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Hintergrund der Erfindung
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1. Gebiet der Erfindung
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Die Erfindung betrifft eine Zusammensetzung
zum Nachweisen oder Quantifizieren eines Proteins in einer Protein
enthaltenden flüssigen
Probe (z. B. Urin) bei einer niedrigen Konzentration bis zu einer
sehr geringen Menge.
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2. Kurze Beschreibung
des Standes der Technik
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Es ist klinisch wichtig, zu beurteilen,
ob eine Person ein Protein, wie Albumin oder dergleichen, ins Urin übermäßig ausscheidet
oder nicht. Selbst bei einer gesunden Person, d. h. in dem Fall
in dem die Niere normal funktioniert, wird eine äußerst geringe Proteinmenge
ausgeschieden und deren Gesamtmenge variiert von 50 bis 100 mg pro
Tag. Zusätzlich
ist bekannt, daß sich
die ausgeschiedene Menge nach dem Sport oder in Abhängigkeit
des Zustands des Körpers
erhöht,
und dies wird allgemein physiologische Proteinurea genannt. Nach
Analysen von Elektrophoresen stammen ungefähr 60% der in das Urin ausgeschiedenen
Proteine bei einem gesunden Menschen vom Blutplasma ab, und Albumin
mit einem Molekulargewicht von ungefähr 67.000 nimmt davon 70 bis
80% ein.
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Zusätzlich zu der physiologischen
Proteinurea wird die symptomatische Proteinurea in prärenale,
renale und postrenale Typen klassifiziert, und der Renaltyp wird
wiederum in Untertypen klassifiziert, z. B. vom glomerularen Ursprung,
tubularen Ursprung und dergleichen. Die prärenale Proteinurea ist eine
Folge von erhöhtem
Leck von Blutprotein in das Urin, die durch eine funktionelle Änderung
oder Störung
der spezifischen Organgewebe verursacht wird, und der Nachweis einer
solchen spezifischen Komponente ist direkt mit der Diagnose der
Krankheit verbunden. Ein typisches Beispiel davon ist das Bence-Jones-Protein,
das ein Tumormarker ist. Unter den Typen der renalen Proteinurea
wird die glomeruläre
Proteinurea, die beispielhaft für
Albumin und dergleichen ist, durch eine verringerte Filtrierung
der renalen glomerulären
Grundmembran verursacht, und das tubuläre Protein, das durch β2-Mikroglobulin
und α1-Mikroglobulin veranschaulicht wird, wird durch
die verringerte renale tubuläre
Reabsorptionsfähigkeit
verursacht, und beide Fälle
können
als ausgezeichnete Marker zum Verstehen des Grades der renalen Wirkungsverringerung
und renaler Störungen
verwendet werden. Die postrenale Proteinurea ist eine Proteinurea,
die ausgedrückt
wird durch zum Beispiel Bluten, Calculus, Tumore und dergleichen
in bestimmten Organen, wie dem renalen Becken, dem Harntrakt, der Blase,
der Harnröhre,
der Prostata und dergleichen, und wird zur Diagnose der oben beschriebenen
topischen Krankheiten verwendet.
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Unter der Vielzahl von die Proteinurea
messenden Verfahren hat ein Proteinfehlerverfahren unter Verwendung
von Tetrabromphenolblau (TBPB), das ein pH-Indikator ist, eine lange
Geschichte und wird immer noch als Screening-Inspektionsverfahren verwendet. TBPB
entwickelt eine gelbe Farbe in einer Lösung von pH 2 bis 3 und eine
blaue Farbe bei einem pH von 4 oder mehr, wird aber auch bei einem
pH von 3 blau wenn ein Protein in der Lösung vorhanden ist. Wenn ein
Testpapier, wie in Filterpapier oder dergleichen, mit TBPB zusammen
mit einem Puffer von pH 3 imprägniert
wird, wobei von diesem Phänomen
Verwendung gemacht wird, ändert
sich der Ton der blauen Farbe in Abhängigkeit der vorkommenden Proteinmenge,
wie Albumin oder dergleichen, im Urin, so daß der Grad der Proteinurea
durch den Farbton bestimmt werden kann.
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Jedoch kann dieses "Proteinfehlerverfahren" im allgemeinen kein
Protein von 10 bis 15 mg/dl oder weniger nachweisen. Da das Verfahren
ein Testpapierverfahren ist, ist der Nachweis darüber hinaus
qualitativ derart, z. B. "–" bis "±" bis "+".
Im allgemeinen ist das einzig nachweisbare Protein Albumin und Globulin,
das ungefähr
40% der Plasmaproteine einnimmt, wobei das oben beschriebene Bence-Jones-Protein
und dergleichen nicht nachgewiesen werden kann.
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Abgesehen von einem solchen qualitativen
Meßverfahren
gibt es eine Vielzahl von verschiedenen Verfahren, bei denen ein
Protein per se quantitativ nachgewiesen werden kann. Über 20 Jahre
wurde die Nephelometrie, als Beispiel gilt das Kingsbury-Clark-Verfahren,
als hauptsächliches
routinemäßiges Inspektionsverfahren
durchgeführt,
aber es weist Probleme auf, weil es kaum mit Proteinen außer Albumin
reagieren kann ähnlich
wie im Fall des Proteinfehlerverfahrens. Da das Verfahren ein manuelles
Verfahren ist, benötigt
es außerdem
Zeit und Arbeit zur Messung.
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Ein Farbstoff-Bindeverfahren unter
Verwendung eines Farbstoffes, zum Beispiel Pyrogallolrot mit einem
Metall, wie Molybdänum
oder dergleichen, wird jetzt am häufigsten als quantitatives
Bestimmungsverfahren verwendet. Gemäß diesem Verfahren können sehr
genaue Meßergebnisse
erhalten werden, nicht nur durch die manuelle Handhabung als auch
die Anwendung eines automatisierten Analysegeräts.
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JP-B-4-53263 (der Ausdruck "JP-B" wie hier verwendet
bedeutet eine "ungeprüfte japanische
Patentveröffentlichung") offenbart ein kolorimetrischen
Verfahren zur Bestimmung einer geringen Proteinmenge unter Verwendung
eines Farbstoffs, der einen Komplex mit Molybdänum bilden kann und seine Wellenlänge in der
Gegenwart eines Proteins verändert.
Das Basisprinzip dieses Verfahrens ist gut bekannt und wenn eine Substanz,
die an Molybdänum
bindet in einer Testprobe vorhanden ist, zeigt der Test einen negativen
Wert im Fall von normalem Urin, so daß die Absorption niedriger
wird als die bei der Messung von reinem Wasser.
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Zu diesem Zweck wird in JP-B-4-53265
die Maßnahme
ergriffen, zuvor in der Reagenszusammensetzung Molybdänum von
inhibierenden Substanzen fern zu halten, zum Beispiel durch Formulierung
eines Chelatbildners, der an Molybdänum bindet, oder durch Formulierung
eines Metallions, das an eine hemmende Substanz, wie Zitronensäure oder
dergleichen, bindet, die an Molybdänum bindet.
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JP-B-6-70632 offenbart außerdem ein
kolorimetrischen Verfahren zur Bestimmung einer kleinen Proteinmenge,
umfassend die Verwendung eines Polyhydroxybenzolsulfonphthalein-Farbstoffs
und/oder eines Polyhydroxybenzolphthalein-Farbstoffs, der einen
Komplex mit Wolfram bilden und seine Wellenlänge in der Gegenwart eines
Proteins ändern
kann, und eines Puffers, um die Zusammensetzung bei einem sauren
pH zu halten.
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Zusätzlich beschreibt eine Veröffentlichung "Color Reaction Between
Pyragallol Red-Molybdenum(IV) Complex and Protein", Y. Fujita, I. Mori
und S. Kitano, Analytical Chemistry, 32, S. E379–E386 (1983) Ergebnisse eines
Screeningstests für
Metalle und Farbstoffe, der als Verfahren zum Messen von kleinen
Mengen verwendet werden kann, wobei Verwendung von dem Proteinfehlerphänomen gemacht
wird. Der Farbstoff ist ein Polyhydroxybezolsulfonphthalein-Farbstoff
oder ein Polyhydroxybenzolphthalein-Farbstoff. Beispiele der zu
screenenden Metalle umfassen Molybdänum(VI), Wismut(III), Aluminium(III),
Eisen(III), Uran(VI), Zirkonium(IV), Antimon(III), Wolfram(VI),
Cerium(III), Zinn(IV), Zink(II), Mangan(II), Quecksilber(II), Silber(I)
UND Kadmium(II).
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JP-A-61 093 448 offenbart ein Silberhalogenid
fotoempfindliches Material. Die Emulsionsschicht umfasst eine Iridiumverbindung,
ein Silberhalogenid, das mit mindestens einem spezifischen sensibilisierenden Farbstoff
sensibilisiert ist und eine spezifische Verbindung. Von der Zusammensetzung
wird gesagt, daß sie die
Reziprozität
der Fehlereigenschaften verbessert, wobei sie nicht die Sensitivität und den
Abbau ändert, selbst
wenn die Belichtung verändert
wird.
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GB-A-10 68 715 offenbart thixotrope
Emulsionen, die auf wäßrigen Dispersionen
organischer Polymere basieren. Die thixotropen wäßrigen Emulsionen umfassend
ein filmbildendes Polymer oder Copolymer, eine Hydroxylgruppe enthaltend
organisches Kolloid und 0,1 bis 12,5 Gew.% einer wasserlöslichen
Metallverbindung auf Basis des Gewichts des Polymers oder Copolymers.
Die wasserlösliche
Metallverbindung kann inter alia Indiumchlorid sein.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Eine Aufgabe der Erfindung ist es,
eine kleine Proteinmenge in einer flüssigen Probe, wie Urin oder dergleichen,
durch ein neues Verfahren nachzuweisen oder zu quantifizieren.
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Diese und andere erfindungsgemässe Aufgaben
wurden erreicht durch eine Zusammensetzung, die eine Farbänderung
zeigen kann, die ausreicht, um das Vorhandensein und/oder die Konzentration
eines Proteins in einer Protein enthaltenden flüssigen Probe anzuzeigen, indem
sie mit der Probe in Kontakt gebracht wird, umfassend Indium oder
eine Indiumverbindung und einen Farbstoff oder ein Pigment, der
einen Komplex mit Indium bilden kann.
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Kurze Beschreibung
der Abbildungen
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1 ist
ein Diagramm, das das Ergebnis der Absorptionsmessung von Serienverdünnungen
einer Standardproteinlösung
unter Verwendung der erfindungsgemässen Zusammensetzung zeigt.
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2 ist
ein Diagramm, das die Korrelation zwischen der erfindungsgemässen Zusammensetzung und
einem vorherigen Verfahren zeigt.
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3 ist
ein Diagramm, das das Ergebnis einer Absorptionsmessung zeigt, wenn
ein Chelatbildner zu der erfindungsgemässen Zusammensetzung gegeben
wird.
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4 ist
ein Diagramm, das den Vergleich der erfindungsgemässen Zusammensetzung
mit einem vorherigen Verfahren zeigt, wenn ein Chelatbildner zugegeben
wird.
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Kurze Beschreibung
der Erfindung
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Erfindungsgemäss kann ein Protein in einer
Testprobenlösung
in einem geringen Gehalt gemessen werden, von einer kleinen Konzentration
bis zu einer geringen Menge, unter Verwendung einer Indikatorreagenszusammensetzung,
enthaltend eine neu verbesserte Indiumverbindung/Farbstoff oder
Pigmentkomplex, so daß es
möglich
wird, ausreichende Sensitivität
für ein
Protein zu erreichen bei einer so niedrigen Menge und um Änderungen
des Farbtons ausreichend visuell zu bewerten. Insbesondere kann
ein Protein in einer geringen bis sehr geringen Menge gemessen werden
und ein Proteingehalt von 0 mg/dl bis ungefähr 2.00 mg/dl, insbesondere
von 0 mg/dl bis ungefähr
30 mg/dl, kann im Urin quantitativ gemessen werden. Unter Verwendung
der erfindungsgemässen
Reagenszusammensetzung kann außerdem
ein Protein im Urin in einem Gehalt von einer kleinen Konzentration
bis zu einer sehr geringen Menge, wie zwischen 0 mg/dl und ungefähr 30 mg/dl,
zwischen 0 mg/dl und ungefähr
5 mg/dl oder zwischen ungefähr
5 mg/dl und ungefähr
10 mg/dl nachgewiesen und gemessen werden. Ruf die gleiche Weise
kann eine solche Proteinmenge in einer Spinalflüssigkeit gemessen werden.
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Die erfindungsgemässe Reagenszusammensetzung
eignet sich zur Messung bei nassen Bedingungen, wie einem flüssigen Reagens,
und außerdem
bei trockenen Bedingungen, bei denen die Reagenszusammensetzung
einheitlich in einen Träger
eingeführt
wird. Beispiele des Trägers
bei trockenen Bedingungen umfassen wasserabsorbierbare poröse Materialien,
wie Filterpapier, nicht-wasserabsorbierbare Materialien, wie eine
Membran, die aus einem durchlässigen
Polymer hergestellt ist, und geknetete Materialien der wasserlöslichen
Polymere. Die Reagenszusammensetzung wird in den Träger einheitlich über seinen
gesamten Teil bei einer solchen vorbestimmten Konzentration eingeführt, daß die flüssige Probe
in den Träger
eindringen kann.
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Anders als im Fall von JP-B-4-53265
ist es nicht notwendig, einen Chelatbildner vorher in der Reagenszusammensetzung
zu formulieren, um Indium von inhibierenden Substanzen zu trennen
oder Metallione zu formulieren, da Zitronensäure oder dergleichen, die an
Molybdänum
binden, keine inhibierenden Substanzen für Indium sind.
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Die vorliegende Erfindung macht daher
von dem Phänomen
Gebrauch, daß der
Polyhydroxybenzolsulfonphthalein-Farbstoff oder ein Polyhydroxybenzolphthalein-Farbstoff,
wie Pyrocatecholviolett, Pyrogallolrot, Brompyrrogallolrot, Xylenolorange,
Pyrogallolphthalein, o-Hydroxyhydrochinonphthalein oder dergleichen, einen
Komplex mit Indium bilden und daß der so gebildete Komplex
an ein Protein bindet, um die Wellenlänge zu ändern. Sie können entweder
allein oder in Kombination verwendet werden. Die durch die Erfindung
erhaltene Zusammensetzung kann verwendet werden, um in ein Testreagens
eines flüssigen
Systems oder in ein einfaches Teststück eines trockenen Systems
verarbeitet zu werden.
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Die Indiumverbindung, die im Indium/Farbstoff
oder Pigmentkomplex verwendet wird, ist nicht besonders beschränkt. Jedoch
sollte die Indiumverbindung ausreichend in Wasser löslich sein,
um einen Komplex mit dem oben beschriebenen Polyhydroxybenzolsulfonphthalein-Farbstoff
oder Polyhydroxybenzolphthalein-Farbstoff zu bilden. Darüber hinaus
ist es bevorzugt, daß das
Kation der Indiumverbindung erfindungsgemäss im wesentlichen nicht gefärbt ist,
um Störungen
der Messung durch Kationen mit einem hohen Färbegrad zu vermeiden. Beispiele
der Indiumverbindung mit ausreichender Löslichkeit in Wasser zur Bildung
eines Komplexes mit dem Polyhydroxybenzolsulfonphthalein-Farbstoff
oder dem Polyhydroxybenzlphthalein-Farbstoff umfassen Indiumsulfat,
Indiumchlorid, Indiumbromid, Indiumnitrat und Ammoniumindiumbisulfat.
Sie können
allein oder in Kombination verwendet werden.
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Bei einem flüssigen System unter Verwendung
der erfindungsgemässen
Reagenszusammensetzung liegen die Mengen an Indium und eines Farbstoffs
oder Pigments, das mit Indium in der Reagenszusammensetzung einen
Komplex bilden kann, bevorzugt bei 10 bis 400 μmol bzw. 10 bis 250 μmol, und
das Molverhältnis
von Indium und dem Farbstoff oder Pigment ist bevorzugt entweder
1 : 10 bis 1 : 1 oder 5 : 1 bis 1 : 1. Auf der anderen Seite kann
in einem trockenen System der obige Mengenbereich und das Molverhältnis angewendet
werden, jedoch können
die Mengen auch höher
sein.
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Jeder Puffer kann erfindungsgemäss verwendet
werden, solange er das Reagensreaktionssystem bei einem konstanten
pH hält,
der ausreicht, um Änderungen
im Farbton zu erzeugen, die als Indikatorreagenszusammensetzung
erforderlich sind, und der im wesentlichen die Änderungen des Farbtons entfernen
kann, die durch Fluktuation des pHs einer zu messenden Protein enthaltenden
Probe verursacht wird. Die Eigenschaften der Pufferänderung
hängen
von dem Komplex der Indiumverbindung/Farbstoff oder dem Pigment
in der Indikatorreagenszusammensetzung ab. Auf der anderen Seite
hängt die
Puffermenge von den Eigenschaften jeder zu messenden Probe ab. Im
allgemeinen liegt die Puffermenge in der Reagenszusammensetzung zwischen
ungefähr
100 mmol und ungefähr
500 mmol.
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Obgleich es bevorzugt ist, einen
Puffer in der Reagenszusammensetzung zu verwenden, ist es nicht immer
notwendig, den Puffer hinzuzufügen.
Zum Beispiel kann die gleiche Wirkung erreicht werden, indem zunächst eine
Zusammensetzung hergestellt wird, die sich ausschließlich aus
Indium oder einer Indiumverbindung und einem Farbstoff oder Pigment,
das einen Komplex mit Indium bilden kann, zusammensetzt, wodurch ermöglicht wird,
daß die
Reagenszusammensetzung mit der zu messenden Probe in Kontakt gebracht
wird und anschließend
ein Puffer hinzugefügt
wird, der das Reaktionssystem bei einem sauren pH hält. Das
heißt, es
ist auch ein System, bei dem ein Puffer zu dem Urin im voraus gegeben
wird und der Fall, bei dem die zu messende Probe bereits eine geeignete
Menge einer geeigneten puffernden Substanz enthält, eingeschlossen.
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Beispiele des sauren Puffers, der
erfindungsgemäss
verwendet werden kann, umfasst einen Glycinpuffer (z. B. Glycin/Salzsäure), Lactat,
Phthalat, Succinat, Trichloracetat, Sulfosalicylat, Phosphate, Acetate, Natriumchlorid/Salzsäure, Piperazin-N,N'-bis(2-hydroxypropan)sulfonsäure (POPSO),
N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES),
3-N-(Trishydroxymethyl)methalamino-2-hydroxypropansulfonsäure (TAPSO)
und 2-((Tris-(hydroxymethyl)methyl)amino)ethansulfonsäure (TES)
und andere saure Puffer, die im Stand der Technik gut bekannt sind
und einen pH-Wert von 2,0 bis 4,0, bevorzugter von 2,2 bis 2,7 halten.
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Die erfindungsgemässe Reagenszusammensetzung
kann außerdem
eine optionale Komponente enthalten, die ein oberflächenaktives
Mittel, das die Eigenschaften und Wirkungen des Komplexes der Indiumverbindung/Farbstoff
oder Pigment und Puffer nicht wesentlich ändert und nicht die Proteinmessung
beeinträchtigt.
Zusätzlich
besteht die Möglichkeit
des Erhöhens
der Reaktivität
mit dem Protein durch Zugabe eines oberflächenaktiven Mittels, wobei
die Zugabe eines oberflächenaktiven
Mittels (obgleich auf eine Reaktionslösung eines flüssigen Systems
beschränkt)
eine Wirkung aufweist, das Färben
im Inneren der Reaktionszelle zu vermeiden. Das oberflächenaktive
Mittel kann entweder ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel oder ein
anionisches oberflächenaktives
Mittel sein. Die Menge des oberflächenaktiven Mittels in der
Reagenszusammensetzung ist bevorzugt ungefähr 0,001 bis 1 Gew.%.
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Geeignete Beispiele des nichtionisches
oberflächenaktiven
Mittels umfassen die Tritonreihe, Methylcellulose, Polyvinylalkohol
und die Brijreihe. Geeignete Beispiele des anionischen oberflächenaktiven
Mittels umfassen Natriumlaurylsulfat, Natriumlaurylbenzolsulfonat
und Polyacrylsäure.
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Beispiele anderer nicht wichtiger
Komponenten umfassen eine Polymerverbindung, einen Weichmacher und
einen Farbstoff, der als inerte Basis verwendet wird.
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Zusätzlich beschreibt JP-B-6-70632,
daß Chelatbildner
nicht in dem Reagens enthaltend sind und daß Chelatbildner die Messung,
wenn sie enthalten sind, sogar beeinträchtigen. Jedoch ist ein weiteres
erfindungsgemässes
wichtiges Merkmal, daß die
erfindungsgemässe
Zusammensetzung glatt verläuft
selbst wenn Chelatbildner enthalten sind. Zum Beispiel verursacht
die Messung keine falschen Ergebnisse, wenn das Reagens oder Urin
eine Verbindung enthält,
die chelatbildende Wirkung aufweist, wie ein Glycinpuffer, Tartarsäure, Oxalsäure, Zitronensäure, Iminodiessigsäure (IDA)
oder dergleichen.
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Die vorliegende Erfindung kann auf
ein Teststück
vom trockenen Typ aufgetragen werden, das gemäss einem allgemeinen Herstellungsverfahren
für ein
trockenes Teststück
erhalten wird. Zum Beispiel kann es hergestellt werden durch Imprägnieren
eines Stücks
eines wasserabsorbierbaren porösen
Materials, wie Filterpapier, mit einer wäßrigen Lösung der erfindungsgemässen Reagenszusammensetzung,
Trocknen des Stücks
und anschließendes
wahlweises Auftragen auf ein wasser-nicht-permeables Material, das
als Handstück
verwendet wird.
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Eine geringe Proteinmenge in einer
flüssigen
Probe kann nach dem erfindungsgemässen Verfahren durch Zeigen
einer Farbänderung,
die ausreicht, um die Gegenwart und/oder Konzentration des Proteins
in der Probe anzuzeigen, quantifiziert werden.
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Beispiele der vorliegenden Erfindung
sind nachfolgend durch Veranschaulichung dargestellt, sind aber als
nicht beschränkend
anzusehen.
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Beispiel 1
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Eine Reagenslösung mit der folgenden Zusammensetzung
wurde hergestellt durch Auflösen
der Reagenzien der folgenden Formulierung in gereinigtem Wasser.
| Brompyrogallolrot
(Dojindo Laboratories) | 0,05
mmol |
| Indiumsulfat
(Nakalai Tesque, Inc.) | 0,05
mmol |
| Succinatpuffer
(Succininsäure
+ Natriumhydroxid) | pH
2,7 |
| Natriumlaurylsulfat
(Nakalai Tesque, Inc.) | 0,1% |
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Als Standardproteinlösung wurde
Humanserumalbumin auf 200 mg/dl eingestellt. Unter Verwendung dieser
Lösung
wurden Serienverdünnungen,
die die jeweiligen in der X-Achse der 1 gezeigten
Konzentrationen aufweisen, hergestellt. Die Reagenslösung (350 μl) wurde
zu 5 μl
der jeweils so hergestellten Proben hinzugefügt, und die Mischung wurde
bei 37°C
10 Minuten inkubiert, um eine Absorption bei 600 nm zu messen. Die
Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
Wie aus der Abbildung ersichtlich ist, wurde eine ausgezeichnete Kalibrierungskurve
erhalten.
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Beispiel 2
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Insgesamt 60 Urinproben von Patienten
wurden durch das gleiche Verfahren von Beispiel 1 gemessen. Die
Messung wurde ebenfalls durch ein vorheriges Verfahren durchgeführt (Pyrogallolrot-Molybdänumverfahren;
kommerzielle Reagenzien), um die Korrelation zwischen dem erfindungsgemässen Verfahren
und dem vorherigen Verfahren zu prüfen. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Eine ausgezeichnete
Korrelation wurde mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,9946
erhalten.
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Beispiel 3
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Eine Reagenslösung mit der folgenden Zusammensetzung
wurde hergestellt durch Auflösen
der Reagenzien der folgenden Formulierung in gereinigtem Wasser,
ein Blatt aus Filterpapier (hergestellt von Whatman Corp.: 3MMchr)
wurde mit der Reagenslösung
imprägniert,
aus der Lösung
herausgenommen und bei 50°C
10 Minuten getrocknet, und anschließend wurde das so erhaltene
Basisblatt in Streifen von 5 mm × 80 mm geschnitten, um als
trockenes Testpapier verwendet zu werden.
| Brompyrogallolrot
(Nakalai Tesque, Inc.) | 0,25
mmol |
| Indiumsulfat
(Nakalai Tesque, Inc.) | 0,25
mmol |
| Succinatpuffer
(Succininsäure
+ Natriumhydroxid) | pH
2,7 |
| Triton
X-100 (Nakalai Tesque, Inc.) | 0,5% |
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Die Standardproteinlösung (10 μl) mit einer
in Tabelle 1 gezeigten Konzentration wurde auf das so erhaltene
trockene Testpapier punktmäßig aufgetragen,
und die Änderung
des Farbtons auf dem Punkt wurde mit dem nackten Auge 30 Sekunden
danach beobachtet. Wie in Tabelle 1 gezeigt, konnten die Ergebnisse
ausreichend mit dem nackten Auge bewertet werden.
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Beispiel 4
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Eine Reagenslösung mit der folgenden Zusammensetzung
wurde hergestellt durch Auflösen
der Reagenzien mit der folgenden Formulierung in gereinigtem Wasser.
| Brompyrogallolrot
(Dojindo Laboratories) | 0,05
mmol |
| Indiumsulfat
(Nakalai Tesque, Inc.) | 0,05
mmol |
| Glycinpuffer
(Glycin + Salzsäure) | pH
2,2 |
| Polyacrylsäure (Wako
Pure Chemical Industries, Ltd.) | 0,1% |
| Iminodiessigsäure (Dojindo
Laboratories), Zitronensäure
(Nakalai Tesque, Inc.) oder Tartarsäure (Nakalai Tesque, Inc.) | 0,1% |
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Die Reagenslösung (350 μl) wurde zu 5 μl einer Urinprobe
gegeben, die hergestellt worden ist durch Zugeben von 100 mg/dl
humanem Serumalbumin zu normalem zusammengeführtem humanem Urin, und die Mischung
wurde bei 37°C
10 Minuten inkubiert, um eine Absorption bei 600 nm zu messen. Die
Ergebnisse sind in 3 gezeigt.
In 3 stellt das Symbol "⧫" normale zusammengeführte humane Urinproben dar,
und das Symbol "?" stellt Urinproben
dar, die hergestellt worden sind durch Zugeben von 100 mg/dl humanem
Serumalbumin zu normalem zusammengeführtem humanem Urin. Wie aus
der Abbildung ersichtlich ist, trat keine Fluktuation gemessener
Werte auf wenn Chelatbildner in dem Reagens vorhanden waren.
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Beispiel 5
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Eine Reagenslösung mit der folgenden Zusammensetzung
wurde hergestellt durch Auflösen
der Reagenzien der folgenden Formulierung in Wasser.
| Brompyrogallolrot
(Dojindo Laboratories) | 0,05
mmol |
| Indiumsulfat
(Nakalai Tesque, Inc.) | 0,05
mmol |
| Succinatpuffer
(Succininsäure
+ Natriumhydroxid), | pH
2,7 |
| Polyacrylsäure (Wako
Pure Chemical Industries, Ltd.) | 0,1% |
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Die Proben wurden hergestellt durch
Zugeben von 0, 50 oder 200 mg/dl Zitronensäure oder Tartarsäure als
Chelatbildner zu einer Urinprobe, die hergestellt worden ist durch
Zugeben von 100 mg/dl humanem Serumalbumin zu normalem zusammengeführtem humanem
Urin. Die Reagenslösung
(350 μl)
wurde zu 5 μl
jeder der so hergestellten Proben gegeben, und die Mischung wurde
bei 37°C
10 Minuten inkubiert, um eine Absorption bei 600 nm zu messen. Die
Messung wurde ebenfalls durch ein vorheriges Verfahren (Pyrogallolrot-Molybdänumverfahren)
durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt.
In 4 stellt das Symbol "∎" die Proben dar,
die durch das erfindungsgemässe
Verfahren gemessen wurden, und das Symbol "?" stellt
die Proben dar, die durch das vorherige Verfahren gemessen wurden.
Wenn Chelatbildner in den Proben vorhanden waren, trat eine Fluktuation
der gemessenen Werte bei dem vorherigen Verfahren auf, nicht aber
wenn die erfindungsgemässe
Zusammensetzung verwendet wurde.
