DE1253934B

DE1253934B - Verfahren zur Herstellung eines Diagnostiziermittels zur Bestimmung von Eiweiss in biologischen Fluessigkeiten

Info

Publication number: DE1253934B
Application number: DEB70383A
Authority: DE
Inventors: Dr Rer Nat Hans-Georg Rey; Dr Rer Nat Peter Rieckmann
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1963-01-18
Filing date: 1963-01-18
Publication date: 1967-11-09
Also published as: US3359072A; NL301192A; GB997644A; DK104864C; AT246929B; LU45228A1; CH425277A; BE642648A

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. CL:

GOIn

Deutsche KI.: 421-3/55

Nummer: 1 253 934

Aktenzeichen: B 70383IX b/421

Anmeldetag: 18. Januar 1963

Auslegetag: 9. November 1967

Der qualitative und quantitative Nachweis von Eiweiß in biologischen Flüssigkeiten, z. B. im Urin, hat eine große diagnostische Bedeutung, insbesondere bei Nierenerkrankungen, aber auch bei Kreislaufschwäche, Arteriosklerose, Hypertonie, Diabetes. Es sind eine Reihe von Methoden zum Nachweis von Eiweiß bekanntgeworden, ζ. B. die Sulfosalicylsäureprobe, Essigsäure-Kochprobe, Salpetersäure-Ringprobe, Pikrinsäureprobe; alle diese Methoden beruhen auf Fällungsreaktionen und sind ohne Laboratoriumsgeräte nicht durchführbar. Für schnell-diagnostische Zwecke kommen diese Reaktionen daher nicht in Betracht; hierfür benötigt man eine einfache Farbreaktion, welche auch durch ungeschultes Personal routinemäßig durchgeführt werden kann, z. B. mit Hilfe von Testpapieren. ·

Eine für den Eiweißnachweis geeignete Farbreaktion wurde erstmals von F e i g 1 et al. (Mikrochim. Acta, 2, 1937, S. 107) beschrieben. Diese Reaktion nutzt den bei verschiedenen Indikatoren bekannten sogenannten »Proteinfehler« aus: Wird der pH-Wert des Reagenzes unterhalb des Indikatorumschlagbereiches gehalten, so tritt bei Zugabe von Eiweißlösung eine Farbänderung ein, die vom pH-Wert unabhängig ist und durch den Eiweißgehalt bedingt wird; die Farbintensität der entstehenden Farbe ist abhängig von der Konzentration des Eiweiß in der zu prüfenden Lösung. F e i g 1 arbeitete diesen Eiweißnachweis als Tüpfelreaktion aus, wobei er als Reagenzien das Kaliumsalz des Tetrabromphenolphthaleinäthylesters und Essigsäure verwendete. Zur Herstellung von Eiweißtestpapieren auf Basis der Feigl-Reaktion muß natürlich die Essigsäure durch eine nichtflüchtige Säure ersetzt werden; nach den Verfahren der britischen Patentschriften 814 223, 826 066 und 840 362 verwendet man hierfür zweckmäßig eine saure Puffersubstanz, wie z. B. Citratpuffer. Die auf diese Weise erhaltenen Eiweißteststreifen befriedigen jedoch nicht völlig, da die Farbkontraste von negativer und positiver Eiweißprobe in Konzentrationsbereichen unterhalb von 0,1 °/₀ Eiweiß sehr wenig differieren; der positive: Test fällt mehr oder weniger stark gelbgrün aus, der negative Test ist grüngelb und ist dunkler als der trockene Teststreifen. Auch läßt die Empfindlichkeit dieser Testpapiere einiges zu wünschen übrig (Nachweisgrenze etwa 0,03 bis 0,01 °/o Eiweiß). Es ist für den Mediziner aber erforderlich, Eiweiß im Harn in derselben Verdünnung nachweisen zu können, wie es mit der Essigsäure-Kochprobe möglich ist; demnach müssen noch 0,005 °/o Eiweiß im Harn einwandfrei diagnostiziert werden können.

Bei dem Verfahren der obengenannten britischen

Verfahren zur Herstellung eines
Diagnostiziermittels zur Bestimmung von Eiweiß in biologischen Flüssigkeiten

Anmelder:

C. F. Boehringer & Soehne G. m. b. H.,

Mannheim-Waldhof, Sandhoferstr. 112-132

Als Erfinder benannt:

Dr. rer. nat. Hans-Georg Rey,

Dr. rer. nat. Peter Rieckmann,

Mannheim-Waldhof

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Patentschriften wird der saugfähige Träger mit einer Lösung imprägniert, welche die Puffersubstanz zusammen mit dem Farbstoffindikator enthält. Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß man wesentlich empfindlicher reagierende Eiweißtestpapiere erhält, wenn man die Puffersubstanz und den FarbstofF-indikator getrennt, d. h. nacheinander auf den Träger aufbringt. Die hierbei erhaltenen Testpapiere sind schwach gelb gefärbt und geben mit eiweißhaltigem Urin kräftige Blaufärbungen, die entsprechend der Eiweißkonzentration abgestuft sind und sich deutlich von der gelben Färbung des negativen Testes abheben. Es können bis 0,005 °/₀ Eiweiß einwandfrei nachgewiesen werden; selbst geringere Eiweißkonzentrationen lassen sich noch feststellen. Bei normalem Urin sowie bei einem alkalischen Urin verändert sich die Farbe des Papiers nicht.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Diagnostiziermittels zur Bestimmung von Eiweiß in biologischen Flüssigkeiten, bestehend aus einem Farbstoffindikator, welcher den sogenannten »Proteinfehler« aufweist, einer sauren Puffersubstanz und einem saugfähigen Träger, ist demgemäß dadurch gekennzeichnet, daß man den saugfähigen Träger zuerst mit der Pufferlösung imprägniert und ihn anschließend mit der Farbstofflösung behandelt.

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Claims

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Als Farbstoffindikatoren kommen solche in Be- Beispiel

tracht, die einen großen Eiweißfehler bei einem Indi- „ „ ...

katorumschlag im sauren pH-Bereich haben, insbe- Zusammensetzung der Pufferlosung:

sondere Tetrabromphenolphthaleinäthylester und -bu- tert. Natriumeitrat 9,8 g

tylester sowie Tetrabrombenzaurin. Von großer Be- 5 Citronensäure 3,5 g

deutung ist die Auswahl eines geeigneten Lösungs- Natriumlaurylsulfat 0,05 g

mittels für den Indikator. Natürlich muß ein leicht destilliertes Wasser ad 100 ml

flüchtiges Solvens verwendet werden, damit die Teststreifen nach der Imprägnierung schnell trocknen. Zusammensetzung der Indikatorlösung:
Wird nun der Indikator in Methanol oder Aceton io Tetrabromphenolphthaleinäthylester ... 40 mg

gelöst und mit dieser Lösung ein bereits mit Puffer- Methylenchlorid ad 100 ml

substanz behandeltes Papier imprägniert, so erhält

man ein Testpapier, das bei einer grünen Grundfarbe Filterpapier (Schleicher & Schüll Nr. 2316) wird zu-

mit mehreren blauen Flecken durchsetzt ist. Es wurde erst mit der oben angegebenen Pufferlösung behandelt

nun gefunden, daß man gleichmäßig schwach gelb- 15 und dann an der Luft getrocknet. Anschließend

gefärbte Eiweißtestpapiere erhält, wenn man als imprägniert man das Papier mit der Indikatorlösung

Lösungsmittel für den Farbstoffindikator einen Halo- und trocknet erneut. Das getrocknete Papier wird auf-

genkohlenwasserstoff verwendet. Hierfür kommen gerollt, und die Rollen werden quer auf die gewünschte

z. B. Chloroform und Tetrachlorkohlenstoff in Frage; Breite von 5 mm geschnitten. Die auf diese Weise er-

besonders gut geeignet ist Methylenchlorid. 20 haltenen Teststreifen sind schwach gelblich gefärbt

Als Puffer ist grundsätzlich jedes Puffersystem ein- und ändern ihre Farbe nicht, wenn sie mit eiweißsatzfähig, das auf einen pH-Wert unterhalb 7,0 ein- freiem normalem Urin befeuchtet werden. Eiweiß im gestellt werden kann; vorzugsweise wird Citratpuffer, Harn zeigt sich durch Blaufärbungen, die je nach d. h. eine wäßrige Lösung von Citronensäure und Eiweißgehalt abgestuft sind. So kann Eiweiß im Harn tert. Natriumeitrat, verwendet. Der optimale pH-Wert 25 bei einer Konzentration von 0,005% noch einwandliegt bei etwa 5,0. Dieser Befund ist als sehr über- frei nachgewiesen werden.

raschend zu bezeichnen, denn dieser pH-Wert liegt Um unbegrenzt haltbare Reagenzpapiere zu erhal-

bereits auf der »alkalischen Seite« der genannten ten, werden die oben beschriebenen Eiweißteststreifen

Farbstoffindikatoren. In der oben zitierten Vor- nach dem Verfahren der Patentanmeldung B 66255 VIb/

literatur wird nämlich ausdrücklich betont, daß die 30 55 f zwischen eine weiß eingefärbte und eine transpa-

optimalen pH-Werte bei dem auf dem sogenannten rente polyäthylenbeschichtete Polyterephthalsäure-

»Proteinfehler« von Farbstoffindikatoren basierenden esterfolie eingesiegelt.

Eiweißnachweis etwas unterhalb des pH-Umschlag- Hierbei leitet man die Reagenzpapierstreifen von punktes des Farbstoffs, also in dessen »saurem Be- 5 mm Breite zwischen den zwei obengenannten reich«, liegen (vgl. zum Beispiel britische Patent- 35 Kunststoff-Folien (Breite etwa 30 cm) durch zwei schrift 840 362, pH 3,5 bis 4). Auch wenn das fertige Walzen, von denen eine oder beide beheizt sind. Reagenzpapier gemäß vorliegender Erfindung in eine Durch den Wärmekontakt werden die Kunst-Lösung ohne Eiweiß eingetaucht wird, schlägt der stoff-Folien verschweißt bzw. der Papierstreifen Indikator nicht von seinem sauren Farbbereich in den ein- oder beiderseits mit dem Kunststoff veralkalischen um. Eine Erklärung für diese pH-Ver- 4° schweißt. Flache Rillen auf den Walzen gewährschiebung, welche durch die einfache Maßnahme des leisten das sichere Verschweißen der Folien neben getrennten Aufbringens von Puffersubstanz und Färb- den Papierstreifen. Die mit den Papierstreifen Stofflösung gemäß vorliegender Erfindung bewirkt verschweißten Kunststoffbänder werden quer wird, konnte bislang nicht gefunden werden. zum Reagenzpapierstreifen geschnitten. Man er-

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Diagnosti- 45 hält nach diesem Verfahren schmale Folienziermittel erfolgt in an sich üblicher Weise: Der saug- streifen von 60 mm Länge und 5 mm Breite, die fähige Träger, z. B. Filterpapier, wird zunächst mit der an einem Ende einen Reagenzpapierabschnitt von Pufferlösung imprägniert und anschließend an der etwa 5 · 5 mm Größe enthalten. Das Papier ist Luft getrocknet. Zweckmäßig fügt man der Puffer- von beiden Seiten mit Folie bedeckt, die Testlösung eines der üblichen oberflächenaktiven Mittel 50 lösung wird durch die offenen Schnittkanten aufzu, z. B. Natriumlaurylsulfat oder Polyoxyäthylen- gesogen.

sorbitanmonolaurat; hierdurch wird beim Gebrauch Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, wenn man die

des Testpapiers eine beschleunigte Aufnahme der Teststreifen mit einem zweiten, nichtimprägnierten

Testflüssigkeit und somit eine schnellere und gleich- Papierstreifen (Filterpapier Schleicher &SchüllNr. 1450)

mäßigere Färbung des Reagenzpapiers erzielt. Dann 55 zusammen einsiegelt; die Einsiegelung wird in diesem

wird das Filterpapier mit der Indikatorlösung behan- Falle derart durchgeführt, daß die zu kombinierenden

delt, erneut getrocknet und zugeschnitten. Die auf Streifen übereinanderliegen, wobei der Teststreifen

diese Weise erhaltenen Eiweißteststreifen können als durch die transparente Folie und der nichtimprägnierte solche verwendet oder aber nach dem Verfahren der Papierstreifen von der weiß eingefärbten Folie abge-

Patentanmeldung B 66255 VIb/55 f mit Kunststoff- 60 deckt wird.
Folien eingesiegelt werden. Im letzteren Falle hat es

sich als zweckmäßig erwiesen, wenn man das Test- Patentansprüche:
papier mit einem zweiten, nichtimprägnierten Papierstreifen zusammen einsiegelt; hierdurch wird eine 1. Verfahren zur Herstellung eines Diagnostiziergleichmäßigere Färbung des Teststreifens bei Durch- 65 mittels zur Bestimmung von Eiweiß in biologischen führung der Nachweisreaktion gewährleistet. Flüssigkeiten, bestehend aus einem Farbstoff-

Im nachstehenden Beispiel ist das erfindungs- indikator, welcher den sogenannten »Proteingemäße Verfahren näher erläutert. fehler« aufweist, einer sauren Puffersubstanz und

einem saugfähigen Träger, dadurch gekennzeichnet, daß man den saugfähigen Träger zuerst mit der Pufferlösung imprägniert und ihn anschließend mit der Farbstofflösung behandelt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungsmittel für den Farbstoffindikator ein Halogenkohlenwasserstoff verwendet wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Pufferlösung und Farbstofflösung auf Filterpapier aufgebracht werden und dieses danach getrocknet wird.
4. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß die mit der Pufferlösung und der Farbstofflösung imprägnierten Filterpapierstreifen getrocknet und in Kunststoff-Folien eingesiegelt werden.
5. Verfahren gemäß Ansprüchen 1, 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Testpapier mit einem zweiten, nichtimprägnierten Papierstreifen zusammen eingesiegelt wird.