DE69837607T2

DE69837607T2 - Verfahren zum herstellen von dicarbonsäuren

Info

Publication number: DE69837607T2
Application number: DE69837607T
Authority: DE
Inventors: Nhuan Phu Knoxville NGHIEM; Mark Warrenville DONNELLY; Cynthia S. Plainfield MILLARD; Lucy Woodridge STOLS
Original assignee: UT Battelle LLC; UChicago Argonne LLC
Current assignee: UT Battelle LLC; UChicago Argonne LLC
Priority date: 1997-01-31
Filing date: 1998-01-30
Publication date: 2007-12-27
Anticipated expiration: 2018-01-31
Also published as: EP1012323B1; EP1012323A4; WO1998033930A1; DE69837607D1; HUP0001997A2; CA2278892C; CA2278892A1; AU724274B2; AU6052398A; ATE360084T1; DK1012323T3; CN1121500C; BR9806822B1; US5869301A; PT1012323E; JP3681404B2; HU227509B1; CN1246155A; EP1012323A1; HUP0001997A3

Description

FACHGEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Dicarbonsäuren, insbesondere ein Fermentierungsverfahren unter Verwendung eines Escherichia-coli-Stammes, um große Mengen an Dicarbonsäuren, wie z.B. Äpfelsäure, Fumarsäure und Bernsteinsäure, herzustellen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Carbonsäuren und Derivate davon werden häufig als Sonderchemikalien für Anwendungen in Polymeren, Nahrungsmitteln, Pharmazeutika und Kosmetika verwendet. Bernsteinsäure, beispielsweise, ist für die Herstellung von derartigen Kunststoffvorstufen wie 1,4-Butandiol (BDO), Tetrahydrofuran und γ-Butyrolacton verwendbar. Neue Produkte, die sich von Bernsteinsäure ableiten, werden ständig entwickelt, einschließlich der Entwicklung von Polyester. Polyester wird hergestellt, indem Bernsteinsäure und BDO verbunden werden. Generell weisen Ester der Bernsteinsäuren das Potential als neue, „grüne" Lösungsmittel auf, die schädlichere Lösungsmittel verdrängen und als Vorstufen für Millionen von Pfund an Chemikalien jährlich dienen können, bei einem Gesamtmarktwert von über einer Milliarde Dollar.
Die Herstellung von Carbonsäuren, wie z.B. Äpfelsäure, Bernsteinsäure und Fumarsäure, aus erneuerbaren Einsatzmaterialien (in diesem Fall mit Fermentierungsverfahren) ist ein Weg zur Verdrängung der energie-intensiveren Verfahren der Gewinnung derartiger Säuren aus nicht-erneuerbaren Quellen. Succinat ist eine Zwischenstufe für anaerobe Fermentierungen durch Propionat produzierende Bakterien, aber diese Verfahren führen zu niedrigen Ausbeuten und Konzentrationen.
Viele Bernsteinsäure produzierende Organismen sind isoliert worden, wie z.B. die anaeroben Pansen-Bakterien, Bacteroides ruminicola und Bacteroides amylophilus. Jedoch sind Pansen-Organismen charakteristischerweise in Fermentierungsverfahren instabil. Ein anderer Bernsteinsäure produzierender Organismus ist Anaerobiospirillum succiniciproducens (A. succiniciproducens). Mehrere Patente sind auf die Verwendung dieses Organismus' zur Herstellung von Bernsteinsäure in einem anaeroben Fermentierungsverfahren erteilt worden. Ein derartiges Patent von Glassner et al., U.S.-Patent Nr. 5,143,834, umreißt die Verwendung dieses Organismus' in Fermentierungsverfahren, um auf natürlichem Weg Bernsteinsäure in mäßigen Ausbeuten herzustellen. Jedoch weisen Fermentierungsverfahren unter Verwendung von A. succiniciproducens eine Reihe von Problemen auf. Ein Problem ist, dass der Organismus ein strenger Anaerobier ist, dessen Kultivierung in einer von Sauerstoff völlig freien Umgebung durchgeführt werden muss. Die Vermehrung dieses Organismus' in einer kommerziellen Fermentierungsanlage ist schwierig und erfordert sehr erfahrene Arbeiter. A. succiniciproducens ist auch schwierig zu handhaben, sogar im Labormaßstab, und neigt unter ungünstigen Bedingungen zur Degeneration. Seine Entartung kann nicht umgekehrt werden. Der Organismus ist nie in einem kommerziellen Fermentierungsverfahren verwendet worden. In anderen Worten, Erfahrung mit der Fermentierung im Produktionsmaßstab mit diesem speziellen Organismus ist nicht vorhanden. Darüber hinaus erfordert der Organismus eine Kohlendioxidzufuhr von außen, um eine hohe Ausbeute an Bernsteinsäure zu erzielen. Bei einem Fermentierungsverfahren muss ein Strom reinen Kohlendioxids in die Fermentierungsbrühe eingesprüht werden. A. succiniciproducens produziert ein Gemisch aus Bernstein- und Essigsäuren in einem Succinat:Acetat-Molverhältnis von etwa 2. Die Gegenwart von Essigsäure in hohen Konzentrationen in der Fermentierungsbrühe erhöht die Kosten der Bernsteinsäurereinigung. Die Produktion des Acetat-Nebenprodukts veranschaulicht, dass ein Drittel der teuren Glucose nicht in Succinat umgewandelt wird. Darüber hinaus ist von dem A. succiniciproducens-Wirtsstamm gezeigt worden, dass er nicht sehr osmotolerant ist, insofern als er keine hohen Konzentrationen an Salzen toleriert und durch mäßige Konzentrationen des Produkts weiter gehemmt wird. Ein anderes Problem, das die Verwendung von A. succiniciproducens aufwirft, ist, dass die Mediumherstellung für das Impfgut die Zugabe von Tryptophan erfordert und auch das Mischen von vier unterschiedlichen Lösungen erfordert, wovon eine korrodierend wirkendes und toxisches H₂S enthält.
Es ist seit langem bekannt, dass bei der E. coli-Fermentierung ein Gemisch aus Säuren produziert wird, wie 1949 von J.L. Stokes in „Fermentation of glucose by suspensions of Escherichia coli," J. Bacteriol., 57: 147–158, ausgeführt. Jedoch werden für jedes Mol fermentierter Glucose nur 1,2 Mol Ameisensäure, 0,1–0,2 Mol Milchsäure und 0,3–0,4 Mol Bernsteinsäure produziert. Als solches haben die Bemühungen, Carbonsäuren fermentativ herzustellen, dazu geführt, dass verhältnismäßig große Mengen an Wachstumssubstraten, wie z.B. Glucose, nicht in das gewünschte Produkt umgewandelt wurden.
Fairoz Mat-Jan et al. beschreiben in J. Bacteriol., V. 171 (1989), S. 342–348, eine an Mutanten von Escherichia coli, denen die fermentative, mit NAD verbundene Lactatdehydrogenase (ldh) fehlt, die isoliert worden waren, durchgeführte Studie, die keine Wachstumsschwächen unter anaeroben Bedingungen zeigte, sofern der Mangel nicht zusammen mit einem Fehler bei der Pyruvatformiatlyase (pfl) vorlag. Doppel-Mutanten (pfl ldh) waren unfähig, anaerob auf Glucose oder anderen Zuckern zu wachsen, sogar wenn Acetat ergänzt wurde, wohingegen pfl-Mutanten dazu in der Lage sind. Die Studie diskutierte die Produktion von Bernsteinsäure oder Dicarbonsäuren nicht und untersuchte sie auch nicht.
Obwohl das Succinat-Ion eine häufige Zwischenstufe im Stoffwechselweg von mehreren anaeroben Mikroorganismen ist, besteht auf dem Fachgebiet Bedarf für ein Fermentierungsverfahren, um wirtschaftlich Bernsteinsäure, sowie andere Carbonsäuren, wie z.B. Äpfelsäure und Fumarsäure, in großen Mengen oder mit hohen Ausbeuten herzustellen. Das Verfahren sollte preiswerte Nährstoffe und Substrate nutzen, die Fermentierungsrate sollte hoch sein, für hohe Ergiebigkeit, und die Produktkonzentration in der Fermentierungsbrühe sollte hoch sein.
AUFGABEN DER ERFINDUNG
Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes, praktisches und wirtschaftliches Verfahren zum Herstellen von Dicarbonsäuren bereitzustellen, das die von dem Stand der Technik aufgeworfenen Nachteile und Probleme überwindet.
Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes, praktisches und wirtschaftliches Verfahren zum Herstellen von Bernsteinsäure, Äpfelsäure und Fumarsäure mit hohen Ausbeuten bereitzustellen.
Es ist noch eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Fermentierungsverfahren, das eine Escherichia coli-Mutante nutzt, für die Herstellung von Bernsteinsäure, Äpfelsäure und Fumarsäure mit hohen Ausbeuten bereitzustellen.
Es ist immer noch eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes, praktisches und wirtschaftliches Fermentierungsverfahren, das eine Escherichia coli-Mutante nutzt, für die Herstellung von Bernsteinsäure, Äpfelsäure und Fumarsäure mit hohen Ausbeuten bereitzustellen, wobei das Fermentierungsverfahren in einem einzigen Gefäß ausgeführt wird, was die genaue Steuerung der Anreicherung mit Sauerstoff, der Glucosespiegel, des pH-Wertes und der Zugaberaten der Nährstoffe erlaubt.
Weitere und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden aus der hier enthaltenen Beschreibung hervorgehen.
ZUSAMMENFASSUNG
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die vorstehenden und andere Aufgaben mit einem Verfahren zur Herstellung von Carbonsäuren gelöst, das die Schritte umfasst: a) Beimpfen eines Mediums, das eine Kohlenstoffquelle aufweist, mit einem Carbonsäure produzierenden Organismus; b) Inkubieren des Carbonsäure produzierenden Organismus' in einer aeroben Atmosphäre, um das schnelle Wachstum des Organismus' zu fördern, wodurch sich die Biomasse des Organismus' erhöht; c) steuerbares Freisetzen von Sauerstoff, um die aerobe Atmosphäre aufrechtzuerhalten; d) steuerbare Zufuhr einer Lösung, die die Kohlenstoffquelle enthält, zu dem Organismus mit erhöhter Biomasse, um die Konzentration der Kohlenstoffquelle in dem Medium von etwa 0,5 g/l bis etwa 1 g/l aufrechtzuerhalten; e) Entzug des Sauerstoffs aus der aeroben Atmosphäre, um eine anaerobe Atmosphäre zu schaffen, wodurch der Organismus veranlasst wird, einen anaeroben Stoffwechsel durchzumachen; f) steuerbare Zufuhr einer Lösung, die die Kohlenstoffquelle enthält, zu dem Organismus mit erhöhter Biomasse, um die Konzentration der Kohlenstoffquelle in dem Medium von ≥ 1 g/l aufrechtzuerhalten und g) Umwandeln der Kohlenstoffquelle in Carbonsäuren unter Verwendung des anaeroben Stoffwechsels des Organismus'.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden andere Aufgaben mit einem Verfahren zur Herstellung von Carbonsäuren gelöst, das die Schritte umfasst:
a) Beimpfen eines Mediums, das eine Kohlenstoffquelle aufweist, mit einem Carbonsäure produzierenden Organismus; b) Inkubieren des Organismus' in einer Umgebung, die einen aufrechterhaltenen pH-Wert und eine aerobe Atmosphäre aufweist, um das schnelle Wachstum des Organismus' zu fördern, wodurch sich die Biomasse des Organismus' erhöht; c) steuerbares Freisetzen von Sauerstoff, um die aerobe Atmosphäre aufrechtzuerhalten; d) steuerbare Zufuhr einer Lösung, die die Kohlenstoffquelle enthält, zu dem Organismus, um eine Konzentration der Kohlenstoffquelle in dem Medium von etwa 0,5 g/l bis zu etwa 1 g/l aufrechtzuerhalten; e) Überführen des Organismus' mit erhöhter Biomasse in einen Produktionsfermentator mit einer anaeroben Atmosphäre, wodurch der Organismus veranlasst wird, einen anaeroben Stoffwechsel durchzumachen; f) steuerbare Zufuhr einer Lösung, die die Kohlenstoffquelle enthält, zu dem Organismus, um eine Konzentration der Kohlenstoffquelle in dem Produktionsfermentator von ≥ 1 g/l aufrechtzuerhalten; und g) Umwandeln der Kohlenstoffquelle in Carbonsäuren unter Verwendung des anaeroben Stoffwechsels des Organismus'.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Für ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung, zusammen mit anderen und weiteren Aufgaben, Vorteilen und Möglichkeiten davon, wird Bezug genommen auf die folgende Offenbarung und beigefügten Ansprüche, wenn sie in Zusammenhang mit den beigefügten Zeichnungen gelesen werden, wobei:
1 die Ergebnisse des in BEISPIEL 1 beschriebenen Versuchs zeigt.
2 die Ergebnisse des in BEISPIEL 2 beschriebenen Versuchs zeigt.
3 die Ergebnisse des in BEISPIEL 3 beschriebenen Versuchs zeigt.
4 die Ergebnisse des in BEISPIEL 4 beschriebenen Versuchs zeigt.
5 die Ergebnisse des in BEISPIEL 5 beschriebenen Versuchs zeigt.
6 die Ergebnisse der in BEISPIEL 6 beschriebenen Versuche zeigt.
7 die Ergebnisse der in BEISPIEL 7 beschriebenen Versuche zeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist ein neues, aber praktisches, wirtschaftliches Mittel zum Herstellen großer Mengen an Bernsteinsäure, Fumarsäure und Äpfelsäure in einem gesteuerten Fermentierungsverfahren. Ein Stamm von Escherichia coli (E. coli), als AFP-111 bezeichnet, ist in dem Fermentierungsverfahren der vorliegenden Erfindung genutzt worden, um die Probleme zu überwinden, die auf dem Fachgebiet aufgeworfen wurden. AFP-111, eine NZN-111-E. coli-Mutante, ist ein fakultativer Organismus. E. coli ist sehr leicht zu handhaben. Seine Molekularbiologie und -Physiologie sind in großen Einzelheiten bekannt. Verfahrensverbesserung kann deshalb leicht mit Molekularbiologie oder Modifikation der Verfahrensparameter oder beidem erzielt werden. Darüber hinaus ist E. coli ausgedehnt in Fermentierungsverfahren für die Herstellung von Biopharmazeutika und Chemikalien verwendet worden. Es besteht eine Fülle von Erfahrungen mit diesem Organismus im Produktionsmaßstab.
E. coli produziert auch ein Gemisch aus Bernstein- und Essigsäuren, jedoch beträgt das Molverhältnis von Succinat:Acetat unter nicht-optimierten Bedingungen bereits etwa 3 oder mehr. Dieses Verhältnis kann wesentlich erhöht werden. Niedrigere Essigsäurekonzentrationen in der Fermentierungsbrühe werden die Bernsteinsäurereinigungskosten signifikant senken. Außerdem braucht E. coli keine Kohlendioxidzufuhr von außen, um eine hohe Ausbeute an Bernsteinsäure zu erzielen. Ohne Kohlendioxid-Einsprühung ist die Ausbeute an Bernsteinsäure während des Zeitraumes der Spitzenproduktion mit der mit A. succiniciproducens mit Kohlendioxid-Einsprühung erhaltenen vergleichbar.
Normalerweise produziert der Wildtyp E. coli unter anaeroben Bedingungen ein Gemisch aus Fermentierungsprodukten, von denen Bernsteinsäure ein Nebenbestandteil ist. Wenn jedoch AFP-111 unter anaeroben Bedingungen vermehrt wird, ist das Stoffwechsel-Hauptprodukt Bernsteinsäure. AFP-111 enthält eine einzigartige spontane chromosomale Mutation, die ein Gemisch aus Bernsteinsäure, Essigsäure und Ethanol produziert, wobei Bernsteinsäure das Hauptprodukt ist. Eine maximale Ausbeute von 99 Prozent, Gewicht der Bernsteinsäure pro Gewicht der Glucose, wird mit AFP-111 produziert. Die Verwendung von AFP-111 könnte die Kosten der Herstellung von Bernsteinsäure mit Fermentierungsverfahren signifikant senken.
Das E. coli-Fermentierungsverfahren besteht aus zwei Stufen. In der ersten wurde der AFP-111-Stamm in dem Fermentator unter aeroben Bedingungen, in einer Umgebung mit niedriger Glucose, zu hoher Zellendichte vermehrt. In der vorliegenden Erfindung wird Glucose als eine Kohlenstoffquelle sowohl für das Wachstum der Biomasse des Organismus' als auch für die Produktion von Dicarbonsäuren verwendet. Sobald die gewünschte Zellendichte erzielt war, wurde die Luftzufuhr abgesperrt, um den Organismus zu zwingen in seinen anaeroben Stoffwechsel zu wechseln, der zu der Produktion von Dicarbonsäuren, einschließlich Äpfel-, Fumar- und Bernsteinsäure, als dem letztlichen Endprodukt führte. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung findet dieser zweistufige Fermentierungsprozess in einem einzigen Gefäß statt.
Der biochemische Weg der Bernsteinsäureproduktion in E. coli bezieht eine Folge von Umwandlungsschritten ein. Brenztraubensäure wird zuerst in Oxaloessigsäure umgewandelt, dann in Äpfelsäure, Fumarsäure und schließlich in Bernsteinsäure. Unter diesen Säuren sind Äpfelsäure, Fumarsäure und Bernsteinsäure industriell bedeutend. AFP-111 akkumuliert Bernsteinsäure als das Endprodukt. Falls Fumarsäure das gewünschte Produkt ist, wird das Gen, das das für die Umwandlung von Fumarsäure in Bernsteinsäure verantwortliche Enzym codiert, entfernt und der so erhaltene Organismus wird Fumarsäure anstelle von Bernsteinsäure akkumulieren. Entsprechend wird, falls Äpfelsäure das gewünschte Produkt ist, das Gen, das das für die Umwandlung von Äpfelsäure in Fumarsäure verantwortliche Enzym codiert, entfernt, um einen Äpfelsäure produzierenden Organismus zu erzeugen. Mit den gebräuchlichen molekularbiologischen Techniken auf dem Stand der Technik und der Kenntnis des gesamten E. coli-Verknüpfungsplans ist die Entfernung eines speziellen Gens lediglich eine simple Aufgabe. Ein Fermentierungsverfahren zur Bernsteinsäureherstellung wird ohne weiteres für die Herstellung von Äpfel- und Fumarsäuren, unter Verwendung der Äpfelsäure produzierenden beziehungsweise Fumarsäure produzierenden Organismen, angewandt.
Das gesamte Verfahren arbeitet mit chargenweiser Zufuhr. In diesem Verfahren wird eine konzentrierte Glucoselösung, die auch leichtes Weichwasser, als eine Quelle für organischen Stickstoff und Wachstumsfaktoren, und anorganische Nährstoffe enthält, zu dem Fermentator in einer ausreichenden Geschwindigkeit zugeführt, um die Restglucose-Konzentration bei oder unterhalb von 1 g/l zu halten. Eine niedrige Glucosekonzentration ist notwendig, um die übermäßige Bildung von Essigsäure zu verhindern. Bildung von Essigsäure zu hohen Konzentrationen während der aeroben Wachstumsphase wird schließlich das Wachstum des Organismus' stoppen und eine hohe Zellendichte kann nicht erzielt werden. Während der anaeroben Produktionsphase werden hohe Essigsäurekonzentrationen die Geschwindigkeit der Bernsteinsäureproduktion senken und können sie schließlich vollständig stoppen. Die Verwendung von AFP-111 kann die Kosten der Herstellung von Bernsteinsäure mit Fermentierungsverfahren signifikant senken.
Die Aufrechterhaltung der niedrigen Glucosekonzentration in kommerziellen Fermentatoren wird leicht durch Computersteuerung der Glucosezufuhrgeschwindigkeit, basierend auf Abgasanalyse oder Prozessbegleitender Glucoseanalyse, erzielt. Dies ist in der Industrie eine sehr häufige Praxis geworden.
Anaerobe Fermentierung ist der altertümlichste Stoffwechselweg zur Erhaltung von Energie aus Energieträgern, wie z.B. Glucose. In anaeroben Zellen ist sie der alleinige Energie produzierende Prozess. In den meisten fakultativen Zellen, ist sie eine obligatorische erste Stufe im Glucoseabbau, der die aerobe Oxidation der Fermentierungsprodukte über den Zitronensäurezyklus folgt.
Die am häufigsten genutzte Art der Fermentierung ist Glykolyse, wobei Pyruvat als ein vorletztes Produkt produziert wird. Die Verfügung über das Pyruvat hängt davon ab, welche Gene in dem Organismus vorhanden sind. In Gegenwart des Enzyms Lactatdehydrogenase endet die Glykolyse, sobald Pyruvat über NADH und H⁺ zu Lactat reduziert ist. In Gegenwart von Pyruvatdecarboxylase und Alkoholdehydrogenase wird Ethanol gebildet. In Gegenwart von Pyruvatformiatlyase (pfl) endet die Fermentierung mit der Produktion von Acetat, Ethanol und Formiat, oder Wasserstoff plus Kohlendioxid.
Falls eine Mutation oder eine Vielzahl von Mutationen in einem Bakteriengenom die Gene in diesem Organismus beseitigt, die für den Abbau von Pyruvat verantwortlich sind, dann wird Pyruvat akkumulieren. In anaerob wachsendem E. coli sind diese Gene Pyruvatformiatlyase (pfl) und Lactatdehydrogenase (ldh). Der E. coli-Stamm NZN-111, weithin für Forscher von Dr. David Clark, Southern Illinois University, Carbondale, I11. 62901, erhältlich, enthält Mutationen in beiden Genen, wodurch sowohl pfl als auch ldh infolge von Abänderungen in der chromosomalen E. coli-DNA-Sequenz inaktiviert worden sind. Als solches kann NZN-111 nicht fermentativ wachsen. AFP-111, das von NZN-111 abgeleitet wurde, indem zusätzliche genetische Abänderungen angewandt wurden, produziert unter anaeroben Bedingungen ein Gemisch aus Bernsteinsäure, Essigsäure und Ethanol, wobei Bernsteinsäure das Hauptprodukt ist.
Es ist festgestellt worden, dass zusätzliche Abänderungen an NZN-111, die entweder spontan während selektiver Kultivierung oder über Plasmidtransformation stattfinden, letztlich zum Auftauchen von AFP-111 führen, das Bernsteinsäure als ein Hauptprodukt produziert.
Spontane chromosomale Mutationen an NZN-111, die zu AFP-111-artigen Kennzeichen führen, finden statt, wenn bei Reihen-Kultivierungstechniken selektive Umgebungen genutzt werden. In einem ersten Schritt wird die NZN-111-Biomasse aerob auf einem reichhaltigen Medium, wie z.B. Luria Bertaini (LB)-Brühe (0,5 Prozent Hefeextrakt, 1 Prozent Trypton und 1 Prozent NaCl, pH-Wert 7,5), erhöht. Ausbeuten von zwischen annähernd 10⁹ bis 10¹⁰ Zellen pro Milliliter sind wünschenswert. Während die Inkubationszeiträume variieren können, liefert eine Dauer der Wachstumsphase von zwischen 5–7 Stunden, bei 37°C und bei Standarddruck die vorstehend erwähnten Konzentrationen.
Als ein zweiter Schritt wird die nun angesammelte Biomasse anaeroben Bedingungen, reich an Glucose, unterzogen, um das Wachstum nur von denjenigen Zellen (Mutanten) zu erleichtern, die fähig sind Pyruvat abzubauen. Beispielsweise werden die Zellen auf 1,5-prozentigen Agarplatten ausgestrichen, die annähernd 1 bis 30 Gramm pro Liter (g/l) Glucose, vorzugsweise 10 g/l Glucose, und 30 Mikrogramm (μg)/ml Kanamycin enthalten. Das Gen für Kanamycinresistenz wird bei NZN-111 in das Gen für Lactatdehydrogenase inseriert. Die Kulturen werden für 24 Stunden bei 37°C, in einer kontrollierten anaeroben Atmosphäre, vermehrt. Eine anaerobe Atmosphäre, die gute Ergebnisse lieferte, war ein Gemisch aus Kohlendioxid und Wasserstoff, das durch die Verwendung eines Atmosphären-Steuerungsgeräts, das im Handel von Becton-Dickinson, Cockeysville, Maryland als GASPAK^TM erhältlich ist, bereitgestellt wurde.
Der Inkubationszeitraum ergab viele Kolonien von AFP-111 (annähernd 2 pro 10⁷ Zellen) und annähernd die Hälfte von diesen waren in der Lage, in flüssigem Medium zu wachsen, um das gewünschte Gemisch aus Produkten zu produzieren.
Im Falle der Plasmidtransformation, wenn NZN-111 mit dem Plasmid pMDH13, das das Gen mdh für eine Mutante des Enzyms Malatdehydrogenase enthält, transformiert wird, liefert der Pyruvatabbau wieder Lactat. Reihenkultivierung dieses Transformanten (NZN-111 (pMDH13)) führt zu AFP-111, das eine spontane chromosomale Mutation enthält. AFP-111 produziert ein Gemisch aus Bernsteinsäure, Essigsäure und Ethanol als Fermentierungsprodukte, wobei Bernsteinsäure bis zu 99 Gewichtsprozent, verglichen mit dem Gewicht der in dem Wachstumsmedium verwendeten Glucose, produziert wird. Das Entwicklungs- und Transformationsprotokoll von pMDH 13 ist ähnlich wie das in W.E. Boernke, et al. (10. September 1995) Archives of Biochemistry and Biophysics 322, Nr. 1, S. 43–52, offenbarte.
Für die experimentelle Beurteilung der hier beschriebenen Stämme, werden die Zellen aerob in Glucose-freiem Wachstumsmedium (Luria-Brühe) kultiviert, bis Zelldichten von zwischen 0,5 und 10 OD₆₀₀ erreicht werden.
Sobald diese geeignete Biomasse von AFP-111 erreicht wird, werden die Zellen in eine verschlossene Fermentierungs-Reaktionskammer injiziert oder anderweitig dorthin überführt, um darin eingeschlossen zu sein. Die Brühe wird mit Glucose oder einem anderen geeigneten Kohlenhydrat, wie z.B. Xylose, Galaktose oder Arabinose, in Konzentrationen, die zwischen annähernd 10 bis 30 g/l variieren, gemischt. Das nun enthaltene Gemisch wird einer Atmosphärenänderung unterzogen, wodurch anaerobe Bedingungen erzielt werden. Ein Mittel zum Erzielen der Atmosphärenänderung ist mit einer Begasungsstation, wodurch Umgebungsluft gegen Kohlendioxid ausgetauscht wird.
Vor Einführung des Gemischs in die Fermentierungs-Reaktionskammer wird die Kammer mit einer geeigneten Menge an Puffermedium, wie z.B. MgCO₃, CaCO₃ oder CaMg(CO₃)₂ versorgt, um einen nahezu neutralen pH-Wert aufrechtzuerhalten. Zwischen annähernd 4 und 8 Gewichtsprozent des Puffermediums werden typischerweise für eine geeignete Pufferkapazität genutzt. Besonders gute Ergebnisse werden erhalten, wenn das Puffermedium als ein Feststoff vorliegt, um der Fermentierflüssigkeit eine Depot-Pufferkapazität zu verleihen.
Die vorstehende Vorgehensweise führt zu hohen Ausbeuten an Bernsteinsäure. Beispielsweise wurde ein 6:1-Gewichtsverhältnis von Bernsteinsäure zu Essigsäure erhalten, mit einer 99-prozentigen Ausbeute. Das Bernsteinsäure-zu-Essigsäure-Verhältnis steigt sogar weiter, wenn die Fermentierung in Gegenwart von Wasserstoffgas, mit H₂-Konzentrationen von zwischen annähernd 25 Prozent bis 100 Prozent, durchgeführt wird. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass im Gegensatz zu den Organismen auf dem Stand der Technik, der Mutant AFP-111 exogenen Wasserstoff als ein Reduktionsmittel verwendet. Beispielsweise werden, wenn Luria-Brühe, Glucose, Puffermittel und ein Gemisch aus Wasserstoffgas und Kohlendioxid (wobei CO₂ aus dem Puffermittel freigesetzt wird) vorhanden sind, Bernsteinsäure-zu-Essigsäure-Verhältnisse, die sich 9 nähern, erhalten. Dieses Ergebnis spiegelt einen anderen Vorteil der genauen Festlegung des Abbaus der Glucose zum gewünschten Produkt, ohne unerwünschte, Acetat produzierende Nebenreaktionen, wider.
Nachstehende Tabelle 1 veranschaulicht die Produktverteilung der Dicarbonsäuren für den ursprünglichen Stammorganismus W 1485 (auch erhältlich von Southern Illinois University), NZN-111 und AFP-111.
TABELLE 1: Produktausbeute in molarer Ausbeute gegenüber Anfangsglucose (Molprozent) für AFP-111 und die Stammorganismen

*Werte der molaren theoretischen Ausbeute können 200 Prozent betragen, weil ein Molekül Glucose zwei aller Produkte ergeben kann.

Wenn eine 100-prozentige Kohlendioxidatmosphäre genutzt wird, wird die Bernsteinsäureproduktion gesteigert, wobei die Bernsteinsäurekonzentrationen annähernd 45 Gramm pro Liter erreichen, die Ergiebigkeit annähernd 1,6 Gramm pro Liter pro Stunde erreicht, die Prozentausbeute an Gramm der Bernsteinsäure zu Gramm der Glucose 99 Prozent erreicht und das Gewichtsverhältnis von Bernsteinsäure zu Essigsäure annähernd sechs erreicht.
Bernsteinsäure wird auch produziert, wenn das NAD-abhängige E. coli-Äpfelsäureenzym in NZN-111 produziert wird (durch die Zugabe und Induktion des Gens maeA). In diesem Fall wird das induzierbare Plasmid pMEE2-1 verwendet, um die Expression des Äpfelsäureenzymgens in dem Transformant NZN-111 (pMEE2-1) zu erlauben.
Aus E. coli MC1061 isolierte Genom-DNA wurde als Templat für das Klonen des Äpfelsäureenzyms mit PCR verwendet. E. coli MC1061 wurde mit den Restriktions-Endonukleasen Hind III und Pst I verdaut, wobei das so erhaltene verdaute Material an 1-prozentigem TAE-Agarosegel klassiert wurde. Die Größe des Genom-DNA-Fragments, das das Äpfelsäureenzymgen enthielt, wurde unter Verwendung einer Southern-Blot-Analyse mit dem PhotoGene Nukleinsäure-Detektionssystem (Kat. 8192SA) bestimmt, wie vorstehend beschrieben.
Die „Primer" basierten auf einer veröffentlichten DNA-Teilsequenz des Gens:
„Sense": CGAAGAACAAGCGGAACGAGCAT;
„Antisense": GGCAGCAGGTTCGGCATCTTGTC;
Diese „Primer" wurden mit 1 Mikroliter (μM) mit annähernd 20 Nanogramm (ng) der Genom-DNA in einer 100 Mikroliter (μl)-PCR-Standardreaktion kombiniert, die das erwartete innere 0,8 Kilobasen (kB)-Fragment des Äpfelsäureenzymgens lieferte. Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung eines Qiaex Gelextraktions-Kits (Qiagen, Inc., Chatsworth, California) gereinigt und unter Verwendung eines BioNick-Markierungssystems (GibcoBRL, Gaithersburg, Maryland) biotinyliert. Das biotinylierte PCR-Produkt wurde in der Southern-Blot-Analyse der E. coli-Genom-DNA, die mit Hind III und einer von mehreren anderen sekundären Endonukleasen gespalten worden war, als Probe verwendet. Von dem Äpfelsäureenzymgen wurde bestimmt, dass es sich in dem Bereich befindet, der 2,0–2,5 kB-Fragmente der von Hind III und Pst I verdauten DNA enthält.
Ein Mikrogramm E. coli-DNA wurde mit Hind III und Pst I verdaut und auf einem präparativen 1-prozentigen TAE-Agarosegel klassiert. Die E. coli-DNA-Fragmente in dem 2,0–2,5 kB-Bereich wurden isoliert und unter Verwendung des Qiaex Gelextraktions-Kits gereinigt. Die gereinigten DNA-Fragmente wurden durch Ligation mit dem Polylinker-Bereich von pUC19, das mit Pst I und Hind III gespalten worden war, verknüpft und mit alkalischer Garnelenphosphatase behandelt. Das verknüpfte Material wurde dann als ein Templat für eine PCR-Reaktion verwendet, um das gesamte Äpfelsäureenzymgen zu amplifizieren. Ein Mikroliter des Ligationsgemischs wurde mit 1 μM des „Sense-Primer"s GATGCCCCATGGATATTCAAAAAAGAGTGAGT, der auf das Äpfelsäureenzymgen abzielte, und 0,25 μM des „Antisense-Primer"s TTTTCCCAGTCACGACGTTG, der auf die verknüpfte pUC19-DNA abzielte, als ein Templat verwendet. Die Amplifizierungsparameter waren 94°C-Denaturierung, 55°C-Hybridisierung für eine Minute und eine 72°C-Verlängerung für drei Minuten für insgesamt 35 Zyklen. Das PCR-Produkt wurde auf einem einprozentigen TAE-Agarosegel analysiert und das 1,8 kB-Fragment wurde isoliert und unter Verwendung des Qiaex Gelextraktions-Kits gereinigt. Ein Anteil des PCR-Produkts wurde mit Bcl und Bgl verdaut, um nachzuweisen, dass das Produkt das Äpfelsäureenzymgen enthielt. Der Rest des PCR-Produkts wurde mit Pst I und Nco I verdaut, Gel-isoliert, wieder gereinigt und dann durch Ligation mit dem Polylinker-Bereich des Expressionsvektors pTRC99a (Pharmacia, Piscataway, New Jersey), der mit Nco I und Pst I gespalten worden war, verknüpft. Der E. coli-Stamm NZN-111 wurde mit dem Ligationsgemisch mit Standardverfahren transformiert und die so erhaltenen Kolonien (vier Kolonien aus dem Versuch und 2 Kolonien aus der Kontrolle) wurden mit Restriktionsfragmentanalyse unter Verwendung von Xmn auf das Äpfelsäureenzymgen geprüft (0,7 kB-, 1,4 kB- und 3,9 kB-Fragmente erwartet). Das Plasmid, das das geklonte Äpfelsäureenzymgen enthält, wurde pMEE3 genannt.
Eine 100ml-Kultur von NZN (pMEE3) wurde in einer „Übernacht"-Kultur vermehrt und das Plasmid wurde unter Verwendung eines Qiagen Plasmid-Kits isoliert. Das isolierte Plasmid wurde als Templat für die PCR-Reaktion verwendet. Ein neuer „Primer" wurde angelegt, um einen alternativen N-Terminus zu ergeben, der sich 81 Basenpaare abwärts von dem bei dem ersten Klonen des Äpfelsäureenzym verwendeten „Primer"s befand. Zwanzig Nanogramm des Plasmids wurden mit 1 μM des „Sense-Primer"s AGGATCCATGGAACCAAAAACAAAAAAC und des „Antisense-Primer"s CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC als Templat verwendet. Die Amplifizierungsparameter waren die gleichen wie vorstehend angegeben. Ein Anteil des PCR-Produkts wurde wieder mit Restriktionsabbildung mit Bcl I und Bgl II verifiziert, die ergab, dass das Produkt das Äpfelsäureenzymgen enthielt. Der Rest des PCR-Materials wurde mit Pst I und Nco I verdaut und Gel-isoliert, wieder gereinigt und dann durch Ligation mit dem Polylinker-Bereich des Expressionsvektors pTRC99a (Pharmacia, Inc. Piscataway, N.J.), der mit Nco I und Pst I gespalten worden war, verknüpft. Der E. coli-Stamm JM109 wurde mit dem Ligationsgemisch mit Standardverfahren transformiert und die so erhaltenen Kolonien (drei Versuchsklone und 1 Kontrollklon) wurden mit Restriktionsfragmentanalyse auf die gewünschte Insertion geprüft. Das Plasmid, das diese Version des Äpfelsäureenzymgens enthält, wurde pMEE2 genannt.
Dreißig Milliliter LB-Brühe, die 100 μg/ml Ampicillin enthielt, wurden mit 1,5 ml einer „Übernacht"-Kultur von pMEE2 beimpft. Nach zwei Stunden Wachstum wurde die 30ml-Kultur in 3–10ml-Aliquote getrennt. Die Enzymaktivität wurde mit 0,100 μM und 10 μM Isopropylthiogalaktosid (IPTG) induziert. Eine 2ml-Probe wurde aus jeder Kultur bei 0, 1, 2, 3, und 4 Stunden entnommen. Das Protein wurde gemäß Standardverfahren isoliert und die Aktivität wurde wie vorstehend angegeben bestimmt.
Die Enzymproduktion über die Zeit ist in nachstehender Tabelle 2 abgebildet: TABELLE 2: Äpfelsäureenzymproduktion, induziert durch IPTG in LB-Brühe.
Zweifache Kulturen von NZN-111 (pMEE2) und, als eine Kontrolle, NZN 111 (pTRC99a) wurden aerob in 2ml LB-Medium, das Ampicillin enthielt, vermehrt. Eine Kultur von jedem wurde mit 10 μM IPTG induziert. Nach drei Stunden hatte sich die OD₆₀₀ von 0,6 auf 4,8 erhöht. Ein Milliliter der Kulturen wurde in verschlossene 58 ml-Glasfläschchen, die 10 ml LB-Medium, enthaltend Glucose mit 20 g/l, Acetat mit 1 g/l und 0,5 g festes MgCO₃, enthielten, injiziert. Die Atmosphäre bestand aus Luft:Wasserstoff:Kohlendioxid in einem 1:1:2-Verhältnis bei 1 atm Druck über Umgebungsdruck. Der Kultur wurden sofort und in Intervallen während der Inkubation bei 37°C unter Schütteln bei 100 U/min Proben entnommen. Nachstehende Tabelle 3 stellt einen Vergleich der Produktausbeuten bereit, wenn NZN-111 mit rohem Vektor (pTRC99a) transformiert wird, versus pMEE2.
Tabelle 3 Effekt der Expression von Äpfelsäureenzym in NZN-111 (pMEE2) versus NZN-111 (pTRC99a)
Die in Tabelle 3 abgebildeten Ergebnisse sind das Ergebnis von Inkubationszeiträumen zwischen annähernd 19 und 42 Stunden.
Äpfelsäure, eine Vorstufe von Bernsteinsäure ist im Prinzip ein besseres Endprodukt als Bernsteinsäure, insoweit als ihre Produktion einen reduktiven Schritt weniger erfordert. Die theoretische Stöchiometrie für die Äpfelsäureproduktion ist: ein Mol Glucose und zwei Mol Kohlendioxid werden in zwei Mol Äpfelsäure umgewandelt. Als solches könnte die Herstellung von Äpfelsäure ohne Verschwendung von Glucose stattfinden. Fumarsäure, die das Dehydratationsprodukt der Äpfelsäure und die Vorstufe von Succinat auf dem Reduktionsstoffwechselweg ist, könnte auch gebildet werden. Sowohl Äpfelsäure als auch Fumarsäure könnten auch ohne die Produktion von Nebenprodukt gebildet werden, aber die höhere Löslichkeit der Äpfelsäure macht sie für Produktionsprozesse im Großmaßstab besser geeignet.
Die Transformation geeigneter Bakterien mit einem Gen, das für die Produktion von Äpfelsäureenzym (wie z.B. maeA) verantwortlich ist, könnte zu einem Überschuss an Malat führen. Generell würde den idealen Bakterien Lactatdehydrogenaseaktivität, und andere Enzyme, die Pyruvat metabolisieren, fehlen und dadurch zu einer Akkumulation von Pyruvat führen. Die Bakterien werden stattdessen mit maeA transformiert, um direkt Malat zu produzieren. Um die hohen Spiegel an produziertem Malat aufrechtzuerhalten, dürfen die Bakterien nicht in der Lage sein, das Malat zurück in Lactat umzuwandeln, oder weiter in Fumarat oder Succinat. Insoweit als manchen Lactobacillus-Stämmen das Malolactatenzym, die Fumarase und Fumaratreduktase, die für derartige Umwandlungen verantwortlich sind, fehlen, sind diese Stämme besonders geeignete Kandidaten für die Malatproduktion in Fermentierungsverfahren. Die Brauchbarkeit von Lactobacillus wird weiter gesteigert in Anbetracht seiner sehr hohen osmotoleranten Kennzeichen. Lactobacillus gasseri ist ein nahe liegender Wirt für eine derartige Manipulation, da von ihm gezeigt wurde, dass es Malat während der Fermentierung von Glucose nicht verstoffwechselt, und es genetisch ziemlich gut charakterisiert ist. Lactobacillus casei weist auch beträchtliches Potential auf, insoweit als es eine verhältnismäßig höhere Osmotoleranz zeigt als L. gasseri.
Generell würde ein Äpfelsäureenzymgen (wie z.B. maeA) in einem geeigneten Lactobacillus-Expressionsvektor, wie z.B. pTRK327, induziert in einem Lactobacillus-Wirt, dem ein funktionales Lactatdehydrogenasegen fehlt, die Bildung von Äpfelsäure erlauben. Dies könnte durch Insertion des Äpfelsäureenzyms in das Lactatdehydrogenasegen des Wirts erzielt werden.
Die für die folgenden Beispiele für die Produktion von Carbonsäuren verwendeten Chemikalien schließen ein: Hefeextrakt und Trypton (Difco), Glucose (A.E. Staley), leichtes Weichwasser (A.E. Staley, corn processing plant in Loudon, Tn.), anorganische Chemikalien (E. Merck Science oder J.T. Baker, analysenrein). Die verwendeten Gerät schließen ein: 1l-Fermentator (Virtis), 5l-Fermentator (New Brunswick, Bioflow 3000), Pumpen (Cole-Parmer, Master Flex), pH-Wert-Messfühler (Cole-Parmer), pH-Wert-Steuerungsgeräte (Cole-Parmer, Chem Cadet), Messgerät für gelösten Sauerstoff (Cole-Parmer, 01971-00), Messfühler für gelösten Sauerstoff (Ingold), Autoklav (Amsco, Eagle 3000), Schüttelgerät (New Brunswick), Tieftemperatur-Glasfläschchen (Cole Parmer).
Das Glucose-Analysegerät kam von der Yellow Springs Instrument Company (YSI 2700 Select). Außerdem ist der Spektrophotometer für die OD-Messung von Milton Roy (SPEC 21D).
Der E. coli-Stamm AFP-111 wurde von Argonne National Laboratory erhalten. Der AFP-111-Stamm wurde von NZN-111 abgeleitet. Die Vorratskultur wurde hergestellt, indem 1 g Magnesiumcarbonat (MgCO₃) in einen 250 ml-Kolben gegeben, mit einem Schaumstoffstopfen abgedeckt und bei 121 °C für 20 Minuten autoklaviert wurde. Als nächstes wurde ein 500 ml-Medium hergestellt, das Trypton 10 g/l, Hefeextrakt 5 g/l, Glucose 5 g/l, Natriumchlorid (NaCl) 10 g/l, Kaliumphosphat (K₂HPO₄) 7 g/l, Kaliumphosphat (KH₂PO₄) 3 g/l enthielt. Das Medium wurde dann bei 121°C für 20 Minuten autoklaviert und auf Raumtemperatur abgekühlt. Fünfzig Milliliter des Mediums wurden aseptisch in den ersten Kolben, der das Magnesiumcarbonat enthielt, überführt. Der Kolben wurde dann mit einer vollen Beimpfungsschleife des AFP-111 von einer von Argonne National Laboratory geschickten Agarschrägfläche beimpft. Der beimpfte Kolben wurde dann in einem Schüttelgerät bei 250 U/min bei 37°C inkubiert.
Dann wurde ein Liter Medium hergestellt, das Trypton 10 g/l, Hefeextrakt 5 g/l, Glucose 5 g/l, NaCl 10 g/l, K₂HPO₄ 7 g/l, KH₂PO₄ 3 g/l und Magnesiumsulfat (MgSO₄) 0,2 g/l enthielt. Das Medium wurde bei 121°C für 20 Minuten autoklaviert und abgekühlt. Dann wurden 850 ml aseptisch in einen 1 Liter-Fermentator überführt.
Sobald der 250 ml-Kolben für 16 Stunden inkubiert worden war, wurde sein gesamter Inhalt aseptisch in den 1 Liter-Fermentator überführt. Der Fermentator wurde bei 37°C und bei einem pH-Wert von 7,0 gehalten. Luft wurde in den Boden des Fermentators eingesprüht und die Geschwindigkeit des Gebläsepropellers wurde auf 500 U/min oder höher eingestellt, um ausreichende Sauerstoffübertragung in die Fermentierungsbrühe sicherzustellen, um Sauerstoffeinschränkung zu vermeiden. Der pH-Wert wurde mit einem pH-Wert-Steuerungsgerät, das bei Bedarf eine Pumpe aktiviert, um eine Basenlösung zu dem Fermentator zuzugeben, bei 7 gehalten.
Die Basenlösung wurde hergestellt, indem 250 ml deionisiertes Wasser in einen 500 ml-Messzylinder mit einem Rührstab gegeben wurden. Der Messzylinder wurde mit zwei Schichten einer Autoklavierpapierabdeckung abgedeckt und bei 121 °C für 20 Minuten autoklaviert, dann ließ man auf Raumtemperatur abkühlen. Als nächstes wurden 250 ml 30%iges Ammoniumhydroxid (NH₄OH) zugegeben. Dann wurde eine Öldeckschicht zugegeben, um die Verflüchtigung von Ammoniak zu verhindern. Das Öl wurde bei 121°C für 20 Minuten autoklaviert, bevor es zu dem Zylinder zugegeben wurde. Die Lösung wurde durch Rühren auf einer Magnetplatte gemischt. Die resultierende Basenlösung war eine 15%ige NH₄OH-Lösung.
Um eine Glycerinlösung herzustellen, wurden 15 g Glycerin in einen kleinen Kolben gegeben, wozu 15 ml deionisiertes Wasser zugegeben wurden. Ein kleiner Rührstab wurde zu dem Kolben zugegeben und dann wurde der Kolben mit einem Schaumstoffstopfen abgedeckt und auf einer Magnetplatte gemischt, um eine 50%ige Glycerinlösung herzustellen. Die Glycerinlösung wurde bei 121 °C für 20 Minuten autoklaviert, dann ließ man auf Raumtemperatur abkühlen.
Sobald die Glucosekonzentration in dem Fermentator etwa 1 g/l betrug, wurden 30 ml aseptisch aus dem Fermentator entnommen und zu dem Kolben mit 50%igem Glycerin zugegeben. Dann wurde das Gemisch auf einer Magnetplatte gerührt. Das Gemisch wurde dann aseptisch in Tieftemperatur-Glasfläschchen (vor dem Verpacken vom Hersteller sterilisiert) überführt, etwa 1,2 ml pro Glasfläschchen. Die Glasfläschchen wurden verschlossen und in einem –70°C-Gefrierschrank gelagert. Diese Glasfläschchen dienten als AFP-111-Vorratskultur für alle folgenden Beispiele.
BEISPIEL 1
Das Impfgut wurde in einem Schüttelkolben gezüchtet. Das Medium enthielt Trypton mit 10 g/l, Hefeextrakt mit 5 g/l, Glucose mit 5 g/l, NaCl mit 10 g/l, K₂HPO₄ mit 14 g/l, KH₂PO₄ mit 6 g/l, (NH₄)₂SO₄ mit 2 g/l und MgSO₄ mit 0,2 g/l. Fünfzig Milliliter des Mediums wurden in einen 250 ml-Kolben gegeben. Der Kolben wurde zugestöpselt, bei 121°C für 20 Minuten autoklaviert, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 1 ml aus einem Vorratskultur-Glasfläschchen beimpft. Es wurde dann bei 37°C bei 200 U/min für 16 Stunden inkubiert. Das Fermentierungsmedium enthielt Trypton mit 10 g/l, Hefeextrakt mit 5 g/l, Glucose mit 5 g/l, NaCl mit 10 g/l, K₂HPO₄ mit 1,4 g/l, KH₂PO₄ mit 0,6 g/l, (NH₄)₂SO₄ mit 2 g/l und MgSO₄ mit 0,2 g/l. Ein Liter des Mediums wurde hergestellt, bei 121 °C für 20 Minuten autoklaviert und auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, bevor 850 ml in den Ein-Liter-Fermentator überführt wurden. Der Fermentator wurde mit dem gesamten Inhalt des Kolbens beimpft. (Das Fermentierungsmedium enthält niedrige Glucosekonzentrationen von weniger als 10g/l). Die Fermentierung wurde bei 37°C und bei einem pH-Wert von 7,0 mit Durchlüftung ausgeführt. Der pH-Wert wurde bei 7,0 gehalten, indem bei Bedarf durch die Aktion eines pH-Wert-Steuerungsgeräts eine 15%ige NH₄OH-Lösung zugegeben wurde. Sobald die Anfangsglucose in der Fermentierungsbrühe erschöpft war, wurde eine Zufuhrpumpe angeschaltet, um eine Nährlösung zu dem Fermentator zuzugeben.
Die Nährlösung (Lösung 1) wurde hergestellt, indem 250 g Glucose und 50 g leichtes Weichwasser in 400 ml deionisiertem Wasser gelöst wurden. Diese Lösung 1 wurde bei 121°C für 20 Minuten autoklaviert und auf Raumtemperatur abgekühlt. Dann wurden für Lösung 2 NaCl mit 5 g/l, K₂HPO₄ mit 7 g/l, KH₂PO₄ mit 3 g/l, (NH₄)₂SO₄ mit 22,5 g/l und MgSO₄ mit 1 g/l in 100 ml deionisiertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde dann bei 121°C für 20 Minuten autoklaviert, auf Raumtemperatur abgekühlt und zu Lösung 1 zugegeben. Die resultierende Lösung wurde als die Nährlösung für den Fermentator verwendet.
Die Geschwindigkeit der Zufuhrpumpe wurde manuell gesteuert, um die Restglucosekonzentration in dem Fermentator bei oder unterhalb von 1 g/l zu halten. Wenn die Glucosekonzentration über 1 g/l stieg, wurde die Pumpgeschwindigkeit verringert. Wenn die Glucosekonzentration zu hoch war, etwa 5 g/l oder höher, wurde die Pumpe abgeschaltet bis die Glucosekonzentration unter 1 g/l fiel. Während der ersten 24 Stunden wurde der Fermentator durchlüftet, um eine aerobe Umgebung bereitzustellen, die erlaubte, dass sich der Organismus zu einer hohen Zellendichte vermehrte. Die bei 660 nm (OD₆₆₀) gemessene optische Dichte betrug 24 nach 24 Stunden. Die Luft wurde dann abgeschaltet, um eine anaerobe Umgebung zu errichten, um den Organismus in den anaeroben Stoffwechsel für die Bernsteinsäureproduktion zu zwingen. Die anaerobe Bedingung wurde bis zum Ende des Versuchs aufrechterhalten. Während der anaeroben Stufe wurde die Glucosekonzentration bei oder über 1 g/l gehalten.
Die Ergebnisse von Beispiel 1 werden in 1 graphisch dargestellt und nachstehend in TABELLE 4 zusammengefasst.
TABELLE 4
BEISPIEL 2
Der Versuch in diesem Beispiel wurde auf genau die gleiche Weise wie in BEISPIEL 1 durchgeführt, außer dass die Luft nach sechs Stunden abgeschaltet wurde, anstelle von nach 24 Stunden. Zu dem Zeitpunkt als die Luft abgeschaltet wurde, betrug die OD₆₆₀ 6.
Die Ergebnisse werden in 2 graphisch dargestellt und in TABELLE 5 zusammengefasst. TABELLE 5
Die Ergebnisse zeigten eine signifikante Verbesserung durch den früheren Übergang von aeroben zu anaeroben Bedingungen in dem Fermentator an.
BEISPIEL 3
Das in diesem Beispiel verwendete Medium enthielt folgendes: Hefeextrakt mit 2 g/l, Trypton mit 15 g/l, NaCl mit 2 g/l, (NH₄)₂SO₄ mit 2 g/l, CaCl₂ mit 0,6 g/l, MgSO₄ mit 0,5 g/l, KH₂PO₄ mit 1,3 g/l, MnCl₂ mit 0,01 g/l. Vier Fermentierungen wurden in dem Fünf-Liter-Fermentator durchgeführt. Der pH-Wert in diesen Versuchen wurde bei 6,2, 6,6, 7,0 und 7,4 gesteuert, indem bei Bedarf 5 N NaOH zugegeben wurde. Das Impfgut wurde in einem Schüttelkolben unter Verwendung des gleichen, auf pH-Wert 7,0 eingestellten, Mediums gezüchtet. In den Fermentatoren wurden die Zellen aerob mit Lufteinsprühung und einer Geschwindigkeit des Gebläsepropellers bei 500 U/min vermehrt, bis die OD₆₆₀ 6 erreichte (etwa 5 bis 6 Stunden). Dann wurde die Bewegung auf 250 U/min verringert und das Einsprühgas wurde auf reines Kohlendioxid gewechselt.
Die Ergebnisse für BEISPIEL 3 werden in 3 graphisch dargestellt und in TABELLE 6 zusammengefasst. TABELLE 6 ist ein Vergleich der Fermentierungsergebnisse bei 100 Stunden bei unterschiedlichen pH-Werten.
TABELLE 6
Die Ergebnisse zeigten an, dass Bernsteinsäure über einen breiten Bereich des pH-Werts produziert werden konnte, vorzugsweise bei einem pH-Wert von etwa 6,6 bis 7,0.
BEISPIEL 4
In diesem Beispiel wurden sowohl Hefeextrakt als auch Trypton durch leichtes Weichwasser ersetzt, das ein sehr preiswertes Nebenprodukt der Mais verarbeitenden Industrie ist. Das leichte Weichwasser wurde hergestellt, indem der pH-Wert des Weichwassers mit 50%iger NaOH auf 7,0 eingestellt wurde. Die suspendierten Feststoffe wurden durch Filtration durch Whatman Filterpapier Nr. 2 entfernt. Das klare Filtrat wurde in dem Fermentierungsversuch verwendet.
Das Impfgut wurde in einem Schüttelkolben gezüchtet. Eine Lösung wurde mit folgendem hergestellt: NaCl mit 20 g/l, K₂HPO₄ mit 28 g/l, KH₂PO₄ mit 12 g/l, (NH₄)₂SO₄ mit 4 g/l, MgSO₄ mit 0,4 g/l. Die Lösung wurde dann bei 121°C für 20 Minuten autoklaviert. Dann wurden 30 ml des leichten Weichwasser-Filtrats zu einem 250 ml-Kolben zugegeben. Der Kolben wurde zugestöpselt, bei 121 °C für 20 Minuten autoklaviert und dann ließ man auf Raumtemperatur abkühlen. Dann wurden zu dem Kolben 30 ml der Lösung 1 (aus BEISPIEL 1) zugegeben. Deshalb enthielt dieses Medium 50% leichtes Weichwasser-Filtrat. Der Kolben wurde mit 0,1 ml aus einem Glycerin-Vorratskultur-Glasfläschchen (BEISPIEL 1) beimpft. und bei 35°C und 200 U/min für 16 Stunden inkubiert.
Eine Lösung 2 wurde mit folgendem hergestellt: NaCl mit 20 g/l, K₂HPO₄ mit 2,8 g/l, KH₂PO₄ mit 1,2 g/l, (NH₄)₂SO₄ mit 4 g/l und MgSO₄ mit 0,4 g/l. Diese Lösung wurde dann bei 121°C für 20 Minuten autoklaviert und man ließ auf Raumtemperatur abkühlen. Zu dem Ein-Liter-Fermentator wurden 425 ml leichtes Weichwasser-Filtrat zugegeben. Der Fermentator wurde bei 121°C für 20 Minuten autoklaviert und man ließ auf Raumtemperatur abkühlen. Dann wurden 425 ml der Lösung 2 zu dem Ein-Liter-Fermentator zugegeben, was dazu führte, dass das Fermentierungsmedium 50% leichtes Weichwasser-Filtrat enthielt. Der Fermentator wurde mit dem gesamten Inhalt des Schüttelkolbens beimpft. Die Fermentierung wurde bei 37°C und bei einem pH-Wert von 7,0 durchgeführt. Der pH-Wert wurde bei 7,0 gehalten, indem bei Bedarf eine 1,5 M Natriumcarbonatlösung zugegeben wurde. Diese Lösung wurde durch Autoklavieren bei 121°C sterilisiert. Die Zellen wurden anfänglich aerob durch Einsprühung von Luft in den Fermentator für sechs Stunden vermehrt. Der gelöste Sauerstoff wurde während dieses Zeitraums überwacht. Gelegentlich fiel der Spiegel des gelösten Sauerstoffs auf unter 5% Sättigung, aber mit der kontinuierlichen Einsprühung von Luft war die Bedingung im Inneren des Fermentators immer noch aerob. Am Ende des Zeitraums wurde die Luft abgeschaltet, um die Bernsteinsäureproduktion durch anaeroben Stoffwechsel des Organismus' zu starten. Zur gleichen Zeit wurde eine Pumpe angeschaltet, um eine Lösung, die etwa 500 g/l Glucose enthielt, zu dem Fermentator zuzuführen. Die Geschwindigkeit der Zufuhrpumpe wurde manuell eingestellt, um die Glucosekonzentration in der Fermentierungsbrühe größer als oder gleich 1 g/l zu halten.
Die Ergebnisse von BEISPIEL 4 werden in 4 graphisch dargestellt und in TABELLE 7 zusammengefasst. TABELLE 7 zeigt die Akkumulation der Bernsteinsäure in Fermentierungsmedium mit 50% leichtem Weichwasser.
TABELLE 7
Diese Ergebnisse zeigten an, dass Bernsteinsäure in einem billigen Medium, in dem sowohl der teure Hefeextrakt als auch Trypton durch das preiswerte leichte Weichwasser ersetzt wurden, produziert werden konnte.
BEISPIEL 5
In diesem Beispiel wurde die Konzentration des leichten Weichwassers in sowohl dem Schüttelkolben als auch den Fermentierungsmedien auf 25% verringert. Die anderen Bedingungen waren genau die gleichen, wie die in BEISPIEL 4 beschriebenen. Wasser wurde zugegeben, um den Volumenmangel infolge der geringeren Mengen an verwendetem leichten Weichwasser wettzumachen.
Die Ergebnisse werden in 5 graphisch dargestellt und in TABELLE 8 zusammengefasst. TABELLE 8 zeigt die Akkumulation der Bernsteinsäure in Fermentierungsmedium mit 25% leichtem Weichwasser.
TABELLE 8
Die Ergebnisse zeigten an, dass Bernsteinsäure in einem sogar noch wirtschaftlicheren Medium, in dem das leichte Weichwasser auf 25% verringert wurde, produziert werden konnte.
BEISPIEL 6
In diesem Beispiel betrug die Konzentration des leichten Weichwassers in sowohl dem Schüttelkolben als auch den Fermentierungsmedien 25% und die Base war 1,5 M Ammoniumcarbonat. Die anderen Bedingungen waren die gleichen wie in BEISPIEL 4 beschrieben.
Die Ergebnisse werden in 6 graphisch dargestellt und in TABELLE 9 zusammengefasst, die die Akkumulation der Bernsteinsäure in Fermentierungsmedium mit 25% leichtem Weichwasser mit Ammoniumcarbonat zur pH-Wertsteuerung zeigt.
TABELLE 9
Die Ergebnisse zeigten an, dass andere Carbonatsalze als Natriumcarbonat, wie z.B. Ammoniumcarbonat, Magnesiumcarbonat etc. zur pH-Wertsteuerung in einem Bernsteinsäurefermentierungsverfahren verwendet werden konnten.
BEISPIEL 7
Vier Versuche werden in diesem Beispiel beschrieben. In zwei Versuchen betrug die Konzentration des leichten Weichwassers in sowohl dem Schüttelkolben als auch den Fermentierungsmedien 25% und die Base war 2 M NaOH. In den anderen zwei Versuchen betrug die Konzentration des leichten Weichwassers 50% und die Base war 15%ige NH₄OH. Innerhalb jeden Satzes der zwei Versuche, die die gleiche Base zur pH-Wertsteuerung verwendeten, wurde in einem Versuch während der anaeroben Phase für die Herstellung von Bernsteinsäure durch anaeroben Stoffwechsel reines Kohlendioxid in den Fermentator mit etwa 100 ml pro Minute eingesprüht.
Die Ergebnisse werden in 7 graphisch dargestellt und in TABELLE 10 zusammengefasst. TABELLE 10 zeigt die Akkumulation der Bernsteinsäure in Fermentierungsmedium mit leichtem Weichwasser mit Ammoniumhydroxid und Natriumhydroxid zur pH-Wertsteuerung.
TABELLE 10
Die Ergebnisse zeigten, dass falls eine andere Base als ein Carbonatsalz zur pH-Wertsteuerung verwendet wurde, die Einsprühung von Kohlendioxidgas in den Fermentator während der anaeroben Phase für signifikante Bernsteinsäureproduktion notwendig wurde.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Herstellen von Äpfelsäure über Fermentierung bereit. Äpfelsäure, eine Vorstufe von Bernsteinsäure, ist im Prinzip ein besseres Endprodukt als Bernsteinsäure, insoweit als ihre Produktion einen reduktiven Schritt weniger erfordert. Die theoretische Stöchiometrie für die Äpfelsäureproduktion ist: ein Mol Glucose und zwei Mol Kohlendioxid werden in zwei Mol Äpfelsäure umgewandelt. Als solche kann die Herstellung von Äpfelsäure ohne Verschwendung von Glucose stattfinden. Fumarsäure, die das Dehydratationsprodukt von Äpfelsäure und die Vorstufe von Succinat in dem Reduktionsstoffwechselweg ist, kann auch gebildet werden. Sowohl Äpfelsäure als auch Fumarsäure können auch ohne Produktion von Nebenprodukt gebildet werden, aber die höhere Löslichkeit der Äpfelsäure macht sie für Produktionsprozesse im Großmaßstab besser geeignet.
Die vorliegende Erfindung kann auch ein kontinuierliches Fermentierungsverfahren sein, das aus einem Fermentator und einem Absetzbehälter besteht. Die Zellen, die sich am Boden des Absetzbehälters absetzen, werden in den Fermentator zurückgeführt, um die Zellkonzentration zu erhöhen, die wiederum die Ergiebigkeit erhöht. Es ist beobachtet worden, dass die Zellen sich äußerst gut zusammenballten und absetzten, sobald das Mischen gestoppt wurde.
Bernsteinsäure wird auch mit einem kontinuierlichen Fermentierungsverfahren, das aus einem Fermentator und einer Ultrafiltrationseinheit besteht, hergestellt. Die in dieser Einheit aufgefangenen Zellen werden in den Fermentator zurückgeführt, um die Zellkonzentration zu erhöhen, was wiederum die Ergiebigkeit erhöht. Die Entfernung des(der) Fermentierungsprodukts(e) aus der Brühe mit der Ultrafiltrationseinheit entspannt die Produkthemmung und erhöht die Ausbeute.
Bernsteinsäure wird auch mit einem kontinuierlichen Fermentierungsverfahren hergestellt, in dem kontinuierlich ein Adsorbens zu dem Fermentator zugegeben und daraus entfernt wird. Die Entfernung des(der) Fermentierungsprodukts(e) aus der Brühe entspannt die Produkthemmung und erhöht die Ausbeute.
Bernsteinsäure wird auch mit einem Batch-Verfahren, das aus zwei hintereinander geschalteten Fermentatoren besteht, hergestellt. Der Organismus wird unter aeroben Bedingungen in dem ersten Fermentator (Wachstumsfermentator) zu hoher Zellendichte vermehrt. Die Biomasse wird dann in den zweiten Fermentator (Produktionsfermentator) überführt, wo anaerobe Bedingungen angewandt werden, um die Produktion von Bernsteinsäure zu fördern. Der Wachstumsfermentator kann dann gereinigt und verwendet werden, um mehr Biomasse zur Übertragung in einen anderen Produktionsfermentator zu kultivieren. Da der Produktionszeitraum viel länger ist, als der Wachstumszeitraum, kann ein Wachstumsfermentator verwendet werden, um Biomasse für eine Reihe von Produktionsfermentatoren bereitzustellen.
Obwohl gezeigt und beschrieben wurde, was gegenwärtig als die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung betrachtet wird, wird es für Fachleute offensichtlich sein, dass verschiedene Abänderungen und Modifikationen darin vorgenommen werden können, ohne den durch die beigefügten Ansprüche definierten Umfang der Erfindung zu verlassen.

Claims

Verfahren zur Herstellung von Carbonsäuren, umfassend die Schritte: a) Beimpfen eines Mediums, das eine Kohlenstoffquelle aufweist, mit einem Carbonsäure produzierenden Mikroorganismus mit einer Biomasse; b) Inkubieren des Mikroorganismus in einer aeroben Atmosphäre, um das schnelle Wachstum des Mikroorganismus zu fördern, wodurch sich die Biomasse des Mikroorganismus erhöht; c) steuerbares Freisetzen von Sauerstoff, um die aerobe Atmosphäre aufrechtzuerhalten; d) steuerbare Zufuhr zu dem Mikroorganismus einer Lösung, die die Kohlenstoffquelle enthält, um eine Konzentration der Kohlenstoffquelle in dem Medium von etwa 0,5 g/l bis etwa 1 g/l aufrechtzuerhalten; e) Entzug des Sauerstoffs aus der aeroben Atmosphäre, um eine anaerobe Atmosphäre zu schaffen, wodurch bewirkt wird, dass der Mikroorganismus einem anaeroben Stoffwechsel unterzogen wird; f) steuerbare Zufuhr zu dem Mikroorganismus der Lösung, die die Kohlenstoffquelle enthält, um eine Konzentration der Kohlenstoffquelle in dem Medium von ≥ 1 g/l aufrechtzuerhalten; und g) Umwandeln der Kohlenstoffquelle in Carbonsäuren unter Verwendung des anaeroben Stoffwechsels des Mikroorganismus.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus aus Escherichia coli- und Lactobacillus-Bakterien ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus osmotolerant ist, wodurch der Mikroorganismus in der Lage ist, organische Säuren zu produzieren, ohne dass der Stoffwechsel des Mikroorganismus gehemmt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei es sich bei dem Mikroorganismus um Escherichia coli-Bakterien handelt, die von einem Stamm-Mikroorganismus abgeleitet sind, dem die Gene für Pyruvatformiatlyase und Lactatdehydrogenase fehlen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus genetisch manipuliert ist, um ein Enzym zu exprimieren, das es dem Mikroorganismus ermöglicht, Pyruvat in Dicarbonsäure umzuwandeln.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Enzym Äpfelsäureenzym ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Mikroorganismus unter Verwendung des anaeroben Stoffwechsels Bernsteinsäure, Essigsäure und Ethanol produziert, wobei die Bernsteinsäure das Hauptprodukt ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Mikroorganismus unter Verwendung des anaeroben Stoffwechsels Äpfelsäure, Essigsäure und Ethanol produziert, wobei die Äpfelsäure das Hauptprodukt ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Mikroorganismus unter Verwendung des anaeroben Stoffwechsels Fumarsäure, Essigsäure und Ethanol produziert, wobei die Fumarsäure das Hauptprodukt ist.
Verfahren zur Herstellung von Carbonsäuren, umfassend: a) Beimpfen eines Mediums, das eine Kohlenstoffquelle aufweist, mit einem Carbonsäure produzierenden Mikroorganismus mit einer Biomasse; b) Inkubieren des Mikroorganismus in einer Umgebung mit einem gleichbleibenden pH-Wert und mit einer aeroben Atmosphäre, um das schnelle Wachstum des Mikroorganismus zu fördern, wodurch sich die Biomasse des Mikroorganismus erhöht; c) steuerbares Freisetzen von Sauerstoff, um die aerobe Atmosphäre aufrechtzuerhalten; d) steuerbare Zufuhr zu dem Mikroorganismus einer Lösung, die die Kohlenstoffquelle enthält, um eine Konzentration der Kohlenstoffquelle in dem Medium von etwa 0,5 g/l bis etwa 1 g/l aufrechtzuerhalten; e) Überführen des Mikroorganismus mit erhöhter Biomasse in einen Produktionsfermentator mit einer anaeroben Atmosphäre, um zu bewirken, dass der Mikroorganismus einem anaeroben Stoffwechsel unterzogen wird; f) steuerbare Zufuhr zu dem Mikroorganismus einer Lösung, die die Kohlenstoffquelle enthält, um eine Konzentration der Kohlenstoffquelle in dem Produktionsfermentator von ≥ 1 g/l aufrechtzuerhalten; und g) Umwandeln der Kohlenstoffquelle in Carbonsäuren unter Verwendung des anaeroben Stoffwechsels des Mikroorganismus.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Mikroorganismus aus Escherichia coli- und Lactobacillus-Bakterien ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Mikroorganismus osmotolerant ist, wodurch der Mikroorganismus in der Lage ist, organische Säuren zu produzieren, ohne dass der Stoffwechsel des Mikroorganismus gehemmt wird.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Mikroorganismus ein Escherichia coli-Stamm ist, der von einem Stamm-Mikroorganismus abgeleitet ist, welchem die Gene für Pyruvatformiatlyase und Lactatdehydrogenase fehlen.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Mikroorganismus genetisch manipuliert ist, um ein Enzym zu exprimieren, das es dem Mikroorganismus ermöglicht, Pyruvat in Dicarbonsäure umzuwandeln.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Enzym Äpfelsäureenzym ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Mikroorganismus unter Verwendung des anaeroben Stoffwechsels Bernsteinsäure, Essigsäure und Ethanol produziert, wobei die Bernsteinsäure das Hauptprodukt ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Mikroorganismus unter Verwendung des anaeroben Stoffwechsels Äpfelsäure, Essigsäure und Ethanol produziert, wobei die Äpfelsäure das Hauptprodukt ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Mikroorganismus unter Verwendung der anaeroben Atmosphäre Fumarsäure, Essigsäure und Ethanol produziert, wobei die Fumarsäure das Hauptprodukt ist.