DE69127235T2

DE69127235T2 - Biologisch verträgliche perforierte Membranen und ihre Verwendung als Kunsthaut

Info

Publication number: DE69127235T2
Application number: DE69127235T
Authority: DE
Inventors: Gabriella Calderini; Valle Francesco Della; Alessandro Rastrelli; Aurelio Romeo
Original assignee: Fidia SpA
Current assignee: Fidia Farmaceutici SpA
Priority date: 1990-06-01
Filing date: 1991-05-28
Publication date: 1997-12-04
Anticipated expiration: 2011-05-29
Also published as: EP0462426A1; JP3202257B2; FI108918B; IT9020513A1; HU911834D0; TW208652B; IE911825A1; DE69127235D1; AR244354A1; NO912058D0; US5658331A; IL98255A; PT97832B; AU7806691A; NO303562B1; BR9102225A; JPH04231061A; CA2043527C; HU215534B; ATE156689T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft neue biokompatible perforierte Membranen, Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Verwendung als Träger beim in vitro Wachstum von epithelialen Zellen, auf diese Weise erhaltene künstliche Haut und ihre Verwendung bei Hauttransplantaten.

STAND DER TECHNIK

Der Verlust von kutanem Material aufgrund von traumatischen oder pathologischen Ursachen wird üblicherweise durch Autotransplantationstechniken ausgeglichen, wobei Hautexplantate aus Spendergebieten verwendet werden. Zur Abdeckung größerer Flächen können diese Explantate mit chirurgischen Methoden, wie z. B. dem vorn J. Mauchahal, J. Plast. Surgery, 42, 88- 91 (1989) beschriebenen "mesh grafting" ausgedehnt werden. Diese Verfahren liefert positive Ergebnisse nur mit Verletzungen von kleinem Umfang und Patienten mit einem zufriedenstellenden allgemeinen gesundheitlichen Zustand. Falls ältere Patienten oder solche, die sich in einem Stadium ernsthaftem Verfalls befinden, behandelt werden, werden ungenügende Ergebnisse erhalten und es kommt zu einer Anzahl von Problemen in einem solchen Ausmaß, daß diese Verfahren nicht angewendet werden können. Ferner erlauben sie keine Streckung des Spendergewebes auf mehr als 10-fach.
Ein wichtiger Wendepunkt bei der Behandlung dieser Verletzungen durch rekonstruktive Chirurgie war die Entwicklung einer Technik, an der die in vitro-Kultur von Keratinocyten beteiligt ist (J. Rheinwald und H. Green, Cell, 6, 331-344, 1975), welches die in vitro-Expansion dieser Kulturen unter Erhalt epidermaler Zellmembranen, die potentiell zur Abdeckung von Verletzungsgebieten geeignet sind, ermöglichte.
Diese Technik wird weit verbreitet in der klinischen Praktik angewandt, am meisten bei Patienten, die an Verbrennungen leiden (G. G. Gallico et al., M. Engl. J. Med., 311, 448-451, 1984), jedoch ergeben sich zahlreiche Probleme aus diesem Konzept, wie z. B., daß es nicht gelingt, einige Transplantate abzunehmen, die Fragilität des Epithelialfilms und die daraus resultierende Schwierigkeit bei seiner Handhabung durch den Chirurgen, die Dauer der Zeit, die für den Erhalt ausreichender Mengen an Epidermiskulturen erforderlich sind und die Schwierigkeit, Donorgebiete mit ausreichender Größe von Patienten zu erhalten, bei denen große Bereiche der Körperoberfläche geschädigt sind. Die in vitro-Epidermiskulturen erfordern auch eine präzise Orientierung, um die Aufnahme des Transplantats zu ermöglichen, wobei dies eine besonders risikoreiche Maßnahme ist im Hinblick auf die Fragilität des in vitro kultivierten Epidermisfilms.
Ein unterschiedlicher Ansatzpunkt zu diesen Problemen wird von Yannas et al., Science, 215, 174-176 (1982) beschrieben, der Hautsubstitute in Form von resorbierbaren porösen Materialien benutzt, die aus Copräzipitaten von Kollagen und Glycosaminoglycanen (GAG), insbesondere Condroitin-6- sulphat, bestehen, die durch einen dünnen Silikonmembranfilm abgedeckt sind. Die Eigenschaft dieser Materialien ist, daß sie nicht-standardisierte Poren enthalten, die in einer Weise ähnlich wie ein Schwamm miteinander kommunizieren.
Zang et al., schlagen in Burns, 12, 540-543 (1986) ein Verfahren vor, bekannt als Mikrohautverpflanzung, das aus dem Autoverpflanzen sehr kleiner Hautteile besteht, die sich dann unter Verschmelzung zu einem einzelnen Epithel entwickeln. Mit diesem Verfahren ist das maximale Donoroberflächen/abgedeckte Oberflächen-Expansionsverhältnis 1:15.
S. Boyce und J. Hansborough in Surgery, 103, 421-431 (1988) und S. T. Boyce beschreiben in WO-A-88-08305 die Verwendung von Membranen, gebildet aus Kollagen und GAG, zur Förderung des Wachstums von Keratinocyten auf ihrer Oberfläche, wodurch auf diese Weise die Oberflächenporosität des Materials vermindert wird. Es wird auch eine kontinuierliche nicht-poröse Schicht dazwischengelegt, um die Entwicklung der Epidermiskultur auf der Membranoberfläche zu begrenzen. Der Verbundhautersatz, der auf diese Weise erhalten wird, hat eine unidirektionale Applikationsrichtung und ist weniger wirksam bei der Verminderung von Wundkontraktion als ein Autotransplantat oder Xenotransplantat. Die mögliche Antigenizität dieser Hautsubstituenten, welches zu einer Abstoßung des Transplantats führen kann, wurde bislang noch nicht ausreichend sichergestellt.

AUFGABE DER ERFINDUNG

Die Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von biokompatiblen Membranen, welche die in vitro-Kultur von Keratinocyten ermöglichen, wobei die Kulturentwicklung in einer viel kürzeren Zeit als zuvor möglich ist. Ein wichtiges Ergebnis dieser Membranen gemäß der Erfindung ist die Fähigkeit eine Kolonisierung durch homologe oder heterologe Epithelialzellen in einer Zeit zu erreichen, die überraschend kurz (6 bis 10 Tage) im Vergleich zu der Zeit ist, die normalerweise nach traditionellen Verfahren zur Herstellung von vergleichbaren Gebieten von in vitro-Epidermiskultur erforderlich ist (20 bis 40 Tage).
Dieser Vorteil führt zur Herstellung von künstlicher Haut in kurzer Zeit, welches eine sehr rasche Abdeckung eines Gebiets erlaubt, auf dem Epithelialtransplantation erforderlich ist, wodurch die Risiken, die mit einem exzessiven organischen Flüssigkeitsverlust oder Infekt einhergehen, vermindert werden.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von biokompatiblen Membranen, welche die rasche Entwicklung von Keratinocytenkulturen mit einem hervorragenden Donoroberfläche/abgedeckte Oberflächenverhältnis von zwischen 1:20 bis 1:200 erlauben, wobei dies deutlich höher ist, als zuvor mit traditionellen Methoden erhältlich war.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer biokompatiblen und vorzugsweisen bioresorbierbaren künstlichen Haut, die in einer kurzen Zeit hergestellt werden kann, fest ist und einfach während der Transplantation gehandhabt werden kann, und darüber hinaus an der Verletzungsstelle unabhängig von ihrer ursprünglichen Orientierung im Kulturgefäß aufgebracht werden kann und leicht gelagert werden kann. Diesbezüglich ist ein Vorteil der erfindungsgemäßen künstlichen Haut, daß sie einfach gekühlt aufbewahrt werden kann, was den Aufbau einer Epithelialgewebebank, einschließlich Heterlogen, ermöglicht. Die Möglichkeit der Kryokonservierung vermindert auch deutlich oder eliminiert nach mindestens zwei Zyklen das antigene Potential der durch die Epithelialzellen exprimierten Oberflächenantigene.

BESCHREIBUNG

Diese und andere Aufgaben werden gelöst durch die erfindungsgemäßen biokompatiblen Membranen, die durch Materialien gebildet werden, die zu einer der folgenden Klassen gehören:
a) Materialien von natürlichem Ursprung, ausgewählt aus: Kollagen oder Präzipitaten von Kollagen und Glycosaminogylcanen, Zellulose, gellierten Polysacchariden wie Chitin, Chitosan, Pectinen oder Pectinsäuren, Agar, Agarose, Xanthangummi, Gellan, Algininsäure oder Alinaten, Polymannanen oder Polyglucanen, Stärke, natürliche Gummis und Mischungen davon;
b) bioresorbierbare Materialien von synthetischem Ursprung, ausgewählt aus: Polymilchsäure, Polyglycolsäure oder Copolymeren davon oder deren Derivaten, Polydioxanonen, Polyphosphazenen, Polysulphonen und Polyurethanen und Mischungen davon;
c) Materialien von synthetischem Ursprung, ausgewählt aus: Silikon, Silan oder Siloxangummi, Polytetrafluorethylen, Perfluorpolyethern, Polystyrol oder Vinylpolychlorid, Polyacrylat oder Derivaten davon, Polyhydroxyacrylat, Polyhydroxymethacrylat, Carboxyvinylpolymer und deren Derivaten, Maleinsäureanhydridpolymere und deren Derivate, Polyvinylchlorid, Polyvinylalkohol und deren Derivate, Polyethylen und Polypropylen und Mischungen davon;
d) Materialien von halb-synthetischem Ursprung&sub1; ausgewählt aus Kollagen, vernetzt mit Vernetzern ausgewählt aus Dialdehyden, Bicarbonsäuren oder Halogeniden davon, Diaminen und Estern von Hyaluron-, Gellan- und Algininsäuren,
mit einer Dicke von 10 bis 500 µm und Löchern mit einer Größe zwischen 10 und 1000 µm, dadurch charakterisiert, daß sie perforiert sind, und durch die Tatsache, daß die Löcher eine definierte und konstante Größe haben und eine geordnete Reihe bilden, worin sie durch einen konstanten Abstand von 50 bis 1000 µm voneinander getrennt sind.
Die Membranen bestehen vorzugsweise aus semi-synthetischen Derivaten von Hyaluronsäure, insbesondere Esterderivaten davon, wie solche beschreiben in Beispielen 6, 7 und 24 von EPA 0216453, angemeldet am 07.07.1986, wobei diese biokompatible und bioabbaubare Materialien sind, die zur Freisetzung von Hyaluronsäure an ihrer Anwendungsstelle in der Lage sind, wobei man fördernde Wirkung für gewebereparative Prozesse dieser Säure gut kennt. Ein weiteres Charakteristikum, welches diese Materialien besonders geeignet für die erfindungsgemäße Verwendung machen, ist, daß sie keine Intoleranzphänomene hervorrufen, da sie nicht immunogen sind.
Die biokompatiblen Membranen, die aus einer oder mehrerer der zuvor erwähnten Materialien bestehen, haben eine Dicke von 100 bis 500 µm und vorzugsweise von 20 bis 40 µm und sind charakterisiert durch das Vorhandensein einer geordneten Reihe von Löchern mit definierter konstanter Größe von 10 bis 1000 µm und vorzugsweise von 40 bis 70 µm, die voneinander durch einen konstanten Abstand von 50 bis 1000 µm und vorzugsweise 80 µm getrennt sind.
Kontinuierliche biokompatible Membranen aus einer oder mehrerer der zuvor erwähnten Materialien können nach in der Literatur beschriebenen konventionellen Verfahren hergestellt werden.
Die perforierten erfindungsgemäßen biokompatiblen Membranen werden erhalten unter Verwendung mechanischer Perforierungsvorrichtungen, wie geeignet angeordneten Lochmaschinen, oder Verfahren, welche die Verwendung von thermischen oder Ultraviolett-Lasern umfassen, die in einem Frequenzband arbeiten, so daß Löcher von der erforderlichen Größe und Abstand in der Membran erzeugt werden.
Das folgende Beispiel einer Herstellung einer erfindungsgemäßen perforierten biokompatiblen Membran dient nur zur Erläuterung.

BEISPIEL 1

Eine Membran aus Hyaluronsäurebenzylester mit 100%iger Veresterung (beschrieben in EPA 0216453, angemeldet am 07.07.1998) in Form eines Quadrats von 12 x 12 cm und 25 µm Dicke wurde unter Verwendung einer computerisierten UV-Laservorrichtung, die bei einer Frequenz von 273 µm unter den folgenden Bedingungen arbeitete, perforiert: Arbeitsfreguenz 200 Hz, Ausgangsenergie 250 mJ. Unter Verwendung eines geeigneten Screening-Systems wurden Löcher mit einem Durchmesser von 40 µm und einem Abstand von 80 µm, wie in den Figuren 1a und 1b gezeigt, erhalten.
Die erfindungsgemäßen perforierten biokompatiblen Membranen können vorteilhaft für die in vitro-Kultur von Epithelialzellen, insbesondere Keratinocyten, verwendet werden.
Zu diesem Zweck können die Membranen am Boden von Zellkulturgefäßen, auf Metallgitter oder einer anderen Struktur, die für Zellkulturen an der Luft/Kulturmedium-Zwischenschicht geeignet ist, fixiert werden, unter Verwendung von sterilem Vaselin, sterilem Silikon oder anderen Klebsystemen, die eine leichte Entfernung der Membran erlauben, oder durch Systeme, bei denen biologische Materialien, wie Kollagen, Fibrin oder Fibrinleim beteiligt sind. Diese Membranen können in Kulturmedien inkubiert werden, die für das Wachstum epithelialer Zellen entweder allein oder in Kombination anderer Zellen geeignet sind, z. B. als bestrahlte Fibroblasten, wie in der zitierten Literatur beschrieben, ohne daß innerhalb der für das Wachstum und die Lochkolonalisierung vorgesehenen Zeit Veränderungen in den mechanischen Eigenschaften auftreten, die ihre Handhabbarkeit und Festigkeit in Bezug auf die bestimmte Anwendung verschlechtern würden.
Einige der durchgeführten Untersuchungen sind im folgenden zur Erläuterung der Verwendung der erfindungsgemäßen Membranen beschrieben.

BEISPIEL 2

Der folgende Test wurde durchgeführt, um Abwesenheit einer Inhibierung durch Hyaluronsäure-derivatisierte Membranen auf das in vitro-Wachstum humaner Keratinocytzellkulturen zu zeigen.
Membranen, bezeichnet als HYAFF 11, die steril in Quadrate zu 2 x 2 cm geschnitten werden und die aus Hyaluronsäurebenzylester mit 100%iger Veresterung (wie in EP 0216453, angemeldet am 07.07.1986, beschrieben) bestanden, wurden auf die Bodenfläche von Kulturgefäßen mittels sterilem Silikon aufgebracht.
2 x 10&sup5; humane Keratinocyten wurden darauf in einem Volumen von 0,5 ml in Gegenwart von 4 x 10&sup5; während der zweiten Passage lethal bestrahlen 3T3-Fibroblasten ausgesät.
Die Kapseln wurden bei 37ºC 2 Stunden in einer 5%igen CO&sub2;-Atmosphäre inkubiert, um die Anhaftung der Zellen an die Matrix zu ermöglichen. Nach diesem Zeitraum wurden 5 ml CEC-Kulturmedium (Green H. et al., J. Proc. Nation. Acad. Sci., 76, 5665-5668, 1979) zugegeben und die Kapseln nochmals inkubiert. Das Kulturmedium wurde alle 2 Tage verändert. Die Zellen wurden mit Trypsin 9 Tage nach dem Aussäen behandelt und gezählt. Alle Experimente wurden in Doppelbestimmungen durchgeführt. ERGEBNISSE
Diese Ergebnisse zeigen, daß das verwendete Biomaterial keine inhibierende Wirkung auf Keratinocytkulturen hat.

BEISPIEL 3

WACHSTUM HUMANER KERATINOCYTEN UNTER VERWENDUNG DER PERFORIERTEN BIOKOMPATIBLEN ERFINDUNGSGEMÄSSEN MEMBRANEN, DIE NACH DEM IN BEISPIEL 1 BESCHRIEBENEM VERFAHREN ERHALTEN WURDEN

HYAFF 11-Membranen aus 100%ig veresterten Hyaluronsäurebenzylester (wie in EPA 0216453, angemeldet am 07.07.1986 beschrieben) in Form von Quadraten zu 3 x 3 cm wurden auf die Bodenfläche von Petri-Kapseln mit einem Durchmesser von 6 cm unter Verwendung von sterilem Vaselin angeklebt. Lethal bestrahlte 3T3-Fibroblasten wurden auf den Membranen in einer Konzentration von 700.000 Zellen pro Platte unter den in Beispiel 2 beschriebenen Bedingungen ausgesät. Nach Anhaftung der 3T3-Zellen, d. h. nach ca. 24 Stunden, wurde eine Zellsuspension von Humankeratinocyten, die aus Sekundärkulturen stammten, in einer Konzentration von 38.000 Zellen pro cm² zugegeben. Die Kulturbedingungen war zu denen, wie in Beispiel 2 beschrieben, analog. Die Entwicklung der Keratinocytenkultur wurde täglich unter Verwendung eines Phasenkontrastmikroskops verfolgt. Die Entwicklung der inokulierten Epithelialzellen wurde auf dem Membran beobachtet, wobei diese die Konfluenz 8 bis 10 Tage nach dem Aussäen erreichten.
Von besonderer Bedeutung ist die Tatsache, daß auch am zweiten Tag nach dem Aussäen zahlreiche Löcher Keratinocyten enthalten, wobei deren Wachstum innerhalb der Löcher aktiver ist als auf der Oberfläche, wobei sie ca. am 6. Tag ganz ausgefüllt werden (Fig. 2, 3 und 4).
Eine weitere Tatsache von großer Bedeutung ist, daß bei Analyse durch histologische Techniken die Zellen innerhalb der Löcher ein basaloides Aussehen zeigen, was durch die Erkenntnisse der Fig. dokumentiert wird, welche eine häufige Mitose (Fig. 5 und 6) zeigen, was auf eine hohe reproduktive Vitalität hinweist. Diese Erkenntnisse wurden durch immunhistologische Verfahren unter Verwendung spezifischer Antikörper (Mab) bestätigt.
Die innerhalb der Löcher gewachsenen Epithelialzellen können daher insgesamt als in einem aktiven Proliferationsstadium angesehen werden und sind daher wirksam auf Transplantationsgebieten einsetzbar.
Die erfindungsgemäße künstliche Haut, erhalten durch das vorstehende verfahren, besteht daher aus einer biokompatiblen und vorzugsweise bioresorbierbaren Trägermembran aus Materialien von natürlichem, synthetischem oder semi-synthetischem Ursprung und haben eine Dicke von 10 bis 500 µm und vorzugsweise von 20 bis 40 µm, und sind dadurch charakterisiert, daß sie in eine regelmäßige Anordnung von Löchern mit einer definierten und konstanten Größe zwischen 10 und 1000 µm haben, die voneinander durch einen konstanten Abstand von 50 bis 1000 µm voneinander entfernt sind, zusammen mit autologen oder heterologen Keratinocyt-Mikrokolonien im aktiven Proliferationsstadium, die innerhalb der Löcher vorliegen.
Diese künstliche Haut kann leicht durch den Chirurgen auf Grundlage der zu behandelnden Flächen geformt werden, und weist eine mechanische Festigkeit auf, welches die Handhabung und Vernähung ohne Schwierigkeiten ermöglicht. Nach Implantation auf dem Verletzungsgebiet erzeugen die Keratinocyt-Mikrokolonnien Wachstumskerne aus rasch wachsendem Epithelialgewebe, welches in einer kurzen Zeit vollständig das Gebiet, auf dem die Transplantation durchgeführt wurde, re-epithelialisiert.
Es wird verwendet, indem man es aus dem Kulturgefäß entnimmt, alle Spuren von Kulturmedium mittels einer sterilen physiologischen Lösung entfernt und es auf das zu behandelnde Gebiet aufbringt, ohne daß man besondere Aufmerksamkeit auf die Richtung des Aufbringens richten muß, da es gleichermaßen wirksam ist, wenn es, im Gegensatz zu traditionellen Keratinocytkulturen, auf beiden seiner zwei Seiten aufgebracht wird.
Die erfindungsgemäße künstliche Haut kann verwendet werden, um weitflächige Verletzungen der Körperoberfläche von traumatischem Ursprung, wie z. B. Verbrennungen, oder vom chirurgischen Ursprung, wie Entfernung von Gebieten bei der plastischen Chirurgie, oder pathologischem Ursprung, wie Statisgeschwüren oder Wundlegen, abzudecken.

Claims

1. Biokompatible Membranen, gebildet durch Materialien aus einer der folgenden Klassen:

a) Materialien von natürlichem Ursprung, ausgewählt aus: Kollagen oder Präzipitaten von Kollagen und Glycosaminogylcanen, Zellulose, gellierten Polysacchariden wie Chitin, Chitosan, Pectinen oder Pectinsäuren, Agar, Agarose, Xanthangummi, Gellan, Algininsäure oder Alinaten, Polymannanen oder Polyglucanen, Stärke, natürlichen Gummis und Mischungen davon;

b) bioresorbierbare Materialien von synthetischem Ursprung, ausgewählt aus: Polymilchsäure, Polyglycolsäure oder Copolymeren davon oder deren Derivaten, Polydioxanonen, Polyphosphazenen, Polysulphonen und Polyurethanen und Mischungen davon;

c) Materialien von synthetischem Ursprung, ausgewählt aus: Silikon, Silan oder Siloxangummi, Polytetrafluorethylen, Perfluorpolyether, Polystyrol oder Polyvinylpolychlorid, Polyacrylat oder Derivaten davon, Polyhydroxyacrylat, Polyhydroxymethacrylat, Carboxyvinylpolymeren und deren Derivaten, Maleinsäureanhydridpolymeren und deren Derivaten, Polyvinylchlorid, Polyvinylalkohol und deren Derivaten, Polyethylen und Polypropylen und Mischungen davon;

d) Materialien von halb-synthetischem Ursprung, ausgewählt aus: Kollagen, vernetzt mit Vernetzungsmitteln, ausgewählt aus Dialdehyden, Bicarbonsäuren oder Halogeniden davon, Diaminen und Estern von Hyaluron, Gellan und Algininsäuren,

mit einer Dicke von 10 bis 500 µm und Löcher mit einer Größe zwischen 10 und 1000 µm, dadurch gekennzeichnet, daß sie durchlöchert ist und durch die Tatsache, daß die Löcher eine definierte und konstante Größe haben und eine geordnete Reihe bilden, worin sie durch einen konstanten Abstand von 50 bis 1000 µm voneinander getrennt sind.

2. Biokompatible Membranen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Dicke von 20 bis 40 µm ist.

3. Biokompatible Membranen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Lochgröße von 40 bis 70 µm ist.

4. Biokompatible Membranen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Abstand zwischen den Löchern 80 µm ist.

5. Biokompatible Membranen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die biokompatible Membran aus 100%ig verestertem Hyaluronsäurebenzylester besteht.

6. Verfahren zur Herstellung von biokompatiblen Membranen nach Anspruch 1, umfassend die Perforierung einer kontinuierlichen Membran mit einem geeigneten Screening-System unter Verwendung von mechanischen oder Laser-Perforationsvorrichtungen.

7. Verfahren zur Herstellung von biokompatiblen Membranen nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die mechanische Perforierungsvorrichtung ein Locher ist.

8. Verfahren zur Herstellung von biokompatiblen Membranen nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß die Laserperforationsvorrichtung ein UV-Bestrahlungslaser ist.

9. Künstliche Haut, aufgebaut den biokompatiblen Membranen nach Anspruch 1 und aus Mikrokolonien von autologen oder heterlogen Keratinocyten oder anderen Epithelialzellen im aktiven Proliferationsstadium, die innerhalb der Löcher der biokompatiblen Membranen vorliegen.