DE2536572C2

DE2536572C2 - Diagnostisches Verfahren zum Nachweisen der An- oder Abwesenheit eines ausgewählten Antigens oder Antikörpers in einer biologischen Flüssigkeitsprobe

Info

Publication number: DE2536572C2
Application number: DE2536572A
Authority: DE
Inventors: Ivar Schenectady N.Y. Giaever
Original assignee: General Electric Co
Current assignee: General Electric Co
Priority date: 1974-09-03
Filing date: 1975-08-16
Publication date: 1984-06-14
Also published as: US3979509A; SE435426B; NL7510422A; FR2283658B1; IT1077001B; GB1514325A; BR7505668A; DE2536572A1; JPS5916670B2; CH615759A5; JPS5161626A; SE7509710L; FR2283658A1

Description

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das der Flüssigkeitsprobe ausgesetzte beschichtete Substrat mit Watser gespült wird, bevor man die poröse lichtundurchlässige Schicht aufbringt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat mit destilliertem Wasser gespült wird.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Flüssigkeitsprobe ausgesetzte beschichtete Substrat trocknet.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Aufbringen der porösen lichtundurchlässigen Schicht durch leichtes Aufsprühen eines Aerosols aus Teilchen inerten Materials auf das beschichtete Substrat erfolgt.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Aufbringen der porösen lichtundurchlässigen Schicht auf das beschichtete Substrat durch Aufbringen einer dünnen Schicht aus kleinen Teilchen aus Metall, Glas, einem Kunststoff oder eines inerten Materials erfolgt, das die Schicht für das bloße Auge erkennbar macht.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Aufbringen einer Schicht aus Metallteilchen auf das Substrat durch Eintauchen des beschichteten Substrates in eine gerührte Lösung aus Nickelteilchen erfolgt.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Aufbringen einer dünnen Schicht aus Metallteilchen auf das Substrat durch Bilden eines dünnen Metallfilms von wenigen Zehntel mn

Dicke erfolgt

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Inberührungbringen der behandelten Oberfläche mit einer Lösung durch Aufbringen mindestens eines Tropfens einer Lösung einer schwachen Säure auf einen kleinen Teil <ier porösen lichtundurchlässigen Schicht erfolgt.

10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Inberührungbringen der behandelten Oberfläche mit einer Lösung durch Eintauchen des Substrates in eine Lösung einer schwachen Säure erfolgt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Säurelösung nicht stark genug ist, um die Bindung zwischen dem zuerst aufgebrachten Antikörper oder Antigen und dem Substrat zu spalten.

12. Verfahren nach Anspruch 10 und 11, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert der Säurelösung im Bereich von i bis 5 liegt.

13. Verfahren nach den Ansprüchen I bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Inberührungbringen der behandelten Oberfläche mit einer Lösung durch Aussetzen des beschichteten Substrates gegenüber einer alkalischen Lösung mit einem pH-Wert im Bereich von 9 bis 13 oder gegenüber einer Lösung hoher Salzkonzentration erfolgt.

14. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Untersuchen der lichtundurchlässigen Oberfläche des Substrates mittels optischer Instrumente erfolgt.

15. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Untersuchen der porösen lichtundurchlässigen Schicht durch Betrachten des von dieser Schicht reflektierten oder des durch diese Schicht hindurchgegangenen Lichtes erfolgt, um zu bestimmen, ob ein Teil der porösen lichtundurchlässigen Schicht durch die Lösung entfernt worden ist, was die Anwesenheit des ausgewählten Antigens oder Antikörpers in der Flüssigkeitsprobe anzeigt.

Die Erfindung betrifft ein diagnostisches Verfahren zum Nachweisen der An- oder Abwesenheit eines ausgewählten Antigens oder Antikörpers in einer biologischen Flüssigkeitsprobe durch Inberührungbringen der Oberfläche eines mit einem Antikörper oder Antigen beschichteten Substrates, wobei dieser Antikörper bzw. dieses Antigen spezifisch ist für das nachzuweisende Antigen bzw. dem nachzuweisenden Antikörper mit der Flüssigkeitsprobe für eine festgelegte Zeit.

Ein Verfahren der vorstehenden Art ist in der DE-OS 30 702 beschrieben.

Weitere Veröffentlichungen sind der Artikel von Irving Langmuir et al., »Optical Measurement of the Thickness of a Film Adsorbed from a Solution« in Journal of the American Chemical Society, Band 59, Seite 1406, der Artikel von Alexandre Rothen »Immunologie and Enzymatic Reactions Curried Out at a Solid-Liquid Interface« in der Zeitschrift Physiological Chemistry and Physics Band 5. 1973, Seiten 243-58, der Artikel von Leo Vroman et al., »Interactions Among Huniiin Blood Proteins at Interfaces« in Federation Proceedings, Band 30 Nr. 5, Seiten 1494-1^r>02, von 1971. der Artikel von Ivar Giacver »Antibody-Antigen-Reaclion:

A Visual Observation« in the Journal of Immunology, Band 110 Nr. 4, Seiten 1424-1426 von 1973 der Artikel von A. L Adams et al »Three Simple Ways to Detect Antibody-Antigen-Complex cn Flat Surfaces« im journal of Immunological Methods Band 3, Seiten 227-232 von 1973 sowie die US-PS 37 70 380 und 36 46 346.

Die immunologischen Reaktionen sind hoch spezifische biophysikalische Reaktionen, bei denen ein erstes immunologisch reaktives biologisches Teilchen (im allgemeinen ein Protein), das als das Antigen bekannt ist, sich mit einem zweiten Protein verbindet, das spezifisch zu dem Antigen ist und als Antikörper bekannt ist, wobei sich ein immunologisch komplexiertes Protein bildet. Immunologische Reaktionen, die innerhalb eines biologischen Systems stattfinden, wie einem Tier oder einem Menschen, sind lebenswichtig zum Bekämpfen von Krankheit. In einem biologischen System verursacht der Eintritt eines Fremdproteins, d. h. des Antigens, die Erzeugung der spezifischen Antikörper-Proteine gegenüber dem Antigen durch das .biologische System, wobei das Verfahren dieser Erzeugung derzeit noch nicht voll verstanden ist. Einige der wichtigsten Antikörper, die in diagnostischen Verfahren verwendet werden, stehen jedoch nicht in Beziehung zum Eintritt irgendeines bekannten Fremdmoleküls. Einige Antikörper, wie Anti-A und Anti-B, die bei der Blutgruppenbestimmung benutzt werden, werden natürliche Antikörper genannt, weil sie in menschlichen Seren augenscheinlich ohne das Erfordernis einer vorherigen antigenen Stimulierung gefunden werden. Andere Antikörper scheinen die Fähigkeit zu haben, mit einigen Bestandteilen, die normalerweise im Körper vorhanden sind, zu reagieren. Dies führt zu dem als Autoimmunität oder Autoallergie bekannten pathologischen Zustand. Beispiele solcher Antikörper schließen die antinuklearen Antikörper der allgemeinen Schmetterlingsflechte, die rheumatischen Faktoren der Arthritis deformans und die Antithyroglobulin-Antikörper der chronischen Schilddrüsenentzündung (Hachimotos-Krankheit) ein. Die Antikörper-Proteinmoleküle weisen freie Bindestellen auf, die komplementär zu denen des Antigenmoleküls angeordnet sind, so daß sich Antigen und Antikörper unter Bildung eines immunologisch komplexierten Proteins verbinden können.

Die meisten Antigene sind Proteine oder enthalten als wesentlichen Bestandteil Proteine, während alle Antikörper Proteine sind. Proteine sind große Moleküle hohen Molekulargewichtes, d. h. sie sind Polymere, die aus Ketten einer variablen Zahl von Aminosäuren bestehen. In der oben genannten DE-OS ist offenbart, daß ein beliebiges Protein an einem Substrat nur in einer monomolekularen Schicht haften wird und daß an der Proteinschicht kein anderes beliebiges Protein haften wird. Es wird sich jedoch das hinsichtlich des ersten an jedem Substrat adsorbierten Proteins spezifisch reagierende Protein mit diesem immunologisch verbinden. Gemäß den Lehren der genannten DE-OS wurde dies zur Schaffung einer medizinisch diagnostischen Vorrichtung genutzt, bei der ein besonders zubereiteter Objektträger eine daran adsorbierte monomolekulare Proteinschicht trug und dieser dazu verwendet wurde, Lösungen auf die Anwesenheit des darin vermuteten spezifisch mit dem adsorbierten Protein reagierenden Proteins zu untersuchen. Ist das spezifisch reagierende Protein in der Lösung vorhanden, dann weist der Objektträger, nachdem man ihn der Lösung ausgesetzt hat, eine bimolekulare Proteinschicht auf. Ist das spezifisch reagierende Protein dagegen in der Lösung nicht vorhanden, dann weist der Objektträger auch nachdem man ihn der Lösung ausgesetzt hat, nur die ursprüngliche monomolekulare Proteinschicht auf. In der obigen DE-OS sind auch optische elektrische und chemische Mittel zum Unterscheiden der monoreolekularen und bimolekularen Schichten aus biologischen Teilchen beschrieben, und diese Mittel weisen unterschiedliche Empfindlichkeit und Wirtschaftlichkeit auf. Die Untersuchung des proteinbeschichteten Objektträgers mit dem bloßen Auge wäre die bevorzugte Art der Bestimmung der Zahl der Schichten aus biologischen Teilchen auf dem Objektträger, da dies sehr einfach ist und diese Art der Untersuchung ist daher in der vorgenannten DE-OS offenbart.

Der Nachweis von Antikörpern in einem biologischen System ist von medizinisch diagnostischen Wert bei der Bestimmung der Antigene, denen das System ausgesetzt war. Ein Beispiel des diagnostischen Nachweises von Antikörpern ist der Nachweis der Antikörper der Syphilis oder der Gonorrhöe in menschlichem Serum. Umgekehrt ist auch der Nachweis gewisser Antigene in einem biologischen System von medizinisch diagnostischen Wert. Beispiele für den diagnostischen Nachweis von Antigenen sind der Nachweis von HCG-Proteinmolekülen im Urin als Test für die Schwangerschaft und der Nachweis der mit der Hepatitis verbundenen Antigen (HAA)-Moleküle im Blut in Aussicht genommener Blutspender.
Um solche diagnostischen Untersuchungen durchzuführen, muß man erst das geeignete Protein für das immunologisch miteinander reagierende Proteinpaar gewinnen. Derzeit muß die Quelle für ein Antikörperprotein ein lebendes biologisches System sein, im besonderen sind Wirbeltiere dafür bekannt, daß sie die Einführung eines Fremdproteins mit immunologischen Reaktionen beantworten. So werden z. B. viele Antikörper im Blutserum von Tieren und Menschen gefunden, die man den entsprechenden Antigener. ausgesetzt hatte. Auch Nicht-Wirbeltiere zeigen immunologisehe Reaktionen, wenn sie auch wahrscheinlich kein spezifisches Gedächtnis haben. Sogar einige Pflanzenproteine verbinden sich mit Antigenen und die dabei gebildeten sogenannten Lectine, können von beträchtlichem Nutzen in diagnostischen Reaktionen sein. Einige Antigene können kontrollierbar in Laboratoriumskulturen hergestellt werden. Die meisten Antigene jedoch, wie z. B. die mit der Hepatitis verbundenen Antigene, sind derzeit, wie Antikörper, nur aus lebenden biologischen Systemen erhältlich und daher gewinnt man viele

so Antigene aus natürlichen Quellen, wie menschlichen oder tierischen Geweben.

Es ist in der Immunologie bekannt, daß Antikörpermoleküle als Antigene wirken, wenn man sie in das System eines Wirbeltieres einführt, für das sie Fremdproteine sind. In einem solchen Wirbeltiersystem können demgemäß spezifisch reagierende Antikörper zu einem gegebenen Antikörper gebildet werden.

Obwohl in der vorliegenden Anmeldung die biologischen Teilchen, die miteinander immunologisch reagieren, besondere Berücksichtigung gefunden haben, ist die Erfindung auch für andere Arten biologischer Wechselwirkungen zwischen großen Molekülen geeignet, die auch nicht-immunologischen Spezifikationen beruhen, wie z. B. die Bindung von Enzymen an ihre biologischen Substrate oder von Hämoglobin an Haploglobin.

Obwohl die in der obengenannten DE-OS beschriebenen Substrate (Objektträger) in ihrer Leistungsfähigkeit zufriedenstellend sind ηιίίςςρη cip im ^Wnoma.^^^

besonders zubereitet werden, d. h. ein aus Glas oder Kunststoff gebildeter Objektträger wird mit einem Metall beschichtet, um den Kontrast zwischen einer monomolekularen und einer bimolekularen Schicht zu verstärken und dies führt zu zusätzlichen Kosten und einer Komplexizität des mit dieser medizinischen diagnostischen Vorrichtung ausgeführten Verfahrens.

Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrun- ' de, das eingangs genannte Verfahren dahingehend zu verbessern, daß es auch ohne eine Metalischicht auf dem Substrat den Nachweis mit dem bloßen Auge gestattet.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch folgende Merkmale:

15

Aufbringen einer porösen lichtundurchlässigen Schicht aus inerten Teilchen, die nicht mit dem Substrat, der ersten Beschichtung des Substrats, der Flüssigkeitsprobe und der nachfolgend anzuwendenden Lösung reagieren, auf die so behandelte Oberfläche,

2. Inberührungbringen der gemäß den vorhergehenden Stufen behandelten Oberfläche mit einer Lösung, die in der Lage ist, selektiv die Bindung zu spalten, die der Antikörper bzw. das Antigen der ersten Beschichtung des Substrats mit dem in der Flüssigkeitsprobe eventuell vorhandenen Antigen bzw. Antikörper eingegangen ist und

3. Untersuchen der porösen lichtundurchlässigen Schicht zur Bestimmung, ob diese Schicht unversehrt ist, oder ob ein Teil davon entfernt wurde, wobei der letztere Fall die Anwesenheit des Antigens oder Antikörpers in der Flüssigkeitsprobe anzeigt.

Vorteilhafte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens finden sich in den Unteransprüchen.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Spaltung der Bindung zwischen einem Antigen/Antikörper-Paar mit dem bloßen Auge deutlich sichtbar aufgrund des guten Kontrastes zwischen der lichtundurchlässigen Schicht und dem Teil, von dem sie aufgrund der Spaltung entfernt wurde, wodurch die Anwesenheit des ausgewählten Antigens oder Antikörpers in der Flüssigkeitsprobe angezeigt wird. Die Abwesenheit des ausgewählten Antigens oder Antikörpers in der Fiüssigkeitsprobe führt dazu, daß die lichtundurchlässige Schicht vollständig bleibt.

Nachfolgend wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnung näher erläutert Im einzelnen zeigt

Fig. Ia eine Draufsicht auf ein Substrat, wie es in dem erfindungsgemäßen Verfahren Anwendung findet.

F i g. ■ b eine Seitenansicht im Schnitt durch das Zentrum des in F i g. I a abgebildeten Substrates,

F i g. 2a eine Draufsicht auf das Substrat, nachdem die ganze obere Oberfläche mit einer Schicht aus Antikörper oder Antigen versehen worden ist,

F i g. 2b eine Seitenansicht im Schnitt durch das Zentrum des Substrates und der aufgebrachten Schicht die in F i g. 2a abgebildet sind,

F i g. 3a eine Draufsicht auf das mit der Schicht aus Antikörper oder Antigen bedeckte Substrat, nachdem es einer Flüssigkeitsprobe ausgesetzt worden ist, die nachzuweisendes Antigen bzw. Antikörper enthielt, das spezifisch zu dem aufgebrachten Antikörper bzw. Antigen war, wodurch sich eine zweite Schicht auf der ganzen oberen Oberfläc he des Substrates gebildet hat,

F i g. 3b eine Seitenansicht im Schnitt durch das Zeniiiiit) des Substrates und die beiden Schichten, die in F i g. 3a abgebildet sind,

F i g. 4a eine Draufsicht auf das beschichtete Substrat der Fig. 3a, nachdem eine poröse, lichtundurchlässige dritte Schicht auf der äußeren Oberfläche der zweiten Schicht gebildet worden ist,

F i g. 4b eine Seitenansicht im Schnitt durch das Zentrum des mit den drei Schichten bedeckten Substrates, wie es in F i g. 4a gebildet ist,

F i g. 5a eine Draufsicht auf das in F i g. 4a abgebildete beschichtete Substrat, nachdem ein Teil des beschichteten Substrates einer Lösung einer schwachen Säure ausgesetzt worden ist, welche gemäß einer ersten Ausrührungsform der vorliegenden Erfindung die Bindung /wischen Antikörper und Antigen spaltet,

F i g. 5b eine Seitenansicht im Schnitt durch das Zentrum der in F i g. 5a abgebildeten Vorrichtung.

F i g. 6a eine Draufsicht auf das mit der porösen, lichtundurchlässigen Schicht bedeckte Substrat bei Abwesenheit der Schicht aus nachzuweisendem Antigen bzw. Antikörper, nachdem das Substrat der Lösung einer schwachen Säure ausgesetzt worden ist,

F i g. 6b eine Seitenansicht im Schnitt durch das Zentrum der in F i g. 6a abgebildeten Vorrichtung,

F i g. 7u eine Draufsicht auf das Substrat gemäß einer zweiten und bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, bei dem die zuerst aufgebrachte Schicht aus Antikörper oder Antigen nur an einem Teil der Substratoberfläche adsorbiert ist,

F i g. 7b eine Seitenansicht im Schnitt durch das Zentrum der in F i g. 7a abgebildeten Vorrichtung.

Fig. 8a eine Draufsicht auf das mit der Schicht bedeckte Substrat der Fig. 7a, nachdem dieses der Flüssigkeitsprobe mit dem nachzuweisenden Antigen bzw. Antikörper ausgesetzt worden ist, um die zweite Schicht zu bilden,

F i g. 8b eine Seitenansicht im Schnitt durch das Zentrum der in F i g. 8a abgebildeten Vorrichtung,

F i g. 9a eine Draufsicht auf das beschichtete Substrat der Fig. 8a, nachdem die poröse lichtundurchlässige dritte Schicht auf der gesamten Oberfläche des Substrates gebildet worden ist,

I-" i g. 9b eine Seitenansicht im Schnitt durch das Zentrum der in F i g. 9 abgebildeten Vorrichtung,

Fig. IOa eine Draufsicht auf das beschichtete Substrat der F i g. 9a, nachdem dieses gemäß der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung der Lösung einer schwachen Säure ausgesetzt worden ist.

Fig. I Ob eine Seitenansicht im Schnitt durch das Zentrum der in F i g. 10a abgebildeten Vorrichtung,

Fig. 11a eine Draufsicht auf das beschichtete Substrat der Fig. 10a bei Abwesenheit der zweiten Schicht aus nachzuweisendem Antigen bzw. Antikörper und nachdem das Substrat der Lösung einer schwachen Säure ausgesetzt worden ist

F i g. 11 b eine Seitenansicht im Schnitt durch das Zentrum der in F i g. 11 a abgebildeten Vorrichtung,

F i g. 12a eine Draufsicht auf das Substrat nachdem es der Flüssigkeitsprobe mit nachzuweisendem Antigen bzw. Antikörper ausgesetzt worden ist um gemäß einer dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die zweite Schicht zu bilden.

F i g. 12b eine Seitenansicht im Schnitt durch das Zentrum der in Fig. 12aabgebildeten Vorrichtung,

Fig. 13a eine Draufsicht auf das beschichtete Substrat der F i g. 12a, nachdem die poröse lichtundurchlässige dritte Schicht gebildet worden ist

Fig. 13b eine Seitenansicht im Schnitt durch das /.cn · trum der in F i g. 13;i abgebildeten Vorrichtung.

Fig. 14a eine Draufsicht auf das beschichtete Substrat der Fig. 13a, nachdem man es der Lösung einer schwachen Säure ausgesetzt hatte, und

F i g. 14b eine Seitenansicht im Schnitt durch das Zentrum der in F i g. 14a abgebildeten Vorrichtung.

In den Fig. la und Ib sind eine Drauf- bzw. eine Seitenansicht eines typischen Substrates 10 gezeigt, das bei dem erfindungsgemäßenVerfahren benutzt werden kann. Ein Hauptvorleil der vorliegenden Erfindung ist es, daß das Substrat 10 aus irgendeinem festen Material hergestellt sein kann, das für praktische Zwecke mit dem Antigen bzw. Antikörper, das zuerst auf das Substrat aufgebracht wird, und einer porösen lichtundurchlässigen dritten Schicht, die noch näher beschrieben wird, nicht reagiert. Die Oberfläche des Substrates 10 muß undurchdringlich sein, und darf für die benutzten Lösungen und das lichlundurchlässige Material kein Absorptionsmaterial sein, muß jedoch die Adsorption einer ersten Schicht aus Antikörper oder Antigen darauf gestatten. Das Substrat 10 kann also aus irgendeinem geeigneten Material hergestellt sein, wie Glas, Kunststoff oder einem Metall, wobei Glas und Kunststoff wirtschaftliche Vorteile haben. Die Gestalt und die Dicke des Substrates 10 sind also ohne Bedeutung und auch in der vorliegenden Anmeldung der Einfachheil halber die Betonung auf immunologisch reaktiven biologischen Teilchen liegt, so ist die vorliegende Erfindung jedoch gleichermaßen brauchbar für biologische Teilchen, die in andere Arten biologischer Wechselwirkung treten als der immunologischen Reaktion, wobei das einzige Kriterium ist, daß die Teilchen eine spezifische Bindung miteinander eingehen. Das Haften des zuerst aufgebrachten Antikörpers oder Antigens kann durch

in Aufbringen eines oder mehrerer Tropfen einer ersten Lösung dieser Teilchen auf die obere Oberfläche des Substrates unter Verwendung eines geeigneten Tropfers oder anderer Mittel bewerkstelligt werden. Das Substrat 10 kann aber auch kurzzeitig in die Lösung der genannten Teilchen eingetaucht werden. Antikörper bzw. Antigen werden auf der Grundlage ausgewählt, daß sie spezifisch zu besonderen Äntigenen bzw. Antikörpern sind, welche die zweite Schicht auf der Substratoberfläche bilden werden, wenn sie in einer Flüssigkeitsprobe vorhanden sind, die getestet werden soll. Die zuerst aufgebrachten Teilchen können in Laboratoriumskulturen hergestellt werden, oder man kann sie aus höheren lebenden biologischen Systemen, wie oben beschrieben, erhallen und sie sind im allgemeinen im

der Zweckmäßigkeit halber kann ein quadratisches Sub- 25 Handel in einer relativ hochgereinigten Form erhältlich strat mit einer Dicke in der Größenordnung von einem und wenn sie nicht gereinigt erhältlich sind, können sie '/₄ mm benutzt werden. Obwohl es bevorzugt ist, daß
die obere Oberfläche des Substrates im wesentlichen

flach ist, ist dies nicht unbedingt erforderlich und diese chemisch gereinigt werden. Die Lösung der zuerst aufzubringenden biologischen Teilchen kann eine Salzlösung in Wasser oder einer anderen Flüssigkeit sein, die

Oberfläche kann daher auch etwas nicht-planar sein. 30 geeignet ist für die ersten biologischen Teilchen und das

Das Substrat 10 kann als typisches Beispiel in der Form Substratmaterial und mit beiden nicht reagiert. Eine

eines Glasobjektträgers vorliegen, wie einem üblichen Mikroskop-Deckglas von 25 mm² Fläche und einem V₄ mm Dicke, wobei der Glasobjektträger wegen seiner ausführlichere Beschreibung der Herstellung der ersten (und zweiten) monomolekularen Schichten aus den biologischen Teilchen ist in den oben genannten DE-OS

geringen Kosten und ieichten Erhältlichkeit im Handel 35 enthalten, auf die hiermit Bezug genommen wird. Die

eine geeignete Ausführungsform ist. Die Größe des Substrates 10 wird in erster Linie durch die besondere medizinisch diagnostische Anwendung bestimmt, für die das Substrat verwendet werden soll. Im Falle nur eines für die Bildung der ersten Schicht 11 auf dem Substrat 10 erforderliche Zeit, im allgemeinen bis zu einer Stunde, ist umgekehrt proportional der Konzentration der ersten biologischen Teilchen in der ersten Lösung. Die

ben Platz findet. Die einzigen Erfordernisse, welche das Substrat 10 erfüllen muß, sind, daß es eine feste Oberfläche für die in dem jeweiligen diagnostischen Test benutzten Antigene und Antikörper aufweist, wobei die

einzigen Testes ist daher das Substrat 10 kleiner, näm- 4C erste Schicht 11 bedeckt in der ersten Ausführungsform lieh in der Größenordnung der oben genannten 25 mm², der vorliegenden Erfindung, wie sie in den F i g. 2a und während für die Verwendung für eine Vielzahl von Pro- 2b abgebildet ist, im wesentlichen die gesamte obere ben, die gleichzeitig oder nacheinander analysiert wer- Oberfläche des Substrates 10. Das Substrat 10 wird daden sollen, die Größe des Substrates 10 ausreichend her so klein gehalten, wie dies praktisch möglich ist, um groß sein muß, damit die Vielzahl der zu testenden Pro- 45 die Menge des für das Verfahren erforderlichen biologischen Materials möglichst gering zu halten. Es wird empfohlen, die mit der ersten Schicht bedeckte Oberfläche des Substrates 10 mit Leitungs- oder destilliertem Wasser zu spülen, um überschüssige erste biologische

feste Oberfläche relativ frei sein muß von Fehlern, so 50 Teilchen und möglicherweise andere in der ersten Lödaß sie ausreichend glatt ist, obwohl sie nicht vollkom- sung vorhandene Teilchen zu entfernen, die sich auf der men planar sein muß, und schließlich darf das Substrat ersten Schicht angesammelt haben könnten. Soll das nicht mit den Antigenen und Antikörpern oder dem beschichtete Substrat danach vertrieben oder gelagert Material der porösen lichtundurchlässigen Schicht rea- werden, dann wird es getrocknet, vorzugsweise, indem gieren. Eine spezielle Herstellung der Substratoberflä- 55 man Luft bei Zimmertemperatur über das Substrat ehe ist nicht erforderlich, d. h. daß ein Objektträger für bläst, um das Trocknen zu beschleunigen. Soll das Subein Mikroskop als Substrat verwendet werden kann, strat sofort benutzt werden, besteht keine Notwendignachdem man ihn gereinigt hat. keit für ein Trocknen nach dem Spülen. Die erste

Wird für das Substrat ein separates Säuberungsver- Schicht 11 ist im allgemeinen für das bloße Auge nicht fahren benutzt, dann muß es gründlich gespült werden, 60 sichtbar, da die Dicke einer solchen monomolekularen um sicherzustellen, daß unerwünschte Ablagerungen Schicht im Bereiche von 2 bis 10 nm liegt, je nach der

Größe der diese Schicht bildenden besonderen biologischen Teilchen.

Das mit der ersten Schicht bedeckte Substrat wird dann der Flüssigkeitsprobe ausgesetzt, in der man die nachzuweisenden biologischen Teilchen vermutet, die spezifisch zu den ersten biologischen Teilchen sind, um in einem direkten Test solche zweiten biologischen Teil-

des Reinigungsmittels, welche die Adsorption der ersten Schicht biologischer Teilchen auf dem Substrat verhindern oder beeinträchtigen können, nicht an der Substratoberfläche haften bleiben.

Nach Auswahl des Substrates 10 läßt man eine erste Schicht 11 aus Antikörper oder Antigen an der oberen festen Oberfläche des Substrates 10 adsorbieren. Wenn

chen zu ermitteln. Dies erfolgt im allgemeinen durch Eintauchen des mit der ersten Schicht bedeckten Substrates in die Flüssigkeitsprobe für eine Zeit, die wiederum umgekehrt proportional zu der Konzentration der zweiten biologischen Teilchen in der Flüssigkeitsprobe ist. Da die Konzentration der nachzuweisenden Teilchen in der Flüssigkeitsprobe im allgemeinen sehr viel geringer ist, als die Konzentration der ersten Teilchen in der ersten Lösung, erfordert das Eintauchen im allgemeinen sehr viel mehr Zeit, als für die Bildung der Schicht 11 aus den ersten biologischen Teilchen erforderlich war und das zweite Eintauchen kann bis zu 24 Stunden dauern. Bei Anwesenheit der zweiten biologischen Teilchen in der Flüssigkeitsprobe bildet sich eine zweite im wesentlichen vollständige Schicht 12 auf dem Substrat als Ergebnis der immunologischen Reaktion der zweiten biologischen Teilchen mit den ersten biologischen Teilchen und das Ergebnis dieser Verbindung ist in den F i g. 3a und 3b abgebildet. Nachdem das Substrat ausreichend der Flüssigkeitsprobe ausgesetzt worden ist, wird das beschichtete Substrat daraus entfernt und mit einer geeigneten Lösung gespült, die in vielen Fällen Leitungswasser, destilliertes Wasser oder eine Salzlösung davon sein kann, je nachdem in welcher Lösung die zweiten biologischen Teilchen enthalten waren. Dieses Spülen wird auch hier wiederum dazu durchgeführt, ein überschüssiges Ansammeln der zweiten biologischen Teilchen auf dem Substrat zu vermeiden und eine nichtspezifische Adsorption möglichst gering zu halten, da die Flüssigkeitsprobe häufig eine große Zahl anderer biologischer Teilchen enthält, wie z. B. einer Probe menschlichen Serums. Das beschichtete Substrat wird dann wie oben beschrieben getrocknet, wenn die folgende Stufe die der Bildung einer lichtundurchlässigen porösen nicht-reaktiven Schicht auf dem Substrat ein Besprühen erfordert, andernfalls ist das Trocknen nicht notwendig. Sind in der Flüssigkeitsprobe keine zweiten biologischen Teilchen vorhanden, dann bildet sich auch keine zweite monomolekulare Schicht auf dem Substrat.

Als nächstes wird eine Schicht 13 aus dritten Teilchen auf der gesamten beschichteten Oberfläche des Substrates als dritte und äußerste Schicht gebildet, wie in den F i g. 4a und 4b abgebildet, wobei diese dritten Teilchen nicht reagieren mit dem Substrat 10 und den die monomolekularen Schichten U und 12 bildenden biologisehen Teilchen. Enthielt die Flüssigkeitsprobe keine zweiten biologischen Teilchen, dann bildet die Schicht 13 die zweite Schicht auf dem Substrat 10, wie in den F i g. 6a und 6b abgebildet Die nicht-reaktive Schicht 13 muß ausreichend porös sein, so daß beim nachfolgenden Aussetzen des beschichteten Substrates gegenüber einer Spaltmittellösung das Spaltmitte!, wie nachfolgend näher beschrieben vird, durch die Schicht 13 hindurchsickern kann. Da das beschichtete Substrat der Spaltmittellösung ausgesetzt wird, darf das Material der Schicht 13 auch nicht mit dem Spaltmittel reagieren. Und schließlich muß die poröse nicht-reaktive Schicht 13 lichtundurchlässig sein, so daß sie mit dem bloßen Auge erkennbar ist, während die Schichten 11 und 12 normalerweise nicht sichtbar sind. Die Lichtundurchlässigkeit wird erhalten, indem man die Schicht 13 wesentlich dicker sein läßt, als die monomolekularen Schichten 11 und 12 und die Lichtundurchlässigkeit wird auch durch die Art des für die Bildung dieser Schicht verwendeten Materials bedingt Die lichtundurchlässige Schicht 13 kann praktisch aus jedem Material gebildet werden, das in Form diskreter kleiner Teilchen existiert oder das eine poröse zusammenhängende Schicht bildet und das an der Schicht biologischer Teilchen und im Falle der /weiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung an der Oberfläche des Substrates 10 hiiftet. und das die vorgenannten Eigenschaften aulweist, mit den ersten und zweiten biologischen Teilchen, dem Substrat und der Spaltmittellösung nicht zu reagieren. Die Schicht 13 kann aus Metallteilchcn, wie Nickel oder Gold gebildet werden, und in einem solchen Falle wird die Schicht 13 durch Eintauchen des beschichteten Substrates in eine gerührte dritte Lösung gebildet, die eine relativ hohe Konzentration solcher nicht-reaktiver Teilchen enthält, um eine Schicht aus den Teilchen zu bilden, die miteinander in Berührung stehen oder in geringem Abstand zueinander angeordnet sind. Es können zur Herstellung der Schicht 13 auch Glas- oder Kunststoffteilchen in einer geeignet gerührten Lösung verwendet werden. Die Lösung, in der Metall-, Glas- oder Kunststoffteilchen vorhanden sind, kann einfach Wasser sein. Für den Fall, daß das beschichtete Substrat in eine Lösung der kleinen Teilchen eingetaucht wird, besteht keine Notwendigkeit, das beschichtete Substrat zu trocknen, nachdem das mit der Schicht 12 überzogene Substrat gespült worden ist, da die die Teilchen enthaltende Lösung das Substrat ohnehin befeuchten wird. Die Größe der im allgemeinen kugelförmigen Teilchen, seien sie aus Metall, Glas oder Kunststoff, kann in einem weiten Bereich liegen, wie Durchmessern von 0,1 bis 100 μιτι^α die Funktion der Schicht 13 lediglich die ist, für die danach zu benutzende Spaltmittellösung eine poröse Schicht zu bilden sowie lichtundurchlässig zu sein, so daß die Schicht 13 für das bloße Auge sichtbar ist, wenn man sie im reflektierten Licht betrachtet oder im durchgehenden Licht, wenn das Substrat lichtdurchlässig ist

Die lichtundurchlässige Schicht kann auch als dünner Metallfilm gebildet werden, der anstelle der Verwendung der Metallteilchen in Lösung, wie oben beschrieben auf das mit den biologischen Teilchen bedeckte Substrat durch Elektroplattieren oder Bedampfen aufgebracht ist Ein Vorteil dieser An Schicht ist es, daß der Metallfilm, der aus Silber bestehen kann, beträchtlich dünner sein kann, als die in Lösung benutzten Teilchen, wobei ein wenige Zehntel nm dicker Film deutlich erkennbar ist.

Ein anderes Verfahren zum Herstellen der Schicht 13 auf dem Substrat besteht in der Verwendung eines üblichen Aerosolsprays wobei das Sprühgerät mit praktisch jedem Material gefüllt werden kann, das mit dem Substrat, den biologischen Teilchen und dem Spaltmittel nicht reagiert porös äst und eine lichtundurchlässige Schicht bildet. Das beschichtete Substrat sollte vor dem Besprühen trocken sein, um ein wirksameres Haften der Schicht 13 an der Schicht 12 (oder 1!) zu gestatten. Das Aerosol ist eine Suspension feiner fester oder flüssiger Teilchen in einem Gas, so daß die Schicht 13 aus Festoder Flüssigkeits-Teilchen zusammengesetzt sein kann. Als typisches Beispiel kann ein leichtes Besprühen der getrockneten beschichteten Oberfläche des Substrates mit MS-122 FLUOROCARBON erfolgen, das ein handelsübliches Entformungsmittel auf Basis eines Trokkenschmiermittels ist und das aus einer Aerosolzubereitung eines niedermolekularen synthetischen polymeren Harzwachses besteht und an der äußeren Oberfläche der Schicht aus biologischen Teilchen haftet und ein weißes Aussehen aufweist Als anderes Beispiel aus der großen Zahl sprühbarer Materialien, die zur Herstellung der Schicht 13 verwendet werden können, hat sich eine dünne Schicht aus SURE, einem handelsüblichen desodorierenden Mittel, als brauchbar erwiesen. Es ist

also praktisch jedes sprühbare Material, das an der äußeren Schicht aus biologischen Teilchen haftet, und mit diesen biologischen Teilchen und dem nachfolgend angewendeten Spaltmittel nicht reagiert, porös und lichtundurchlässig für die Zwecke der Bildung der Schicht 13 geeignet. Die aufgesprühte Schicht 13 ist beträchtlich dicker als die Schichten 11 und 12 und ihre Dicke liegt typischerweise im Bereich von 1 bis ΙΟμπι, doch kann sie insgesamt in einem Bereich von 0,1 bis ΙΟΟμίη, liegen. Die Bereiche für die Größen der diskreten Teilchen oder die Dicken der aufgesprühten Schicht können wegen der unterschiedlichen Porosität und Lichtundurchlässigkeit für die verschiedenen Materialien unterschiedlich sein.

Nachdem die nicht-reaktive, poröse lichtundurchlässige Schicht auf im wesentlichen der gesamten äußeren beschichteten Oberfläche des Substrates 10 gebildet worden ist, wird ein Teil der mit der Schicht 13 bedeckten Oberfläche des Substrates 10 einer Spaltmittellösung ausgesetzt, wie einer Lösung einer schwachen Säure, einer alkalischen Lösung oder einer Lösung hoher Salzkonzentration, wobei in der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein oder mehrere Tropfen der Spaltmittellösung im allgemeinen auf den zentralen Bereich der beschichteten Substratoberfläche aufgebracht werden. Da die lichtundurchlässige Schicht 13 mit dem Spaltmittel nicht reagiert, diesem gegenüber aber porös ist, sickert die Spaltmittellösung durch die Schicht 13 in dem Bereich, in dem sie aufgebracht wurde, und das Spaltmittel spaltet bei Anwesenheit der Schicht 12 aus den zweiten biologischen Teilchen die Bindung zwischen Antikörper und Antigen in diesem Bereich, so daß ein entsprechender Teil der Schicht 12 zusammen mit dem entsprechenden Teil der daran haftenden Schicht 13 entfernt wird, wie in den F i g. 5a und 5b abgebildet, und nur die Schicht 11 aus dem zuerst aufgebrachten Antikörper bzw. Antigen auf dem Substrat 10 in dem Bereich verbleibt, in dem die Spaltmittellösung aufgebracht worden ist. Da die Schicht 13 lichtundurchlässig ist und daher mit dem bloßen Auge klar sichtbar, gibt es einen deutlichen Kontrast bei Betrachtung im reflektierten oder (falls das Substrat lichtdurchlässig ist) durchgehenden Lichtes zwischen den Teilen des beschichteten Substrates, in denen die Schicht 13 verblieben ist und dem zentralen Bereich, in dem die Schicht 13 aufgrund der Spaltung der Bindung zwischen Antikörper und Antigen entfernt worden ist. Dieser klar erkennbare Kontrast zwischen den genannten Teilen des beschichteten Substrates zeigt daher die Anwesenheit der nachzuweisenden Teilchen in der Flüssigkeitsprobe in der man sie vermutet hatte und dieser Kontrast zeigt auch die immunologische Reaktion zwischen Antigen und Antikörper. Hatte die Flüssigkeitsprobe die nachzuweisenden Antigene oder Antikörper nicht enthalten, dann bewirkt die Anwendung der Spaltmittellösung im Bereich 14, wie in F i g. 6a gezeigt, keine Veränderung an der beschichteten Oberfläche des Substrates, weil es keine zu spaltende Bindung zwischen Antikörper und Antigen gibt und die lichtundurchlässige Schicht 13 daher vollständig bleibt. Ist das Spaltmittel eine Säurelösung, dann wird im allgemeinen eine schwache Säure verwendet, d. h. eine die stark genug ist, die Bindung zwischen den Schichten aus Antikörper und Antigen zu spalten, aber wiederum nicht so stark, um die Bindung zwischen der ersten Schicht 11 aus Antikörper bzw. Antigen und der festen Oberfläche des Substrates, an dem sie adsorbiert ist, zu spalten oder in anderer Weise zu beeinflussen.

Für die oben beschriebenen Zwecke ist eine 0,1 normale Zitronensäurelösung geeignet. Der Konzentrationsbereich der Zitronensäure, um die gewünschten Ergebnisse zu erhalten, liegt zwischen 0,1 und 1,0 normal. Andere geeignete schwache Säuren, die für diesen Zweck eingesetzt werden können, sind 0,1 normale Maleinsäure und 0,1 normale Ameisensäure. Es können auch stärkere Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure und Schwefelsäure benutzt werden, dann jedoch in sehr viel geringerer

ίο Konzentralion, z. B. etwa 0,01 normal. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung benutzbare Lösung einer schwachen Säure kann allgemein so beschrieben werden, daß sie jede Säurelösung ist, welche das Substrat oder die dritte Schicht nicht angreift, einen pH-Wert im Bereich von 2—5 hat, obwohl auch ein pH-Wert von 1,0 sich als geeignet erwiesen hat, bei Verwendung von 0,1 normaler Chlorwasserstoffsäure. Es können auch alkalische Lösungen und Lösungen mit höherer Salzkonzentration als Spaltmittel verwendet werden. Die für diesen Zweck verwendbare alkalische Lösung hat einen pH im Bereich von 9—13 und im speziellen Fall ist eine 0,2 normale Natriumhydroxid-Lösung zur Spaltung der Bindung zwischen Eialbumin und seinem Antigen benutzt worden. Verschiedene Salzlösungen, wie NaCI und NaJ sind als Spaltmittel bekannt. So spaltet eine 1,71 molare NaCl-Lösung pneumoccales Polysaccharid und seinen Antikörper. Der Vergleich zwischen den F i g. 5a und 6a ebenso wie zwischen den F i g. 5b und 6b zeigt die Fälle, in denen die nachzuweisenden Teilchen in der Flüssigkeitsprobe vorhanden bzw. nicht vorhanden waren.

Die Endstufe des Verfahrens, d. h. die Stufe der Untersuchung des mit der lichtundurchlässigen Schicht bedeckten Substrates, nachdem man es dem Spaltmittel ausgesetzt hat, ist nicht auf eine visuelle Beobachtung mit dem bloßen Auge beschränkt. Bei einer kommerziellen Anwendung der vorliegenden Erfindung, insbesondere für Testuntersuchungen im großen Umfange, können auch optische Instrumente verwendet werden, wobei ein Densitometer bzw. Schwärzungsmesser ein typisches Instrument zur Messung der durch das beschichtete (transparente) Substrat hindurchgehenden Lichtmenge wäre.

Eine zweite und bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist in den F i g. 7a bis 11 b veranschaulicht und soll im folgenden beschrieben werden. Der Hauptunterschied zwischen der eben beschriebenen Ausführungsform und dieser zweiten Ausführungsform ebenso wie der dritten Ausführungsform, die unter bezug auf die Fig. 12a bis 14b beschrieben werden wird, ist der, daß in der zweiten und dritten Ausführungsform das ganze beschichtete Substrat der Spaltmittellösung ausgesetzt wird und daß nicht nur ein geringer Bereich davon mit dem Spaltmittel in Berührung gebracht wird.

Bei der zweiten Ausführungsform wird, soweit in den F i g. 7a und 7b veranschaulicht nach der Auswahl des Substrates 10 ein einzelner (oder mehrere) Tropfen der ersten Lösung, welche die ersten biologischen Teilchen Antikörper oder Antigen enthält, auf die obere Hauptoberfläche des Substrates 10 aufgebracht und dies führt zur Bildung einer Schicht 11 mit dem Muster des aufgebrachten Tropfens durch Adsorption der Teilchen an der Oberfläche des Substrates. Der Tropfen aus der ersten Teilchenlösung wird vorzugsweise der Bequemlichkeit halber etwa in der Mitte des Substrates aufgebracht Da in Abhängigkeit von der Feuchtigkeit im Raum nur ein einzelner Trnnfen rW prewn ι «eimer Ko.

13 14

nutzt werden muß, kann das Substrat in einer Feuchtig- deutlicher Kontrast gegenüber dem Bereich 11 sichtbar keitskammer gelagert werden, um eine zu rasche Ver- ist, in dem der Teil der lichtundurchlässigen Schicht 13 dampfung des Lösungsmittels zu vermeiden, das die er- zusammen mit der gesamten Schicht 12 aus zweiten sten biologischen Teilchen enthält, obwohl diese Lage- biologischen Teilchen (im Falle der zweiten Ausführung in einer Feuchtigkeitskammer nicht immer erfor- 5 rungsform) durch die Spaltmittellösung entfernt worden derlich ist Ein Vorteil dieser zweiten Ausführungsform ist. Wie im Falle der F i g. 6a und 6b der ersten Ausfühder vorliegenden Erfindung ist es, daß ein geringerer rungsform weist das beschichtete Substrat nach der Bereich der monomolekularen Schicht 11, verglichen zu Herausnahme aus der Spaltmittellösung eine vollständider das ganze Substrat bedeckenden Schicht bei der ge Schicht 13 aus lichtundurchlässigem Material auf ersten Ausführungsform, zu einer Einsparung an biolo- io dem Substrat 10 auf, wie in den Fi g. 1 la und 11b wiegischem Material führt Nach Adsorbieren der Schicht dergegeben, wenn die Flüssigkeitsprobe die zweiten 11 am Substrat 10, kann, wie im Fall der ersten Ausfüh- (nachzuweisenden) biologischen Teilchen nicht enthalrungsform, die beschichtete Oberfläche des Substrates ten hatte,
gespült werden. In den F i g. 12a bis 14b ist das Aussehen des beschich-

Das mit der monomolekularen Schicht 11 bedeckte 15 teten Substrates in den verschiedenen Stufen einer drit-

Substrat der Fig.7a und 7b wird als nächstes in die ten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar-

Flüssigkeitsprobe eingetaucht, in der man die nachzu- gestellt. Bei dieser dritten Ausführungsform wird das

weisenden Teilchen vermutet, und wenn solche Teilchen Substrat 10 zuerst in eine erste Lösung eingetaucht,

in der Flüssigkeitsprobe vorhanden sind, dann reagieren welche die ersten biologischen Teilchen (Antikörper

diese immunologisch mit den ersten biologischen Teil- 20 oder Antigen) enthält, so daß danach die gesamte obere

chen in der monomolekuiaren Schicht 11 unter Bildung Oberfläche des Substrates 10 eine monomolekulare

einer monomolekularen Schicht 12 aus den zweiten bio- Schicht 11 aus ersten immunologisch reaktiven biologi-

logischen Teilchen, deren Muster die gleiche Gestalt hat sehen Teilchen adsorbiert aufweist, wie dies auch in den

wie die Schicht 11, wie in den F i g. 8a und 8b dargestellt, F i g. 2a und 2b <?or ersten Ausführungsform abgebildet

und außerdem bildet sich eine monomolekulare Schicht 25 ist, und danach wird das beschichtete Substrat gespült.

12a an den verbliebenen i'reien Oberflächen des Sub- Im Unterschied zur ersten Ausführungsform wird dann

strates 10 durch nichtspezifisches Haften anderer in der jedoch nur ein geringer Teil des beschichteten Substra-

Flüssigkeitsprobe enthaltener Teilchen. Die Eintauch- tes der Flüssigkeitsprobe ausgesetzt, von der man an-

zeit für das beschichtete Substrat in die Flüssigkeitspro- nimmt, daß sie die zweiten biologischen Teilchen ent-

be ist, wie bei der ersten Ausführungsform, umgekehrt 30 hält. Dies kann dadurch bewirkt werden, daß man einen

proportional der Konzentration der nachzuweisenden einzelnen oder mehrere Tropfen der Flüssigkeitsprobe

Teilchen in der Flüssigkeitsprobe. Das Muster der etwa in der Mitte des beschichteten Substrates auf-

Schichten 11 und 12 ist, wie dargestellt, im allgemeinen bringt. Da die Flüssigkeitsprobe im allgemeinen eine

ein runder Fleck. Nach Herausnahme des beschichteten verdünnte Lösung der zweiten biologischen Teilchen ist.

Substrates aus der Flüssigkeitsprobe wird dieses vor- 35 kann das beschichtete Substrat, wie im Falle der zweiten

zugsweise nochmals gespült und kann dann getrocknet Ausführungsform, während der Bildung der Schicht aus

werden, je nach Ander Aufbringung der nachfolgenden zweiten biologischen Teilchen, wobei sich die zweiten

lichtundurchlässigen Schicht, wie dies bereits bei der biologischen Teilchen immunologisch sich mit den er-

ersten Ausführungsform beschrieben wurde. sten biologischen Teilchen verbinden, in einer Feuchtig-

AIs nächstes wird auf der beschichteten Oberfläche 40 keitskammer gelagert werden.

des Substrates 10 in der gleichen Weise wie bei der Nachdem sich die kleine im allgemeinen kreisförmige ersten Ausführungsform der Erfindung, die nicht-rcakti- Schicht 12 aus den zweiten biologischen Teilchen auf ve. poröse lichtundurchlässige Schicht 13 gebildet, in- dem Substrat gebildet hat, wird das Substrat aus der dem man das Material dieser Schicht auf die gesamte Feuchtigkeitskammer herausgenommen, gespült und obere Oberfläche des Substrates 10 aufbringt, so daß es 45 kann dann je nach der Art der Aufbringung der nachfolin Berührung gelangt mit den Schichten 12 und 12a aus genden licht-undurchlässigen Schicht 13 getrocknet biologischen Teilchen, wie in den F i g. 9a und 9b veran- werden. Das beschichtete Substrat hat nach Bildung der schaulicht. Nachdem die Schicht 13 auf dem Substrat nicht-reaktiven porösen lichtundurchlässigen Schicht entweder durch Aufsprühen des geeigneten Aerosols 13, das in den Fig. 13a und 13b dargestellte Aussehen,
auf die beschichtete Oberfläche des Substrates oder 50 Nach Bildung der Schicht 13 auf dem Substrat wird durch Eintauchen des beschichteten Substrates in eine das beschichtete Substrat kurzzeitig in die Spaltmittel-Lösung gebildet worden ist, die kleine Teilchen aus dem lösung eingetaucht, so daß bei dem Vorhandensein der besonderen Material enthält, welches die Schicht 13 bil- Schicht 12 aus zweiten biologischen Teilchen auf dem det, wird das gesamte beschichtete Substrat kurzzeitig Substrat, die Bindung zwischen Antikörper und Antigen in die Spaltmittellösung eingetaucht, um die Bindung 55 durch das Spaltmittel aufgespalten wird und die Schicht zwischen Antikörper und Antigen zu spalten, wenn die 12 aus zweiten biologischen Teilchen zusammen mit der zweite Schicht 12 tatsächlich auf dem Substrat vorhan- darüber liegenden Schicht 13 von dem Substrat entfernt den ist. Da die biologischen Teilchen nur in Form eines wird. Das beschichtete Substrat hat dann das in den kleinen Bereiches auf dem Substrat 10 vorhanden sind, Fig. 14a und 14b wiedergegebene Aussehen, worin die hat das beschichtete Substrat nach der Entfernung aus 60 gesamte obere Oberfläche des Substrates mit der lichtder Spaltmittellösung das in den F i g. 10a und lObabge- undurchlässigen Schicht 13 bedeckt ist, mit Ausnahme bildete Aussehen unter der Annahme, daß die Flüssig- des kleinen im allgemeinen kreisförmigen Bereiches, der keitsprobe von der man annahm, daß sie die zweiten etwa in der Mitte der Substratoberfläche angeordnet ist. biologischen Teilchen enthielt, diese tatsächlich enthal- wo nur noch die erste monomolekulare Schicht 11 aus ten hatte. Das beschichtete Substrat erscheint daher für 65 den ersten biologischen Teilchen vorhanden ist. Wie im das bloße Auge in 1 i g. 10a genauso wie in Fig. 5a, da Falle der Ausführungsform der Fi g. 5a, 5b und 10a, 10b die obere Oberfläche des Substrates 10 mit einer licht- ist der Kontrast zwischen dem Teil de Substratoberfläundurchlässigen Schicht 13 bedeckt ist, und dadurch ein ehe, in dem die Bindung aus Antikörper und Antigen

gespalten worden ist und dem restlichen Teil der Substratoberfläche leicht erkennbar. Wenn die Flüssigkeitsprobe die nachzuweisenden biologischen Teilchen nicht enthalten hatte, dann hat das beschichtete Substrat das gleiche Aussehen, wie in den F i g. 6a und 6b abgebildet, d. h. die gesamte obere Oberfläche des Substrates 10 bleibt mit der nicht-veaktiven, porösen, lichtundurchlässigen Schicht 13 bedeckt

Die obigen Beschreibungen der drei Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beziehen sich alle auf einen direkten Nachweis der zweiten biologischen Teilchen als Ergebnis der an der Substratoberfläche stattfindenden immunologischen Reaktion. Das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung der nicht-reaktiven, porösen, lichtundurchlässigen Schicht 13 kann aber auch in einem indirekten oder Inhibitionstest für den Nachweis von Antigen bzw. Antikörper benutzt werden, da es der allgemeine Zweck der vorliegenden Erfindung ist, zwischen einer monomolekularen Schicht aus ersten biologischen Teilchen und einer bimolekularen Schicht aus ersten und zweiten biologischen Teilchen zu unterscheiden.

Das Prinzip des Inhibitionstestes besteht darin, daß Antigenteilchen, wenn sie in ausreichender Menge vorhanden sind, freie Antikörper in einer Lösung neutralisieren werden. Diese Reaktion verhindert es, daß Antikörper beobachtbare Komplexe bilden, z. B. eine bimolekulare Schicht, wenn das Substrat mit einer monomolekularen Antigenschicht darauf der Lösung ausgesetzt ist.

In den obigen drei Ausführungsformen eines direkten Nachweises des Vorhandenseins der zweiten biologischen Teilchen in der Flüssigkeitsprobe sind die ersten biologischen Teilchen, die an der Oberfläche des Substrates 10 haften, im allgemeinen ein besonderes Antigen, während die zweiten nachzuweisenden biologischen Teilchen im allgemeinen der Antikörper sind, der spezifisch ist gegenüber dem besonderen Antigen. Die ersten biologischen Teilchen müssen jedoch nicht das Antigen sein, sondern sie können auch die Antikörperteilchen sein, so daß die zweiten biologischen Teilchen dann die Antigenteilchen wären, gegenüber denen der Antikörper spezifisch ist.

Der Inhibitionstest wird folgendermaßen ausgeführt:

Eine monomolekulare Schicht aus ersten biologischen Teilchen, von denen hier angenommen werden soll, daß sie Antigenteilchen seien, wird, wie bei dem oben beschriebenen direkten Test, an dem Substrat 10 adsorbiert und dies entweder auf der gesamten oberen Oberfläche des Substrates 10 oder nur an einem kleinen, im allgemeinen kreisförmigen Teil davon. Die Flüssigkeitsprobe wird zubereitet, indem man eine zu testende Probe zu einer Lösung des spezifischen Antikörpers in einem Glasfläschchen oder einem anderen geeigneten Behälter hinzugibt. Das Glasfläschchen wird dann für eine ausreichende Zeit gelagert, damit sich der Antikörper mit dem Antigen in der Testprobe komplexieren kann, falls Antigen in der Testprobe vorhanden ist. Vorzugsweise wird das Glasfläschchen bewegt, um die Komplexierungsgeschwindigkeit zu erhöhen. Schließlich wird das mit der monomolekularen Antigenschicht bedeckte Substrat in die Flüssigkeitsprobe eingetaucht und nach einer geeigneten Zeitdauer, die wiederum bis zu 24 Stunden betragen kann, wird das Substrat herausgenommen und kann gespült und getrocknet werden, und dann wird die nicht-reaktive, poröse, lichtundurchlässige Schicht 13 darauf gebildet und danach das beschichtete Substrat der Spaltmittellösung ausgeset/i, wie oben beschrieben. Die Ergebnisse des Inhibitionstests sind dem des direkten Tests entgegengesetzt, d. h. bei Anwesenheit des Antigens in der untersuchten Probe ist kein Kontrast in der lichtundurchlassigen Schicht 13 vorhanden, d. h. es bildet sich dann keine zweite monomolekulare (Antikörper) Schicht auf dem Substrat während die Entfernung eines Teiles der lichtundurchlässigen Schicht des Teiles 13 unter Bildung eines deutlichen Kontrastes, der für das bloße Auge leicht erkennbar ist die Abwesenheit von Antigen in der Testprobe anzeigt In gleicher Weise wird der Inhibitionstest für den Nachweis eines spezifischen Antikörpers ähnlich dem Inhibitionstest für das Antigen ausgeführt wobei jeweils Antigen anstelle von Antikörper eingesetzt wird und Antikörper anstelle von Antigen.

In der vorstehenden Beschreibung der vorliegenden Erfindung ist die Rede gewesen von ersten und zweiten immunologisch reaktiven biologischen Teilchen, wobei das zweite biologische Teilchen spezifisch zu dem ersten ist Diese Bezeichnungen sind absichtlich gewählt und die mit Hilfe der vorliegenden Erfindung verwendbaren und nachweisbaren immunologisch reaktiven biologischen Antigenteilchen schließen Hormone, Viren, Bakterien, Enzyme und andere Teilchen ein, die leicht gezüchtet oder in anderer Weise isoliert und gesammelt werden können oder die in menschlichem Serum oder einer anderen untersuchten Lösung vorhanden sein können. Die vorliegende Erfindung ist brauchbar für jedes Paar biologischer Teilchen, die spezifisch miteinander reagieren. Neben dem immunologisch reaktiven Antigen-Antikörper-Paar schließt die vorliegende Erfindung auch andere Formen spezifischer biologischer Wechselwirkungen zwischen großen Molekülen ein, die auf nicht-immunologischen Besonderheiten beruhen, wie z. B. dem Verbinden von Enzymen mit ihren biologischen Substraten oder von Hämoglobin mit Haptoglobin.

Eine wichtige Anwendung der vorliegenden Erfindung ist der Fall, bei dem die getestete Flüssigkeitsprobe nur eine sehr geringe Konzentration der darin vermuteten biologischen Teilchen aufweist. In einem solchen Falle bleibt das mit einer monomolekularen Schicht bedeckte Substrat in der Flüssigkeitsprobe für eine ausreichende Zeit eingetaucht, so daß die zweiten (in geringer Konzentration vorhandenen) biologischen Teilchen eine monomolekulare Schicht bilden können, die nicht so viele Moleküle erfordert, besonders wenn die zweite Ausführungsform der vorliegenden Erfindung (vgl. besonders die F i g. 8a und 8b) benutzt wird.

so Die Flüssigkeitsprobe, die in der vorliegenden Erfindung benutzt wird, ist im allgemeinen eine Probe menschlichen Serums, obwohl es auch eine andere Art Lösung sein kann, die für die besonderen untersuchten biologischen Teilchen geeignet ist. In dem direkten Test, in dem ein Antikörper nachgewiesen werden soll, wie im Falle der Syphilis oder Gonorrhöe, wird dier Antikörper in dem menschlichen Serum eines Patienten nachgewiesen, von dem man weiß oder annimmt, daß er diese besondere Krankheit hat. Beim Inhibitionstest, bei dem man ein Antigen nachzuweisen versucht, wie das mit der Hepatitis verbundene Antigen HAA, kann der Antikörper in einer Ziege, einem Kaninchen oder in einem anderen geeigneten Tier entwickelt werden und die richtige Menge dieses Tierserums wird mit dem menschlichen Serum eines Patienten vermischt, das auf Hepatitis untersucht werden soll.

Es werden im folgenden einige Beispiele für die vorliegende Erfindung beschrieben, die verschiedene Ami-

gen/Antikörper-Paare und geeignetes nicht-reaktives Material für die poröse lichtundurchlässige Schicht 13 zeigen. In jedem dieser Beispiele besteht das Substrat 10 aus einem festen Material, das nicht mit den biologischen Teilchen und mit dem die lichtundurchlässige Schicht 13 bildenden Material reagiert, wobei ein kleiner Objektträger aus Glas oder Kunststoff mit 25 mm² Größe und einem '/4 mm Dicke für die Zwecke der vorliegenden Erfindung brauchbar ist In einigen der Beispiele wird die Stufe des Aussetzens der oberen Oberfläche des Substrates gegenüber einer ersten Lösung, welche die ersten immunologisch reaktiven biologischen Teilchen enthält, um eine monomolekulare Schicht darauf zu adsorbieren, als Aufbringen eines Tropfens der ersten Lösung im Zentrum der oberen Oberfläche des Substrates beschrieben, wie für die zweite Ausführungsform im Zusammenhang mit den F i g. 7a und 7b, um erste biologische Teilchen zu sparen. Es sollte jedoch klar sein, daß auf der gesamten oberen Oberfläche des Substrates die erste monomolekulare Schicht adsorbiert sein kann (Beispiel 1) wie dies unter Bezugnahme auf die erste und dritte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben ist, indem man das ganze Substrat in die erste Lösung eintaucht und diese Art des Herangehens könnte brauchbar sein in Fällen, in denen Tropfen verschiedener Flüssigkeitsproben, von denen man vermutet, daß sie die zweiten biologischen Teilchen enthalten, im Abstand voneinander auf dem mit der monomolekularen Schicht bedeckten Substrat aufbringt, um mehrere Versuche nahezu gleichzeitig durchzuführen. Alle Stufen der verschiedenen Beispiele können bei Zimmertemperatur ausgeführt werden, d. h. in einem Temperaturbereich von etwa 18 bis 24°C, der für die vorliegende Erfindung nicht kritisch ist. Schließlich sollte klar sein, daß die für die Beschreibung des verwendeten Substrates benutzte Bezeichnung »nicht-reaktiv« mit den biologischen Teilchen und der lichtundurchlässigen Schicht auf seine chemische und biologische Inertheit zu einem Ausmaß bezogen ist, daß das Substrat die biologischen Teilchen odvir die lichtundurchlässige Schicht nicht angreift oder zerstört. Das Substrat ist dagegen reaktiv in dem Ausmaß, als es die Fähigkeit hat, die ersten biologischen Teilchen daran als monomolekulare Schicht zu adsorbieren. In gleicher Weise ist das ltchtundurchlässige Material 13 nicht-reaktiv mit den biologischen Teilchen (und dem Substrat), doch hat das Material die Fähigkeit an der Schicht aus zweiten biologischen Teilchen (oder der Schicht aus ersten biologischen Teilchen im Falle der Abwesenheit der zweiten Schicht) zu haften oder sich damit zu verbinden.

Es folgen die Beispiele zur näheren Erläuterung der Erfindung

Beispiel 1
Direkter Rinderserum-Albumintest

Die Quelle für das Antigen war eine 10%ige Lösung von handelsüblichem Pentex-Rinderalbumin. Eine 1 %ige Lösung des im folgenden als BSA-Antigen bezeichneten Rinderserum-Albumin-Antigens in physiologischer Kochsalzlösung (0,154 normal) wurde zubereitet und übliche Mikroskop-Deckgläser darin eingetaucht und etwa 1 Minute darin belassen. Nach dem Herausnehmen der mit einer monomolekularen BSA-Antigenschicht bedeckten Objektträger aus der Lösung wurden diese mit destilliertem Wasser gespült und mit Druckluft getrocknet Die Quelle für die Antikörper ist auch eine handelsübliche Zubereitung von Pentex-Kaninchen-Antibovin-Albuminserum. Eine Reihe von Verdünnungen von 1 :1 bis 1 :10 000 des Antiserums in physiologischer Kochsalzlösung, die sich jeweils um den Faktor 5 voneinander unterschieden, wurden zubereitet und es wurden Tropfen von l/20ml dieser Verdünnungen auf die mit BSA-Antigen bedeckten Objektträger aufgebracht und für 2 Minuten darauf belassen. Dann wurden die Objektträger mit destilliertem Wasser gespült und mit Druckluft getrocknet Zu diesem Zeitpunkt können die bimolekularen Anligen/Antikörper-Schichten auf den Glasobjektträger-Oberflächen vorhanden sein, ohne daß sie mit dem bloßen Auge sichtbar sind. Die mit den vorgenannten Schichten bedeckten Objektträger wurden dann leicht eingesprüht (jede für etwa 2 bis 3 Sekunden), um eine dünne Schicht aus dem obigen handelsüblichen synthetischen polymeren Harzwachs als lichtundurchlässigen Film zu schaffen, der an den Antigen/Antikörper-Schichten haftet und den Objektträgern ein weißliches Aussehen gibt. Schließlich wurden die Objektträger für eine Minute in eine Zitronensäurelösung mit einem pH-Wert von 2,0 eingetaucht und dann wieder herausgenommen. Die Säurelösung spaltete die Bindungen zwischen BSA-Antigen und Antikörpern. Werden die Antikörper durch das Spalten der Bindung entfernt, dann werden dadurch auch einige der Harzwachsteilcher· entfernt. Eine klare Stelle auf dem Objektträger, der die Entfernung im wesentlichen aller Harzwachs-Teilchen von einer solchen Stelle anzeigt, ist ein Zeichen für die Entfernung einer vollständigen Schicht der BSA-Antikörper, während eine partiell klare Stelle zeigt, daß sich nur eine unvollständige Antikörperschicht gebildet hatte. Keine Veränderung im Aussehen der weißen Beschichtung auf dem Objektträger zeigt, daß sich keine Antikörperschicht gebildet hatte und daß daher die jeweilige Antiscrumverdünnung (oder eine Flüssigkeitsprobe, von der man annahm, daß sie BSA-Antikörpcr enthielt) die Antikörper nicht in ausreichender Menge zum Nachweis enthielt. Durch dieses Verfahren können BSA-Antikörper in Verdünnungen nachgewiesen vcrden bis zu 1 bis 1000 von dem Kaninchcn-Antirinderalbuminserum, was einer Konzentration der Antikörper von etwa 10 -^h g/ml Serum entspricht. Diese Empfindlichkeit kann durch Verlängern der zweiminüligen Verweilzcit, durch Rühren der Aniis<;rumlösung oder durch Verwenden eines größeren Serumvolumens verbessert werden. Die Verwendung der verschiedenen Verdünnungen des Antiserums führt so zu einem Endpunkt in einem Titrationstest und gestattet die quantitative Bestimmung der Antikörperkonzentration. Durch Ausführung eines Inhibitionstestes kann auch die Titration des Antigens erfolgen.

Beispiel 2
Direkter Toxoplasma-Test

Als Antigen wurde ein Derivat des gereinigten Toxoplasmas verwendet. Die Quelle des Antigens war ein peritonealer Extrakt einer ausgewachsenen Maus, die drei Tage vor der Tötung mit einem verdünnten Impfstoff (unter Verwendung von 100 ml steriler Salzlösung) von Toxoplasma gondii, einem Protozoenparasiten geimpft worden war. Der Extrakt wurde dann für etwa 20 Minuten mit Schallcnergic behandelt und die Zubereitung danach durch Zentrifugieren geklärt, wobei die überstehende l-lüssigkeit als einzelnes Tröpfchen von

55

Test zur Überprüfung von Beispiel 2

Um zu überprüfen bzw. bestätigen, daß das beobachteie Loch der Anwesenheit einer Schicht aus dem Toxoplasma-Antikörper zuzuschreiben ist, wurde das Beispiel 2 wiederholt, dabei jedoch anstelle der Antikörperlösung ein Serum ohne einen solchen Antikörper verwendet. Nach Behandlung mit der Säurelösung war kein sichtbares Loch in dem lichtundurchlässigen Film entstanden.

Bei einem zweiten Überprüfungstest wurde eine 0,154 normale Natriumchloridlösung anstelle der Antikörperlösung verwendet. Eine solche Lösung ist isoton zum Blutplasma, enthält jedoch keine Antikörper zum Toxoplasma. Auch hierbei war nach der Säurebehandlung kein Loch in der lichtundurchlässigen Schicht entstanden.

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etwa 6 mm Durchmesser auf die Oberfläche eines Glas-Objektträgers aufgebracht wurde. Der Objektträger wurde dann etwa 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer Feuchtigkeitskammer, einer feuchte Schwämme enthaltenden Hülle, inkubiert. Nach der Herausnahme des mit der Toxoplasma-Anligenschicht bedeckten Objektträgers aus der Feuchtigkeitskammer wurde der Objektträger mit destilliertem Wasser gespült und trokkengeblasen. Dann ordnete man den Objektträger in einer engen Vertiefung in einem Kunststofftrog an und füllte die Vertiefung mit einer 0,154 normalen physiologischen Kochsalzlösung, die in einer 1:10 Verdünnung den Antikörper zum Toxoplasma enthielt Der von einer Ziege gewonnene Antikörper ist eine handelsübliche Zubereitung.

Der Objektträger wurde in der bewegten Antikörperlösung für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert Der Objektträger wurde dann aus der Lösung herausgenommen, mit destilliertem Wasser gewaschen und trockengeblasen. Die zu diesem Zeitpunkt auf der Objektträgeroberfläche vorhandenen Antigen/Antikörper/Schichlen sind mit dem bloßen Auge nicht sichtbar. Der beschichtete Objektträger wurde dann für etwa 2 oder 3 Sekunden zur Schaffung einer dünnen Schicht aus synthetischem polymeren Harzwachs, dem oben beschriebenen Handelsprodukt, leicht besprüht, das als lichtundurchlässiger Film vorlag. Schließlich wurde der beschichtete Objektträger in eine Säurelösung, 0,2 molarer Natriumacetatpuffer mit einem pH-Wert von 3,6 eingetaucht Diese Lösung durchdringt den lichtundurchlässigen Film und spaltet die Antigen/Antikörper-Bindung. Im Bereich der gespaltenen Antigen/Antikörper-Bindung ist der lichtundurchlässige Wachsfilm von dem Objektträger entfernt und es erscheint ein Loch in dem üchtundurchlässigen Film, der mit dem bloßen Auge leicht erkennbar ist.

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35

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45

Beispiel 4
Test mit der lichtundurchlässigen Schicht

Führte man den obigen Test mit einem anderen Material als dem synthetischen polymeren Harzwachs aus, so führte dies bei Anwesenheit der zweiten Monoschicht ebenfalls zu einem mit dem bloßen Auge leicht erkennbaren Loch in der lichtundurchlässigen Schicht. Dieses andere Material war eine Lösung von Polystyrol mit dem Molekulargewicht 33 000 in Aceton. Zuerst wurde ein Wassertropfen auf das mit der bimolekularen Schicht bedeckte Substrat aufgebracht und dann ein Tropfen der Polystyrollösung in Aceton auf den Wassertropfen. Durch Vermischen der beiden Tropfen entstand ein weißer Niederschlag, der die lichtundurchlässige Schicht bildete.

Beispiel 5
Substrat-Test

Der obige Test wurde auf Substraten ausgeführt, wie einer Laboratoriumssschale aus Kunststoff, einem dünnen Goldfilm auf einem Glasobjektträger und einem Siiiziumdioxidi'ilm auf einer Siliziumscheibe, und ergab jeweils in gleichem Maße zufriedenstellende Ergebnisse wie auf dem Glasobjektträger-Substrat.

Aus der vorstehenden Beschreibung ergibt sich, daß durch die vorliegende Erfindung ein verbessertes Verfahren zum Nachweisen immunologischer und anderer Arten biologischer Reaktionen geschaffen werden, wobei die an einer festen Oberfläche stattfindenden Reaktionen durch direkte visuelle Beobachtung mit dem bloßen Auge nachgewiesen werden und das verwendete Substrat praktisch jedes feste Material sein kann, das nicht mit den biologischen Teilchen und der nicht-reaktiven porösen lichtundurchlässigen Schicht, die als äußerste Schicht auf dem Substrat benutzt wird, reagiert, Wegen seiner Lichtundurchlässigkeit ist die äußere Schicht deutlich mit dem bloßen Auge erkennbar und das Spalten der Bindung zwischen dem ersten und zweiten biologischen Teilchen auf der Substratoberfläche ist leicht erkennbar wegen der damit verbundenen Entfernung eines Teiles einer solchen lichtundurchlässigen Schicht am Schluß des Testverfahrens.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

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■J5

Beispiel 3

Versuch mit menschlichem chorionischem Gonadotrophin

Der Test wurde wie in Beispiel 2 ausgeführt, wobei die Antigenlösung 2 mg menschliches chorionisches Gonadotrophin pro ml destilliertem Wasser enthielt e^r> und der Antikörper zu diesem chorionischen Gonado-Irophin war unverdünnt und wurde von einem Kaninchen Ecwonncn.

Claims

Patentansprüche:

1. Diagnostisches Verfahren zum Nachweisen der An- und Abwesenheit eines ausgewählten Antigens oder Antikörpers in einer biologischen Flüssigkeitsprobe durch

Inberührungbringen der Oberfläche eines mit einem Antikörper oder Antigen beschichteten Substrates, wobei dieser Antikörper bzw. dieses Antigen spezifisch ist für das nachzuweisende Antigen bzw. den nachzuweisenden Antikörper, mit der Flüssigkeitsprobe für eine festgelegte Zeit,
gekennzeichnet durch folgende Merkmale:

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1. Aufbringen einer porösen lichtundurchlässigen Schicht aus inerten Teilchen, die nicht mit dem Substrat, der ersten Beschichtung des Substrates, der Flüssigkeitsprobe und der nachfolgend anzuwendenden Lösung reagieren, auf die so behandelte Oberfläche,