einer bakteriellen Infektion, insbesondere durch Streptococcus pneumoniae, ausgesetzt waren und Antikörper des Typs Anti-Streptococcus pneumoniae besitzen. Folglich kann eine Mischung von Plasmen oder Seren von gesunden Patienten (oder Individuen), d. h. die keine oder eine geringe Wahrscheinlichkeit haben, die Infektion aufzuweisen, als Standard dienen.
Die Erfinder bemerkten, dass, wenn das biologische Muster, das aus einem solchen Pool, d. h. einer Plasmamischung, die von mehr als 200 Patienten hergestellt wurde, präpariert wurde, vorzugsweise wenn die Anzahl von Patienten mehr als 1000, 2000 bzw. 5000 gesunde Patienten beträgt, dieses durch eine sehr geringe (statistische) Varianz gekennzeichnet ist und als „Universal"-Standard für Diagnose- und/oder Quantifizierungsvorrichtungen dienen kann, da sie durch eine sehr geringe Varianz gekennzeichnet sind, auch wenn in dem Plasmapool ein oder mehrere gesunde Patienten oder Individuen zum Zeitpunkt der Blutspende die besagte Infektion hatten, die charakterisiert werden soll. Der Titer dieser Antikörper in Bezug auf die Anzahl von bei anderen Erwachsenen ausgewählten Antikörpern, die als gesunde Patienten oder Individuen gekennzeichnet waren, würde nämlich die vorteilhaften Eigenschaften des erfindungsgemäßen Standards nicht signifikant beeinträchtigen.
Ferner kann der Standard oder Kalibrator der Erfindung vorzugsweise aus einem oben schwimmenden Kryoelement des Plasmapools präpariert werden, der leicht in großer Menge verfügbar sein kann.
Ein solcher Standard ermöglicht nicht nur eine Diagnose, sondern auch eine Quantifizierung (Berechnung des Antikörpertiters) sowie das Monitoring (auch „Verlaufskontrolle" genannt) der besagten Immunreaktion. Dieses Monitoring ist insbesondere nützlich, wenn die Entwicklung einer Impfung gegenüber einem Mikroorganismus, der für eine Infektion verantwortlich ist, oder gegenüber einer Antiallergie-Behandlung oder einer Behandlung, die für die Behandlung einer Autoimmunpathologie oder eines Autoimmunsyndroms bestimmt ist, verfolgt werden soll.
Der Standard oder die Referenz der Erfindung, die von einem definierten Antikörpertiter, der durch eine geringe Varianz, d. h. durch einen signifikanten Unterschied zwischen den Antikörpertypen gekennzeichnet ist, gebildet ist, ermöglicht die einfache Verwendung eines solchen Standards in einer Diagnose- und/oder Quantifizierungsvorrichtung, ohne komplexe mathematische Analysen oder Extrapolationen zu erfordern und ohne die oben erwähnten üblichen Diagnose-, Quantifizierungs- und eventuell Monitoringverfahren zu beeinträchtigen. Ein solcher Standard kann vorzugsweise in jeder Art von Diagnose- oder Quantifizierungsvorrichtung verwendet werden, insbesondere in jeder Art von Diagnose- und/oder Quantifizierungskit, der auf den ELISA-Technologien, wie unten beschrieben, oder anderen Technologien zur Erfassung von Antikörpern, wie beispielsweise der RIA-Technologie oder der Technologie der Hämagglutination beruht, und auf jeder Art von Trägermaterial.
Die Vorrichtung und das Verfahren der Erfindung können auch ein Medium und einen Schritt umfassen, die eine vorherige Inkubation der zu testenden Muster ermöglicht, vorzugsweise im Beisein von Polysaccharid C, vorzugsweise von ungefähr 2,5 μM/ml von Polysaccharid C während einer Dauer von 30 min bei 37°C, um die kapsulären Antikörper in den verschiedenen Präparaten eines immunochemischen Tests zu dosieren, wobei als immobilisierte Antigene Präparate von Polysaccharid-Antigenen verwendet werden (beispielsweise für die Diagnose von Streptococcus pneumoniae).
Die Diagnosevorrichtung der Erfindung ist besonders gut für die Diagnose, Quantifizierung und/oder das Monitoring von Immunreaktionen geeignet, die mit einer allergischen Reaktion verbunden sind, insbesondere für die Erfassung, Quantifizierung und/oder das Monitoring von Antikörpern des Typs IgG oder IgE, die mit einer allergischen Reaktion, insbesondere einer allergischen Reaktion auf Nahrungsmittel, verbunden sind, für die Erfassung von Autoantikörpern im Falle einer Autoimmunreaktion oder für die Erfassung, Quantifizierung und/oder das Monitoring der Antikörper, die gegen verschiedene bakterielle oder virale Infektionen gerichtet sind, insbesondere Infektionen durch Stämme von Streptococcus pneumoniae, Neiseria und Hämophilus.
Der Gegenstand der Erfindung ist detailliert in dem nachstehenden Ausführungsbeispiel beschrieben.
Figuren
1 stellt die Kalibriergerade dar.
Beispiel 1: Immunoenzymatischer Test ELISA zur Erfassung von Antipneumokokken-Antikörpern im Plasma, in den Plasmapools und in den Immunglobulin-Konzentraten
Der Stamm Streptococcus pneumoniae ist ein gemeinsamer Wirt der Oropharyngealflora, deren Kapsel die Virulenz und die Antigenität verleiht. Die gegen die Polysaccharid-Antigene gerichteten Antikörper der Kapsel sind Infektionsschutzmittel. Die Rate der Träger von Streptococcus pneumoniae variiert mit dem Alter, der Jahreszeit und der infektiösen oder nicht infektiösen Umgebung. Die Pneumokokken sind die Hauptursache der erworbenen Pneumonien in den Gemeinschaften und die häufige Quelle von akuten Otitiden des Mittelohrs, von Sinusitiden und Pharyngitiden. Die Pneumonien, die in den meisten Fällen durch Pneumokokken hervorgerufen werden, sind die fünfthäufigste Todesursache in den USA. In Belgien beträgt die Häufigkeit der Infektionen durch Pneumokokken 200.000 Fälle pro Jahr. Die Rate der antibioresistenten Stämme steigt ständig, wobei 12% gegen Tetracyclin und 21% gegen Erythromycin resistent sind. Die Mortalitätsrate wird auf 2.000 Todesfälle pro Jahr geschätzt, die mit Problemen der Antibioresistenz zusammenhängen dürften.
Wenn die Pneumokokken alle Individuen (70% der gesunden Träger) befallen, stellen gewisse Umstände eine Prädisposition für die Pneumokokken-Infektion dar, wie beispielsweise das Alter, die Bronchopneumopathien, die Krebserkrankungen der oberen serodigestiven Wege, Alkohol und Rauchen, sowie Herzinsuffizienz. Die Hypoasplenien stellen einen entschiedenen erschwerenden Faktor dar, sowie die Hämopathien, die insbesondere die Kinder im Alter von unter 5 Jahren betreffen.
Die Erforschung der Antipneumokokken-Antikörper im Plasma und den durch das erfindungsgemäße Diagnosekit abgeleiteten Fraktionen ermöglicht es, die Antipolysaccharid-Antikörper der Kapsel der 23 häufigsten Serotypen (95% der in Belgien isolierten Stämme) zu erfassen. Der immunoenzymatische Test ELISA, der unten beschrieben ist, ermöglicht die quantitative Dosierung der Antipneumokokken-Antikörper in einem Plasma oder einer Plasmafraktion ohne vorherige Behandlung der an Antikoagulanzien gesammelten Plasmaprobe. Dieser ermöglicht es, die Antikörper in den Plasmen oder Plasmafraktionen, die wenige Antikörper enthalten (Konzentration 1000-mal geringer als der bei den gesunden Individuen angetroffene Durchschnitt) sowie in den nach der Impfung erhaltenen hyperhumanen Plasmen zu erfassen.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ermöglicht somit ein besonders wirksames Monitoring (oder eine Verlaufskontrolle) einer Impfung oder der Entwicklung einer Infektion.
Präparation der Lösungen, Verdünnungen und Proben
Lösung A: PBS-Puffer 10x konzentriert

– 400 g NaCl
– 10 g KCl
– 72 g Na₂HPO₄
– 12 g KH₂PO₄

Mit Wasser mQ auf 5 Liter zu ergänzen.
Lösung B: Waschlösung (PBS 1x-Tween^® 0,1%)
Die endgültigen Konzentrationen betragen jeweils:

– 0,14 M NaCl
– 2,7 mM KCl
– 10 mM Na₂HPO₄
– 1, 8 mM KH₂PO₄
– 0,1% Tween^® 20

Für 1000 ml der Arbeitslösung sind zu nehmen:

– 100 ml der Lösung A
– 1 ml von Tween^® 20
– 899 ml Wasser mQ.

Lösung C: Verdünnungspuffer des mit Peroxidase markierten Antikörpers
Lösung C₀: Lagerlösung von Rinderalbumin zu 5%
Für 10 ml der Lösung:

– 500 g BSA (Sigma)

Mit Wasser mQ endgültig auf 10 ml zu ergänzen. Die Lösung wird bei 20°C gelagert.
Arbeitslösung C
Für 10 ml der Lösung C:

– 1 ml der Lösung C₀
– 1 ml der Lösung A
– 8 ml Wasser mQ

Lösung D: Lösung zur Sättigung und Verdünnung der zu dosierenden Proben

– 20 g Kasein (Merck) in 400 ml Wasser mQ auflösen
– auf 60°C erhitzen und den pH-Wert regelmäßig auf 9,6 mit NaOH 5 M einstellen
– durch Erhitzen auf 60°C 2 h lang in einem Magnetrührer mischen
– 36 g NaCl und 0,8 g Thimerosal^® (Merck) beigeben
– langsam 1600 ml Wasser mQ und 200 ml Tris-HCl 20 mM, pH-Wert 6,6 (Merck) beigeben
– den pH-Wert auf 7,2–7,4 mit HCl 1 M oder NaOH 1 M einstellen
– die Lösung mit 4500 U/min 1 Stunde lang bei 22°C zentrifugieren
– dekantieren lassen und auf Wattman^® filtern
– bei –20°C in Flakons zu 500 ml einfrieren
– vor der Verwendung auf Milli-Fil PF^® 0,8 μm (Millipore) filtern und bei 4°C aufbewahren

Die endgültige Lösung beträgt 10 μM trist pH-Wert 7,2–7,4; 0,15 M NaCl, 0,02% Thimerosal^®; 0,5% Kasein
Lösung E: Lösung zur Einstellung der Reaktion

– H₂SO₄: 2 N

Präparation der Verdünnungen des Kalibrators
Der Kalibratorflakon wird in 1 ml „verwendungsfertigen" Kaseins (Kalibrator 1/1) wiederhergestellt.
Beispiele

Kalibrator zu 1/125: 16 μl Kalibrator 1/1 + 1984 μl „verwendungsfertiges" Kasein
Kalibrator zu 1/250: 400 μl Kalibrator 1/125 + 400 μl „verwendungsfertiges" Kasein
Kalibrator zu 1/500: 400 μl Kalibrator 1/250 + 400 μl „verwendungsfertiges" Kasein
Kalibrator zu 1/1000: 400 μl Kalibrator 1/500 + 400 μl „verwendungsfertiges" Kasein

Präparation der verschiedenen zu testenden Proben
Beispiele

Probe Nr. 1 zu 1/250: 8 μl einer zu testenden Probe + 1992 μl Kasein entnehmen
Probe Nr. 2 zu 1/500: 400 μl der Probe Nr. 1 + 400 μl Kasein entnehmen

Verfahren
A. Präparation der Lösung Pneumovax^® R²³ für das „coating"
Die Antigenkonzentration des Impfstoffes Pneumovax^® R²³ (Pasteur Merieux MSD) beträgt 1,15 mg/ml. Die Arbeitskonzentration beträgt 1 μg/ml.
Für eine Plaque (96 Öffnungen):

– 9,85 ml Wasser mQ
– 1,15 ml der Lösung A
– 11 ml der Lagerlösung von Pneumovax^® R²³

Mit Hilfe einer Multipipette 100 μl der Antigenlösung zu 1 μg/ml in jede Öffnung hinzufügen.
Die Plaque mit einem transparenten Kleber bedecken. 16 h bei 4°C inkubieren.
B. Waschen der Plaque
5-mal die Mikroplaque mit der Lösung B mit Hilfe einer Plaque-Wascheinrichtung (NUNC^® Immuno Wash 8) waschen.
Die Plaque auf einem absorbierenden Papier schütteln, um sie maximal zu trocknen.
C. Sättigung der nicht spezifischen Standorte
200 μl der Lösung D in jede Öffnung mit Hilfe einer Multipipette hinzufügen.
Die Mikroplaque mit einem transparenten Kleber bedecken. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
Die Lösung entfernen und die Plaque maximal trocknen, indem sie auf einem absorbierenden Papier geschüttelt wird.
D. Inkubation mit der zu testenden Probe
Während des Sättigungsschrittes (Schritt C) sind die Verdünnungen der verschiedenen zu testenden Proben zu präparieren.
D-1: Wenn die zu testende Probe ein Plasma ist
Alle Verdünnungen der zu testenden Proben erfolgen in der Lösung D.
Um eine Kalibrierkurve zu erhalten, muss:

– der Standardplasmapool mit 1 ml Wasser mQ wiederhergestellt werden (2 min mit Vortex mischen)
– 250 μl Plasma des zu 1/125; 1/250; 1/500 und 1/1000 verdünnten Standardpools in der Lösung D, wie oben beschrieben, präpariert werden.

Um die zu testenden Proben zu präparieren, muss:

– 250 μl einer Verdünnung 1/250 und 1/500 der zu testenden Plasmen in der Lösung D präpariert werden
– „im Duplikat" 100 μl der verschiedenen zu testenden Verdünnungen hinzugefügt werden (Kalibrierkurve und Probe)

Um die Vergleichsproben zu präparieren (diese Proben umfassen keine ersten Antikörper), muss:

– ebenfalls in 4 Öffnungen 100 μl der Lösung D „im Duplikat" hinzugefügt werden
– die Plaque mit einem transparenten Kleber überzogen und 1 Stunde bei 37°C inkubiert werden.

D-2: Wenn die zu testende Probe ein Konzentrat von Immunglobulinen ist
Wie oben beschrieben vorgehen, indem 250 μl einer Verdünnung der Menge zu 0,1; 0,05; 0,025 und 0,01 mg/ml in dem Puffer D präpariert werden.
E. Beigabe des Kaninchenantiserums, das mit der Peroxidase (HRP) markiert und spezifisch gegen die IgG des Menschen gerichtet ist

– 5-mal die Plaque mit der Lösung C waschen
– einen zweiten Antikörper beigeben, der ein Kaninchenantiserum Anti-IgG des Menschen, das mit der Peroxidase markiert ist, ist. Es kann insbesondere ein Antikörper, der von der Firma Sigma unter der Bezugsnummer A8792 vertrieben wird, in einer Verdünnung von 1/60000 oder ein Antikörper, der von der Firma Dako unter der Bezugsnummer P0214 vertrieben wird, in einer Verdünnung von 1/28000 verwendet werden.
– In jede der Öffnungen 100 μl des Kaninchenantiserums hinzufügen und 30 min bei 37°C inkubieren.

F. Entwicklung der Plaques
Die Entwicklung der Plaques erfolgt durch Beigabe eines Substrats (TMB oder flüssiges 3,3'-5,5'-Teramethylbenzidin von Sigma (Ref.: T8665)), das bei Raumtemperatur zugeführt wird.

– 5-mal die Plaque mit der Lösung C waschen.
– 100 μl einer Lösung TMB in alle Öffnungen hinzufügen
– 15 min lang bei 37°C inkubieren

G. Einstellung der Reaktion
Die Einstellung der Reaktion erfolgt durch Beigabe von 100 μl H₂SO₄ 0,5 N.
H. Spektrophotometrische Messung
Den Absorptionskoeffizienten bei 450 nm innerhalb der 15 min ablesen.
Berechnung des Anti-Pneumokokken-Antikörpertiters
A. Erstellung einer Kalibriergeraden und Anti-Pneumokokken-Antikörpertiters
Per Definition besitzt eine Verdünnung eines Standard-Plasmapools zu 1/500 einen Titer von 1000 mU/ml von Antipneumokokken-IgG.
In der Graphik wird der Nettoabsorptionskoeffizient eingetragen: Odnet = Durschnitt der Odgemessen – Durchschnitt der OdVergleichsproben erhalten für jede Verdünnung des Plasmapools in Abhängigkeit von dem Logarithmus des entsprechenden Anti-Pneumokokken-Titers.
Mit Hilfe eines linearen Regressionsprogramms wird die Gleichung der Kalibriergeraden bestimmt.
B. Berechnung des Titers an den unbekannten Proben
Mit Hilfe der Gleichung der Kalibriergeraden wird der Titer an Anti-Pneumokokken-Antikörpern in mU/ml bestimmt, die in den unbekannten Proben vorhanden sind, indem die verwendeten Verdünnungen berücksichtigt werden.
Die Tabelle 1 stellt den Wert der bei 450 nm erzielten Dichten dar.
Der Titer jeder der Verdünnungen wird unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors neu berechnet.
Tabelle 1
Tabelle 2 stellt den Wert der in Abhängigkeit von den UI/ml erzielen Dichten dar (logarithmischer Maßstab für den Kalibrator).
Tabelle 2
Die durchschnittlichen optischen Dichtewerte, um die Vergleichsprobe korrigiert, werden in die Graphik in Abhängigkeit vom Titer eingetragen (halblogarithmischer Maßstab).
Der Titer der unbekannten Proben wird mit Hilfe der Parameter der Kalibriergeraden (1) der untenstehenden Methode berechnet:

1) Gleichung der Kalibriergeraden: OD = a + (logmV/ml) – b; wobei a = 1,007 und b = 2,26
2) Berechnung des Titers einer unbekannten Probe: den Wert von log(Titer) berechnen. Log(Titer) = (OD_(gemessen) ^–b)/a
3) Titer (mV/ml) = 10^log(Titer)
4) Den durchschnittlichen Titer der Probe bei zwei unterschiedlichen verwendeten Verdünnungen (1/250 und 1/500) berechnen, unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors.

Beispiel 2: Spezifität des Diagnosetests gegenüber kapsulären Antigenen von S. pneumoniae
Die Immunantwort, die gegen die Polysaccharid-Antigene von S. pneumoniae gerichtet ist, zeigt sich im Vorhandensein von spezifischen Antikörpern der Zellwand und der Kapsel (Sorensen et al., 1995 Danish Medical Bulletin 42, S. 47–53). Diese beiden Typen von Antikörpern können insbesondere bei den gesunden Spendern, den Patienten, die mit Immunglobulinen behandelt wurden oder nicht, oder die mit den Immunglobulinen geimpft wurden, aufgezeigt werden.
Die relative Bestimmung dieser beiden Typen von Antikörpern kann sich als wesentlich herausstellen, insbesondere für die kapsulären Anti-Antigen-Antikörper, deren Schutzrolle gegen eine zukünftige Infektion bewiesen wurde (Lee et al., 1997 Critical Reviews in Microbiology 23 (2), S. 121–142).
Folglich kann die Vorrichtung zur Diagnose und/oder Quantifizierung der Erfindung vorzugsweise für die Sicherstellung der Verlaufskontrolle solcher Infektionen eingesetzt werden.
Zur Unterscheidung der Antikörper, die gegen das Polysaccharid C, das in der Bakterienwand und in dem Antipneumokokken-Impfstoff der kapsulären Antikörper vorhanden ist, gerichtet sind, wird Polysaccharid C (beispielsweise aus Stämmen gereinigt, die keine Kapsel besitzen, oder durch Gentechnik erhalten) in einem vorherigen Schritt verwendet, um die spezifisch gegen letztgenanntes gerichteten Antikörper zu neutralisieren.
Eine vorherige Inkubation der zu testenden Proben, beispielsweise im Beisein von 2,5 μl/ml Polysaccharid C während einer Dauer von 30 min bei 37°C ermöglicht es, die kapsulären Antikörper in den verschiedenen Präparaten im immunochemischen Test zu dosieren, indem als immobilisierte Antigene Präparate von Polysaccharid-Antigenen verwendet werden (die beispielsweise aus dem Produkt Pneumovax^® oder aus anderen Antigenquellen gewonnen wurden).
Unter diesen Bedingungen beträgt die Rate der kapsulären Antikörper in Bezug auf die Gesamtzahl von Antikörpern ungefähr 50% in den Plasmapoolstandards, 80 im Standard 89SF und 10 bis 90% bei den gesunden Spendern.

Claims

Vorrichtung zur Erfassung und/oder Quantifizierung des Titers von Antikörpern, die in einer biologischen Flüssigkeit eines Patienten vorhanden und für eine Reaktion, die mit einer Infektion durch einen Mikroorganismus verbunden ist, für eine Autoimmunreaktion oder eine Allergie spezifisch sind, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Standard ein biologisches Muster umfasst, das aus einem Blutplasmapool von mehr als 200 gesunden Individuen ausgewählt wird.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das biologische Muster aus einem Blutplasmapool von mehr als 1000 gesunden Individuen ausgewählt wird.
Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das biologische Muster aus einem Blutplasmapool von mehr als 5000 gesunden Individuen ausgewählt wird.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Diagnose- und/oder Quantifizierungskit handelt.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Patient ein Mensch ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus ein bakterieller Infektionserreger ist.
Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der bakterielle Infektionserreger der Stamm Streptococcus pneumoniae ist.
Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der bakterielle Infektionserreger ein Stamm von Neiseria ist.
Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der bakterielle Infektionserreger ein Stamm von Hämophilus ist.
Verwendung der Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Erfassung und/oder Verlaufskontrolle einer Infektion durch einen Mikroorganismus.
Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus ein bakterieller Infektionserreger ist, der aus der Gruppe, die von den Stämmen Streptococcus pneumoniae, Neiseria und Hämophilus gebildet ist, ausgewählt wird.