DE69913543T2

DE69913543T2 - Dermales gerüst auf der grundlage eines neutralisierten chitosan-schwammes oder eines neutralsierten gemischten chitosan-kollagen-schwammes

Info

Publication number: DE69913543T2
Application number: DE69913543T
Authority: DE
Inventors: Son; Dongjak-Ku; Yong-Ha Bupyung-ku YOUN; Hong; Nowon-Ku; Lee; Yong-Jae Nowon-ku GIN
Original assignee: Korea Atomic Energy Research Institute KAERI
Current assignee: Korea Institute of Radiological and Medical Sciences
Priority date: 1998-09-24
Filing date: 1999-09-13
Publication date: 2004-09-30
Anticipated expiration: 2019-09-14
Also published as: DE69913543T8; JP2002526204A; EP1115432A1; AU5761499A; KR100298846B1; ATE255915T1; CN1185019C; DE69913543D1; KR20000020800A; DE69913543T3; EP1115432B2; WO2000016817A1; EP1115432B1; CN1324254A

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein dermales Gerüst und eine bioartifizielle Dermis, die dieselbe verwendet. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung das dermale Gerüst und die bioartifizielle Dermis umfassend einen neutralisierten Chitosanschwamm, einen gemischten neutralisierten Chitosan/Kollagen-Schwamm oder einen neutralisierten gemischten Chitosan/Kollagen-Schwamm enthaltend Chitosanfasern, welche extrem nützlich bei der Wundheilungstherapie sind.
Hintergrund und Stand der Technik
Verschiedene Arten von normalen Verbandsmaterialien für die Wundheilung wurden bisher entwickelt und werden bequemerweise verwendet, aber in den meisten Fällen wurden sie lediglich deshalb verwendet, um einer Infektion oder Dehydrierung vorzubeugen.
Kürzlich wurden azelluläre künstliche Häute oder zell-basierte bioartifizierte Häute entwickelt und durch viele Biotechnologiefirmen vertrieben. Als azelluläre künstliche Häute sind beispielsweise eine azelluläre Kollagen-Glycosaminoglycanmatrix gebubden an eine dünne Silikonmembran (INTEGRAFT^TM, Interga LifeSciences Co.) und dehydrothermisch quervernetzte Verbundstoffe aus fibrillärem und denaturiertem Kollagen (Terudermis^TM, Terumo Co.) nun kommerziell erhältlich. Jedoch sind solche Produkte durch die Miteinbeziehung von Biomaterialien, so wie Kollagen sehr teuer, und es besteht daher eine Schwierigkeit bei der Verwendung in klinischen Versuchen auf breiten Wundorten, z. B. Verbrennungen.
Als zell-basierte bioartifizielle Häute, haben Advances Tissue Sciences, Inc. (La Jolla, Kalifornien) ein Hautersatzprodukt entwickelt, das aus einem dünnen biologisch abbaubaren Maschennetzwerk zusammengesetzt ist, auf welchem dermale Fibroblasten gesät werden, zur Verwendung bei der Behandlung von diabetischen Fußgeschwüren (Dermagraft-TC^TM). Zusätzlich wurde ein epidermes Zellblatt für halb-dicke Wunden (Acticel^TM, Biosurface Technology, Inc.), Verbundtransplantate aus kultivierten Keratinozyten und Fibroblasten auf einer Kollagen-Glycosaminoglycanmatrix (Apligraft^TM, Organogenesis, Inc.) und ein Hautersatzprodukt, abgeleitet von der Haut eines menschlichen Kadavers (Alloderm^TM, Lifecell), usw. entwickelt.
Die zellbasierenden bioartifizierten Häute wurden hergestellt aus einer Primärkultur aus humanen dermalen Fibroblasten und Keratinozyten, gefolgt durch eine 3-dimensionale Kultur (3-D Kultur, Floßkultur) der kultivierten Zellen in hydrierten Kollagen. Sie hatten bei klinischen Versuchen bei Verbrennungspatienten oder Patienten, die der Schönheitschirurgie unterlagen, bemerkenswert gute Wundheilungs- und narbenreduzierende Wirkungen. Jedoch haben diese Produkte immer noch Probleme dahingehend, dass sie aufgrund der Miteinbeziehung von Kollagen (z. B. Dermagraft-TC: 2.000 $/10 × 10 cm, Terudermis: 1.500 $) zu teuer und in ihrer Verwendung als Transplantate aufgrund einer niedrigen Festigkeit des hydrierten Kollagengels limitiert sind. Daher gibt es immer noch einen wichtigen Bedarf für die Entwicklung von Polymeren mit guter Biokompatibilität und biologischer Abbaubarkeit, welche erfolgreich Kollagen ersetzen können und welche ebenso nützlich für die Verwendung als ein Gitter sind.
Ein Polysaccharidschwamm gekennzeichnet dadurch, dass er (i) eine durchschnittliche Porengröße im Bereich zwischen etwa 10 mum bis etwa 300 mum; (ii) eine durchschnittliche Dicke zwischen den Poren, die die Wanddicke der Poren im Bereich zwischen etwa 5 mum bis zu etwa 270 mum beträgt; und (iii) ein E-Modul mit einer Elastizität die ein Maß für die Festigkeit des Schwammes ist, und die sich im Bereich von etwas 50 kPa bis zu etwa 500 kPa bewegt, hat, ist offenbart in WO-A1-9744070.
Chitosan ist ein kationisches Polysaccharid, zusammengesetzt aus Glucosamin- und N-acetylglucosamin-Resten mit einer 1,4-β-Verbindung. Chitosan kann hergestellt werden durch Deacetylierung von Chitin aus Krabben und anderen Quellen. Chitin wird in vivo langsam abgebaut und daher sind Chitin und dessen Abbauprodukte natürlich und sicher. Auf pharmazeutischem Gebiet wurde Chitosan als ein Vehikel für die verzögerte Freisetzung von Medikamenten verwendet (Hou et al., Chem Pharm Bull 1985; 33(9): 3986–3992). Chitin als solches wurde in Stoffe verwebt und als Verband für die Wundheilung verwendet. Jedoch wurde von neutralisiertem Chitosan niemals berichtet, dass es als dermales Gitter verwendet werden könnte.
Offenbarung der Erfindung
Dementsprechend, um die oben erwähnten Probleme, die im Stand der Technik gegenwärtig sind, zu lösen, ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues dermales Gitter zur Wundheilung mit exzellenter Biokompatibilität und biologischer Abbaubarkeit zur Verfügung zu stellen, welches nicht nur kosteneffektiv ist, aber welches außerdem aufgrund dessen verbesserter Festigkeit bequem zu manipulieren ist, wobei das dermale Gitter weiterhin basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), Fibronectin, usw., zur beschleunigten Wundheilung umfasst.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine bioartifizielle Dermis zur Verfügung zu stellen, wobei humane Fibroblasten auf das dermale Gitter geladen werden, insbesondere nützlich zur Heilung von breiten Wundorten sowie von Verbrennungen.
Um die oben beschriebenen Aufgaben zu erfüllen, stellt ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein dermales Gitter zur Verfügung, welches einen neutralisierten Chitosanschwamm, einen gemischten neutralisierten Chitosan/Kollagen-Schwamm oder einen gemischten neutralisierten Chitosan/Kollagen-Schwamm enthaltend Chitosanfasern zur Verfügung stellt. Das dermale Gitter umfaßt weiterhin vorzugsweise einen Bestandteil oder mehrere Bestandteile ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fibronectin, basischen Fibroblastenwachstumsfaktor, epidermalen Wachstumsfaktor und transformierenden Wachstumsfaktor-β.
Ein weitere Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt eine bioartifizielle Dermis zur Verfügung, wobei humane Fibroblasten auf neutralisierten Chitosan, einen neutralisierten gemischten Chitosan/Kollagen-Schwamm oder auf einen neutralisierten gemischten Chitosan/Kollagen-Schwamm enthaltend Chitosanfasern geladen werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine lichtmikroskopische Aufnahme von hergestelltem Chitosan- und Kollagenschwämmen (Vergrößerung × 200);
2 ist eine lichtmikroskopische Aufnahme eines Chitosanschwammes mit kultivierten humanen Fibroblasten (Vergrößerung × 200);
3 ist eine lichtmikroskopische Aufnahme eines neutralisierten Chitosanschwammes umfassend humane Fibroblasten enthaltend bFGF (50 ng/ml) oder kein bFGF (Vergrößerung × 200);
4 zeigt die Histologie der Querschnitte auf neutralisierten Chitosanschwamm (A) und neutralisierten gemischten Chitosan/Kollagen-Schwamm (B) mit kultivierten humanen Fibroblasten für vier Wochen in vitro (Vergrößerung × 200);
5 zeigt Chitosanschwammtransplantate auf den Gesamtdickenausschnitten in der Balb/c Mäusen;
6 zeigt Transplantationsorte in Balb/c Mäusen 4 Wochen nach der Transplantation;
7 zeigt die Gesamthistologie der Kontrolle biopsiert aus der dorsolateralen Region der Balb/c Maus 10 Tage nach der Transplantation;
8 zeigt die Gesamthistologie des Transplantationsortes biopsiert aus der dorsolateralen Region der Balb/c Maus, transplantiert mit neutralisiertem Chitosanschwamm 10 Tage nach der Transplantation;
9 zeigt die Gesamthistologie des Transplantationsortes biopsiert aus der dorsolateralen Region der Balb/c Maus, transplantiert mit neutralisiertem Chitosan plus bFGF(50 ng/ml)-Schwamm 10 Tage nach der Transplantation;
10 zeigt die Gesamthistologie des Transplantationsortes biopsiert aus der dorsolateralen Region der Balb/c Maus, transplantiert mit neutralisiertem Chitosan plus Typ Ip Kollagen-Schwamm 10 Tage nach der Transplantation;
11 ist ein Graph, der ein Lebensfähigkeitsanalyseergebnis von humanen dermalen Fibroblasten zeigt, die mit Chitosanderivaten behandelt wurden.
Bestes Verfahren zum Ausführen der Erfindung
Hiernach wird die vorliegende Erfindung genauer beschrieben.
Die vorliegenden Erfinder haben unerwarteterweise gefunden, dass ein schwammartiges Gitter erhalten werden kann durch die Neutralisierung einer Chitosanlösung mit einer alkalischen Lösung, gefolgt durch Lyophilisierung der neutralisierten Chitosanlösung. Der erhaltene neutralisierte Chitosanschwamm ist kosteneffektiv verglichen mit dem Kollagenschwammproduktes des Standes der Technik und hat verbesserte Festigkeit, so dass er bequem zu manipulieren ist. Weiterhin kann er in das verwundete Gewebe transplantiert werden, und zeigt dabei exzellente Wundheilungswirkungen und wäre daher extrem nützlich als Verband zur Wundheilung.
Um ein dermales Gitter umfassend einen neutralisierten Chitosanschwamm der vorliegenden Erfindung herzustellen, wird zunächst eine Chitosanlösung mit einer alkalischen Lösung vermischt, um eine neutralisierte Chitosanlösung zu erhalten. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Chitosanlösung vorzugsweise hergestellt durch Lösen von Chitosan in einer 1%igen Essigsäurelösung mit Konzentrationen von 1–2 w/v%. Als alkalische Lösung für die Neutralisierung wird vorzugsweise eine gemischte Lösung aus Rekonstruktionspuffer (2,2 g NaHCO₃, 4,77 g HEPES (222 mM)/100 ml 0,05 N NaOH) und 10fach Medium frei von NaHCO₃ (DMEM : F12 = 3 : 1, Gibco BRL. DMEM-Cat. No. 12800-058, F12-Cat. No. 21700-026) verwendet. Die neutralisierte Chitosanlösung wird bei niedriger Temperatur für einen Tag gefroren, insbesondere bei –70°C, oder unter flüssigen Stickstoff (bei etwa –140°C) und wird dann lyophilisiert (–42°C), um ein schwammartiges dermales Gitter zu erhalten. Das erhaltene dermale Gitter wird sterilisiert und dann auf die Wundorte aufgebracht. Bei der vorliegenden Erfindung wird Gammastrahlung oder ultraviolette Bestrahlung oder Einweichen in 70%igen Ethanol vorzugsweise zur Sterilisierung verwendet.
Um die Biokompatibilität des neutralisierten Chitosanschwammes gemäß der vorliegenden Erfindung zu erhöhen, kann neutralisierter gemischter Chitosan/Kollagen-Schwamm verwendet werden. Der gemischte neutralisierte Chitosan/Kollagen-Schwamm kann hergestellt werden durch Vermischen der neutralisierten Chitosanlösung, hergestellt wie oben mit einer neutralisierten Typ-Ip Kollagen (atelomeres Kollagen)-Lösung, hergestellt gemäß im Wesentlichen demselben Verfahren wie die neutralisierte Chitosanlösung. Vorzugsweise wird ein Mischverhältnis vorzugsweise für ein Gewichtsverhältnis des Kollagens zum Chitosan angepasst, so dass es im Bereich von 1 : 8–1 : 2 basierend auf dem finalen Produkt liegt. Jedoch kann es entsprechend variiert werden unter in Erwägungziehen der gewünschten Festigkeit und der histologischen Charakteristika des verwundeten Gewebes. Da Kollagen sehr bereitwillig ein Gel bei Raumtemperatur bildet, wird die Herstellung und Neutralisierung der Kollagenlösung vorzugsweise bei 4°C oder weniger ausgeführt.
Um die Dehnbarkeit des neutralisierten Chitosanschwammes zu erhöhen, kann ein gemischter neutralisierter Chitosan/Kollagen-Schwamm enthaltend Chitosanfasern hergestellt werden. Insbesondere können Chitosanfasern in Stoffe gemäß einem konventionellen Verfahren eingewebt werden. Auf den gewebten Chitosanfasern wird die neutralisierte Chitosanlösung angeordnet, und der neutralisierte Chitosanschwamm enthaltend Chitosanfasern wird hergestellt gemäß dem oben beschriebenen Verfahren. Dann, um die Anhaftung von humanen Fibroblasten zu erhöhen, wird der hergestellte Schwamm mit der neutralisierten Typ-Ip Kollagenlösung beschichtet, um einen gemischten Chitosan/Kollagen-Schwamm enthaltend Chitosanfasern zu erhalten.
Neutralisierter Chitosanschwamm, gemischter neutralisierter Chitosan/Kollagen-Schwamm oder ein gemischter neutralisierter Chitosan/Kollagen-Schwamm enthaltend Chitosanfasern kann weiterhin Fibronectin, basischen Fibroblastenwachstumsfaktor, epidermalen Wachstumsfaktor, transformierenden Wachstumsfaktor-β, usw. enthalten. Bei der vorliegenden Erfindung umfasst der Schwamm vorzugsweise 50–500 ng/ml Fibronectin oder 10–100 ng/ml basischen Fibroblastenwachstumsfaktor.
Zusätzlich ist eine bioartifizielle Dermis, hergestellt durch Beladen eines Schwammes mit humanen Fibroblasten, nützlich zur Wundheilung dadurch, dass sie auf relativ breite Wundorte transplantiert wird. Die bioartifizielle Dermis kann hergestellt werden, durch Beladen von 1 bis zu ungefähr 5 × 10⁵ Zellen/cm² auf den Schwamm, gefolgt durch Kultivieren der Zellen unter Bedingungen, die geeignet sind für das Anhaften und die Proliferation der humanen Fibroblasten. Jedoch für Notfälle wird es erlaubt sein, die bioartifizielle Dermis umfassend humane Fibroblasten zu transplantieren, wenn die Fibroblasten nur einen Tag kultiviert wurden.
Bei dem vorliegenden neutralisierten Chitosanschwamm oder dem gemischten neutralisierten Chitosan/Kollagen-Schwamm können jegliche Formen, wie rund, quadratisch, usw. erlaubt und die Größe und Dicke davon in Übereinstimmung mit den Anwendungsorten entsprechend angepasst werden, und insbesondere kann er in verschiedene Formen. z. B. Nase, Ohr, usw. geformt werden.
Beispiele
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele besser verstanden werden.
Beispiel 1: Herstellung eines dermalen Gitters
(1) Herstellung eines dermalen Gitters umfassend einen Chitosanschwamm
Abgewogene Mengen Chitosan (Fluka, Medium MW; 400.000) wurden in 1%iger v/v Essigsäure gelöst, um eine 2 w/v%ige Lösung zu erhalten. Die Lösungen wurden eine Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt und dann über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert, um eingeschlossene Luftblasen aus den Lösungen in einer staubfreien Atmosphäre zu entfernen. 20 ml der Lösungen wurden in Plastikpetrischalen mit einem Durchmesser von 100 mm eingefügt (um runde Schwämme mit einem Durchmesser von 100 mm herzustellen), und es wurde ihnen erlaubt, über Nacht bei –70°C zu stehen. Die gefrorenen Lösungen wurden in einem Gefriertrockner 48 Stunden lang lyophilisiert, um einen Chitosanschwamm zu erhalten. Der Schwamm wurde dreimal mit phosphatgepuffertem Salin gewaschen. Anschließend wurde der erhaltene Chitosanschwamm gefroren und erneut unter den gleichen Bedingungen wie oben lyophilisiert und dann durch Gammabestrahlung (20 Kgy/5 Stunden Gammastrahlungsquelle; Co⁶⁰) sterilisiert. 30 W Ultraviolett wurde auf jede Oberfläche dieses Schwammes mit einem Abstand von 30 cm eine Stunde lang gestrahlt, um den Schwamm in Wasser unlöslich zu machen. So wurde ein schwammartiges dermales Gitter mit einer Dicke von 3,0~4,0 mm erhalten.
Der erhaltene Chitosanschwamm war weich und flexibel und bestand aus Chitosanfasern, um porös zu sein. 1 zeigt den halbtransparenten Chitosanschwamm unter einem Phasenkontrastlichtmikroskop (A).
(2) Herstellung eines dermalen Gitters umfassend neutralisierten Chitosanschwamm
Um einen neutralisierten Chitosanschwamm herzustellen, wurden 2%ige w/v Chitosanlösung gelöst in Essigsäure, Rekonstruktionspuffer (2,2 g NaHCO₃, 4,77 g HEPES (200 mM)/100 ml 0,05 N NaOH) und 10fach Medium frei von NaHCO₃ (DMEM : F12 = 3 : 1, Gibco BRL. DMEM-Cat. No. 12800-058, F12-Cat. No. 21700-026) in einem Verhältnis von 8 : 1 : 1 gemischt, um eine neutralisierte Chitosanlösung zu erhalten. Neutralisierter Chitosanschwamm wurde hergestellt unter Verwendung der neutralisierten Chitosanlö sung gemäß demselben Verfahren wie in Beispiel 1 (1). 1 zeigt den semitransparenten neutralisierten Chitosanschwamm unter einem Phasenkontrastlichtmikroskop (B).
(3) Herstellung eines dermalen Gitters umfassend neutralisierten gemischten Chitosan/Kollagen-Schwamm
Um eine neutralisierte Kollagenlösung herzustellen, wurde Typ-Ip Kollagen (3 mg/ml bei einem pH von 3,0; Zellmatrizes, Gelatin Corp., Osaka, Japan, Schweinekollagen frei vom telomerem Teil durch Behandlung mit Pepsin)-Lösung, Rekonstruktionspuffer und 10fach Medium frei von NaHCO₃ in einem Verhältnis von 8 : 1 : 1 vermischt, und dann wurde die gemischte Lösung neutralisiert. Neutralisierung und Manipulation der Kollagenlösung wurden ausgeführt bei 4°C oder weniger. Die erhaltene neutralisierte Kollagenlösung und die neutralisierte Chitosanlösung, hergestellt in Beispiel 1 (2), wurde in einem Verhältnis von 1 : 1 (v/v) vermischt, um eine Lösung für die Herstellung eines gemischten Chitosan/Kollagen-Schwammes (als eine finale Konzentration 8 mg/ml Chitosan, 1,2 mg/ml Kollagen) zu erhalten. Ein dermales Gitter wurde hergestellt unter Verwendung der gemischten Chitosan/Kollagen-Lösung gemäß dem im Wesentlichen selben Verfahren wie in den Beispielen 1 (1) und (2). 1 zeigt den semitransparenten neutralisierten Chitosan/Kollagen-Schwamm (C) und den Typ-Ip Kollagenschwamm (D) unter einem Phasenkontrastlichtmikroskop.
(4) Herstellung eines neutralisierten gemischten Chitosan/Kollagen-Schwammes enthaltend Chitosanfasern
Um die Dehnbarkeit des neutralisierten Chitosanschwammes zu erhöhen, wurde ein gemischter neutralisierter Chitosan/Kollagen-Schwamm enthaltend Chitosanfasern wie folgt hergestellt.
Zunächst wurden Chitosanfasern in ein Gewebe gewebt gemäß einem konventionellen Verfahren. Auf die gewobenen Chitosanfasern wurde die neutralisierte Chitosanlösung, hergestellt in Beispiel 1 (2), angeordnet, und der neutralisierte Chitosanschwamm enthaltend Chitosanfasern wurde hergestellt gemäß dem im Wesentlichen selben Verfahren wie Beispiel 1 (1). Dann, um die Anhaftung von humanen Fibroblasten zu erhöhen, wurde der hergestellte Schwamm mit der neutralisierten Typ-Ip Kollagenlösung, hergestellt in Beispiel 1 (3) beschichtet, um einen gemischten Chitosan/Kollagen-Schwamm enthaltend Chitosanfasern zu erhalten.
Der neutralisierte Chitosan/Kollagen-Schwamm enthaltend Chitosanfasern gemäß dem vorliegenden Beispiel hat die verbesserte Dehnbarkeit und kann bequem manipuliert und gelagert werden.
(5) Herstellung eines dermalen Gittes umfassend Fibronectin und basischen Fibroblastenwachstumsfaktor
Zu den Lösungen zur Herstellung von Chitosan, neutralisierten Chitosan und einem neutralisierten gemischten Chitosan/Kollagen-Schwamm, hergestellt in Beispielen 1 (1)–(3), wurde Fibronectin oder basischer Fibroblastenwachstumsfaktor in Konzentrationen von 5, 50 beziehungsweise 500 mg/ml hinzugefügt. In dem obigen Fall umfasste ein finaler Schwamm 0,67 ng/8 mm-Durchmesser Schwamm Fibronectin beziehungsweise 0,33 ng/8 mm-Durchmesser Schwamm basischen Fibroblastenwachstumsfaktor.
Ein dermales Gitter wurde hergestellt unter Verwendung der gemischten Lösung gemäß dem im Wesentlichen selben Verfahren wie in Beispielen 1 (1) bis (3), außer dem Durchführen der Sterilisation durch Gammastrahlung (5 Kgy/5 Stunden, Gammastrahlenquelle; Co⁶⁰).
Beispiel 2: Herstellung einer bioartifiziellen Dermis
(1) Reine Primärkultur von humanen dermalen Fibroblasten
Humane dermale Fibroblasten (HDFs) wurden aus neonataler Vorhaut, erhalten aseptisch nach der Beschneidung, isoliert. Die Dermis wurde aus der Epidermis durch Inkubierung in 0,25% Trypsin/0,02 EDTA-Lösung für eine Stunde bei 37°C abgetrennt. Die Dermis wurde klein geschnitten und eine Stunde bei 37°C mit 0,34% Kollagenase B Lösung verdaut. Die erhaltenen Zellen wurden mehrmals gewaschen, um Kollagenase zu entfernen, dann wurden die Zellen in DMEM Medium suspendiert, angereichert mit 10%igem fötalem Rinderserum. Fibroblasten wurden in einer Gewebekulturflasche bei 37°C, 5% CO₂ in einem befeuchteten Inkubator kultiviert. Nach dem Erreichen einer Konfluenz von 80~90% wurden die Zellen unter Verwendung von einer 0,1%igen Trypsinlösung subkultiviert. Die Standardanzahl der suspensierten Zellen in der Subkultur betrug 1 × 10⁶ Zellen/100 mm Schale. Die Zellen wurden in einer kryokonservierten Lösung gelagert (DMEM 50%, fötales Rinderserum 40%, DMSO 10%). Vor der Vorbereitung für das Beladen auf das dermale Gitter wurden die Zellen getaut und rekultiviert. Um eine bioartifizielle Dermis herzustellen, wurden die kryokonservierten Zellen mit phosphatgepufferten Salin verdünnt und dreimal zentrifugiert. Dann wurden die Zellen gewaschen, in dem Medium suspendiert und rekultiviert.
2 zeigt die reinen humanen dermalen Fibroblasten aus der Primärkultur (A).
(2) Einbringen von dermalen menschlichen Fibroblasten in ein dermales Gitter
In einem Abzug mit laminarer Strömung wurden die Schwämme mit Durchmessern von 8 mm und 100 mm ausgestochen und in einer Kulturplatte (24 wells, ein Durchmesser von 150 mm) angeordnet. Um runde Schwämme mit einem Durchmesser von 8 mm herzustellen, wurden einmal 105 lebensfähige Zellen (bestimmt durch Tryphanblaulösung) mit einem Minimalvolumen von DMEM Medium verdünnt und auf dem Schwamm angeordnet. Dann wurde ihm erlaubt, bei 37°C, 5% CO₂ für 4 Stunden stehen zu bleiben, und weitere 50 μl DNEM Medium wurden hinzugefügt. 24 Stunden nach der Hinzufügung wurde ein ml Medium zu jedem well hinzugefügt und die Zellen wurden kultiviert. Die artifizielle Dermis wurde unter denselben Bedingungen wie oben vier Wochen lang behalten, um eine konstante Konfluenz zu erzielen. Alle Zellen und gebildete Gewebematrizen, die an dem Schwamm anhafteten, wurden unter einem Phasenkontrastlichtmikroskop beobachtet. Das Medium wurde dreimal pro Woche ersetzt.
2 zeigt einen neutralisierten Chitosanschwamm umfassend humane Fibroblasten (B), einen neutralisierten Chitosanschwamm umfassend Fibronectin (C) beziehungsweise einen neutralisierten gemischten Chitosan/Typ-Ip Kollagen-Schwamm umfassend Fibronectin (D).
(3) Evaluierung der Lebensfähigkeit von humanen dermalen Fibroblasten und des Wachstums in neutralisierten Chitosan- und in neutralisierten gemischten Chitosan/Kollagen-Schwämmen in vitro
Die Lebensfähigkeit von Zellen nach der enzymatischen Dissoziierung aus Kulturplatten betrug etwa 95–100%, wie eingeschätzt mit der vitalen Farbe Tryphanblau. Diese Zellen wurden in Chitosanschwämme und in neutralisierte Chitosanschwämme mit einer Einpflanzungskonzentration von 1 × 10⁵ Zellen/Schwamm (ein Durchmesser von 8 mm) okuliert. Eine Woche nach der Okulierung auf Chitosanschwämmen und auf neutralisierten Chitosanschwämmen wurden diese Schwämme trypsinisiert, und die lebensfähigen vertriebenen Zellen wurden unter einem Lichtmikroskop gezählt. Die folgende Tabelle 1 zeigt lebende Fibroblastenzellzahlen in Chitosanschwämmen eine Woche nach der Okulierung.
Tabelle 1 Fibroblastenzellzahlen in Chitosanschwämmen eine Woche nach der Inokulierung (1 × 10⁴ Zellen)
Verglichen mit der ersten Einpflanzungskonzentration sank die Anzahl der lebensfähigen Zellen, die in dem Chitosanschwamm wuchsen, etwa um 40% ab, aber stiegen um etwa 427% in dem neutralisierten Chitosanschwamm an. Bei der Einschätzung der Lebensfähigkeit auf mit Fibronectin (100 /ml) vermischten Chitosan und auf neutralisierten Chitosanschwämmen erhöhten sich die lebensfähigen Zellen bemerkenswert um ungefähr 5,5-fach, beziehungsweise zweifach verglichen mit denen in Chitosan und in neutralisierten Chitosanschwämmen. Die Anzahl der Zellen, die in bFGF (50 ng/ml) vermischten Chitosan und neutralisierten Chitosanschwämmen wuchsen, erhöhte sich signifikant um etwa das 17-fache und das 9-fache, verglichen mit denen in Chitosan und in neutralisierten Chitosanschwämmen, und auch in Typ-Ip Kollagen (1,5 mg/ml) vermischten neutralisierten Chitosanschwamm erhöhten sich die Zellen etwa 9-fach verglichen mit dem Wachstum in neutralisierten Chitosanschwämmen.
(4) Zytologische/biochemische Analyse einer bioartifiziellen Dermis
Die bioartifizielle Dermis mit humanen dermalen Fibroblasten, kultiviert für eine Woche, wurde aus der Kulturplatte entfernt und dann mit phosphatgepufferten Salin dreimal gewaschen. Die Dermis wurde einer 0,25%igen Trypsinlösung 10 Minuten lang ausgesetzt, um Fibroblasten aus der bioartifiziellen Dermis zu isolieren. Die Dermis wurde in einer Petrischale bewegt und dann mit DMEM Medium gewaschen, um eine Suspension zu erhalten. Die resultierende Suspension wurde in ein Plastikteströhrchen enthaltend 10% fötales Kalbsserum eingeführt, und 5 Minuten lang zentrifugiert. 1 ml DMEM Medium wurde zu dem Zellpellet hinzugefügt, um eine Suspension zu erhalten. 100 ml der resultierenden Suspension wurden mit einer Tryphanblaulösung gefärbt, und lebensfähige Zellen wurden unter einem Lichtmikroskop gezählt. Die Resultate sind in der folgenden Tabelle 2 wiedergegeben.
Tabelle 2 Lebensfähige humane dermale Fibroblastenzahlen in Chitosanschwämmen, eine Woche nach der Anhaftung der Zellen auf den Schwämmen (1 × 10⁴ Zellen)
Wie in der obigen Tabelle 2 gezeigt, erhöhten sich eine Woche nach dem Beladen der Zellen auf den Schwamm die lebensfähigen Zellen in dem gemischten neutralisierten Chitosan/Typ-Ip-Kollagen-Schwamm fünfmal verglichen mit denjenigen in dem neutralisierten Chitosanschwamm. Lebensfähige Zellen in dem neutralisierten Chitosanschwamm umfassend 5, 50 und 500 ng/ml bFGF erhöhten sich 2-, 4- beziehungsweise 3-fach verglichen mit denjenigen in dem neutralisierten Chitosanschwamm, der kein bFGF enthielt. Lebensfähige Zellen in dem neutralisierten Chitosanschwamm umfassend 5, 50 und 500 ng/ml Fibronectin erhöhten sich 2-, 4-beziehungsweise 3-fach verglichen mit denjenigen in neutralisierten Chitosanschwämmen, die kein Fibronectin enthielten.
Zusätzlich erhöhten sich lebensfähige Zellen in dem gemischten neutralisierten Chitosan/Kollagen-Schwamm umfassend 5, 50 und 500 ng/ml bFGF 4,5-, 10-, beziehungsweise 11,5-fach verglichen mit denjenigen in dem neutralisierten gemischten Chitosan/Kollagen-Schwamm, der kein bFGF enthielt. Die lebensfähigen Zellen in dem gemischten neutralisiertem Chitosan/Kollagen-Schwamm umfassend 5, 50 und 500 ng/ml Fibronectin erhöhten sich 5-, 7- beziehungsweise 7-fach verglichen mit denjenigen in neutralisiertem Chitosan/Kollagen-Schwamm, der kein Fibronectin enthielt.
3 zeigt kultivierte humane Fibroblasten (A), neutralisierten Chitosanschwamm (B), neutralisierten Chitosanschwamm mit kultivierten humanen Fibroblasten enthaltend kein bFGF (C) und neutralisierten Chitosanschwamm mit kultivierten humanen Fibroblasten enthaltend bFGF (D). Die Pfeile zeigen gesunde Fibroblasten in den Chitosan-Matrixfasern an.
Abschnitte des neutralisierten Chitosanschwammes oder des neutralisierten Chitosan/Kollagen-Schwammes wurden mit 10% Formalin/phosphatgepufferten Salin fixiert und in Ethanol dehydriert. Dann wurden sie mit Xylol gewaschen und in Paraffin über Nacht eingebettet. Die eingebetteten Gewebe wurden in einer Dicke von 4 μm unter Verwendung eines rotierenden Mikrotoms geschnitten und die abgeschnittenen Gewebe wurden mit Hematoxylin-Eosin gefärbt. Der neutralisierte Chitosanschwamm, insbesondere die ersten paar Wochen Fibroblastenwachstum auf dem Chitosanschwamm, zerrissen leicht während des Sektionierens. Jedoch hatte der Schwamm mit den Fibroblasten, die vier Wochen kultiviert wurden, die verbesserte strukturale Integrität und wurde leichter, mit weniger Unterbrechungen, geschnitten (4: Vergrößerung × 200).
In 4(A) (neutralisierter Chitosanschwamm) hatte die Matrix geringe strukturelle Integrität und war brüchig. Humane Fibroblasten wurden während des Zerschneidens zerrissen und sind selten gezeigt. Die Pfeile zeigen Chitosanfasern an.
In 4(B) (gemischter neutralisierter Chitosan/Kollagen-Schwamm) hatte der Schwamm viel mehr Integrität als der in (A). Dieses resultierte wahrscheinlich aus dem Matrixprotein, das aus den Zellen und Kollagenfasern abgeschieden wird. Der Schwamm behielt die strukturelle Integrität während des Schneidens bei. Die Pfeilköpfe zeigen humane Fibroblasten und Matrixfasern.
Beispiel 3: Transplantationsexperiment für eine in vivo Anwendung einer bioartifiziellen Dermis in Balb/c Mäusen
(1) Transplantieren einer artifiziellen Dermis
Balb/c Mäuse wurden in einem sterilen Raum wachsen gelassen. Die Operation und die Transplantation wurde in Laminarflußabzügen ausgeführt und die Anästhesie wurde durch intraperitoneale Injektion von 3 ml/kg Equithesin ausgeführt. Eine Enthaarung wurde an der dorsalen Seite der Mäuse ausgeführt, die Haarbeschichtung wurde abgeschnitten und das enthaarte Gebiet dann mit Povidon-Jod und mit 70%igen Isopropylalkohol desinfiziert. Eine Scheibe der Haut mit Gesamtdicke wurde unter Verwendung einer Autopsielochung ausgeschnitten. Dieser Ausschnitt resultierte in einem Defekt von ungefähr 5% der Gesamtkörperoberfläche der Haut in den Experimentiertieren. Azelluläre und zelluläre künstliche Dermis derselben Größe wie der Ausschnitt wurden auf das Wundbett transplantiert und mit einem sterilen Mullverband bedeckt. Um Infektion zu vermeiden, wurden die Mäuse mit Wasser versorgt, das mit Ampicillin und Streptomycin angereichert war.
Die Tiere wurden hinsichtlich der Integrität der Transplantate und des Heilungsprozesses jeden Tag identifiziert und nach 10 Tagen und nach 4 Wochen geopfert. Die Tiere wurden photographiert und Gewebe wurde für die folgende histologische Analyse erhalten.
5. zeigt Chitosan-Schwammtransplantate auf den Gesamtdickenausschnitten in Balb/c Mäusen. In 5(A) zeigt das rechte (R) keine Transplantat an (Kontrolle), das linke (L) zeigt den neutralisierten Chitosanschwamm an. In 5(B) zeigt das R neutralisierten Typ-Ip Kollagenschwamm an, und L neutralisierten Chitosanschwamm. In 5(C) zeigt R neutralisierten Typ-Ip Kollagen + Fibronectin-Schwamm an, beziehungsweise L neutralisierten Chitosan + Typ-Ip Kollagen + Fibronectin-Schwamm. Diese Schwämme hafteten fest an dem Wundbett und haben keine Fluidsammlungen.
6 zeigt den Transplantationsort in Balb/c Mäusen vier Wochen nach der Transplantation. In (A), zeigt R die Kontrolle und L neutralisierten Chitosanschwamm an. In (B) zeigt R neutralisierten Typ-Ip Kollagenschwamm beziehungsweise L neutralisierten Chitosan + Typ-Ip Kollagen-Schwamm an. Es wurde gezeigt, dass Wunden bei der Kontrolle verblieben, aber dass die Wunden bei den anderen Transplantaten gut verheilten.
(2) Herstellung von Gewebeproben und histologische Analyse
Gewebeproben aus den Tierwunden wurden erhalten durch Ausschnitt des gesamten Transplantats mit einem umgebenden Rand der normalen Mäusehaut und des darunterliegenden panniculus carnosus. Die Probe wurde mit 10%igen Formalin/phosphatgepufferten Salin fixiert und in Paraffin eingebettet. Dann wurde es gemäß demselben Verfahren wie oben sektioniert und das Ergebnis wurde durch Färben mit Hematoxylin-Eosin erhalten.
7 zeigt die Gesamthistologie der Kontrolle biopsiert aus der dorsolateralen Region der Balb/c Mäuse 10 Tage nach dem Transplantieren (Hematoxylin-Eosin Färben, Vergrößerung 100 ×). Dieses Gebiet wurde nicht vollständig epithalisiert, rekonstruierte nicht die Neodermis und zeigte schwere Entzündungen auf. Diese schwache Heilung kann durch das Fehlen einer Dermis verursacht sein.
8 zeigt die Gesamthistologie des Transplantationsortes biopsiert aus der dorsolateralen Region von Balb/c Mäusen, transplantiert mit neutralisiertem Chitosanschwamm 10 Tage nach der Transplantation. Normales Hautgewebe wurde an beiden Seiten gefunden (bestimmt durch viele Follikelzellen, welche rot gefärbt waren), neu regenerierte Dermis und Epidermis wurden in der Mitte gefunden. Vielschichtige Epidermis wurde gefunden und dermale Zellen wurden in den Wundort migriert, um die Neodermis zu rekonstruieren, und weiterhin wurde keine Entzündung beobachtet.
9 zeigt die Gesamthistologie des Transplantationsortes, biopsiert aus der dorsolateralen Region von Balb/c Mäusen, transplantiert mit neutralisierten Chitosanschwamm, enthaltend 50 ng/ml bFGF 10 Tage nach der Transplantation. Auf ähnliche Art und Weise wie der neutralisierte Chitosanschwamm wurde normales Hautgewebe an beiden Seiten und neuregenerierte Epidermis und Dermis in der Mitte gefunden. Im Vergleich mit neutralisiertem Chitosanschwamm trat ein wenig begleitende Entzündung auf, aber insgesamt wurde ein befriedigender Heilungseffekt erhalten.
10 zeigt die Gesamthistologie des Transplantationsortes biopsiert aus der dorsolateralen Region von Balb/c Mäusen, transplantiert mit neutralisiertem gemischten Chitosan/Typ-Ip Kollagen-Schwamm 10 Tage nach der Transplantation. Intakte multischichtige Epidermis und die rekonstruierte Neodermis wurden gefunden und weiterhin wurden ebenso Follikelzellen gefunden.
Beispiel 4: Zytotoxititätstest von Chitosanderivaten in vitro
1 × 10⁴ humane dermale Fibroblastenzellen in 96 well Platten wurden in DMEM Medium kultiviert, angereichert mit 100 μl 10%igem Serum. Dann wurden die kultivierten Zellen mit 5, 50 und 500 ng/ml Chitosanoligomer, CM-Chitin beziehungsweise 3,6-S-Chitin behandelt. 48 Stunden nach der Behandlung wurde MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid; Thiazolyl blau, Sigma Produkt Nr. M5655) hinzugefügt, und dann wurde es der Mischung erlaubt, 4 Stunden stehen zu bleiben. Nach dem Entfernen des Kulturmediums wurde die resultierende Mischung mit phosphatgepufferten Salin zwei- bis dreimal gewaschen, und 100 μl DMSO (Dimethylsulfoxid) wurden hinzugefügt. Nach der Chromogenese wurde eine Absorption bei 545 nm bei jedem well unter Verwendung eines ELISA Auslesers gemessen. Die Resultate sind in 11 (die Linie zeigt die Kontrolle) und in der folgenden Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3 Lebensfähigkeitsanalyseergebnis der humanen dermalen Fibroblasten, behandelt mit Chitosanderivat
Wie oben gezeigt war die Lebensfähigkeit der Fibroblastenzellen behandelt mit Chitosanderivaten im Bereich von 87,9–108,2% verglichen mit der Kontrolle. Daher wurde bestätigt, dass die Chitosanderivate wenig Zytotoxitität in vitro haben. Da die neutralisierten Chitosanschwämme und die gemischten neutralisierten Chitosan/Kollagen-Schwämme der vorliegenden Erfindung zu solchen Chitosanderivaten abgebaut werden, wird unterstellt, dass sie im Wesentlichen in vivo nicht toxisch sind.
Dementsprechend hat das dermale Gitter gemäß der vorliegenden Erfindung ausgezeichnete Wundheilungswirkung durch das Erschaffen von Mikroumgebungen, die für die Migration und die Proliferation von Fibroblasten und von vaskulären Zellen, die die Wunde umgeben, geeignet sind, was extrem nützlich als Wundheilunasverband ist, und die bioartifizielle Dermis umfassend das dermale Gitter und humane Fibroblasten ist insbesondere nützlich zum Ausheilen von breiten Wundorten, so wie Bränden, bei denen die Migration der umgebenden Zellen schwierig ist.

Claims

Dermales Gerüst umfassend einen neutralisierten Chitosan-Schwamm.
Das dermale Gerüst nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der neutralisierte Chitosan-Schwamm durch Neutralisierung einer Chitosan-Lösung mit einer alkalischen Lösung gefolgt durch Lyophilisierung der neutralisierten Chitosan-Lösung hergestellt wird.
Das dermale Gerüst nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin einen oder mehrere Bestandteile, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fibronektin, basischem Fibroblastenwachstumsfaktor, epidermalem Wachstumsfaktor und transformierendem Wachstumsfaktor-β, umfaßt.
Ein dermales Gerüst umfassend einen neutralisierten gemischten Chitosan-Collagen-Schwamm.
Das dermale Gerüst nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der neutralisierte gemischte Chitosan-Collagen-Schwamm durch das Verfahren hergestellt wird, welches die Schritte a) Neutralisieren einer Chitosan-Lösung mit einer alkalischen Lösung, b) Neutralisieren einer Collagen-Lösung mit einer alkalischen Lösung, c) Mischen der neutralisierten Chitosan-Lösung, hergestellt in Schritt a) mit der neutralisierten Collagen-Lösung hergestellt in Schritt b) und d) Lyophilisieren der gemischten Lösung hergestellt in Schritt c) umfaßt.
Das dermale Gerüst nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin einen oder mehrere Bestandteile, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fibronektin, basischem Fibroblastenwachstumsfaktor, epidermalem Wachstumsfaktor und transformierendem Wachstumsfaktor-β, umfaßt.
Ein dermales Gerüst, welches einen neutralisierten gemischten Chitosan-Collagen-Schwamm umfaßt, der Chitosan-Gewebe enthält.
Das dermale Gerüst nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der neutralisierte gemischte Chitosan-Collagen-Schwamm, der Chitosan-Gewebe enthält, hergestellt wird durch das Verfahren, welches die Schritte a) Weben der Chitosan-Fasern in ein Gewebe, b) Neutralisieren einer Chitosan-Lösung mit einer alkalischen Lösung, c) Anwenden der neutralisierte Chitosan-Lösung, hergestellt in Schritt b) auf das Chitosan-Gewebe, hergestellt in Schritt a), d) Neutralisieren einer Collagen-Lösung mit einer alkalischen Lösung und e) Beschichten des neutralisierten Chitosan-Schwamms, der Chitosan-Gewebe enthält, hergestellt in Schritt c) mit der neutralisierten Collagen-Lösung, hergestellt in Schritt d) umfaßt.
Das dermale Gerüst nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin einen oder mehrere Bestandteile, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fibronektin, basischem Fibroblastenwachstumsfaktor, epidermalem Wachstumsfaktor und transformierendem Wachstumsfaktor-β, umfaßt.
Eine bioartifizielle Dermis, dadurch gekennzeichnet, daß menschliche Fibroblasten in das dermale Gerüst, wie definiert in einem der Ansprüche 1 bis 3 angehaftet sind.
Eine bioartifizielle Dermis, dadurch gekennzeichnet, daß menschliche Fibroblasten in das dermale Gerüst, wie definiert in einem der Ansprüche 4 bis 6 angehaftet sind.
Eine bioartifizielle Dermis, dadurch gekennzeichnet, daß menschliche Fibroblasten in das dermale Gerüst, wie definiert in einem der Ansprüche 7 bis 9 angehaftet sind.