-
Gebiet der
Erfindung
-
Diese
Erfindung bezieht sich auf Gewebetransplantatkonstrukte, die in
der Förderung
des Wiederwachstums und der Heilung von beschädigten oder kranken neurologisch
verwandte Gewebestrukturen nützlich
sind. Im Besonderen bezieht sich diese Erfindung auf ein Verfahren
zur Induzierung der Bildung von endogenen neurologischen Strukturen
an einer Stelle mit Bedarf des Wachstums von endogenem neurologisch verwandtem
Gewebe durch Kontaktierung der Stelle mit einem submucosalen Gewebetransplantatkonstrukt.
-
Hintergrund
und Zusammenfassung der Erfindung
-
Der
Neurochirurg wird oft mit der Notwendigkeit der Reparatur duraler
Defekte aufgrund von Traumata, Tumorresektion und dekompressiven
Prozeduren konfrontiert. Viele Materialien wurden für die Verwendung
bei der Reparatur der Dura mater und darunter liegenden Geweben
untersucht. Gegenwärtige
Optionen umfassen autologe Materialien (z. B. Perikranium, Temporals
Fascia und Fascia lata des Spannmuskels), lyophilisierte kadaverartige
Materialien (z. B. Dura mater und Fascia lata des Spannmuskels)
und synthetische Materialien (z. B. silastische Schichten, Dacron
Schichten, Vicrylnetz), jedes dieser Materialien ist jedoch mit signifikanten
Einschränkungen
verbunden.
-
Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein biozersetzbares Material
bereitzustellen, welches als ein Duralersatz dienen kann.
-
Viele
Individuen haben Schädigungen
an deren zentralem Nervensystem erlitten, die das Individuum teilweise
paralysiert lassen oder in einer reduzierten motorischen Funktion
resultieren. Strategien der Wiederherstellung und Transplantatmaterialien
zur Wiederherstellung von Beschädigungen
des zentralen Nervensystems existieren gegenwärtig nicht. Insbesondere regenerieren
sich Nervenfasern innerhalb des Gehirns und des Rückenmarks,
welche sich strukturell von peripheren Nerven unterscheiden, nicht,
nachdem diese abgetrennt oder gequetscht worden sind. Beispielsweise
besteht keine gegenwärtig
bekannte Behandlung für
Menschen, die eine funktionelle Regeneration über eine vollständige Durchtrennung
des Rückenmarks
oder einen abgetrennten Sehnerv fördert.
-
Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung
und ein Verfahren bereitzustellen, das die Produktion von endogenen
Zentralnervenzellen fördert
und dadurch die Wiederherstellung von Beschädigungen sowohl von Geweben
des zentralen Nervensystems und peripheren Nervengeweben erlaubt.
-
Es
ist bekannt, dass Zusammensetzungen, die die Tunica submucosa enthalten,
die sowohl von der Tunica muscularis und wenigstens dem luminalen
Bereich der Tunica mucosa des Darms von warmblütigen Wirbeltieren delaminiert
sind, als Gewebetransplantatmaterialien verwendet werden können. Siehe
beispielsweise US-Patente Nr. 4,902,508 und 5,281,422. Die in diesen
Patenten beschriebenen Zusammensetzungen sind durch ausgezeichnete
mechanische Eigenschaften gekennzeichnet, einschließlich hohe
Dehnbarkeit, hoher Berstdruck und einen wirksamen Porosizitätsindex,
welche es derartigen Zusammensetzungen gestatten, für Vaskulartransplantatkonstrukte
und in Anwendungen des Ersatzes von Bindegewebe nützlich zu
sein. Wenn sie in derartigen Anwendungen eingesetzt werden, scheinen
submucosale Transplantatkonstrukte als eine Matrix für das Wiederwachstum
der durch die Transplantatkonstrukte ersetzten Gewebe zu dienen.
Des Weiteren können,
wie in dem US-Patent Nr. 5,275,826 beschrieben ist, fluidisierte
Formen von submucosalem Gewebe von Wirbeltieren ebenfalls als injizierbare
oder implantierbare Gewebetransplantate ohne Verlust von biotropen
Eigenschaften verwendet werden. In signifikanter Weise wurde es
zudem in über
600 Überkreuz-Spezies-Implantaten
niemals gezeigt, dass aus Submucosa erhaltene Transplantatzusammensetzungen
eine Transplantatabstoßungsreaktion
des Gewebes erklären.
-
Die
Anmelder haben entdeckt, dass submucosales Gewebe das Wachstum und
die Vermehrung von auf die Neurologie verwandten Geweben induzieren,
einschließlich
der Dura mater und Nervenzellen des zentralen und peripheren Nervensystems.
Dementsprechend ist die vorliegende Erfindung auf die Verwendung von
submucosalem Gewebe als ein Transplantatkonstrukt zur Förderung
der Wiederherstellung von beschädigten
oder kranken neurologisch verwandten Geweben ausgerichtet.
-
Detaillierte
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele
-
Es
wurde gefunden, dass die submucosalen Gewebekonstrukte der vorliegenden
Erfindung das Wachstum von neurologisch verwandten Geweben fördern oder
induzieren. In Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung schließt der Begriff der neurologisch
verwandten Gewebe Neuronen und Glialzellen sowie Dura mater, Arachnoid-
und Pia mater Gewebe ein. Es wird in Übereinstimmung mit dieser Erfindung
ein Verfahren zur Verwendung von Zusammensetzungen enthaltend submucosales
Gewebe von warmblütigen
Wirbeltieren zur Wiederherstellung oder zur Verbesserung der Wiederherstellung
von beschädigten
oder kranken neurologisch verwandten Geweben in einem warmblütigen Wirbeltier
bereitgestellt. Das Verfahren weist den Schritt der Kontaktierung
der Stelle, die einer Wiederherstellung bedarf, mit einer submucosales
Gewebe enthaltenden Zusammensetzung auf.
-
Submucosales
Gewebe, welches zur Verwendung in Übereinstimmung mit der vorliegenden
Erfindung geeignet ist, enthält
natürliche
kollagene Matrizes, welche hochkonservierte Kollagene einschließen, Glycoproteine,
Proteoglycane und Glycosaminglycane in deren natürlicher Konfiguration und natürlichen
Konzentration ein. Eine Quelle von submucosalem Gewebe ist das Darmgewebe
eines warmblütigen
Wirbeltiers. Dünndarmgewebe
ist eine bevorzugte Quelle von submucosalem Gewebe zur Verwendung
gemäß dieser
Erfindung.
-
Submucosales
Gewebe zur Verwendung in dieser Erfindung wird aus verschiedenen
Quellen warmblütiger
Wirbeltiere erhalten, einschließlich
Darmgewebe, welches von für
die Fleischproduktion aufgezogenen Tieren wie beispielsweise Schweinen,
Rindern und Schafen oder anderen warmblütigen Wirbeltieren geerntet wurde.
Dieses Gewebe kann entweder in dessen natürlicher Konfiguration oder
in einer zerkleinerter oder teilweise enzymatisch verdauter fluidisierter
Form verwendet werden. Submucosales Wirbeltiergewebe ist ein reichlich
vorhandenes Nebenprodukt von Arbeitsgängen der kommerziellen Fleischproduktion
und ist daher ein Transplantatmaterial mit geringen Kosten, insbesondere
wenn das submucosale Gewebe in dessen natürlicher Schichtenlagenkonfiguration
verwendet wird.
-
Geeignetes
submucosales Darmgewebe weist typischerweise die von sowohl der
Tunica muscularis und wenigstens dem luminalen Bereich der Tunica
mucosa delaminierte Tunica submucosa auf. In einem Ausführungsbeispiel
nach der vorliegenden Erfindung weist das submucosale Darmgewebe
die Tunica submucosa und basilare Bereiche der Tunica mucosa, einschließlich die
Lamina muscularis mucosa und das Stratum compactum auf. Es ist bekannt,
dass diese Schichten in Abhängigkeit
von der Quelle der Wirbeltierspezies in der Dicke und in der Definition
variieren.
-
Die
Herstellung von submucosalem Gewebe zur Verwendung in Übereinstimmung
mit dieser Erfindung wird in dem US-Patent Nr. 3,902,508 beschrieben.
Ein Segment des Darms eines Wirbeltieres, vorzugsweise geerntet
von Schweine-, Schaf- oder Rinderspezies, aber nicht andere Spezies
ausschließend,
wird einer Abrasion unter Verwendung einer Streichbewegung in Längsrichtung
unterworfen, um die äußeren Schichten,
die Glattmuskelgewebe enthalten, und die am weitesten innenliegende
Schicht, d. h. den luminalen Bereich der Tunica mucosa, zu entfernen.
Das submucosale Gewebe wird mit Salzlösung gespült und wahlweise sterilisiert;
es kann in einem hydratisierten oder dehydratisierten Zustand gelagert
werden. Lyophilisiertes oder luftgetrocknetes submucosales Gewebe
kann rehydratisiert und in Übereinstimmung
mit dieser Erfindung ohne signifikanten Verlust von dessen biotropen
und mechanischen Eigenschaften verwendet werden.
-
Von
Organen warmblütiger
Wirbeltiere gewonnenes submucosales Gewebe hat typischerweise eine abluminale
und eine luminale Oberfläche.
Die luminale Oberfläche
ist die submucosale Oberfläche,
die dem Lumen der Organquelle zugewandt ist und typischerweise benachbart
einer inneren Mucosaschicht in der Organquelle ist, wobei die abluminale
Oberfläche
die submucosale Oberfläche
ist, welche von dem Lumen der Organquelle wegweist und typischerweise
in Kontakt mit glattem Muskelgewebe in der Organquelle ist.
-
Die
submucosalen Gewebetransplantatzusammensetzungen nach der vorliegenden
Erfindung können
durch Dehnung des Materials in einer Längs- oder Querrichtung vorkonditioniert
werden, wie in dem US-Patent Nr. 5,275,826 beschrieben ist. Mehrfache
Streifen Stücke
von submucosalem Gewebe können auch
miteinander vereinigt werden, um ein einheitliches mehrschichtiges
submucosales Gewebetransplantat mit einem Oberflächenbereich größer als
jeder der individuellen Streifen/Stücke des submucosalen Gewebes zu
bilden. Der Prozess der Bildung großer Bereiche/mehrschichtiger
submucosaler Gewebekonstrukte ist in der US-Patentanmeldung 08/418,515 beschrieben.
Zusammenfassend gesagt enthält
der Prozess der Bildung großflächiger Lagen
von submucosalem Gewebe die Überlappung
wenigstens eines Bereichs von einem Streifen aus submucosalem Gewebe
mit wenigstens einem Bereich eines anderen Streifens aus submucosalem
Gewebe und Ausübung
eines Druckes auf wenigstens die überlappenden Bereiche unter
Bedingungen, die eine Dehydratation des submucosalen Gewebes erlauben.
Unter diesen Bedingungen werden die überlappten Bereiche "verschmolzen" werden, um eine
einheitliche große
Gewebelage zu bilden.
-
Die
großflächigen Transplantatkonstrukte
bestehen im Wesentlichen aus submucosalem Gewebe, welches frei von
potentiell kompromissbehafteten Klebemitteln und chemischen Vorbehandlungen
ist, und sie haben eine größere oberflächliche
Fläche
und größere mechanische
Festigkeit als die zur Bildung des Transplantatkonstruktes verwendeten
individuellen Streifen. Die viellagigen submucosalen Konstrukte
können
wahlweise perforiert sein, wie in dem US-Patent 5,711,969 beschrieben
ist. Die Perforationen des submucosalen Gewebekonstrukts erlauben
es extrazellulären
Flüssigkeiten,
durch das Gewebetransplantatmaterial zu passieren, eine Fluidretention
innerhalb des Transplantats zu verringern und die Remodellierungseigenschaften der
Gewebetransplantate zu verstärken.
Die Perforation des submucosalen Gewebes ist insbesondere für mehrfach
laminierte Gewebetransplantatkonstrukte nützlich, wobei die Perforationen
auch die adhäsive
Kraft zwischen benachbarten Schichten verstärken.
-
Das
zur Verwendung in Übereinstimmung
mit dieser Erfindung spezifizierte submucosale Gewebe kann auch
in einer fluidisierten Form vorliegen. Submucosales Gewebe kann
durch Zerkleinerung des Gewebes und wahlweise Aussetzung desselben
gegenüber
einer enzymatischen Verdauung fluidisiert werden, um eine im Wesentlichen
homogene Lösung
zu bilden. Die Herstellung von fluidi sierten Formen von submucosalem
Gewebe wird in dem US-Patent Nr. 5,275,826 beschrieben, dessen Offenbarung
hiermit ausdrücklich durch
Inbezugnahme mit eingeschlossen ist. Fluidisierte Formen von submucosalem
Gewebe werden durch Zerkleinerung von submucosalem Gewebe durch
Zerreißen,
Schneiden, Zermahlen oder Scheren des geernteten Gewebes hergestellt.
Stücke
von submucosalem Gewebe können
daher durch Scherung in einem Hochgeschwindigkeitsmischer oder durch
Zermahlen der Submucosa in einem gefrorenen oder gefriergetrockneten Zustand
zerkleinert werden, um ein Pulver zu erzeugen, welches nachfolgend
hierzu mit Wasser oder einer gepufferten Salzlösung hydratisiert werden kann,
um eine submucosale Flüssigkeit
von flüssiger,
gelartiger oder pastenartiger Konsistenz zu bilden. Die Formulierung
fluidisierter Submucosa kann des Weiteren mit Enzymen wie beispielsweise
Protease, einschließlich
Trypsin oder Pepsin, bei einem sauren pH-Wert für einen zur Solubilisierung
sämtlicher
oder eines Hauptteils der Bestandteile des submucosalen Gewebes
behandelt werden und wahlweise filtriert werden, um eine homogene
Lösung
von teilweise solubilisierter Submucosa bereitzustellen.
-
Die
Transplantatzusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung
können
unter Verwendung herkömmlicher
Desinfektions-/Sterilisations-Techniken
sterilisiert werden, einschließlich
Glutaraldehyd-Gerbung, Formaldehyd-Gerbung bei saurem pH-Wert, Propylenoxidbehandlung,
Ethylenoxidbehandlung, Gasplasmasterilisation, Gammastrahl- oder
Elektronenstrahlbehandlung und Peressigsäure (PAA)-Desinfektion. Sterilisationstechniken,
welche die mechanische Festigkeit, Struktur und biotropen Eigenschaften
des submucosalen Gewebes nicht negativ beeinflussen, sind bevorzugt.
Beispielsweise kann starke Gammabestrahlung einen Verlust der Festigkeit
der Lagen des submucosalen Gewebes bewirken. Bevorzugte Sterilisationstechniken
umfassen die Aussetzung des Transplantats gegenüber Peressigsäure, 1–4 Mrad
Gammabestrahlung (mehr bevorzugt 1–2.5 Mrad an Gammabestrahlung)
oder Gasplasmasterilisation. Typischerweise wird das submucosale
Gewebe zwei oder mehr Sterilisationsprozessen unterworfen.
-
Nachdem
das submucosale Gewebe in einem einleitenden Desinfektionsschritt
behandelt wurde, beispielsweise durch Behandlung mit Peressigsäure, kann
das Gewebe in eine Kunststoff- oder Folienumhüllung eingewickelt und erneut
unter Verwendung von Elektronenstrahl- oder Gammabestrahlungssterilisationstechniken
sterilisiert werden.
-
In Übereinstimmung
mit einem Ausführungsbeispiel
wird submucosales Gewebe als ein Gewebetransplantatkonstrukt für den Ersatz
oder die Wiederherstellung von beschädigten oder kranken neurologisch verwandten
Geweben verwendet. Insbesondere wurde es gefunden, dass das gegenwärtige submucosale
Gewebekonstrukt das Wachstum und die Vermehrung von Neuronen fördert. Dementsprechend
können
die gegenwärtigen
Zusammensetzungen in einem Verfahren der Wiederherstellung von beschädigten oder
kranken, neurologisch verwandten Geweben in einem warmblütigen Wirbeltier
verwendet werden.
-
Das
in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung verwendete submucosale Gewebekonstrukt weist
submucosales Darmgewebe auf, welches sowohl von der Tunica muscularis
und wenigstens dem luminalen Bereich der Tunica mucosa des Darms
eines warmblütigen
Wirbeltieres oder eines Verdaus desselben delaminiert ist. Das Konstrukt
kann mit einem zugefügten
Wachstumsfaktor wie einem vaskularen Endothelialwachstumsfaktor,
Nervenwachstumsfaktor oder Fibroblastwachstumsfaktor oder einem
Wachstumsfaktor enthaltend Extrakte von submucosalem Gewebe kombiniert
werden. Alternativ kann das Gewebetransplantatkonstrukt submucosales
Gewebe in Kombination mit peripherem neuronalem Gewebe und wahlweise
zugefügten
Wachstumsfaktoren enthalten.
-
In
einem Ausführungsbeispiel
werden feste Formen von submucosalem Gewebe mit einem oder mehr Wachstumsfaktoren
durch Einweichen des Gewebes in einer den Wachstumsfaktor enthaltenden
gepufferten Lösung
kombiniert. Beispielsweise wird das submucosale Gewebe für 7–14 Tage
bei 4°C
in einer PBS gepufferten Lö sung,
die ungefähr
5 bis ungefähr
500 mg/ml enthält,
oder mehr bevorzugt 25 bis ungefähr
100 mg/ml des Wachstumsfaktor, eingeweicht. Submucosales Gewebe
bindet schnell an Proteine und wird eine Assoziation mit einem bioaktiven
Mittel für
mehrere Tage zurückbehalten.
Um jedoch die Aufnahme der Wachstumsfaktoren in das submucosale
Gewebe zu steigern, kann das Gewebe teilweise vor der Kontaktierung
der Wachstumsfaktorlösung
dehydratisiert werden. Für
Zusammensetzungen enthaltend fluidisierte oder solubilisierte Extrakte
oder Guanidin-Extrakte von submucosalem Gewebe können lyophilisierte Pulver
oder Lösungen
von Wachstumsfaktoren direkt mit dem submucosalen Gewebe gemischt
werden. Beispielsweise kann fluidisiertes oder solubilisiertes submucosales
Gewebe mit einem Wachstumsfaktor vermischt und anschließend innerhalb
eines Röhrchens
aus submucosalem Gewebe (oder anderes biozersetzbares Gewebe) verpackt werden.
Das offene Ende des Röhrchens
wird nach Füllung
des Röhrchens
mit dem fluidisierten oder solubilisierten submucosalem Gewebe abdichtend
verschlossen.
-
In Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung wird submucosales Gewebe eines warmblütigen Wirbeltieres
verwendet, um ein zur Induzierung der Wiederherstellung von neurologischem
Gewebe in einem warmblütigen
Wirbeltier nützliches
Gewebetransplantatkonstrukt herzustellen. Die Herstellung umfasst
die Schritte der Kombination des submucosalen Gewebes eines warmblütigen Wirbeltieres,
oder eines Verdaus desselben, mit einem zugefügten Wachstumsfaktor ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus vaskularem Endothelialwachstumsfaktor,
Nervenwachstumsfaktor und Fibroblastwachstumsfaktor.
-
In
einer Ausführungsform
wird das submucosale Gewebe verwendet, um ein Transplantatkonstrukt herzustellen,
welches sich auf das in vivo-Wachstum von Neuronen entlang einem
vorbestimmten Weg richtet. Die Herstellung umfasst die Schritte
der Bildung eines Röhrchens
aus bioabbaubarem Material und Füllung des
Röhrchens
mit fluidisiertem submucosalen Gewebe. Das Röhrchen sollte so geformt sein,
um einen Durchmesser von ungefähr
0,5 mm bis ungefähr
4 mm für
periphere Nervenapplikationen aufzuweisen, und ungefähr 1 mm
bis ungefähr
2 cm für
Anwendung am Zentralnerv. In einer Ausführungsform wird das Röhrchen aus
submucosalem Gewebe gebildet, wobei das submucosale Gewebe manipuliert
wird, um einen Zylinder mit einem Durchmesser der bevorzugten Größe zu definieren.
Typischerweise wird das submucosale Gewebe direkt aus Darmgewebe
präpariert
und hat daher eine im Allgemeinen zylindrische Gestalt. Das Gewebe
kann manipuliert werden, um einen Zylinder mit dem bevorzugten Durchmesser
durch Nähen
oder Sicherung des Transplantats in Längsrichtung auf andere Weise
und Entfernung des überschüssigen Gewebes
zu definieren. Beispielsweise kann das Transplantatkonstrukt durch
Ausfall eines sterilen Glasstabes mit einem äußeren Durchmesser, der gleich
dem gewünschten
Durchmesser des Lumen des gebildeten Transplantatkonstrukts ist,
hergestellt werden. Der Glasstab wird in das Lumen des Transplantats
eingeführt,
redundantes Gewebe wird anschließend gesammelt und der gewünschte Lumendurchmesser
wird durch Nähen
entlang der Länge des
Transplantats oder durch Verwendung anderer bekannter Techniken
der Gewebefestlegung erzielt.
-
Alternativ
kann das Röhrchen
aus submucosalem Gewebe durch Umwickeln von Streifen aus submucosalem
Gewebe auf einen Dorn hergestellt werden, wobei das aufgewickelte
submucosale Gewebe überlappend
angeordnet ist, wobei kein Bereich des darunter liegenden Dornes
exponiert gelassen wird. Siehe US Provisional Application Serien
Nr. 60/032,679, deren Offenbarung hiermit ausdrücklich mit eingeschlossen ist. Das
submucosale Gewebe kann spiralförmig
auf einen Dorn als ein kontinuierliches Stück aus submucosalem Gewebe
aufgewickelt werden, und eine Mehrzahl von Streifen aus submucosalem
Gewebe kann verwendet werden, um die röhrenförmigen Konstrukte zu bilden.
Das gewickelte submucosale Gewebe wird anschließend unter dehydratisierenden
Bedingungen komprimiert und die röhrchenförmige Prothese wird von dem
Dorn entfernt. Die Größe des Überlapps
in einem spiralför mig
gewickelten Konstrukt in Übereinstimmung
mit dieser Ausführungsform
liegt in dem Bereich zwischen 10 bis 60% der Weite des vorhergehenden
Streifens und mehr bevorzugt ist der überlappende Bereiche ein 50%iger Überlapp.
-
Nach
der Bildung des biozersetzbaren Röhrchens wird das Röhrchen mit
fluidisiertem oder solubilisiertem submucosalen Gewebe gefüllt und
das Röhrchen
an einem oder beiden Enden des Röhrchens
unter Verwendung auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren (einschließlich Klammern,
Nähen,
Bindemittelpasten und Kompression unter dehydratisierenden Bedingungen)
verschlossen. Alternativ kann das Röhrchen an einem oder beiden
Enden des Röhrchens
verschlossen werden, bevor dieses mit fluidisiertem/solubilisiertem Gewebe
gefüllt
wird. Das Röhrchen
kann anschließend
durch Injektion von fluidisiertem/solubilisiertem Gewebe in das
Lumen durch die Verwendung einer Spritze gefüllt werden.
-
Die
submucosalen Gewebetransplantatkonstrukte nach der vorliegenden
Erfindung werden zur Wiederherstellung von neurologisch verwandten
Geweben und im Speziellen von Bestandteilen des zentralen und peripheren
Nervensystems verwendet. Das Verfahren umfasst die Kontaktierung
der einer Wiederherstellung bedürfenden
Stelle mit einer Zusammensetzung enthaltend submucosales Darmgewebe,
welches von sowohl der Tunica muscularis und wenigstens dem luminalen
Bereich der Tunica mucosa des Darms eines warmblütigen Wirbeltieres delaminiert
ist. Das submucosale Gewebe kann beispielsweise in Schichten-, Streifen-, Band-
oder Schlaufenform verwendet und chirurgisch an der Stelle des Bedarfs
einer Wiederherstellung implantiert werden. Die submucosale Gewebezusammensetzung
kann des Weiteren in einer fluidisierten Form verabreicht und an
der Stelle des Bedarfs einer Wiederherstellung in das warmblütige Wirbeltier
injiziert werden. Schließlich
kann die Zusammensetzung einen mit fluidisiertem submucosalen Gewebe
gefüllten
Zylinder aus submucosalem Gewebe aufweisen.
-
In
einem Ausführungsbeispiel
in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung werden die submucosalen Gewebekonstrukte
verwendet, um die Bildung von neurologisch verwandtem Gewebe zwischen
endogenen neurologischen Gewebestrukturen in einem warmblütigen Wirbeltier
zu induzieren. Das Verfahren umfasst die Schritte der chirurgischen
Implantation einer Gewebetransplantatzusammensetzung enthaltend submucosales
Gewebe eines warmblütigen
Wirbeltieres in den Wirt, um die endogenen neurologischen Gewebestrukturen
zu überbrücken und
ein Wachstum von endogenem neurologisch verwandtem Gewebe zwischen
den überbrückten neurologischen
Strukturen zu induzieren.
-
Wenn
submucosales Gewebe, welches die Tunica submucosa und die basilaren
Bereiche der Tunica mucosal einschließlich der Lamina muscularis
mucosa und dem Stratum compactum umfasst, in nicht-fluidisierter Form
verwendet wird, ist es bevorzugt, dass dieses so implantiert wird,
dass das Stratum compactum die Oberflächengewebe am stärksten flachliegend
kontaktiert, um Adhäsionen
mit dem Transplantatmaterial zu bilden.
-
In Übereinstimmung
mit einer Ausführungsform
kann eine Beschädigung
des Rückenmarks
durch manuelle Trennung benachbarter longitudinaler Nervenfasern
in dem Rückenmark
repariert werden, wobei die Trennungen oder Einschnitte parallel
zu den Axons der Neuronen der Wirbelsäule verlaufen und durch die Dura
mater, Arachnoid- und Pia mater-Schichten durchdringt. Streifen
von submucosalem Gewebe werden chirurgisch in die vertikalen Trennungen
oder in natürliche
Furchen implantiert und sind daher in direktem Kontakt mit neurologisch
verwandten Geweben und werden durch diese Gewebe an ihrem Platz
gehalten. Alternativ können
Schichten von submucosalem Gewebe verwendet werden, um das Äußere des
beschädigten
Bereiches zu umwickeln, um eine Wiederherstellung der beschädigten Gewebe
zu fördern.
Wahlweise können Nähte verwendet
werden, um das mucosale Gewebe an dessen gewünschten Ort zu sichern.
-
In
Anwendungen, in welchen das Rückenmark
durchtrennt worden ist, kann das submucosale Gewebe zwischen den
zwei getrennten Enden angeordnet werden, um den Spalt zu überbrücken und
als ein Rahmen zu dienen, welcher das Wachstum der Neuronen der
zwei getrennten Enden in Richtung aufeinander richtet. Fluidisierte
Formen von Submucosa können
ebenso in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um beschädigte oder
kranke neurologisch verwandte Gewebe wiederherzustellen. Vorteilhafterweise
können
die fluidisierten Formen in die Stelle, die einer Wiederherstellung
bedarf, injiziert werden und können
daher in einem weniger invasiven Verfahren verwendet werden, um
die Vermehrung von endogenen neurologisch verwandten Geweben zu
induzieren.
-
In Übereinstimmung
mit einer Ausführungsform
wird eine Gewebetransplantatzusammensetzung enthaltend submucosales
Gewebe eines warmblütigen
Wirbeltieres einem warmblütigen
Wirbeltier an einer Stelle verabreicht, die ein endogenes neurologisch
verwandtes Gewebewachstum in einer Menge bedarf, die wirksam ist,
ein Wachstum von endogenem, neurologisch verwandtem Gewebe an der
Stelle, an welcher die Zusammensetzung verabreicht ist, zu induzieren.
Die biotropen Eigenschaften des submucosalen Gewebes fördern das
Wachstum von neurologischem Wege entlang „Gebieten", wie sie durch den Weg des implantierten submucosalen
Gewebes definiert sind. Dementsprechend kann das Wachstum von Neuronen,
einschließlich Neuronen
des zentralen und peripheren Nervensystems, auf eine Stelle gerichtet
werden, die der Versorgung mit Nerven bedarf. In einer Ausführungsform
wird das Wachstum von neurologischem Gewebe durch die Verwendung
eines Gewebetransplantatkonstrukts enthaltend ein mit fluidisiertem
submucosalen Gewebe gefülltes
Röhrchen „ausgerichtet". In dieser Ausführungsform
wird gesundes neuronales Gewebe in einem Ende des Röhrchens
eingeführt
und es wird in direktem Kontakt mit dem innerhalb des Röhrchens
enthaltenen fluidisierten submucosalen Gewebe platziert. Das gegenüberliegende
Ende des Röhrchens
wird anschließend
an oder nahe bei dem Ort platziert, welcher eine Innervation bedarf.
Das Röhrchen
wird an seinem Ort fixiert und stellt eine in vivo-Durchführung für neues
neuronales Wachstum und Innervation der gewünschten Stelle bereit. Das
Röhrchen
aus fluidisiertem submucosalen Gewebe kann ebenfalls verwendet werden,
um durchtrennte Nerven wiederherzustellen, wobei die beiden Enden
des durchtrennten Nerves in das Röhrchen eingeführt werden,
um eine Wiederanbringung der beschädigten Enden zu induzieren
und die Nervenfunktion wiederherzustellen.
-
Jedes
der nachfolgenden Verfahren kann in Konjugation mit den Gewebetransplantatkonstrukten
nach der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um eine Durchführung für gerichtetes
de novo-Wachstum
von neuronalen Geweben bereitzustellen. In einer Ausführungsform
wird submucosales Gewebe in der Gestalt eines Röhrchens mit einem Lumen und
zwei offenen Enden hergestellt. In einer Ausführungsform wird das Röhrchen aus
submucosalem Gewebe direkt in den Wirtsorganismus implantiert und
das Ende einer beschädigten Nervenfaser
kann in das Lumen des submucosalen Geweberöhrchens eingeführt werden.
Eine Spritze wird anschließend
verwendet, um das Röhrchen
mit zerkleinertem oder solubilisiertem submucosalen Gewebe zu füllen. Alternativ
kann submucosales Gewebe in der Gestalt eines Röhrchens ausgebildet werden,
welches mit fluidisiertem/solubilisierten submucosalem Gewebe gefüllt und
an jedem Ende abgeschlossen ist. Das geschlossene Röhrchen aus
submucosalem Gewebe kann anschließend gelagert werden, bis es
gebraucht wird. In einer Ausführungsform
wird das verschlossene Röhrchen
aus submucosalem Gewebe in den Wirtsorganismus eingeführt und
an seinem Platz unter Verwendung von dem Fachmann auf diesem Gebiet
bekannter Techniken fixiert. Das eingeführte Transplantatkonstrukt
stellt eine Durchführung
für neues
neuronales Gewebewachstum bereit. In einer bevorzugten Ausführungsform
wird ein Schlitz oder ein Loch in das Röhrchen aus submucosalem Gewebe
geschnitten und ein beschädigtes
oder durchtrenntes Ende eines Nervengewebes wird durch den Schlitz
oder die Öffnung
und in das Lumen des Röhrchens
eingeführt.
-
Das
in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung verwendete submucosale Gewebe kann
alleine oder in Kombination mit zugefügten Wachstumsfaktoren wie
beispielsweise vaskularem Endothelialwachstumsfaktor, Nervenwachstumsfaktor
oder saurem Fibroblastwachstumsfaktor verwendet werden. Des Weiteren
können
Implantate von peripheren Nerven in Kombination mit submucosalem
Gewebe verwendet werden, um die Wiederherstellung der neuronalen
Gewebe zu verbessern. Der Begriff des peripheren Nervenimplantats,
wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf neuronales Gewebe,
welches von dem peripheren Nervensystem eines warmblütigen Wirbeltieres
geerntet wurde, und vorzugsweise ein autologes peripheres neuronales
Gewebe. Zusätzliche
Komponenten können
zu der Transplantatzusammensetzung des neurologen Gewebes zugefügt werden,
die die Zusammensetzungen mit struktureller Unterstützung für Anwendungen unter
Beteiligung des Rückenmarks
bereitstellen, insbesondere wenn Bereiche der Wirbelsäule fehlen
oder bedürfen,
ersetzt zu werden. Beispielsweise kann Hydroxyapatit und/oder andere,
biokompatibles Calcium enthaltende Mineralien mit der Transplantatzusammensetzung
kombiniert werden, oder Metallstifte oder Drähte können ebenfalls in Kombination
mit dem submucosalen Gewebe verwendet werden, um eine zusätzliche strukturelle
Unterstützung
für das
Ersatzgewebe zu ergeben.
-
Die
submucosalen Gewebetransplantatkonstrukte nach der vorliegenden
Erfindung können
auch verwendet werden, um das Wachstum und die Vermehrung von anderen
mit dem Zentralnerv assoziierten Geweben und von Stützgeweben
zu fördern.
Submucosales Gewebe verbessert die Wiederherstellung von Glialzellen
und Dura mater, Arachnoid- und Pia mater-Geweben.
-
In
einer Ausführungsform
wird das submucosale Gewebe als ein Duralersatz verwendet, welcher
als ein Gewebetransplantatlappen gebildet ist, welches gestaltet
ist, um einen in der endogenen Dura mater gebildeten Defekt oder
gebildetes Loch zu bedecken. Gegenwärtig verfügbare Optionen für Ersatzmaterialien
der Dura mater haben signifikante Beschränkungen: autologe Materialien
sind häufig
in ihrer Menge nicht adäquat und
werden mit der assoziierten Morbidität von zusätzlichen Einschnitten erhalten,
und die Handhabungscharakteristika von synthetischen Lagen sind
im Vergleich mit biologischen Materialien schlecht. Des Weiteren wurden
Befürchtungen
bezüglich
der Langzeitrisiken von Blutungen durch eine Gewebereaktion mit
synthetischen Transplantatmaterialien erhoben. Die Dura von Leichen
ist teuer, verschiedentlich in deren Zurverfügungstellung beschränkt und
hat nur einigermaßen
gute Handhabungscharakteristika. Von größerer Besorgnis ist dessen
dokumentierte Rolle als ein Vektor in der Übertragung der langsamen Viren
wie beispielsweise der Jakob-Creutzfeldt-Krankheit.
-
Submucosales
Gewebe stellt einen ausgezeichneten Duralersatz bereit, da dieses
Material nicht eine nachteilige Immunantwort heraufbeschwört und eine
Vermehrung von endogenen Zellen induziert, welche in das Transplantat
eindringen und das Transplantat schließlich durch endogene Zellen
ersetzen. Ein Experiment wurde unter Verwendung von Ratten als Wirt
durchgeführt,
um die Brauchbarkeit von Zusammensetzungen aus submucosalem Gewebe
als Duralersatz zu bestätigen.
-
Wie
in Beispiel 1 beschrieben, fungiert submucosales Gewebe, welches
in einer Ratte nachfolgend einer Duralresektion implantiert wurde,
als ein geeigneter Duralersatz. 28 Tage nach der Implantation hat
eine Remodellierung des submucosalen Gewebes begonnen, wie dies
durch die Anwesenheit von Spindelzellen, aggressiver Neovaskularisation
und eosinophiler Färbung
der Bindegewebematrix angezeigt ist. Die Inkorporation und Remodellierung
des Transplantats tritt in der Abwesenheit von jeglichen nachteiligen
Effekten auf den darunter liegenden cerebralen Cortex ein.
-
Beispiel 1
-
Submucosales
Gewebe als ein Duralersatz
-
Experimentelle Ausgestaltung
und chirurgische Prozedur
-
Zwanzig
Sprague-Dawley Laborratten mittlerer Größe wurden anästhesiert
(Ketamin 90 mg/kg und Xylazin 10 mg/kg, IM) und in einem stereotaktischen
Kopfrahmen platziert, um das Kranium zu stabilisieren. Die Haut
wurde rasiert, mit Chlorhexadin vorbereitet und mit 1% Lidocain
durchtränkt.
Nachfolgend einem Einschnitt der Fascia an der oberen temporalen
Linie wurden die Schläfenmuskel
lateral durch einen Kopfhauteinschnitt entlang der Mittellinie angehoben,
wodurch die parietalen Konvexitäten
exponiert wurden. Bihemisphere parietale Kraniektomien mit ungefähr 4 mm × 8 mm wurden
mit einem elektrischen Handbohrer und einer Fräse gemacht. Die Dura, eine
dünne,
nahezu transparente Membran in der Ratte, wurde an den kraniektomischen
Stellen unter Vergrößerung der
Schleife herausgeschnitten. Es wurde Sorge dafür getragen, nicht den darunter
liegenden zerebralen Cortex zu verletzen.
-
Submucosales
Transplantatmaterial des Dünndarms
wurde in Schichtenform in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung hergestellt und durch Aussetzung
gegenüber
0,1% Peressigsäure
sterilisiert. Das Transplantat wurde auf die ungefähre Größe geschnitten
und als ein Auflagetransplantat über
eine Konvexität platziert,
wobei das Transplantat so orientiert war, dass die Oberfläche des
Stratum compactum dem cerebralen Cortex zugewandt war. Die gegenüberliegende
laterale Hemisphäre
erhielt kein Transplantat, um so als eine Kontrolle für die Wirtsantwort
auf das operative Verfahren zu dienen. In zwei Tieren wurde das
Knochenfragment ersetzt. Die Wunde wurde mit normaler Salzlösung ausgespült und mit
Krampen geschlossen. Eine einzelne postoperative Dosis von Ampicillin
(25 mg/kg, SQ) wurde verabreicht. Eine unmittelbare nachoperative
Versorgung umfasste die Anordnung auf einem Heizkissen, Abdeckung
mit einem Handtuch, Umdrehen alle 15 Minuten bis zum Aufwachen und
der Bewegung und Überwachung
der Herztätigkeit
und Atmung. Die Tiere wurden täglich
bezüglich
des Auftretens von plötzlichen
Anfällen
oder neurologischer Defizite, Appetit und Flüssigkeitsaufnahme und Gewicht überwacht.
Zehn der Ratten wurden durch eine Überdosis an Barbiturat (150
mg/kg, IC) 7 Tage nach der Transplantatanordnung getötet. Die
verbleibenden 10 Ratten wurden 28 Tage nach der Transplantatanordnung
getötet.
-
Histologische
Präparation
und Auswertung
-
Drei
der zwanzig Ratten starben an Komplikationen mit Bezug auf die Anästhesie
in dem frühem
postoperativen Zeitraum. Die verbleibenden siebzehn Ratten wurden
ohne Ereignis von der Prozedur ohne Nachweis von Anfällen, Infektionen
oder neurologischen Defiziten zurückerlangt. Acht Ratten wurden
an dem 7. Tag getötet.
Neun Ratten wurden an dem 28. Tag getötet.
-
Nachfolgend
zu der Tötung
wurden die Ratten mit Formalin über
Halsschlagaderarterienkatheter perfundiert. Das Kranium wurde anschließend in
Formalin fixiert und entkalkt. Abschnitte mit einer Dicke von 6 Mikrometer
wurden herausgeschnitten, mit Hematoxylin und Eosin gefärbt und
für eine
histologische Untersuchung präpariert.
Die untersuchten Gewebe umfassten die Zwischenbereiche des Transplantats
mit dem Cortex, Knochen und Kopfhaut. Die Kontrollseite wurde auf ähnliche
Weise präpariert.
-
Eine
mikroskopische Untersuchung der Proben wurde mit einer Quantifizierung
des zellulären
Infiltrats, der Vaskularität
und der Dicke der defekten Stelle unter Verwendung eines Bildanalysesystems
(Optimus Image Analysis System; Bioscan, Inc; Edmonds, WA) erweitert.
Daten bezüglich
der mit dem submucosalen Transplantationsimplantat behandelten defekten
Stelle wurden mit der Kontrollstelle an sowohl den Zeitpunkten des
7. Tages und des 28. Tages verglichen. Die numerischen Ergebnisse,
die zu den remodellierenden Geweben zugeordnet wurden, basierten
auf den in Tabelle 1 wiedergegebenen Kriterien. Die Werte wurden
unter Verwendung des Student's
T-Tests verglichen. Das Gesamtergebnis für die jeweiligen Gruppen wurde
verwendet, um die Nullhypothese zu überprüfen, dass kein Unterschied
zwischen den morphologischen Änderungen in
der gefüllten
Submucosa gegenüber
den nicht mit Submucosa gefüllten
defekten Stellen an entweder dem 7. oder 28. Tag gesehen wird. Ein
p-Wert von weniger als 0,05 wurde als signifikant angesehen.
-
Tabelle
1: Quantitative histologische Beurteilung einer duralen Auflagetransplantation
von Submucosa gegenüber
einer Kontrollprobe
-
Die
Stellen mit Submucosatransplantat sind mit den Kontrollstellen unter
Verwendung der Dicke, Vaskularität
und Zelldichte als die Ergebniskriterien verglichen. Die angegebenen
Werte repräsentieren
den Mittelwert ± S.
E. M.
-
-
Die
histologische Untersuchung zeigte eine Infiltration des Transplantats
durch spindelförmige
mononukleare Zellen, Deposition von Bindegewebe und Neovaskularität. Des Weiteren
zeigte die histologische Analyse deutliche Unterschiede zwischen
den mit Submucosagewebe wiederhergestellten Defekten gegenüber den
Kontrollstellen (d. h. Defekte, die ohne jeglichem an der defekten
Stelle platzierten Material der Heilung überlassen wurden). Das Gesamtergebnis
für die
jeweiligen Gruppen wurde unter Verwendung des Student's T Test verglichen,
wobei eine Signifikanz für
einen p-Wert von < 0,05
akzeptiert wurde. Ein signifikanter Unterschied zwischen den histologischen
Ergebnissen der submucosalen Transplantatstelle und der Kontrollstelle wurde
bei 7 Tagen (3,4 + 0,8 versus 0,1 + 0,1) und bei 28 Tagen (4,6 +
1,1 versus 2,2 + 0,5) gefunden. Kein Nachweis einer negativen Wirkung
auf den darunter liegenden Cortex wurde beobachtet.
-
Am
siebten Tag waren die Hauptunterschiede zwischen den zwei Gruppen
das zelluläre
Infiltratat, die Vaskularität
und die Dicke des an der Defektstelle deponierten Bindegewebes.
Diese morphologischen Veränderungen
wurden in einer halbquantitativen Weise, wie in Tabelle 1 definiert,
verglichen. Dieses Vergleichsverfahren zeigte eine erhöhte Dicke,
erhöhte
Vaskularität
und größere zellulare
Infiltration der mit Submucosa behandelten Defekte gegenüber den
nicht mit Submucosa behandelten Kontrolldefekten. Die mononuklearen Zellen,
welche innerhalb und um das Submucosamaterial am siebten Tag gesehen
wurden, zeigten oftmals eine spindelförmige Gestalt und waren durch
die eosinophil anfärbendes
extrazelluläres
Matrixmaterial (ECM) umgeben. Das remodelierende Submucosamaterial
zeigte eine große
Anzahl von Gefäßen kapillarer
Größe im Gegensatz
zu jenen, die in den nicht mit Submucosa behandelten Kontrolldefekten
beobachtet wurden.
-
Nach
28 Tagen war das zelluläre
Infiltrat in den Submucosagefüllten
Defekten schwächer
geworden und die Menge an ECM war gestiegen. Das eosinophil anfärbende Bindegewebe
in und um die Submucosa zeigte eine Orientierung in der Richtung,
welche sich von einem Rand der durchtrennten Calvaria zu dem gegenüberliegenden
Rand erstrecken würde.
Es wurde ebenfalls eine moderate Organisation des Bindegewebes in
den nicht-submucosa Defekten gesehen; die Menge von anwesendem Material
war jedoch viel geringer als an den Submucosa-Defektstellen. Das
Submucosamaterial selber war am 28. Tag nicht unterscheidbar. Das ECM
erschien in diesen H & E
gefärbten
Abschnitten homogen. Das zelluläre
Infiltrat war an dem 28. Tag wesentlich geringer als an dem 7. Tag
und im Grunde genommen waren sämtliche
der anwesenden Zellen mit spindelförmig geschalteten Mesenchymalzellen
konsistent.
-
Gelegentliche
Adhäsionen
wurden zwischen dem ECM innerhalb der Defektstelle und dem darunter liegenden
cerebralen Cortex in sowohl der Submucosa- und der Nichtsubmocosa-Seite
festgestellt. Keine der Proben zeigten Veränderungen, die mit einer enzephalitischen
Degeneration oder einer Nekrosis konsistent waren.
-
BEISPIEL 2
-
Submucosales Gewebe als
ein Duralersatz in dem Hunde-Modell.
-
Experimentelle Ausgestaltung
und chirurgische Prozedur
-
Bastardhunde
mittlerer Größe (20 – 30 kg)
wurden anästhesiert,
intubiert und in der supinierten Brustbeinposition (Einleitung mit
2% Thiopental 1,0 mg/kg, intravenös; Aufrechterhaltung mit Isofluran
1%–2%;
Atropin 0,5 mg/ml, intravenös)
platziert. Eine Augensalbe wurde verabreicht. Die Kopfhaut wurde
rasiert, mit Chlorhexadin behandelt und mit 1% Lidocain infiltriert.
Durch einen Einschnitt in die Kopfhaut entlang der Mittellinie und
nachfolgendem Einschnitt der Fascia an der oberen Schläfenlinie
wurde der Schläfenmuskel
unter lateraler Exposition der parietalen Konvexität angehoben.
Ein 2 × 3
cm das Schläfenbein
betreffende Kraniotomy wurde mit einem elektrischen Handbohrer und
einer Knochenfräse
durchgeführt.
Blutende Knochenränder
wurden gewachst. Die Dura wurde von der Kraniotomy-Stelle unter
Vergrößerung der
Schleife herausgetrennt. Es wurde Sorge dafür getragen, eine Verletzung
des darunter liegenden zerebralen Cortex zu vermeiden.
-
Das
submucosale Gewebetransplantatmaterial wurde geerntet und durch
Aussetzung gegenüber 0,1%iger
der Essigsäure
in 20%igem Ethanol für
120 Minuten sterilisiert. Das Material wurde auf die geeignete Größe geschnitten
und mit den verdichteten basalen Schichten der Tunica mucosa auf
den zerebralen Cortex platziert und mit einer umsponnenen Nylonnaht
gesichert. Bei fünf
Tieren wurde eine kontralaterale Prozedur durchgeführt, in
welcher die herausgeschnittene autologe Dura verwendet wurde, um den
Defekt zu schließen und
dadurch als eine Kontrolle für
die Wirtsantwort auf die operative Prozedur zu dienen.
-
Bei
drei Tieren wurde 60 Tage nach dem Beginn der Prozedur die kontralaterale
Seite einer duralen Heraustrennung mit einem Ersatz durch Darmsubmucosa
unterworfen. Der kraniotomische Hautlappen wurde ersetzt, die Wunde
mit normaler Salzlösung
ausgespült
und mit Klammern verschlossen. Tribiotische Salbe, ein steriler
Kopfverband und ein elisabethanischer Kragen wurden angewandt. Eine
antibiotische Behandlung bestehend aus Cephalexin 1000 mg, PO, b.
i. d., einen Tag vor der Operation und für drei Tage nach der Operation
wurde verabreicht. Eine unmittelbar nach der Operation stattfindende
Versorgung umfasste die Abdeckung mit einer Decke und Überwachung
der Herztätigkeit
und Atmung. Nachoperativer Schmerz wurde mit Butorphanol (2,4 mg,
intramuskulär)
und Acepromazin (2,0 mg, intramuskulär) behandelt. Die Tiere wurden hinsichtlich
des Auftretens von Anfällen
oder neurologischen Defiziten, Appetit und Flüssigkeitsaufnahme und Gewicht überwacht.
Eine Tötung
erfolgte durch eine Überdosis
an Barbiturat (150 mg kg, intrakardial) nach 7, 30, 60, 90 und 120
Tagen nach der einleitenden Transplantatanordnung und 7, 30 und
60 Tage nachfolgend der wiederholten Aussetzung gegenüber submucosalem
Darmgewebe. Der Tötung
vorausgehend wurden 5 cc von CSF über eine subokcipitale Punktion
aspiriert und bezüglich
verschiedener Zellzählungen
untersucht.
-
Histologische
Präparation
und Auswertungen
-
Nachfolgend
der Tötung
wurde der Kopf und Nacken der Hunde mit Formalin über Herzschlagaderarterienkatheter
durchströmt.
Das Kranium wurde anschließend
in Formalin fixiert und entkalkt. Nach der Einbettung in Paraffin
wurden 6 um dicke Abschnitte der chirurgischen Stellen herausgeschnitten,
mit Hematoxilin und Eosin gefärbt
und für
eine histologische Untersuchung präpariert. Die untersuchten Gewebe
schlossen die Zwischenbereiche des Transplantats mit dem zerebralen
Cortex, Knochen und Kopfhaut ein.
-
Ergebnisse
-
Sämtliche
acht Hunde wurden ohne Ereignis von dem Verfahren ohne Nachweis
von Anfällen,
einer Infektion oder einem neurologischen Defizit zurückerhalten.
Eine wiederholte Transplantation wurde nicht durch einen klinischen
Nachweis einer Sensibilisierung gegenüber dem submucosalen Gewebe
begleitet.
-
An
dem siebten Tag nachfolgend der Implantation war eine intensive
mononukleare Zellantwort in das submucosale Darmgewebe mit extensiver
Neovaskularisation und Deposition von disorganisierter extrazellulärer Matrix
um das submucosale Gewebe vorhanden. Es bestand jedoch kein Nachweis
für eine
Involvierung des darunter liegenden zerebralen Cortex. Es war eine
geringe Anzahl von spindelförmig
geformten Zellen, die mit Fibroplasten konsistent sind, um und innerhalb
der Transplantatstelle vorhanden.
-
Bei
jeder Untersuchungszeit nachfolgend des Zeitraumes von sieben Tagen
(30, 60, 90 und 120 Tage) war ein gut organisiertes, eosinophil
anfärbendes,
dichtes Bindegewebe offensichtlich vorhanden, wobei kein Nachweis
bestand, dass das submucosale Gewebe nach dem sechzigsten Tag zurückblieb.
Keine meningozerebralen Adhäsionen
waren zu sehen. In den Hunden, welche einer zweiten Aussetzung gegenüber submucosalem
Darmgewebe unterworfen wurden, wurde eine Antwort gefunden, die
von denen mit einer einfachen Aussetzung gegenüber submucosalem Darmgewebe
nicht unterscheidbar war.
-
Bei
manchen Tieren wurde sowohl an der Teststelle als auch an der Kontrollstelle
eine geringe Entzündungsreaktion
der Pia mater benachbart dem Gehirn festgestellt. Da diese sowohl
an der Kontrollstelle als auch an der Teststelle anwesend war, repräsentiert
diese wahrscheinlich eine Antwort auf die chirurgische Prozedur.
Bei keinem Tier war ein Nachweis für eine Involvierung des zerebralen
Cortex selber gegeben. Eine Neovaskularisa tion war an den Zeitpunkten
des siebten und des dreißigsten
Tages in den Stellen des submucosalen Gewebes, verglichen mit den
Kontrollstellen, intensiver. Es bestand kein Nachweis für eine durch
das Immunsystem vermittelte Transplantatreaktion der Wirtsensibilisierung
in entweder den ursprünglichen
Implantaten oder in den reimplantierten Tieren. Es wurden keine
Abnormalitäten
in der Serumchemie oder CSF-Zytologie in irgendeiner der nachoperativen
Proben gefunden.
-
Diskussion
-
Gegenwärtige Optionen
für einen
Duralersatz umfassen autologe Materalien (z. B. Perikranium, Temporalis
fascia und Tensor fascia lata), lyopholizierte Leichenmaterialien
(z. B. Dura mater und Tensor fascia lata), xenogene Biomaterialien
(Perikardium vom Rind und Schaf, Dura des Rinds und rekonstituierten
Collagenschwamm vom Rind) und synthetische Materialien (z. B. expandiertes
polymeres Fluorethylen, silastische Lagen, Dacron-Lagen, Vicrylnetze).
Jedes dieser Materialien ist jedoch mit signifikanten Beschränkungen
verbunden.
-
Autologe
Materialien sind oftmals in der Menge nicht adäquat vorhanden und werden mit
der assoziierten Morbidität
von zusätzlichen
Schnitten erhalten. Die Handhabungscharakteristika von synthetischen
Lagen sind im Vergleich zu biologischen Materialien schlecht. Des
Weiteren wurden Bedenken bezüglich
des Langzeitrisikos von Blutungen aus Gewebereaktionen benachbart
zu dem Transplantat erhoben. Die Dura von Leichen ist teuer, in
ihrer Anwendung gelegentlich beschränkt und hat nur mäßige Handhabungscharakteristika.
Ihre dokumentierte Rolle als ein Vektor in der Übertragung der Jakob-Creutzfeld-Krankheit
beschränkt
sehr stark deren Anwendung. Gleichermaßen ruft ein kürzlicher
Nachweis der Transmission der schwammförmigen Encephalopathie von
Rindern auf Menschen Bedenken bezüglich neurologischer Gewebe
auf Rinderbasis hervor.
-
Die
Dura mater besteht primär
aus Typ I Collagen, und daher sind Produkte auf Collagenbasis vernünftige Kandidaten
für einen
Duralersatz. Des Weiteren besteht, obwohl eine relative biologische
Inertheit früher
als ein wünschenswertes
Charakteristikum des Transplantats betrachtet wurde, ein zunehmendes
Bewusstsein der potentiellen Vorteile einer induzierten günstigen
biologischen Antwort auf die Transplantation. In der Tat wurde es
gezeigt, dass Fibroblaste und Endothelialzellen entlang eines rekonstituierten
Collagengerüstes
eindringen und dieses durch neues synthetisiertes Collagen ersetzen.
Verschiedene auf Collagen basierende Präparationen wurden untersucht
und scheinen viele von diesen Charakteristika zu zeigen. Für einen Duralersatz
berichtete Präparationen
umfassen verarbeitete Haut und das Peritoneum von Schweinen, das Korium
und Perikardium von Rindern, das Perikardium von Schafen und mehrfach
rekonstituierte Produkte der menschlichen Plazenta. Eine Transplantatinkorporation
mit einer nachfolgenden Resorption wird für jedes dieser Materialien
berichtet. Des Weiteren erzeugten diese weder akute Immunantworten
noch epileptogene meningoencephalitische Narben, wenn diese am Cortex
appliziert wurden.
-
Nichtsdestoweniger
ist nur das Perikardium von Rindern kommerziell erhältlich.
Ein nicht auf Rindern basierendes Collagenpräparat mit günstigen biologischen Eigenschaften
scheint viele Vorteile zu haben, während viele Nachteile vermieden
werden. Das azelluläre
submucosale Material nach der vorliegenden Erfindung stellt ein
neuartiges Material für
Dura mater-Ersatzkonstrukte
bereit. Zusätzlich
zu der Abwesenheit einer nachteiligen immunologischen Antwort wird
eine unverkennbare Remodelierung des submucosalen Gewebes und Inkorporation
in das Wirtsgewebe demonstriert. Die endgültige Form des remodelierten
Duraltransplantats scheint histologisch von dem natürlichen
Gewebe unterscheidbar zu sein. Des Weiteren wird eine Aussetzung des
submucosalen Darmgewebes zwei Monate nachfolgend der einleitenden
Transplantation nicht durch nachteilige klinische Ereignisse begleitet.
Eine routinemäßige CSF-Zytologie
ergibt keinen Nachweis für
eine nachteilige Wirtsantwort auf das submucosale Gewebetransplantat.
-
Beispiel 3
-
In Vitro Wachstum und
Differenzierung von auf submucosalem Gewebe kultivierten neuronalen
Zellen.
-
Pheochromocytomazellen
(PC 12-Zellen) sind neuronale Zellen, welche als sphärische chromaffine Zellen
in der Abwesenheit eines Nervenwachstumsfaktors (NGF) wachsen aber
unter Bildung von sympatikus-artigen Neuronen bei der Exposition
gegenüber
der Behandlung mit einem Nervenwachstumsfaktor differenzieren. PC
12-Zellen sind eine etablierte und gut studierte Zelllinie, die
als Modellsystem verwendet worden ist, um eine neuronale Differenzierung
und Vermehrung zu studieren. Die Antwort von PC 12-Zellen auf die Exposition
gegenüber
verschiedenen Formen von submucosalem Gewebe (Dehydratisierung,
ETO, PAA) wurde untersucht, um zu bestimmen, ob submucosales Gewebe
die Differenzierung, Wachstum und Vermehrung von neuronalen Zellen
fördern
würde.
-
Zellkultur
-
Pheochromocytoma
(PC 12)-Zellen von Raten wurden von der American Type Culture Collection (Rockville,
MD) erhalten und wurden wie von Green Tishler (1983) beschrieben
kultiviert. Anfänglich
wurde den Zellen gestattet, zu wachsen, um in Monoschichten, die
an 75 cm Kunststoffkolben angehaftet waren, zusammenzufließen. Die
PC 12-Zellen wurden in RPMI 1640 medium, welches mit 10% Pferdeserum,
5% fötalem Rinderserum,
1% L-Glutamin und 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin
ergänzt
war, beibehalten. Die Zellen wurden in Kunststoffkulturenschalen
mit sechs Vertiefungen, die mit 0,2 mg/ml Collagen vorbeschichtet
waren, platziert. PC 12-Zellen, die als positive Kontrollmittel
dienten, wurden durch Behandlung mit Nervenwachstumsfaktor (NGF)
bei einer Konzentration von 50 mg/ml für 7 bis 10 Tage in RPMI in
Sympathoblast-artige Zellen differenziert. Das NGF enthaltende Medium
wurde jeden Tag während
dieses Zeitraumes ausgetauscht. Nach 10 Tagen in Kultur waren die
PC 12-Zellen unheilbar krank differenziert und zum Überleben
von NGF abhängig.
-
Chemikalien
-
Pferdeserum
und Rinderserum wurde von Hyclone (Logan, UT) bezogen. RPMI wurde
von Gibco BRL (Grand Island, NY) bezogen. Dünndarmsubmucosa wurde in Übereinstimmung
mit den in der vorliegenden Beschreibung beschriebenen Prozeduren
hergestellt. Sämtliche
andere Chemikalien wurden von Sigma Chemical Company bezogen.
-
1. Wachstum-
und Differenzierungsstudien
-
Um
zu demonstrieren, dass PC 12-Zellen auf Submucosagewebe differenzieren,
wurden Zellen (50.000/ml) in unbeschichteten Plastikkulturplatten
mit sechs Vertiefungen platziert, wobei jede Vertiefung 1 bis 2
Quadratinch an submucosalem Gewebe (dehydratisierte Submucosa war
als sterile Lage konserviert, ETO, PAA) und RPMI Medium für zehn Tage
enthielt. Die Submucosa wurde in kleine Stücke geschnitten und durch sterile
Zangen in Vertiefungen von Zellkulturplatten platziert und die Zellen
wurden auf die Submucosa pipetiert. Die Zellen wurden unter einem
invertierten Lichtmikroskop jeden Tag bezüglich der Veränderungen der
PC 12-Zellen beobachtet.
-
Alle
2, 4, 6, 8 und 10 Tage wurden Bilder aufgenommen, um den Grad der
Differenzierung der PC 12-Zellen durch quantitative Beobachtung
der Anzahl von Neuritis und der Neuritlänge zu vergleichen. Jedes Experiment
wurde dreimal (n = 3) in dreifacher Ausführung wiederholt. Eine Differenzierung
der Zellen wurde für
Zellen in direktem Kontakt mit dem submucosalen Gewebe sowie auch
für Zellen,
die nicht in direktem Kontakt mit dem in der Vertiefung anwesenden
submucosalen Gewebe waren, beobachtet.
-
Die
nachfolgenden Kontrollen wurden verwendet, um die experimentellen
Beobachtungen zu vergleichen, wobei jede Kontrolle (umfassend vier
Vertiefungen) für
dreimal (n = 3) wiederholt wurde.
-
Positive
Kontrolle: Die Zellen wurden in Kunststoffkulturplatten mit sechs
Vertiefungen, die mit 0,2 mg/ml Collagen vorbeschichtet waren, und
in Medien, die 50 mg/ml NGF enthielten, platziert. Die Zellen wurden
für 10
Tage in NGF enthaltendem RPMI wachsen gelassen, welches alle 2 Tage
ausgetauscht wurde.
-
Negative
Kontrolle 1: Die Zellen wurden in Kunststoffkulturplatten mit sechs
Vertiefungen, welche mit 0,2 mg/ml Collagen vorbeschichtet waren,
in Medien platziert, die kein NGF enthielten.
-
Negative
Kontrolle 2: In einer zweiten negativen Kontrolle wurden Zellen
in unbeschichteten Kunststoffkulturplatten mit sechs Vertiefungen
in Medien platziert, die kein NGF enthielten. Da die Zellen in dem
negativem Kontrollmedium 2 nach zwei bis drei Tagen begannen, zu
sterben und aufzuschwimmen, wurde diese Kontrolle verworfen und
keine experimentellen Daten wurden mit dieser Kontrolle verglichen.
-
Ergebnisse
-
Neuronale
PC12-Zellen, die auf submucosalen Gewebesubstraten in der Abwesenheit
von jeglichen zugefügten
Wachstumsfaktoren kultiviert wurden, differenzierten und vermehrten
sich und schienen auf dem Substrat zu migrieren. Eine zeitbasierende
Studie wurde durchgeführt
und Beobachtungen wurden nach 2, 4, 6, 8 und 10 Tagen der Kultivierung
gemacht, um die Expositionszeit des Submucosasubstrats mit Veränderungen
in der Differenzierung neuronaler Zellen zu korrelieren. PC12-Zellen
differenzierten auf dem Submucosasubstrat so früh wie einen Tag nach der Aussetzung.
An dem zweiten Tag bestand eine erkennbare Differenzierung im Vergleich
zu einer negativen Kontrollprobe. Eine größere Anzahl von Zellen differenzierten
jedoch und ein höherer
Grad der Differenzierung wurde in den Zellen nach zwei Tagen der
Kultivierung beobachtet. Die qualitativen Unterschiede zwischen
den Kontrollproben und experimentellen Zellen setzten sich nach
vier Tagen der Kultivierung fort: an dem vierten Tag zeigte die
positive Kontrollprobe einen höheren
Differenzierungsgrad als die auf der Submucosa wachsenden Zellen
und die negative Kontrollprobe zeigte schließlich den geringsten Grad an
Differenzierung.
-
Nach
sechstägiger
Kultivierung zeigte ein visueller Vergleich der Zellen unter dem
Mikroskop an, dass eine Erhöhung
in der Zellenanzahl vorlag. Viele Zellen schwammen jedoch auf und
klumpten. Dieses Ergebnis ist sehr typisch für in vitro PC12 Zellkulturen
und legt nahe, dass jene Zellen, die sich nicht differenzieren,
fortfahren sich zu vermehren und dass diese als ein Ergebnis einer
höheren
Anzahl von Zellen verklumpen. Auf Submucosa kultivierte Zellen hatten
an dem sechsten Tag keine bis sehr kleine Neuriten im Vergleich
mit einer positiven Kontrollprobe, und viele Zellen migrieren in
diesem Stadium auf der Submucosa. Ein höherer Differenzierungsgrad
wurde in Zellen beobachtet, die nicht in direktem Kontakt mit der
Submucosa in der Kulturplatte waren. Das heißt, dass jene PC12-Zellen unmittelbar
benachbart zu dem submucosalen Darmgewebe, aber nicht in direktem
Kontakt mit diesem, eine gute Differenzierung zeigten.
-
Histologische Studien
-
Eine
zeitbasierende histologische Analyse wurde verwendet, um zu untersuchen,
wann eine Zellmigration auf dem Submucosasubstrat auftritt und ob
oder nicht die migrierenden Zellen differenziert bleiben oder sich
in undifferenzierte Zellen und lose Neuriten verändern. Vertiefungen mit submucosalem
Material wurden mit PBS (2 ml) gespült und dann anschließend in
mit Salzlösung
gepuffertem Formalin (4 ml) über
Nacht fixiert, bevor sie weiter für eine Objektträgerpräparation
verarbeitet werden konnten. Zweifache Proben wurden am 2., 4., 6.,
8. und 10. Tag der zeitbasierenden Studien für eine Objektträgerpräparation
bereitgestellt. Objektträger
sind in der Präparation.
-
Experimente
wurden ebenfalls durchgeführt,
um zu demonstrieren, welche Seite der Submucosa (mucosal oder serosal)
in der Lage war, besser PC12-Zellen zu differenzieren. Verfahren
zur Platzierung von PC12-Zellen auf beiden Seiten der Submucosa
waren ähnlich,
wie oben beschrieben. Es wurde beobachtet, dass die mucosale Seite
der Submucosa zur Differenzierung der neuronalen Zellen im Vergleich
mit der anderen Seite der Submucosa besser geeignet erschien.
-
Um
die Wirkung von Gammabestrahlung auf die Differenzierung von PC12-Zellen
zu beobachten, wurden PC12-Zellen auf beiden Seiten von gammabestrahlter
Submucosa ausgesät.
Vorläufige
Ergebnisse zeigen an, dass der Differenzierungsgrad von auf gammabestrahlter
Submucosa kultivierten Zellen höher
war, als bei Zellen, welche auf regulärer Submucosa (hydratisiert,
ETO, PAA) kultiviert waren. Diese Studie wurde nur einmal (n = 1)
in dreifacher Ausführung
gemacht, so dass daher wiederholte Studien erforderlich sind, um die
Ergebnisse zu bestätigen.
Diese anfänglichen
Ergebnisse legen jedoch die Möglichkeit
von Gammabestrahlung zur Unterstützung
beim Zerbrechen/Stören
der mechanischen Struktur von Submucosa und der Freigabe von einigen
Arten von die Differenzierung fördernden
Faktoren nahe, um eine erhöhte
Differenzierung zu zeigen.
-
Um
die Wirkung einer physikalischen Bewegung der Kulturplatte ("mechanische Störungsstudien") auf die Zelldifferenzierung
zu bestimmen, wurden PC12-Zellen wie oben beschrieben auf Submucosa
ausgesät. Die
ausgesäte
Kulturplatte wurde für
fünf Tage nicht
bewegt und die Zellen wurden unter dem Mikroskop überwacht.
Das Experiment wurden einmal (n = 1) in sechs Vertiefungen ausgeführt. Eine
physikalische Bewegung der Kulturplatte resultierte in einem geringeren
Differenzierungsgrad, was impliziert, dass die Bewegungen der Kulturplatte
nach dem Aussäen
die Zelldifferenzierung stört.
-
Zwei
Experimente wurden in zweifacher Ausführung durchgeführt, um
die Wirkung der Veränderung des
Mediums auf die Zelldifferenzierung zu bestimmen. Das RPMI Medium
wurde am 2., 4., 6., B. und 10. Tag in den Vertiefungen ersetzt,
welche aus Zellen bestanden, die auf der mucosalen Seite der Submucosa
und der abluminalen Seite der Submucosa, der negativen Kontrollprobe
und Kontrollprobe ausgesät
waren, wobei Zellen auf einer unbeschichteten Platte ohne NGF ausgesät wurden.
Das Experiment wurde zweimal (n = 2) in dreifacher Ausführung wiederholt.
Ergebnisse aus dieser Studie zeigen an, dass eine Veränderung
in den Medien keine signifikante Wirkung bei der Zelldifferenzierung
unter Verwendung einer der Seiten der Submucosa und der negativen
Kontrollprobe hatte. In der Kontrollprobe schwammen jedoch die Zellen
nicht auf und starben so früh
wie die Kontrollzellen, die ohne eine Veränderung in den Medien kultiviert
wurden.
-
Beispiel 4
-
Neutralisationsstudien
von Antikörpern
von auf submucosalem Gewebesubstrat kultivierten PC12-Zellen
-
Materialien & Methoden
-
Zellen:
Pheochromocytoma (PC12)-Zellen von Ratten wurden von der American
Type Culture Collection (Rockville, MD) erhalten und wurden, wie
von Green Tishler (1983) beschrieben, kultiviert. Anfänglich wurden
die Zellen wachsen gelassen, um in Monoschichten zusammenzufließen, die
an 75 cm Kunststoffkolben angehaftet waren. PC12-Zellen wurden in
RPMA 1640 Medium, welches mit 10% Pferdeserum, 5% fötalem Rinderserum,
1% L-Glutamin und 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin
beibehalten. Die Durchläufe
3–4 wurden
für diese
Studien bei einer Konzentration von 40.000 Zellen/ml verwendet.
-
Kulturplatten:
Platten mit 12 Vertiefungen (Falcon) wurden über Nacht mit 1 ml einer Lösung von
0,2 mg/ml Rattenschwanzcollagen bei 37°C behandelt. Die mit Collagen
beschichteten Platten wurden für
die Experimente innerhalb von drei Tagen nach der Beschichtung verwendet.
-
Testmedien:
Vollständige
RPMI Medien und konditionierte Medien mit submucosalem Gewebe (STCM)
wurden in diesen Experimenten verwendet. STCM wurde durch Inkubierung
von serumfreiem RPMI 1640 Vorratsmedien mit PAA (0,1%) & mit Gammabestrahlung
(1 MRad) behandeltem submucosalem Gewebe bei einer Konzentration
von 2 g submucosalem Gewebe auf jeweils 15 ml der Medien hergestellt.
Die Behandlung erfolgte für
48 Stunden bei 37°C.
Das Serum und andere Ergänzungsmittel
wurden zu dem mit dem Medien behandelten submucosalem Gewebe zugefügt, um STCM
zu erhalten.
-
Wachstumsfaktoren:
Maus 7S-NGF (BT-5023) wurde von Harlan bezogen und wurde bei einer
Konzentration von 50 ng/ml verwendet. Rekombinantes Rinder FGF2
(1363–719)
wurde von Boehringer Mannheim bezogen und wurde bei einer Konzentration
von 10 ng/ml verwendet.
-
Antikörper: Anti-Mäuse NGF
(1087–754)
wurde von Boehringer Mannheim bezogen und wurde bei einer Konzentration
von 150 ng/ml verwendet. Kaninchen Anti-Rinder FGF2 (AB-33-NA) wurde
von R & D bezogen
und bei einer Konzentration von 40–50 μg/ml verwendet.
-
Verfahren:
PC12-Zellen wurden zweifach bei einer Konzentration von 40.000 Zellen/ml
in Platten mit 12 Vertiefungen enthaltend 0,5 ml an RPMI Medium
oder STCM plattiert. Wachstumsfaktoren und/oder Antikörper wurden
wie geeignet zugefügt.
Die Kulturen wurden bezüglich
der PC12-Differenzierung 48 Stunden nach der Plattierung durch Zählung von
3-20X Felder je Vertiefung ausgewertet.
-
Differenzierung:
PC12-Zellen wurden als differenziert betrachtet, wenn diese wenigstens
eine Neurit-artige Erweiterung zeigen, welche sich mindestens zwei
Zellkörperdurchmesser
von dem Zellkern erstreckte.
-
Ergebnisse
-
RPMI
Medienbehandlung: Es wurde entdeckt, dass sowohl NGF als auch FGF2
eine PC12-Differenzierung in den getesteten Konzentrationen induzierten.
Vertiefungen, die keine Wachstumsfaktoren enthielten, differenzierten
nicht. Es wurde beobachtet, dass die Wachstumsfaktoraktivität wirksam
durch die Zugabe der jeweiligen neutralisierenden Antikörper zu
dem Neuriteninduzierenden Faktor neutralisiert wurde. Die Zugabe von
anti-NGF zu den
FGF2 enthaltenden Vertiefungen blockierten ebenfalls die Differenzierung
in RPMI 1640 Medien, wobei eine Zugabe von anti-FGF2 zu den NGF
enthaltenden Vertiefungen die Differenzierung nicht änderte.
-
STCM
Behandlungen: STCM induzierte die Differenzierung von PC12-Zellen.
Die Differenzierung wurde wirksam durch die Zugabe von anti-FGF2
neutralisierenden Antikörpern
blockiert. Die Zugabe von anti-NGF neutralisierendem Antikörper hatte
keine Auswirkung auf die Differenzierung.
-
Schlussfolgerungen
-
- 1. STMC enthält eine Substanz, die eine
PC12-Differenzierung bewirkt. Die Wirkung dieser Substanz kann durch
die Zugabe von anti-FGF2 neutralisierendem Antikörper neutralisiert werden.
- 2. Eine PC12-Differenzierung in STCM wird nicht durch die Zugabe
von anti-NGF neutralisierendem Antikörper beeinflusst.
- 3. Der anti-NGF neutralisierende Antikörper kann mit Rinder FGF2 eine
Kreuzreaktion ergeben. Es ist ebenfalls möglich, dass der Antikörper nicht-spezifisch
an den FGF2-Rezeptor bindet.
-
Beispiel 5
-
Regeneration
des Ischiasnerv
-
Experimentelle Anordnung
und chirurgische Prozedur
-
Submucosales
Transplantatmaterial des Dünndarms
wurde in Schichtenform in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung hergestellt und durch Aussetzung
gegenüber
0,1%iger Peressigsäure
sterilisiert. Eine einzelne Lage von submucosalem Gewebe wurde in
der Gestalt eines Röhrchens
mit einem luminalen Durchmesser von ungefähr 2 mm gebildet und die gegenüberliegenden
Ränder
der Gewebelage wurden in Längsrichtung
entlang der Achse des Röhrchens
vernäht.
Das Lumen des submucosalen Geweberöhrchens wurde mit einer Suspension
von zerkleinertem submucosalem Gewebe unmittelbar vor der Implantation
des Transplantatkonstrukts in die Ratte gefüllt.
-
Elf
Sprague-Dawley Laborratten mittlerer Größe wurden anästhesiert
(Ketamin 90 mg/kg und Xylazin 10 mg/kg, I. M.) und ungefähr 6 bis
7 mm des tibialen Zweiges des Ischiasnervs wurden in jeder der Ratten abgetrennt.
Der abgetrennte Bereich wurde entweder durch ein leeres silastisches
Röhrchen
(welches als Kontrollprobe diente) oder ein mit fluidisiertem submucosalem
Gewebe gefülltes
Röhrchenkonstrukt
ersetzt. Die zwei durchtrennten Enden des tibialen Zweiges wurden
in die präparierten
Röhrchen
eingeführt,
ein abgetrenntes Nervenende wurde in das erste Ende des Röhrchens
und das andere abgetrennte Nervenende wurde in das gegenüberliegende
Ende des Röhrchens
eingeführt,
so dass eine Lücke
von ungefähr
6 bis ungefähr
7 mm die beiden Enden des durchtrennten tibialen Zweiges trennte.
Fünf der
Ratten dienten als Kontrolle, bei denen die durchtrennten Nervenenden
innerhalb eines leeren silastischen Röhrchens angeordnet waren, und bei
sechs Ratten waren die durchtrennten Nervenenden in die submucosalen
Geweberöhrchen
in direktem Kontakt mit dem fluidisierten submucosalen Gewebe eingeführt (siehe
Tabelle 2). Die Transplantatkonstrukte wurden in ihrer Lage durch
Annähen
an das umgebende Gewebe fixiert. Die Wunde wurde mit normaler Salzlösung gespült und mit
Klammern geschlossen. Unmittelbar erfolgende postoperative Nachsorge
umfasste die Platzierung auf einem Heizkissen, Abdeckung mit einem
Handtuch, Umdrehen nach jeweils 15 Minuten bis zum Aufwachen und
der Bewegung und Überwachung
der Herztätigkeit
und Atmung.
-
Die
Tiere wurden täglich überwacht
und nach 30 Tagen wurde beobachtet, dass sämtliche Ratten ihre Beine nur
dazu benutzen, um sich abzustoßen.
Kein Greifen wurde beobachtet. Vier Tiere wurden am 23. August 1997
getötet.
Die zwei Ratten mit implantierten silastischen Röhrchen zeigten einige Anzeichen
von neuronalem Gewebewachstum und ein gewisses gerichtetes Wachstum
entlang der Röhrchenachse.
In den Röhrchenkonstrukten
mit submucosalem Gewebe erschien es jedoch, dass die durchtrennten
Enden des tibialen Zweiges sich wieder miteinander verbunden hatten.
-
Tabelle
2
Experimentelle Zeittabelle
