CN1130404A - 一种利用微生物双转化株制备二羟乙酸/氨甲基膦酸混合物改进方法 - Google Patents
一种利用微生物双转化株制备二羟乙酸/氨甲基膦酸混合物改进方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1130404A CN1130404A CN94193254A CN94193254A CN1130404A CN 1130404 A CN1130404 A CN 1130404A CN 94193254 A CN94193254 A CN 94193254A CN 94193254 A CN94193254 A CN 94193254A CN 1130404 A CN1130404 A CN 1130404A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- catalase
- acid
- transformant
- reaction
- double
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 30
- HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N glyoxylic acid Chemical compound OC(=O)C=O HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 title description 2
- ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N Phosphorous acid Chemical compound OP(O)=O ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 title 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 claims abstract description 126
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 claims abstract description 126
- 108010062584 glycollate oxidase Proteins 0.000 claims abstract description 82
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 60
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 53
- MGRVRXRGTBOSHW-UHFFFAOYSA-N (aminomethyl)phosphonic acid Chemical compound NCP(O)(O)=O MGRVRXRGTBOSHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 10
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims abstract description 7
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 claims abstract description 6
- 230000006872 improvement Effects 0.000 claims abstract description 5
- MOOYVEVEDVVKGD-UHFFFAOYSA-N oxaldehydic acid;hydrate Chemical compound O.OC(=O)C=O MOOYVEVEDVVKGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 60
- 229960004275 glycolic acid Drugs 0.000 claims description 58
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims description 30
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 12
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 11
- 125000004202 aminomethyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 3
- 235000008935 nutritious Nutrition 0.000 claims description 3
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 51
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 51
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 37
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 abstract description 37
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 abstract description 37
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 2
- 102100038837 2-Hydroxyacid oxidase 1 Human genes 0.000 abstract 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 89
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 84
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 62
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 58
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 48
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 32
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 31
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 28
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 28
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 27
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 21
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 19
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N flavin mononucleotide Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 18
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 17
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 16
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 16
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 15
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- OCBHHZMJRVXXQK-UHFFFAOYSA-M benzyl-dimethyl-tetradecylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 OCBHHZMJRVXXQK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 9
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 8
- 241000219315 Spinacia Species 0.000 description 7
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 7
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 7
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 7
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 6
- 229950001574 riboflavin phosphate Drugs 0.000 description 6
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 5
- 229930003756 Vitamin B7 Natural products 0.000 description 5
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-N isobutyric acid Chemical compound CC(C)C(O)=O KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 235000011912 vitamin B7 Nutrition 0.000 description 5
- 239000011735 vitamin B7 Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101150025634 CTT1 gene Proteins 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 3
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 3
- CCBICDLNWJRFPO-UHFFFAOYSA-N 2,6-dichloroindophenol Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1N=C1C=C(Cl)C(=O)C(Cl)=C1 CCBICDLNWJRFPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100034289 Deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase SAMHD1 Human genes 0.000 description 2
- QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N Ethylamine Chemical compound CCN QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000641031 Homo sapiens Deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase SAMHD1 Proteins 0.000 description 2
- 239000007868 Raney catalyst Substances 0.000 description 2
- 229910000564 Raney nickel Inorganic materials 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 235000021336 beef liver Nutrition 0.000 description 2
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 2
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 description 2
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 1
- SPSSULHKWOKEEL-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trinitrotoluene Chemical group CC1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O SPSSULHKWOKEEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 2-(4-chloro-2-methylphenoxy)acetic acid;n-methylmethanamine Chemical compound CNC.CC1=CC(Cl)=CC=C1OCC(O)=O PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710105017 2-Hydroxyacid oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 244000024675 Eruca sativa Species 0.000 description 1
- 235000014755 Eruca sativa Nutrition 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 1
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 231100000674 Phytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N Ruthenium Chemical compound [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- NSOXQYCFHDMMGV-UHFFFAOYSA-N Tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine Chemical compound CC(O)CN(CC(C)O)CCN(CC(C)O)CC(C)O NSOXQYCFHDMMGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001464837 Viridiplantae Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 150000008044 alkali metal hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 229910052728 basic metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003818 basic metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000009903 catalytic hydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006392 deoxygenation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 150000002373 hemiacetals Chemical class 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002466 imines Chemical class 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 229910052741 iridium Inorganic materials 0.000 description 1
- GKOZUEZYRPOHIO-UHFFFAOYSA-N iridium atom Chemical compound [Ir] GKOZUEZYRPOHIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N kalafungina Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC=C2C(=O)C2=C1[C@@H](C)O[C@H]1[C@@H]2OC(=O)C1 XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- -1 methyl phosphono Chemical group 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 235000012149 noodles Nutrition 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 229910052762 osmium Inorganic materials 0.000 description 1
- SYQBFIAQOQZEGI-UHFFFAOYSA-N osmium atom Chemical compound [Os] SYQBFIAQOQZEGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MUMZUERVLWJKNR-UHFFFAOYSA-N oxoplatinum Chemical compound [Pt]=O MUMZUERVLWJKNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- XNQULTQRGBXLIA-UHFFFAOYSA-O phosphonic anhydride Chemical compound O[P+](O)=O XNQULTQRGBXLIA-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910003446 platinum oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000000452 restraining effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000006965 reversible inhibition Effects 0.000 description 1
- 229910052703 rhodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010948 rhodium Substances 0.000 description 1
- MHOVAHRLVXNVSD-UHFFFAOYSA-N rhodium atom Chemical compound [Rh] MHOVAHRLVXNVSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229910021654 trace metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052723 transition metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003624 transition metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C51/00—Preparation of carboxylic acids or their salts, halides or anhydrides
- C07C51/347—Preparation of carboxylic acids or their salts, halides or anhydrides by reactions not involving formation of carboxyl groups
- C07C51/373—Preparation of carboxylic acids or their salts, halides or anhydrides by reactions not involving formation of carboxyl groups by introduction of functional groups containing oxygen only in doubly bound form
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/28—Phosphorus compounds with one or more P—C bonds
- C07F9/38—Phosphonic acids [RP(=O)(OH)2]; Thiophosphonic acids ; [RP(=X1)(X2H)2(X1, X2 are each independently O, S or Se)]
- C07F9/3804—Phosphonic acids [RP(=O)(OH)2]; Thiophosphonic acids ; [RP(=X1)(X2H)2(X1, X2 are each independently O, S or Se)] not used, see subgroups
- C07F9/3808—Acyclic saturated acids which can have further substituents on alkyl
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
一个改进的二羟乙酸和氨甲基膦酸混合物的制备方法,包括在有氨甲基膦酸以及羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶存在的水溶液里,用氧气氧化羟乙酸的步骤,其中的改进包括利用微生物双转化株细胞催化剂,表达外源性羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶,该外源性过氧化氢酶由于不受氨甲基膦酸的抑制而被选择。
Description
发明背景
1.发明涉及的领域
该发明是关于改进二羟乙酸与氨甲基膦酸混合物的生产工艺,改进后是将二羟乙酸与氧在氨甲基膦酸和催化剂存在的条件下,在水溶液中进行反应。更具体地说,不过不限于此,该发明是关于基因工程得到的微生物双转化株的应用,该转化株表达两个外源酶作催化剂,一个是羟基乙酸氧化酶(例如,(S)-2-羟-酸氧化酶,EC1.1.3.15);另一个是不被AMPA(氨甲基膦酸)抑制的过氧化氢酶(例如,EC1.11.1.6),例如来源于啤酒酵母的过氧化氢酶T。
2.有关工艺的描述
羟基乙酸氧化酶一般存在于绿叶植物和哺乳类细胞中,它催化羟基乙酸氧化生成二羟乙酸,伴随过氧化氢产生:N.E.Tolbert等(J.Biol.Chem.,Vol.181,905~914,1949)首先报道,自烟叶中提取的一种酶,催化羟乙酸氧化成甲酸和二氧化碳的反应,该反应的中间产物是二羟乙酸。加入某些化合物,如乙二胺,可限制二羟乙酸的进一步氧化。氧化反应发生在pH8左右,羟乙酸的典型浓度约为3~40mM(毫克分子)。报道的羟基乙酸氧化的最佳pH值是8.9。据报道草酸(100mM)可阻止羟基乙酸氧化酶的催化作用。K.E.Richardson和N.E.Tolbert(J.Biol.Chem.,Vol.236,1280~1284,1961)有相似的报道,含有三羟甲基氨基乙烷(TRIS)的缓冲溶液,在羟基乙酸氧化酶催化羟乙酸氧化过程中,抑制草酸的形成。C.O.Clagett,N.E.Tolbert和R.H.Burris(J.Biol.Chem.,Vol.178,977~987,1949)报道,对于羟基乙酸氧化酶催化的羟基乙酸与氧的氧化反应,最佳pH值是7.8~8.6,最佳温度是35~40℃。
I.Zelitch和S.Ochoa(J.Biol.Chem.,Vol.201,707~718,1953)和J.C.Robinson等(J.Biol.Chem.,Vol.237,2001~2009,1962)报道,在菠菜羟基乙酸氧化酶催化作用下,羟基乙酸氧化产生甲酸和CO2,这是由H2O2同二羟乙酸的非酶催化反应引起的。他们发现加入催化过氧化氢分解的过氧化氢酶,能够通过抑制甲酸和二氧化碳的形成极大地提高二羟乙酸产率。加入FMN(黄素单核苷酸)大大地增加了羟基乙酸氧化酶的稳定性。
N.A.Frigerio和H.A.Harbury(J.Biol.Chem.,Vol.231,135~157,1958)已经报道了自菠菜中分离得到的羟基乙酸氧化酶的制备和性质。纯化的该酶在溶液中很不稳定,这种不稳定性归因于,FMN(黄素单核苷酸)与其活性位点的结合比较弱,另一方面是该酶具有酶活性的四聚体和八聚体解聚成无酶活性的单体和二聚体。这些单体和二聚体发生不可逆的聚集和沉淀。向酶溶液中加入FMN(黄素单核苷酸),可大大提高其稳定性。高蛋白质浓度和高离子强度,可维持该酶以四聚体和八聚体的形式存在。
美国专利5,135,860(U.S.Patent 5,135,860)已描述了一种二羟乙酸和氨甲基膦酸(AMPA)混合物的制备方法。羟乙酸和氧在水溶液中反应,该反应是有AMPA(氨甲基膦酸)和两种酶催化剂存在条件下进行的,其一是可溶性的菠菜羟基乙酸氧化酶,另一个是可溶性过氧化氢酶(例如黑曲霉过氧化氢酶)。这个方法证明使用过氧化氢酶(以破坏副产物过氧化氢,它引起甲酸的生成)以及作为胺添加剂的AMPA,能够同二羟乙酸形成抗氧化的N-取代半缩胺和/或亚胺(限制其进一步氧化)。美国专利(U.S.Patent5,180,846)描述了这些混合物氢化,生成N-(甲基膦酰)甘氨酸的方法,这是一种苗期植物毒性剂和除草剂。本发明是对上述制备过程的特别的改进。
发明概述
本发明涉及发现了当某些过氧化氢酶被用于水溶液中进行的、AMPA存在条件下的羟乙酸(和/或它的盐)与氧发生的酶促氧化反应,生成二羟乙酸(和/或它的盐溶液)和AMPA的混合物的原有的可逆的抑制。一般说来,本发明的优越性在于,利用基因工程得到的双转化株微生物细胞,该细胞表达了两个外源酶作催化剂,一个是羟基乙酸氧化酶(例如,(S)-2-羟酸氧化酶,EC1.1.3.15)(如来源于菠菜),另一个是过氧化氢酶(EC1.11.1.6)。更具体地说,本发明为外源性催化酶提供了表达,选择这种酶的原因是因为它不被AMPA(氨甲基膦酸)抑制(例如啤酒酵母过氧化氢酶T)。二羟乙酸和AMPA(氨甲基膦酸)混合物,对于制备苗期除草剂N-(甲基膦酰)甘氨酸是有用的。
这样,本发明提供了制备二羟乙酸和氨甲基膦酸混合物的改进方法,包括在水溶液中,在氨甲基膦酸和羟基乙酸氧化酶和催化酶存在的条件下,用氧氧化羟乙酸的步骤,其中改进包括利用微生物双转化株细胞催化剂,用以表达两个外源酶,羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶。
附图和生物样品的保藏的概述
依据本发明所述,利用多形汉逊酵母双转化株催化剂,连续进行了30批试验。图1表明了每批实验的反应时间、二羟乙酸产率(%)、透性细胞羟基乙酸氧化酶和总过氧化氢酶的百分回收率(以其透性化之后的起始值为基准)的曲线。
根据布达佩斯条约,下述生物材料保藏于InternationalDepository Authority,Agricultural Research Service CultureCollection(NRRL,农业研究服务机构培养繁殖样品收集处),位于美国的1815N,University Street,Peoria,IL 61604。保藏的生物材料名称 NRRL编号 保藏日期Hansenula polymorpha,G01 Y-21065 1993.3.30Pichia pastoris,GS115-MSP10 Y-21001 1992.9.24Hansenula polymorpha,G02 Y-21113 1993.6.25Hansenula polymorpha,G03 Y-21114 1993.6.25Pichia pastoris,MSP8.6 Y-21187 1994.2.1
优选实施方案描述
一个相近的、尚未批准的、普通转让的专利,U.S.S.N.08/026,615(CH-2279-B,PCT/
)描述了二羟乙酸与AMPA(氨甲基膦酸)混合物的制备。该方法采用几个基因工程微生物转化株之一作为催化剂。这些转化株表达了菠菜羟基乙酸氧化酶以及内源性过氧化氢酶。利用多形汉逊酵母或pastoris毕赤酵母微生物细胞转化株作催化剂氧化羟乙酸/AMPA(氨甲基膦酸)混合物时,需加入第二种过氧化氢酶源,以提高二羟乙酸的产率。与来源于构巢曲霉和黑曲霉的过氧化氢酶相比,多形汉逊酵母和pastoris毕赤酵母的透性细胞所能达到的内源性过氧化氢酶活力较低,致使生成了大量的甲酸(二羟乙酸被过氧化氢氧化之后生成的产物)。加入来自黑曲霉或啤酒酵母可溶性过氧化氢酶或完整的透性啤酒酵母细胞,作为补充的过氧化氢酶来源,使得利用多形汉逊酵母和pastoris毕赤酵母转化株作催化剂,制备二羟乙酸的产量显著提高。
来源于黑曲霉、啤酒酵母(过氧化氢酶T)、多形汉逊酵母和pastoris毕赤酵母及牛肝的过氧化氢酶被一一试验用作分解羟乙酸/AMPA(氨甲基膦酸)混合物氧化生成的过氧化氢的催化剂。这些催化酶都编目作为“Cytostolic”,已发现来源于多形汉逊酵母、pastoris毕赤酵母和牛肝的过氧化氢酶被AMPA(氨甲基膦酸)可逆抑制这种情况在以前未见报道。不论是使用可溶性过氧化氢,固定化过氧化氢酶还是含有过氧化氢酶的完整细胞作为催化剂,都表现出抑制作用。
对于被用作催化剂的、其内源过氧化氢酶被AMPA抑制的微生物转化株(例如:多形汉逊酵母或pastoris毕赤酵母转化株)来说,另一种向羟乙酸/AMPA反应混合物添加补充抗抑制过氧化氢酶源的方法是,将微生物转化株(它表达了外源的羟基乙酸氧化酶)再次进行了基因工程,使之表达了补充的不被AMPA抑制的外源过氧化氢酶,例如来自啤酒酵母的过氧化氢酶。在没有加入不被AMPA(氨甲基膦酸)抑制的过氧化氢酶的条件下,利用此微生物“双”转化株作催化剂,比利用其过氧化氢酶可被AMPA(氨甲基膦酸)抑制的微生物细胞“单”转化株(即外源性羟基乙酸氧化酶和内源性过氧化氢酶)作催化剂,二羟乙酸的产率大大提高,生成的甲酸酯则显著减少。
以既有羟基乙酸氧化酶活性,又具有抗AMPA(氨甲基膦酸)的催化酶活性的微生物细胞双转化株作催化剂,来氧化羟乙酸/AMPA混合物,比过去使用的具有可溶性的抗抑制的催化酶微生物细胞单转化株,有几个优点:1)双转化株容易回收、再利用;反应结束后,将反应混合物离心或过滤即可。而单转化株回收困难,活性损失较大。2)抗抑制过氧化氢酶内含在微生物细胞中,其过氧化氢酶活性比可溶性过氧化氢酶更稳定,这表现在催化剂周转使用的次数上和回收的酶活性上。3)双转化株对于反应条件是稳定的,氧被喷射到反应混合物中,增加了氧溶解速率和反应速率,而在相似条件下,可溶性的过氧化氢酶很快变性,不可逆地损失其酶活性。
本发明使用多形汉逊酵母(一种甲醇营养型酵母)的双转化株为生物细胞催化剂,它表达了菠菜的羟基乙酸氧化酶,以及啤酒酵母的过氧化氢酶T。制备了几种具有充分的羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶T活力的多形汉逊酵母转化株。例如,发现于pHCT-124(Hansen and Roggenkamp,Eur.J.Biochem.,184:173~179(1989))质粒的编码过氧化氢酶T(最初来源于啤酒酵母)的CTTl编码序列,被亚克隆到M13(Ledeboer et al.,Nucleic Acids Res.,13,3063(1985)and Messing,Methods Enzymol;101:20~78(1983))载体上,通过定点突变,在CTT1基因的ATG起始密码和TAA终止密码侧翼产生了BglII限制性酶切酶位点。pBR质粒***了CTT1基因、融合了ADH1/卡那霉素抗性之后,产生的载体是pRBCATT。将CTT1基因***FMD启动子和MOX终止序列之间,构成G0表达质粒。以pRBCATT质粒转化形成的多形汉逊酵母G01,其存取号被确定为NRRL No.Y-21065,而其表达G0(羟基乙酸氧化酶)和过氧化氢酶T的菌株,其确认过程在尚未确定的、广泛转让的美国专利申请U.S.S.N.08/085,491 PCT WO-
得到详尽描述,其中伴有文献。采用pBRCATT质粒进行基因工程时,鉴定了七十多个具有不同表达水平的克隆,其表达水平的定义是在G0(羟基乙酸氧化酶)之外每毫克蛋白所具有的CTT1酶活。从其亚克隆中设定了两个独立的微生物双转化株,分别是G02和G03,它们的存取号被分别确定为NRRL NO.Y-21113和Y-21114。
多形汉逊酵母双转化株的典型制备方法是,首先将双转化株接种到培养基中(500ml)培养,含有0.7g YNB(无硫酸铵)、0.5g酵母提取物,2.5g硫酸铵,1g明胶水解液(BBL)1.5g酪蛋白氨基酸(Difco),0.3g K2HPO4,0.25mg维生素H,1.25mg维生素B1和7.5g甘油。在30℃、pH5.0条件下振荡培养(200转/分)24小时。然后,将培养液转移到14升的发酵桶里,发酵桶原盛有喷雾干燥的玉米浸取液(Roquette,4.7g/L)、硫酸铵(3.5g/L)、维生素H(0.36mg/L),维生素B1(1.0mg/L)和甘油(30g/L),共10升。细胞培养15~20小时,温度30℃,搅拌速度为500~550转/分,空气换气速率为2~4升/分,利用无水氨控制pH为5。当与生长有关的甘油耗尽时,则加入甲醇(10.0g/L)到发酵桶中,诱导羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶T的表达,同时补充加入0.67g/L的YNB(无氨基酸和硫酸铵),0.1mg/L维生素H,0.5mg/L的维生素B1和0.5g/L的甘油。甲醇浓度保持在2~10g/L,甘油浓度保持在<1g/L。诱导后2 0~30小时,羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶T的表达。达到最大值。
培养结束后,培养的细胞通过离心来收集,并储存于-20℃。多形汉逊酵母双转化提取物里,各种酶活分别是,羟基乙酸氧化酶90~180DCIP IU/g湿细胞,总过氧化氢酶(啤酒酵母过氧化氢酶T加上内源性多形汉逊酵母过氧化氢酶)的酶活是165,000~330,000IU/g湿细胞,过氧化氢酶T的酶活是90,000~175,000IU/g湿细胞。
另一种应用于本发明的微生物细胞催化剂是pastoris毕赤酵母(一种甲醇营养酵母)的双转化株,它表达了菠菜羟基乙酸氧化酶和啤酒过氧化氢酶。将编码羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶T的DNA***表达载体,处于乙醇氧化酶(AUX)启动子控制之下,从而制备出几个具有足够羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶活力的pastoris毕赤酵母转化株。以此载体转化pastoris毕赤酵母,制备出的菌株是pastoris毕赤酵母MSP8.6具有高水平的羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶T,其存取号被确定为NRRL No.Y-211187。
pastoris毕赤酵母的双转化株的制备方法是,首先在培养液中培养(1.0L),组成如下:酵母提取物3.0g,麦芽提取物3.0g。胨5.0g,甘油10.0g。然后将培养液转移到14升的发酵桶中。桶内盛有9升培养液,内含38.2g/L的KH2PO4,9.7g/L的硫酸铵,45g/L的甘油,10.53g/L的MgSO4·7H2O,0.81g/L的CaSO4·2H2O和12.9mL的微量元素溶液,微量元素组成如下:6.0g/L的CuSO4·5H2O,0.8g/L的KI,3.0g/L的MnSO4·H2O,0.2g/L的NaMoO4·2H2O,0.02g/L的H3BO3,0.5g/L的CoCl2·6H2O,20g/L的ZnSO4,5mL/L的H2SO4,65g/L的FeSO4·7H2O和0.2g/L的维生素H。细胞在30℃,搅拌速度500~550转/分,空气交换速率5L/分,利用氢氧化铵控制pH为5.0的条件下培养45小时。当与细胞生长有关的甘油耗尽时,向发酵桶中加入50mL诱导培养基,诱导羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶T的表达。诱导培养基是由下列物质组成的混合物:1.5升甲醇;7.5mL微量金属,7.5mL浓度为0.20g/L的维生素H等的溶液。通过向发酵桶添加诱导培养基,保持甲醇浓度为0.2~0.6%。诱导47小时后收集细胞。
发酵结束后,离心收集这些细胞,储存于-20℃。在pastoris毕赤酵母双转化株提取物里,各种酶活是,羟基乙酸氧化酶是218~254 DCIP IU/g湿细胞,总过氧化氢酶(啤酒酵母的过氧化氢酶加上毕赤酵母的内源性过氧化氢酶)是233,000~252,000IU/g湿细胞,过氧化氢酶T的活性20,000~58,000IU/g湿细胞。
多形汉逊酵母及pastoris毕赤酵母双转化株要经过透性化之后,才能用于催化羟基乙酸氧化成二羟乙酸。有许多已知的透性化方法可用于制备具有足够羟基乙酸氧化酶活力的细胞(Felix,Anal.Biochemistry,Vol.120,211~234,1982)。一个方法是将10%(重量比)湿细胞悬浮到0.1%(v/v)“Triton”(***)X-100/20mM磷酸缓冲液(pH7.0)中,混合15分钟,然后在液氮中冷冻,融化,再用20mM磷酸缓冲液洗透性细胞。第二种透性化方法是将10%(重量比)的湿细胞悬浮于0.1%(w/v)氯化苄烷铵/50mM磷酸缓冲液中(pH7.0)60分钟。然后用50mM磷酸缓冲液(pH7.0)洗透性细胞。透性化之后,选择一定数量的完整细胞催化剂加入反应混合物中,以提供所需的羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶的活性浓度。反应后回收的透性细胞催化剂具有的羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶活性大于它们起始值的100%,因为反应过程中,整细胞的透性增加了。
在生产二羟乙酸/AMPA(氨甲基膦酸)混合物过程中,采用微生物细胞双转化株作催化剂,消除了用可溶性催化酶与微生物单转化株联合使用作催化剂的许多不足之处。通过将催化剂从反应混合物中离心分离出来重新投入新反应混合物中循环使用,很容易地回收和重新使用整细胞催化剂。使用这种方法,羟基乙酸氧化酶可循环使用数可高达107。喷射氧气或含氧气体到反应混合物中,而过氧化氢酶的活性无损失(如联合使用可溶性过氧化氢酶与微生物单转化株时所出现的)提高了从催化循环中回收过氧化氢酶活性。
羟基乙酸氧化酶活性(以透性微生物双转化株加入),在反应中的有效浓度通常是0.01到100IU/mL,优选浓度是0.1到10IU/mL。1IU(Intermational Unit,国际单位)被定义为,每分钟催化一微克分子底物发生转变所需的酶量。可溶性酶的检测方法见文献Zelitch和Ochoa,J.Biol.Chem.,Vol.201,707~718,1953。该方法的一个改进方案被用检测新制备的或循环再用的微生物双转化株中羟基乙酸氧化酶活性。双转化株的羟基乙酸氧化酶酶活按下面步骤测定:准确称取5~10mg渗透过的湿细胞,置于一个3mL的石英比色槽中,槽内有磁搅拌棒,加入2.0mL缓冲液(0.12mM的二氯苯酚-靛酚(DCIP)和80mM的TRIS(pH8.3))。比色槽用橡皮膜封口,通N25分钟除氧。用注射器向槽中加0.04mL的1.0M羟乙酸/1.0M TRIS(pH8.3),在搅拌的情况下,于605nm波长处(ε=22.000)测量随时间所发生的吸光度的变化。
抗AMPA抑制的过氧化氢酶酶活(例如,啤酒酵母过氧化氢酶T,以透性微生物双转化株形式加入)在此反应中,有效浓度是50~100,000IU/mL,优选浓度是500~14,000IU/mL。透性微生物双转化株总过氧化氢酶活性(啤酒酵母过氧化氢酶T加上内源性多形汉逊酵母和pastoris毕赤酵母过氧化氢酶)的测定方法是,准确称取2~5mg的透性湿细胞,置于3mL的石英比色槽中,槽中有搅拌棒,然后加入2.0mL的59mM H2O2(溶于16.7mM磷酸缓冲液中,pH7.0),在搅拌情况下,于波长240nm处(ε=39.4)测量吸光度随时间的变化。微生物双转化株的过氧化氢酶T和内源性过氧化氢酶酶活通过制备双转化株的提取物、按上述步骤在pH7.0和pH4.0条件下分别进行测定,与它们各自在pH7.0的活性相比,在pH4.0时,啤酒酵母过氧化氢酶T的酶活是pH7.0时的60%,内源性多形汉逊酵母的过氧化氢酶酶活,仅是pH7.0时的7%,而内源性pastoris毕赤酵母菌过氧化氢酶酶活在pH4.0时,几乎测不出来。
羟乙酸(2-羟基醋酸)可以在市场上买到。在本反应中,其起始浓度可以在0.1M到2.0M范围内变动,优选浓度是0.25M到1.0M。羟乙酸及其合适的盐都可使用,这种盐是水溶性的,其阳离子不干扰预期的羟乙酸向二羟乙酸的转变。也不干扰随后的二羟乙酸同氨甲基膦酸作用,生成N-(甲基膦酰)甘氨酸的反应。通过实验很容易确定合适的形成盐的阳离子基团。代表性的盐有碱金属、碱土金属、铵(NH4 +)、取代的铵、(PR4 +)及取代的盐(PR4X)。
羟乙酸向二羟乙酸的转变,优选地在水溶性介质中进行,这种转变很便利。加入氨甲基膦酸(AMPA)或其适当的盐,使AMPA、羟乙酸的摩尔比率(起始量)为0.01/1.0到3.0/1.0,优选是0.25/1.0到1.05/1.0。AMPA与羟乙酸在水溶液中结合之后,混合物的pH调到6到10,最佳值是7.0到8.5。再用适当的、无干扰的碱,包括碱金属氢氧化物,碳酸盐、碳酸氢盐和磷酸盐调到所需的精确的值。随着反应的进行,反应混合物的pH值略有降低。所以通常采用如下有效的措施,反应开始时其pH值采用接近其最大酶活力pH范围的最高值,大约是9.0~8.5,以弥补在反应过程中的降低。由于酶的活力随pH值改变,最好通过分批加入无干扰无机或有机缓冲液来保持pH值。
羟乙酸和二羟乙酸在水中高度解离,在pH7~20之间,大部分以羟乙酸和二羟乙酸离子形式存在。专业人员认为,二羟乙酸(以及其共轭碱,二羟乙酸根阴离子)亦可能以水合物形式如(HO)2CHCOOH和/或半缩醛HOOCCH(OH)OCH(OH)COOH存在。其组成及阴离子对应物与二羟乙酸及阴离子对应物是等价的,适于反应生成N-(甲基膦酰)甘氨酸。
黄素单核苷酸(FMN)是最佳的加入组分,其浓度为0.0~2.0mM。
羟乙酸转化成二羟乙酸的氧化剂是氧气(O2)氧气可以通过搅拌气-液界面处的液体以气体形式加入,或通过一个可以透过氧气的膜,或把氧气喷射到(鼓泡)到反应混合物中。通过控制加氧气速度(氧气溶于水溶液介质的速率),在大多数情况下,至少部分性地控制于氧气溶解于液体培养基的速率。虽然也能以空气代替氧气,但最好还是使用较纯的氧气,甚至提高加氧气的压力。氧气压力上限虽然不知道,但可用到50个大气压,优选为是15个大气压。为了维持气氧气的溶解速度(亦即维持反应速率),搅拌是很重要的。任何便利的振荡方式均可采用,例如搅拌。
反应温度是个重要的条件,它影响反应速率和酶的稳定性。反应温度采用0℃~40℃,但优选的反应温度范围是5℃~15℃。在最佳温度范围内进行反应,反应结束时可回收到最大的酶活性。温度不能低到水溶液开始结冰的程度。可用很普通的方法来控制温度,例如但不局限于,使用带夹套的反应器,让适当温度的液体通过夹套。反应容器可用任何相对于反应物为惰性的材料构成。
停止反应溶液同氧气接触之后,用倾析过滤或离心的方法移去透性细胞,再重复使用。除去黄素单核苷酸(FMN)的最佳方案是将溶液和活性碳接触。含有二羟乙酸和氨甲基膦酸的溶液(它被认为与相应的半缩胺和胺处于平衡状态),可按照任何一个本专业所熟知的生产N-(甲基膦酰)甘氨酸的方法来处理。
催化氢化是从含有二羟乙酸和氨甲基膦酸的混合物制备N-(甲基膦酰)甘氨酸的优选的方法。适用于此目的氢化催化剂包括(但不限于此)各种铂金属,如铱、锇、钌、铑、铂和钯;以及其它过渡金属,如钴、铜、镍和锌。催化剂可能是无载体的,例如阮内镍和氧化铂;或者可能是有载体的,例如铂载于碳上,钯载于氧化铝上,或者镍载于硅藻土上。优选的是钯载于碳上,镍载于硅藻土上和阮内镍。氢化可于pH4~11范围内进行,优选的是5~10。氢化作用的温度和压力可在广泛范围内改变。一般温度是0℃~150℃,优选的20℃~90℃,H2的压力一般是1~100个大气压,最好是1~10个大气压,N-(甲基膦酰)甘氨酸,可自还原液中回收,不论采用任何专业领域所熟知还原方法,任何回收方法都行。
下面各个实施例,是对本发明的进一步阐述,二羟乙酸、甲酸和草酸的产率以及羟乙酸的回收率,是相对于反应开始时,体系中羟乙酸总量的百分比。用高效液相色谱仪分析反应混合物:有机酸用Bio-Rad HPX-87H柱,而AMPA(氨甲基膦酸)和N-(甲基膦酰)甘氨酸,则用Bio-Rad Aminex Glyphosate分析柱。
实施例1
一个装有Dispersimax高速搅拌机(Autoclave Engineers)300mL的EZE-密封的经高压灭菌反应器,内盛100mL溶液,其组成如下:羟乙酸(0.500M)、AMPA(0.375M)、异丁酸(0.100M,高压液相色谱分析用的内标物)和FMN(0.01mM,pH8.3)将溶液冷却到5℃。然后向反应器中加0.5g的多形汉逊酵母双转化株G02(NRRL No.Y-21113)(357IU羟基乙酸氧化酶和600,000IU总过氧化氢酶(50%啤酒酵母过氧化氢酶T,50%多形汉逊酵母内源性过氧化氢酶)),该转化株已经过0.1%氯化苄烷铵(LonzaBarquat MB-50)处理,而成为透性细胞。用5%NaOH将混合物的pH调到8.3。在5℃和40psig氧气压力下,750转/分搅拌混合物,通过涡轮高速搅拌机使氧气鼓泡经过混合物。为了监测反应的进行情况,定期取样(反应混合物)0.2mL,用10,000NMWLFilter Unit的Millipore ULTRAFREE(Millipore公司,McClean,VA,USA)进行过滤,用高压液相色谱分析过滤液。1.5小时之后,二羟乙酸、草酸和甲酸的得率分别为90.0%,3.1%和1.8%,羟乙酸的回收率为5.0%。透性细胞的羟基乙酸氧化酶和总过氧化氢酶的最终酶活分别是其透性化之后起始值的146%和113%。
微生物细胞催化剂按上述方式,通过离心自反应混合物中回收。不需任何进一步的处理,这些细胞沉淀物可与100mL新的反应混合物混合,进行新的反应。1.5小时后,二羟乙酸、草酸和甲酸的产率分别是84.3%、4.9%和9.9%,羟乙酸回收率是1.7%。透性细胞的羟基乙酸氧化酶和总过氧化氢酶的最终酶活分别是其透性化之后起始值的143%和104%,经两轮使用之后的回收细胞的提取物中,过氧化氢酶T和多形汉逊酵母过氧化氢酶在总过氧化氢酶中所占百分比分别是46%和54%。
实施例2
重复实施例1中描述的反应,用4.6g多形汉逊酵母单转化株G01(NRRL No.Y-21065)(194IU羟基乙酸氧化酶,440,000IU多形汉逊酵母内源性过氧化氢酶,不含过氧化氢酶T),该转化株已经过0.1%氯化苄烷胺(Lonza Barquat MB-50)处理而成为透性细胞。1.5小时后,二羟乙酸、草酸和甲酸的产率分别是59.3%、2.9%和34.4%,羟乙酸的回收是4.9%。透性细胞的羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶的最终酶活分别是透性化之后起始值的191%和116%。
实施例3(比较)
重复例1中描述的反应,利用10.0g pastoris毕赤酵母单转化株GS115-MSP10(NRRL No.Y-21001)(391IU羟基乙酸氧化酶,457,000 IU pastoris毕赤酵母内源性过氧化氢酶,无过氧化氢酶T)该转化株已经0.1%“Triton”X-100/1冻融处理成为透性细胞。在5℃,120psig氧气压力下,搅拌反应混合物1000转/分。1小时后,二羟乙酸、草酸和甲酸的产率分别是45.5%、2.9%和37.1%,羟乙酸的回收是8.2%。
实施例4
在15℃重复实施例1所描述的反应。利用多形汉逊酵母双转化株G02(NRRL No.Y-21003)(402IU羟基乙酸氧化酶以及588,000IU总过氧化氢酶(50%过氧化氢酶T,50%多形汉逊酵母过氧化氢酶)该转化株已经0.1%氯化苄烷铵(Lonza Barquat MB-50)处理而成为透性细胞。1小时后,二羟乙酸、草酸和甲酸的产率分别是83.2%、6.7%和9.5%,羟乙酸回收率是1.0%。透性细胞的羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶的最终酶活分别是透性化之后起始值的132%和127%。
实施例5
在30℃重复上述例1中描述的反应。利用10.0g多形汉逊酵母GO2双转化株(NRRL No.Y-21113)(699IU羟基乙酸氧化酶以及1,007,000IU总过氧化氢酶(50%过氧化氢酶T,50%多形汉逊酵母过氧化氢酶)),该转化株已经0.1%氯化苄烷铵(LonzaBarquat MB-50)处理而成为透性细胞。1小时后,二羟乙酸、草酸和甲酸的产率分别是65.5%、5.7%和23.0%,羟乙酸的回收率是5.5%。透性细胞的羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶的最终酶活分别是透性化之后起始值的100%和103%。
实施例6
重复实施例1中描述的反应。使用10.0g多形汉逊酵母双转化株GO2(NRRL No.Y-21113)(699IU羟基乙酸氧化酶和1,007,000IU总过氧化氢酶(50%过氧化氢酶T和50%多形汉逊酵母过氧化氢酶)),该转化株已用0.1%氯化苄烷铵(Lonza Barquat MB-50)处理而成为透性细胞。1小时后,二羟乙酸、草酸和甲酸的产率分别是89.4%、4.4%和1.6%,羟乙酸的回收2.5%。透性细胞的羟基乙酸氧化酶和总催化酶的最终酶活分别是透性化之后起始值的84%和98%。
实施例7
重复例1中描述的反应。使用2.0g多形汉逊酵母双转化株G02(NRRL No.Y-21113)(140IU羟基乙酸氧化酶和201,000IU总过氧化氢酶(50%过氧化氢酶T和50%多形汉逊酵母过氧化氢酶)),该转化株已用0.1%氯化苄烷铵(Lonza Barquat MB-50)处理而成为透性细胞。1.75小时后,二羟乙酸、草酸和甲酸的产率分别是76.0%、2.8%和14.0%,羟乙酸的回收是5.8%。透性细胞的羟基乙酸氧化酶和总过氧化氢酶的最终酶活分别是透性化之后起始值的155%和126%。
实施例8
重复例1中的反应。在70psig氧气压力下,不加FMN,使用5.0g多形汉逊酵母双转化株GO2(NRRL No.Y-21113)(383IU羟基乙酸氧化酶以及602,000IU总过氧化氢酶(50%过氧化氢酶T,50%多形汉逊酵母过氧化氢酶)),该转化株已经0.2%氯化苄烷铵(Lonza Barquat MB-50)处理,成为透性细胞。1.75小时后,二羟乙酸、草酸和甲酸的产率分别是85.0%、4.3%和7.4%,羟乙酸的回收是4.1%。透性细胞的羟基乙酸氧化酶和总过氧化氢酶的最终酶活分别是透性化之后起始值的104%和99%。
实施例9
重复实施例1中的反应。在70psig氧气压力下,不加FMN,利用5.0g的多形汉逊酵母双转化株GO2(NRRL No.Y-21113)(383IU羟基乙酸氧化酶和602,000IU总过氧化氢酶(50%过氧化氢酶T和50%多形汉逊酵母过氧化氢酶)),该转化株已经0.2%氯化苄烷铵(Lonza Barquat MB-50)处理,成为透性细胞。1小时后,二羟乙酸、草酸和甲酸的产率分别是87.2%、6.8%和5.0%,羟乙酸的回收是2.3%。透性细胞的羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶的最终酶活分别是透性化之后起始值的110%和105%。
实施例10
上述例1反应按下列条件进行。在120psig氧气压力下,不加FMN,利用5.0g的多形汉逊酵母双转化株GO2(NRRL No.Y-21113)(383IU羟基乙酸氧化酶和602,000IU总过氧化氢酶(50%过氧化氢酶T和50%多形汉逊酵母过氧化氢酶)),该转化株已经0.2%氯化苄烷铵(Lonza Barquat MB-50)处理而成为透性细胞。0.8小时后,二羟乙酸、草酸和甲酸的产率分别是91.3%、5.6%和1.5%,羟乙酸的回收是3.6%。透性细胞的羟基乙酸氧化酶和总过氧化氢酶的最终酶活分别是透性化之后起始值的100%和100%。
实施例11
向一个3盎司Fisher-Porter玻璃的喷雾反应容器中,放一个磁搅拌棒和10mL含有下列组成的水溶液:羟乙酸(0.25M)、AMPA(0.25M)、FMN(0.01M)和异丁酸(0.10M,高效液相色谱的内标物),pH8.3(用50%NaOH调节pH)。然后将溶液冷却到5℃。加入0.50g的多形汉逊酵母双转化株G02(NRRL No.Y-21113)(35.0IU羟基乙酸氧化酶和50,300IU总过氧化氢酶(50%啤酒酵母过氧化氢酶T和50%多形汉逊酵母过氧化氢酶)),该转化株已经0.1%氯化苄烷铵(Lonza Barquat MB-50)处理,成为透性细胞。将此反应混合物用5%NaOH调pH到8.3。密封反应容器,在搅拌情况下,用70psig压力的氧气,5次掠过反应容器,放人大气中。然后保持容器内氧气压力70psig,并维持5℃,进行搅拌。为了监测反应的进程,定期用注射器自取样处取样0.1mL(不降低反应容器中的压力),经Millipore“ULTRAFREE-MC”10,000NMWL过滤器过滤后用高压液相色谱法分析。1小时后,二羟乙酸、草酸和甲酸的产率分别是89.7%、9.1%和1.6%,残留有0.8%的羟乙酸。透性细胞的羟基乙酸氧化酶和总过氧化氢酶的最终酶活分别是透性化之后起始值的94%和117%。
实施例12
重复实施例11的反应。采用0.50M羟乙酸和0.15M AMPA。4.5小时后,二羟乙酸、草酸和甲酸的产率分别是87.6%、6.4%和3.8%,残留有2.0%的羟乙酸。透性细胞的羟基乙酸氧化酶和总过氧化氢酶的最终酶活分别是透性化之后起始值的111%和134%。
实施例13
重复实施例11中的反应。利用0.50M羟乙酸和0.525M AMPA。5.5小时后,二羟乙酸、草酸和甲酸的产率分别是85.3%、6.7%和6.7%,残留1.5%的羟乙酸。透性细胞的羟基乙酸氧化酶和总过氧化氢酶的最终酶活分别是透性化之后起始值的137%和138%。
实施例14
重复实施例11的反应。利用0.50M羟乙酸和0.75M AMPA。26个小时之后,二羟乙酸、草酸和甲酸的产率分别是50.9%、0.9%和1.7%,残留有43.1%的羟乙酸。透性细胞的羟基乙酸氧化酶和总过氧化氢酶的最终酶活分别是透性化之后起始值的117%和144%。
实施例15(比较)
重复实施例11的反应。利用0.50M羟乙酸、0.375M AMPA和0.47g多形汉逊酵母单转化株G01(NRRL No.Y-21065)(10IU羟基乙酸氧化酶、22,100IU内源性多形汉逊酵母过氧化氢酶,没有过氧化氢酶T),该转化株已用0.1%“Triton”X-100/1冻融而成为透性细胞。16小时之后,二羟乙酸、草酸和甲酸的产率分别是57.6%、2.6%和32.5%,回收8.9%羟乙酸。透性细胞的羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶的最终酶活分别是透性化之后起始值的60%和378%。
实施例16(比较)
例11中的反应按下面条件进行。采用0.50M羟乙酸、0.375MAMPA和0.75g pastoris毕赤酵母单转化株GS115-MSP10(NRRL No.Y-21001)(13.2IU羟基乙酸氧化酶、21,200IU pastoris毕赤酵母内源性过氧化氢酶,无过氧化氢酶T),该转化株已用0.1%“Triton”X-100/1冻融而成为透性细胞。9小时后,二羟乙酸、草酸和甲酸的产率分别是30.5%、10.7%和59.2%,残留羟乙酸0.8%。
实施例17
装有Dispersimax高速搅拌机(Autoclave Engineers)的300mL EZE-密封高压釜反应器,内盛100mL下列组成的溶液:羟乙酸(0.500M)、AMPA(0.375M)、异丁酸(0.100M,高压液相色谱分析用内标物)、黄素单核苷酸(0.01M),pH8.3(用5%NaOH调节pH)。溶液冷却到5℃。加入0.5g多形汉逊酵母双转化株G02(NRRL No.Y-21113)(655IU羟基乙酸氧化酶和596,000IU总过氧化氢酶(49%过氧化氢酶T,51%多形汉逊酵母内源性过氧化氢酶)),该转化株已经过0.2%氯化苄烷铵(Lonza Barquat MB-50)处理,成为透性细胞。用5%NaOH调混合物的pH到8.3。在5℃、40psig氧气压力下,搅拌700转/分,通过涡轮高速搅拌机使氧气鼓泡通过混合物。为监测反应过程,定期取样0.20mL,用Millipore“ULTRAFREE-MC”10,000NMWL过滤器过滤后,进行高压液相色谱分析。0.9小时后,二羟乙酸、草酸和甲酸的产率分别是90.6%、7.4%和2.8%,残留2.0%的羟乙酸。
如前面所述,通过离心,回收微生物细胞催化剂。不经任何处理,回收的催化剂即可加入100mL新鲜的反应混合物中,重复使用。利用此相同的工艺,加入相同的5.0g多形汉逊酵母双转化株催化剂,连续进行30批反应。图1描述了每批反应反应时间,二羟乙酸产率、透性细胞的羟基乙酸氧化酶和总过氧化氢酶的最终酶活力的回收率(以它们透性化之后的起始值为基准)。
实施例18
重复实施例17中的反应。采用7.1g多形汉逊酵母双转化株G03(NRRL No.Y-21114)(465IU羟基乙酸氧化酶和770,000IU总过氧化氢酶(27%啤酒酵母过氧化氢酶T,73%多形汉逊酵母内源性过氧化氢酶)),该转化株已经0.1%氯化苄烷铵(LonzaBarquat MB-50)处理,成为透性细胞。反应混合物中不加FMN。1.25小时以后,二羟乙酸、草酸和甲酸的产率分别是86.8%、3.8%和6.0%,回收羟乙酸.3.5%。透性细胞的羟基乙酸氧化酶和总过氧化氢酶的酶活分别是透性化之后起始值的92%和106%。
同上面介绍的一样,通过离心,将微生物细胞催化剂自反应混合物中分出。上清液(0.434M二羟乙酸/0.375M AMPA)通过0.2μm的醋酸纤维素过滤,再连续通过AMICON YM30、YM10和YMI膜过滤器(W.R.Grace和Co.,New York,NY)。得到的滤液置于300mL EZE-密封的带Dispersimax高速搅拌机(Autoclave Engineers)的高压反应釜中,同时放入1.0g的5%载于炭上的钯。反应器中充满氮,然后通入275psig的氢,27℃下,搅拌1000转/分。6小时后,N-(甲基膦酰)甘氨酸的产率是99.9%(相对于AMPA,用高压液相色谱法测定)。
实施例19
装有Dispersimax高速搅拌机(Autoclave.Engineers)的300mL EZE-密封的高压釜反应器,内装含有下列组成的100mL溶液:羟乙酸(0.500M)、AMPA(0.375M)、异丁酸(0.100M,高压液相色谱分析用的内标物)和FMN(0.01mM),pH8.3(用5%NaOH调节)。溶液冷却到5℃。然后加入0.5g pastoris毕赤酵母双转化株MSP8.6(NRRL No.Y-21117)(234IU羟基乙酸氧化酶和543,000IU总过氧化氢酶(13%啤酒较过氧化氢酶T,87%pastoris毕赤酵母内源过氧化氢酶)),该转化株已经0.1%氯化苄烷铵(Lonza Barquat MB-50)处理成为透性细胞。用5%NaOH调pH到8.3。在5℃、70psig氧气压力下,通过涡轮高速搅拌机,使氧气鼓泡通过反应混合物,搅拌速度为750转/分。为了监测反应进程,定期取样0.20mL,以Millipore“ULTRAFREE-MC”10,000NMWL过滤器过滤(Millipore Corp.,Bedford,MA),滤液用高压液相色谱分析。1小时后,二羟乙酸、草酸和甲酸的产率分别是90.0%、4.9%和4.4%,回收羟乙酸3.6%。透性细胞的羟基乙酸氧化酶和总过氧化氢酶的最终酶活分别是透性化之后起始值的125%和160%。
实施例20(比较)
重复实施例19描述的反应。利用3.1g pastoris毕赤酵母单转化株GS115-MSP10(NRRL No.Y-21001)(284IU羟基乙酸氧化酶,554,000IU pastoris毕赤酵母内源过氧化氢酶,无过氧化氢酶T),该转化株已经0.1%氯化苄烷铵(Lonza Barquat MB-50)处理而成为透性细胞。二羟乙酸、草酸和甲酸的产率分别是78.8%、3.2%和12.2%,回收羟乙酸4.8%。透性细胞的羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶的最终酶活分别是它们在透性化之后起始值的101%和139%。
实施例21
一个装有Dispersimax高速搅拌机(Autoclave Engineers)的300mL EZE-密封高压釜反应器,内盛100mL下列组成的溶液:羟乙酸(0.500M)、AMPA(0.375M)、异丁酸(0.100M,高效液相色谱的内标物)和FMN(0.01mM),pH8.3(用5%NaOH调)。溶液冷却到5℃。然后加入7.5g pastoris毕赤酵母双转化株MSP-8.6(NRRL No.Y-21187)(368IU羟基乙酸氧化酶和1,166,800IU总过氧化氢酶(12%啤酒酵母过氧化氢酶T,88%pastoris毕赤酵母内源过氧化氢酶)),该转化株已经0.1%氯化苄烷铵(LonzaBarquat MB-50)处理成为透性细胞。用5%NaOH调混合物的pH到8.3。在5℃、750psig氧气压力下,搅拌750转/分,通过涡轮高速搅拌机的作用,使氧气鼓泡通过混合物。为了监测反应的进程,定期取样0.2mL,经Millipore“ULTRAFREE-MC”10,000NMWL过滤器(Bedford,MA)过滤后,用高效液相色谱分析。1小时后,二羟乙酸、草酸和甲酸的产率分别是92.4%、7.8%和0.3%,回收1.8%羟乙酸。透性细胞的羟基乙酸氧化酶和总过氧化氢酶的最终活性是它们在透性化之后起始值的118%和91%。
通过离心,将微生物细胞催化剂自反应混合物中分出,无需进一步处理,即可投入100mL反应混合物中,重复使用。1小时后,二羟乙酸、草酸和甲酸的产率分别是85.0%、5.2%和10.0%;回收羟乙酸2.6%。透性细胞的羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶的最终酶活是它们在透性化之后起始值的116%和65%。经两轮使用之后的回收细胞提取物中,过氧化氢酶T和多形汉逊酵母过氧化氢酶在总过氧化氢酶中所占百分比分别是8.0%和92%。
实施例22(比较)
重复实施例19中反应。采用5.0g pastoris毕赤酵母单转化株GS115-MSP10(NRRL No.Y-21001)(400IU羟基乙酸氧化酶、1,720,000IU pastoris毕赤酵母内源过氧化氢酶,无过氧化氢酶T),该转化株已经0.1%氯化苄烷铵(LonzaBarquat MB-50)处理而成为透性细胞。1小时后,二羟乙酸、草酸和甲酸的产率分别是78.1%、7.2%和11.7%,回收2.7%羟乙酸。透性细胞的羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶活力分别是其透性化之后起始值的105%和87%。
通过离心回收混合物中的微生物细胞催化剂。无需进一步的处理,即可投入100mL反应混合物中,重复使用。1.5小时后,二羟乙酸、草酸和甲酸的产率分别是52.8%、4.0%和39.1%,回收3.0%羟乙酸。透性细胞的羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶的最终酶活是它们在透性化之后起始值的107%和44%。
对本发明已作描述,并举例说明,使之具有一定程度的具体化。下面的权利要求虽然并不局限于此,但却提出了一个与各条权利要求机器等同物的相应的范围。
Claims (6)
1.一个改进的二羟乙酸和氨甲基膦酸混合物的制备方法,包括在有氨甲基膦酸以及羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶存在的水溶液里,用氧气氧化羟乙酸的步骤,其中的改进包括利用微生物双转化株细胞催化剂,表达外源性羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶,该外源性过氧化氢酶由于不受氨甲基膦酸的抑制而被选择。
2.权利要求1的方法,其中外源性过氧化氢酶由啤酒酵母或黑曲霉产生。
3.权利要求1的方法,其中所说的微生物双转化株细胞,是一个甲醇营养酵母。
4.权利要求3的方法,其中所说的甲醇营养酵母是自包括多形汉逊酵母和pastoris毕赤酵母的类群中选择的。
5.权利要求1的方法,其中所说的微生物双转化株细胞是多形汉逊酵母(NRRL Nos:Y-21113或Y-21114)。
6.权利要求1的方法,其中所说的微生物双转化株细胞是pastoris毕赤酵母(NRRL No:Y-21187)。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US8493793A | 1993-07-01 | 1993-07-01 | |
US08/084,937 | 1993-07-01 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1130404A true CN1130404A (zh) | 1996-09-04 |
Family
ID=22188151
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN94193254A Pending CN1130404A (zh) | 1993-07-01 | 1994-06-29 | 一种利用微生物双转化株制备二羟乙酸/氨甲基膦酸混合物改进方法 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0706577B1 (zh) |
JP (1) | JPH08511950A (zh) |
CN (1) | CN1130404A (zh) |
AU (1) | AU7249994A (zh) |
BR (1) | BR9407343A (zh) |
CA (1) | CA2166381C (zh) |
CZ (1) | CZ345195A3 (zh) |
HU (1) | HUT73613A (zh) |
WO (1) | WO1995001449A1 (zh) |
ZA (1) | ZA944776B (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1121500C (zh) * | 1997-01-31 | 2003-09-17 | Ut-巴泰尔有限公司 | 一种生产二羧酸的方法 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5180846A (en) * | 1991-11-06 | 1993-01-19 | E. I. Du Pont De Nemours & Company | Hydrogenation of enzymatically-produced glycolic acid/aminomethylphosphonic acid mixtures |
US5135860A (en) * | 1991-11-06 | 1992-08-04 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Process for preparing glyoxylic acid/aminomethylphosphonic acid mixtures |
DE69303360T2 (de) * | 1992-01-06 | 1997-01-02 | E.I. Du Pont De Nemours & Co., Wilmington, Del. | Oxydation von Glykolsäure zur Herstellung von Glyoxylsäure unter Verwendung von transformierten mikrobiellen Zellen als Katalysator. |
-
1994
- 1994-06-29 WO PCT/US1994/007079 patent/WO1995001449A1/en not_active Application Discontinuation
- 1994-06-29 JP JP7503557A patent/JPH08511950A/ja active Pending
- 1994-06-29 CA CA002166381A patent/CA2166381C/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-29 BR BR9407343A patent/BR9407343A/pt not_active Application Discontinuation
- 1994-06-29 HU HU9503925A patent/HUT73613A/hu unknown
- 1994-06-29 CZ CZ953451A patent/CZ345195A3/cs unknown
- 1994-06-29 EP EP94922002A patent/EP0706577B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-29 CN CN94193254A patent/CN1130404A/zh active Pending
- 1994-06-29 AU AU72499/94A patent/AU7249994A/en not_active Abandoned
- 1994-07-01 ZA ZA944776A patent/ZA944776B/xx unknown
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1121500C (zh) * | 1997-01-31 | 2003-09-17 | Ut-巴泰尔有限公司 | 一种生产二羧酸的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0706577A1 (en) | 1996-04-17 |
WO1995001449A1 (en) | 1995-01-12 |
BR9407343A (pt) | 1996-10-08 |
CA2166381C (en) | 2005-05-24 |
EP0706577B1 (en) | 1997-08-27 |
CA2166381A1 (en) | 1995-01-12 |
JPH08511950A (ja) | 1996-12-17 |
AU7249994A (en) | 1995-01-24 |
ZA944776B (en) | 1996-01-02 |
HUT73613A (en) | 1996-08-28 |
CZ345195A3 (en) | 1996-08-14 |
HU9503925D0 (en) | 1996-03-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107502647B (zh) | 一种生物酶法去消旋化制备l-草铵膦的方法 | |
CN1096500C (zh) | 丙酮酸的制备方法 | |
CN101184717B (zh) | 乙醇酸的制造方法 | |
Heinrich et al. | Formation of gluconic acid at low pH-values by free and immobilized Aspergillus niger cells during citric acid fermentation | |
CN110452861A (zh) | 一种基因重组工程菌及其在催化合成d-泛酰内酯中的应用 | |
CN1130404A (zh) | 一种利用微生物双转化株制备二羟乙酸/氨甲基膦酸混合物改进方法 | |
CN114181917B (zh) | 一种改造尿酸酶、基因序列、制备方法及应用 | |
CN111686809A (zh) | 羰基还原酶/异丙醇脱氢酶共固载催化剂及其制备方法和应用 | |
DE69303360T2 (de) | Oxydation von Glykolsäure zur Herstellung von Glyoxylsäure unter Verwendung von transformierten mikrobiellen Zellen als Katalysator. | |
EP0969095A2 (de) | (S)-Hydroxynitrillyasen mit verbesserter Substratakzeptanz und deren Verwendung | |
CN111172125B (zh) | 一种固定化d-氨基酸氧化酶及其制备方法和应用 | |
JP3937445B2 (ja) | グリオキシル酸/アミノメチルホスホン酸ジアルキル混合物の製造法 | |
NL8303369A (nl) | Werkwijze voor het bereiden van l-fenylalanine door het opnieuw gebruiken van fenylalanineammoniaklyase. | |
US6709847B2 (en) | Immobilized euphorbiaceae, poaceae or olacaeae s-hydroxynitrile lyase | |
CN1073482A (zh) | 酶促生成的二羟乙酸/氨甲基膦酸混合物的氢化方法 | |
Gavagan et al. | Chemoenzymic synthesis of N-(phosphonomethyl) glycine | |
JP2721536B2 (ja) | D―β―ヒドロキシアミノ酸を取得する方法 | |
CN1153532A (zh) | 用微生物转化体制备的乙醛酸和氨甲基膦酸混合物 | |
DE60126767T2 (de) | Neuartige (r)-2-hydroxy-3-phenylpropionat (d-phenyllaktat) dehydrogenase und für diese kodierendes gen | |
JP4240558B2 (ja) | メタノール資化性酵母の培養法 | |
JP3651924B2 (ja) | (r)−4−(2−ハロ−1−ヒドロキシエチル)−2−トリフルオロメチルチアゾールの製造方法 | |
JPH05284982A (ja) | 微生物によるラセミ化2−アミノニトリルの製造法 | |
AU7316194A (en) | Glyoxylic acid/aminomethylphosphonic acid mixtures prepared using a microbial transformant | |
JP2000354485A (ja) | リパーゼの製造方法 | |
CN1341751A (zh) | 融合蛋白催化顺序酶反应的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C01 | Deemed withdrawal of patent application (patent law 1993) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |