DE2723183B2 - Prufmittel zur Bestimmung von Hämoglobin in einer Blutprobe - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Prüfmittel zur Bestimmung des Hämoglobingehalts im Blut mit Hilfe von Lichtreflexionsmessungen, umfassend eine opake, lichtreflektierende, blutabsorbierende Matrix.

Die Bestimmung des Hämoglobingehalts im Blut wird seit langem als wertvolle Hilfe bei der Diagnose vieler krankhafter Zustände angesehen. Zum Beispiel ist Eisenmangelanämie bei Säugetieren, besonders beim Menschen bekannt. Dieser Zustand, der verursacht sein kann durch eine chemische Vergiftung, Infektion oder Erkrankung, ist im allgemeinen gekennzeichnet durch eine Verminderung der im Blut vorhandenen Hämoglobinmenge. Üblicherweise variiert der Hämoglobingehalt im Blut bei erwachsenen Männern zwischen 12 und 16 g/100 ml Blut und bei erwachsenen Frauen zwischen 11 und 15 g/100 ml Blut. Wenn

ίο Blut wesentlich weniger als 12 g Hämoglobin/100 ml enthält, wird es als Zeichen für Anämie angesehen. Im Hinblick auf die Bedeutung, einen derartigen Zustand zu diagnostizieren, wird es als höchst wünschenswert angesehen, ein empfindliches, schnelles

ii und zuverlässiges Mittel zur Bestimmung des Hämoglobingehalts im Blut zur Verfügung zu haben.

In der Literatur sind verschiedene Verfahren und Vorrichtungen bzw. Prüfmittel zur Bestimmung des Hämoglobingehalts im Blut beschrieben. Üblicher-

><> weise wird Hämoglobin als Oxyhämoglobin gemessen, oder es wird zunächst in eines der verschiedenen Derivate umgewandelt, wie in alkalisches Hämatin, saures Hämatin, Cyanmethhämoglobin oder Carboxyhämoglobin. Die Konzentration an Hämoglobin wird dann

r> bestimmt durch Vergleich der Farbe oder Absorption der unbekannten Probe mit einer Standardfarbkarte. Der Vergleich kann visuell oder instrumenten durchgeführt werden, wobei die Lichtabsorption der Probe bei definierten Wellenlängen gemessen wird. Ungün-

m stigerweise sind diese Verfahren häufig zeitraubend und erfordern umfangreiche Ausrüstung, die ständig gesäubert werden muß, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten.

Ein weiteres Verfahren ist von T. W. TalIqvist

j-, in Z. Klin. Med. 40, 137 (1900) und Arch. Gen. Med. 3,421 (1900) beschrieben. Bei diesem Verfahren wird eine Probe unverdünntes Blut auf ein absorbierendes Papier aufgebracht und die Farbe des mit Blut gesättigten Papiers dann visuell mit einer Reihe von Iitho-

Au graphierten Farbstandards verglichen, um den Hämoglobingehalt abzuschätzen. Obwohl angegeben ist, daß dieses Verfahren einen Fehler von 20 bis 50% besitzt (M. M. Wintrobe, Clinical Hematology, Lea und Febiger, Philadelphis, 1961, S. 393), wird es noch

4-, von vielen Ärzten aufgrund seiner Einfachheit angewandt. Versuche, das Tallqvist-Verfahren instrumenten durch Anwendung von Lichtabsorptionsverfahren oder in letzter Zeit durch Lichtreflexionsmessungen quantitativ zu machen, waren nicht erfolgreich, auf-

,(I grund der verhältnismäßig großen Fehlerquellen, die bei Lichtabsorptions- oder Reflexionsmessungen auftreten.

Verschiedene handelsübliche analytische Vorrichtungen, die speziell zum Nachweis von Blutbestand-

-,-, teilen oder Bakterien bestimmt sind, wurden ohne Erfolg von Fachleuten angewandt, um den Hämoglobingehalt im Blut zu bestimmen. Zum Beispiel wurden mehrschichtige Vorrichtungen bzw. Prüfmittel angewandt, wie sie in den US-PS 3 552925, 3 552928 oder

,,ο der DE-OS 2332760 angegeben sind, und die verschiedene Mittel darstellen, wie poröse Membranen oder Filterschichten zur Abtrennung von roten Blutkörperchen von Blutproben vor dem Nachweis von Bestandteilen im Serum, und Prüfmittel zum Nach-

h-, weis von Bakterien, wie sie in der US-PS 3 764480 beschrieben sind und zum Nachweis von Oberflächenbakterien durch Reflexionsmessungen dienen. Es war erwartet worden, daß der Hämoglobingehalt im

Blut mit Hilfe dieser Prüfmittel und instrumenteller Vorrichtungen gemessen werden könnte. Die Versuche, diese verschiedenen analytischen Prüfmittel zum Nachweis bzw. zur Bestimmung des Hämoglobingehalts quantitativ zu machen unter Anwendung der Lichtreflexion oder Absorption, waren jedoch nicht erfolgreich aufgrund der verhältnismäßig großen Fehlerquellen, die bei Lichtreflexions- oder Absorptionsmessungen auftreten.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Prüfmittel zur Bestimmung des Hämoglobingehaltes in einer Blutprobe der eingangs genannten Art zu entwickeln, das die oben angegebenen Nachteile nicht aufweist. Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß die Matrix einen Brechungsindex von weniger als ungefähr 1,0 oder mehr als ungefähr 1,7 aufweist und gebildet wird aus einem blutabsorbierenden Glied, in das eine opake, lichtreflektierende, weiße oder hellgefärbte, in der Blutprobe unlösliche und nicht mit ihr reagierende Substanz eingebaut ist, und zwar in einer Konzentration, die eine Lichtreflexion zwischen ungefähr 30 und ungefähr 70% des einfallenden Lichtes ergibt, wenn die Matrix mit der Blutprobe gesättigt ist.

Vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Prüfmittels sind in den Patentansprüchen 2 bis 7 und Verfahren zur Bestimmung des Hämoglobingehaltes in einer Blutprobe unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Prüfmittels in den Patentansprüchen 8 und 9 beschrieben.

Während es bekannt ist, daß die Lichtreflexion einer Oberfläche, d. h. das Verhältnis des von einer Oberfläche reflektierten Lichts zu dem gesamten einfallenden Licht, abhängig ist von den physikalischen Eigenschaften und der Lichtabsorption und der Brechung eines Oberflächenmediums und den Brechungsindizes der Medien, durch die das Licht hindurchgehen muß, ist es für den Fachmann klar, daß die Reflexion ein komplexes Phänomen ist, das weiter kompliziert wird durch den Zusatz einer lichtabsorbierenden Substanz, wie Blut, das das stark gefärbte Hämoglobin enthält. Es war tatsächlich äußerst überraschend, daß die Anwendung einer Matrix mit einem Brechungsindex, der wesentlich anders ist als derjenige einer Blutprobe, nicht nur die Empfindlichkeit der Lichtreflexionsmessungen der Oberflächen, die mit der Blutprobe in Berührung stehen, erhöht, sondern auch deutlich die Genauigkeit solcher Messungen verbessert und dadurch die großen Fehlergrenzen, die bei bekannten Prüfmitteln, die bisher zur Bestimmung des Hämoglobingehalts im Blut mit Hilfe instrumenteller Verfahren auftraten, vermeidet. Die Anwendung einer Matrix mit einem Brechungsindex, der ähnlich oder gleich demjenigen einer Blutprobe ist, verbessert die Genauigkeit der Lichtreflexionsmessungen nicht wesentlich.

Geeignete blutabsorbierende Glieder, die angewandt werden können, sind solche, die ein schnelles und gleichmäßiges Eindringen der zu untersuchenden Blutprobe ermöglichen, wenn sie auf die Oberfläche der Matrix aufgebracht wird. Derartige Materialien umfassen Papier, Cellulose, Holz, synthetische Bahnen, Vliesstoffe oder gewebte Stoffe und ähnliches.

Geeignete lichtreflektierende Substanzen, die erfindungsgemäß angewandt werden können, sind im wesentlichen opak und haben einen Brechungsindex, der sich deutlich von demjenigen von Blut unterscheidet. Derartige Materialien umfassen die weißen und

hellgefärbten pulverförmigen Metalle, Metallcarbonate, -oxide und -sulfide, die in Wasser oder Blutserum unlöslich sind und nicht reagieren. Spezielle Beispiele für derartige Materialien und ihre mittleren Brechungsindizes bei der Natrium-D-Linie (589 nm), soweit nicht anders angegeben, sind Aluminiummetallpulver (0,78 bie 434 nm), Silbermetallpulver (0,18), Bleicarbonat (1,99), Bleioxid (2,61), Titandioxid (2,64), Zinkoxid (2,02), Zinksulfid (2,37), Zinkonoxid (2,17) und ähnliche. Vorzugsweise wird die lichtreflektierende Substanz auf oder in der absorbierenden Matrix in einer Konzentration eingebaut, die eine Lichtreflexion zwischen 30 und 70% des einfallenden Lichtes ergibt, wenn die imprägnierte Matrix mit einer Blutprobe gesättigt ist, da in diesem Bereich die optimale Genauigkeit bei Lichtreflexionsmessungen erreicht werden kann.

Neben den oben angegebenen lichtreflektierenden Substanzen, die aktiv an der Messung des Hämoglobingehaltes teilnehmen, können weitere Bestandteile, wie wasserlösliche Bindemittel und Netzmittel, gegebenenfalls in dem erfindungsgemäßen Prüfmittel enthalten sein. So kann es in einigen Fällen günstig sein, ein Verdickungsmittel zuzusetzen, um die lichtreflektierende Substanz mit dem absorbierenden Glied zu verbinden. Solche wasserlöslichen Bindemittel oder Verdickungsmittel umfassen Albumin, Algin, Karrageenin, Kasein, Carboxymethylcellulose, Hydroxyäthylcellulose, Methylcellulose, Polyvinyl-pyrrolidon und ähnliches. Oberflächenaktive Mittel, wie Detergenzien, können ebenfalls zugesetzt werden, um die Benetzungseigenschaften der Matrix zu verbessern und die Hämolyse der Erythrozyten des Blutes zu beschleunigen und dadurch die Homogenität der Probe in der Matrix zu verbessern sowie die Genauigkeit der Lichtreflexionsmessung. Solche Netzmittel umfassen anionische, kationische oder amphotere Detergenzien. Vorzugsweise werden anionische Detergenzien, wie Natriumlaurylsulfat oder irgendein langkettiges organisches Sulfat oder Sulfonat, angewandt, wie Dioctylnatriumsulfosuccinat oder Natriumdodecylbenzolsulfonat und ähnliche.

Bei der Anwendung wird eine abgemessene Menge einer Blutprobe auf die Matrix des erfindungsgemäßen Prüfmittels aufgebracht und ermöglicht, daß sie gründlich eindringt und einen Teil der Matrix sättigt. Obwohl die gemessene Menge, die auf eine spezielle Matrix aufgebracht wird, innerhalb von ungefähr ± H) Vol.% konstant gehalten werden sollte, kann die genaue Menge der auf die Matrix aufgebrachten Blutprobe weitgehend variieren, in Abhängigkeit von der Größe und Absorptionsfähigkeit einer speziellen Matrix. Es ist jedoch wesentlich, daß kein Überschuß über die zur Sättigung der Matrix erforderliche Menge aufgebracht wird. Ein Überschuß an Blut führt zur Bildung eines dünnen Films oder einer »Pfütze« auf der Oberfläche und damit zu einer wesentlichen Veränderung der Lichtreflexion an der Oberfläche. Das von der mit Blut gesättigten Oberfläche reflektierte Licht wird dann mit Hilfe irgendeines Reflektometers gemessen, mit dem es möglich ist, eine diffuse Reflexion bei einer bestimmten Wellenlänge zwischen ungefähr 300 und 620 nm mit einer ausreichenden Auflösung, Genauigkeit und Stabilität zu messen, und die es ermöglicht, Lichtreflexionsmessungen durchzuführen, die eine Bestimmung auf ungefähr ± 0,5 g Hämoglobin pro 100 mi ermöglichen. Die Intensität der Lichtreflexion von der mit Blut gesättigten Matrix ist

umgekehrt proportional der in der Blutprobe vorhandenen Hämoglobinmenge. Die jeweilige Menge an Hämoglobin, das in dem Blut vorhr.nden ist, wird bestimmt unter Bezugnahme auf eine Standardkurve, die hergestellt worden ist mit Hilfe von Standardflüssigkeiten, die bekannte Hämoglobinmengen enthalten, oder Standardreflexions-Chips, wie es bekannt ist. Obwohl die Zeit innerhalb der die Reflexionsablesung durchgeführt wird, nicht kritisch ist, sollte sie durchgeführt werden, bevor die Verdampfung der Feuchtigkeit zu einer Änderung der Hämoglobinkonzentration führt. Üblicherweise kann die Ablesung innerhalb eines Zeitraums von ungefähr 0,5 bis 3 Minuten, nachdem die Blutprobe auf das Prüfmittel aufgebracht worden ist, durchgeführt werden.

Die Matrix kann an einer Haltevorrichtung oder einem Trägerteil bzw. Griff befestigt werden, um ihre Anwendung zu erleichtern. Eine große Vielzahl von Materialien kann für diesen Zweck ausgewählt werden, solange der Träger nicht so an eier Matrix befestigt ist, daß er ein schnelles Eindringen und eine Sättigung der Matrix mit der Blutprobe verhindert. Da Blut eine verhältnismäßig viskose Flüssigkeit ist, ist es bei einigen Matrizes, wie einigen Papierarten, bevorzugt, Belüftungsmöglichkeiten vorzusehen, um ein Entweichen der Luft aus der absorbierenden Matrix nach dem Aufbringen der Blutprobe zu ermöglichen. Das wird vorzugsweise erreicht, indem man eine Belüftungsschicht zwischen die Matrix und den Träger einbringt.

Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel näher erläutert:

Beispiel

Die folgenden Bestandteile wurden vermischt unter Bildung einer Imprägnieremulsion.
Bestandteil Menge

Wasser, entionisiert	2000 ml
Benzol	2000 ml
Titandioxid	400 g
Natriumlaurylsulfat	2,0 g
Methyläthylencellulose	2,0 g

Die Emulsion wurde hergestellt durch Vermischen von ungefähr 100 ml Wasser mit dem Titandioxid in einer Ultraschall-Mischvorrichtung zur Erleichterung der Dispersion des Titandioxids. Die Methyläthylcellulose wurde in ungefähr 200 ml Wasser auf einem erwärmten Magnetrührer gelöst und dann zu der Titandioxidsuspension zugegeben. Das Natriumlaurylsulfat wurde in 800 ml Wasser gelöst und ebenfalls zu der Titandioxidsuspension gegeben. Dann wurde das Benzol zu der obigen Suspension gegeben und diese unter Bildung der Emulsion gerührt.

Whatman 3MM-Filterpapierstücke wurden mit der oben angegebenen Emulsion imprägniert und getrocknet. Die so imprägnierten Papiermatrizes wurden dann in günstige Streifen von 1,016 X 30,48 cm geschnitten. Außerdem wurden Streifen von 0,005 cm Polyesterkunststoffolien, wie Polystyrolterephthalat, 0,76 X 30,48 cm zur Verwendung als Belüftungsschicht und Streifen von doppelseitigem Klebeband von 1,016 X 30,48 cm und Streifen aus einem flexiblen Plastikmaterial, wie Polystyrol, 0,018 X 9,53 X 30,48 cm als Träger und Stützteile hergestellt. Ein Streifen des doppelseitigen Klebebandes wurde dann mit einer Seite auf einen Streifen, der Polystyrolfolie mit dieser parallel und im Abstand

κι von 0,25 cm von einer Längsseite der letztgenannten Folie aufgeklebt. Ein Streifen der Polyesterkunststoffolie wurde dann auf die freie Oberfläche des doppelseitigen Klebebandes in Fluchtung aufgebracht, wobei das Längsende des Klebebandes in einer Breite von ungefähr 0,13 cm auf jeder Seite der Polyesterkunststoffolie freiblieb. Ein imprägnierter Papierstreifen wurde dann auf dem Polyesterstreifen in Übereinstimmung mit dem doppelseitigen Klebeband und auf dem entgegengesetzten Längsende des Matrixstreifens aufgebracht und mit dem freiliegenden Längsteil des doppelseitigen Klebebandes verklebt. Das entstehende Laminat von 9,53 X 30,48 cm wurde dann quer in 0,51-cm-Abständen aufgeschnitten unter Bildung von Prüfmitteln von einer Größe von je-

2j weils ungefähr 9,53 X 0,51 cm.

Eine Standardkurve zur Anwendung bei dem erfindungsgemäßen Prüfmittel wurde hergestellt unter Verwendung von Blutproben mit bekanntem Hämoglobingehalt, enthaltend zwischen 6,2 und 18,5 g Hä-

Ji) moglobin auf 100 ml Blut, um jeweils das absorbierende Papier einer Vielzahl derartiger Prüfmittel zu sättigen. Ungefähr 18 μΐ Blut wurden auf dem größten Teil der freiliegenden Oberfläche der entsprechend imprägnierten Papiermatrizes aufgebracht und konn-

Γ) ten gründlich eindringen. Üblicherweise war die Matrix innerhalb von ungefähr 15 see gesättigt. Die Lichtreflexion von dem hauptsächlich freiliegenden Oberflächenteil der mit Blut gesättigten Matrix wurde dann bei 620 nm mit Hilfe eines Lichtreflexionsmeßgeräts gemessen. Es zeigte sich, daß die Lichtreflexionsmessungen sich linear mit einer Änderung des Hämoglobingehaltes in der zu untersuchenden Blutprobe änderten.

Insgesamt 331 Blutproben wurden analysiert mit j Hilfe der oben angegebenen Prüf mittel und des Verfahrens. Die Hämoglobingehalte wurden von der Standardkurve bestimmt, und die Ergebnisse wurden verglichen mit Werten für den Hämoglobingehalt der gleichen Proben, die mit Hilfe des Standard Cyan-

,Ii methhämoglobinverfahrens erhalten worden waren. Die Ergebnisse, die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Prüfmittel und Verfahren gefunden worden waren, variierten von den Werten des Standardverfahrens um eine Abweichung von 0,7 g Hämoglobin auf 100 ml Blut. Das entspricht einem Variationskoeffizienten von ungefähr 6%. Es zeigte sich daher, daß das erfindungsgemäße Verfahren und die Vorrichtung klinisch geeignet sind zur Bestimmung der Hemoglobinkonzentration im ganzen Blut.

Claims (9)

Patentansprüche:

1. Prüfmittel zur Bestimmung des Hämoglobingehalts in einer Blutprobe mit Hilfe von Lichtreflexionsmessungen, umfassend eine opake, lichtreflektierende, blutabsorbierende Matrix, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix einen Brechungsindex von weniger als ungefähr 1,0 oder mehr als ungefähr 1,7 aufweist und gebildet wird aus einem blutabsorbierenden Glied, in das eine opake, lichtreflektierende, weiße oder hellgefärbte, in der Blutprobe unlösliche und nicht mit ihr reagierende Substanz eingebaut ist, und zwar in einer Konzentration, die eine Lichtreflexion zwischen ungefähr 30 und ungefähr 70% des einfallenden Lichtes ergibt, wenn die Matrix mit der Blutprobe gesättigt ist.

2. Prüf mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das blutabsorbierende Glied auch ein wasserlösliches Bindemittel und ein Netzmittel enthält.

3. Prüfmittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die opake, lichtreflektierende Substanz eine Substanz aus der Gruppe pulverförmige Metalle, Metallcarbonate, Metalloxide und Metallsulfide ist.

4. Prüfmittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die opake, lichtreflektierende Substanz Aluminiummetallpulver, Silbermetallpulver, Bleicarbonat, Bleioxid, Titandioxid, Zinkoxid, Zinksulfid und/oder Zirkonoxid ist.

5. Prüf mittel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die opake, lichtreflektierende Substanz Titandioxid ist.

6. Prüfmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es Anordnungen zur Belüftung der blutabsorbierenden Matrix umfaßt.

7. Prüfmittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Belüftungsvorrichtung eine Belüftungsschicht umfaßt, die sich in laminatförmiger Anordnung zwischen der blutabsorbierenden Matrix und einem Trägerglied befindet.

8. Verfahren zur Bestimmung des Hämoglobingehalts in einer Blutprobe, dadurch gekennzeichnet, daß man die Blutprobe mit einem Prüfmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zusammenbringt und das von dem Prüfmittel reflektierte Licht bei einer Wellenlänge von ungefähr 300 bis ungefähr 620 nm mißt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Messung innerhalb von ungefähr 0,5 bis ungefähr 3 Minuten nach Aufbringen der Blutprobe auf das Prüfmittel durchführt.