HU227509B1 - A method for the production of dicarboxylic acids - Google Patents
A method for the production of dicarboxylic acids Download PDFInfo
- Publication number
- HU227509B1 HU227509B1 HU0001997A HUP0001997A HU227509B1 HU 227509 B1 HU227509 B1 HU 227509B1 HU 0001997 A HU0001997 A HU 0001997A HU P0001997 A HUP0001997 A HU P0001997A HU 227509 B1 HU227509 B1 HU 227509B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- organism
- acid
- carbon source
- anaerobic
- succinic acid
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 39
- 150000001991 dicarboxylic acids Chemical class 0.000 title description 7
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 141
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 claims description 65
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 57
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 claims description 42
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 41
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 41
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 claims description 41
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 claims description 34
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 34
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 22
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 21
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 20
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 19
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 claims description 19
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 18
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 claims description 17
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 16
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 claims description 15
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 12
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 10
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 claims description 10
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 claims description 10
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Malonic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 4
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 claims description 3
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 claims description 3
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 claims 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 claims 2
- 108010008221 formate C-acetyltransferase Proteins 0.000 claims 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims 1
- 235000011044 succinic acid Nutrition 0.000 description 66
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 64
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 61
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 49
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 49
- 239000000047 product Substances 0.000 description 36
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 25
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 235000011087 fumaric acid Nutrition 0.000 description 17
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 14
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 12
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 10
- 239000003570 air Substances 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 239000002585 base Substances 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 6
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 6
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 5
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 4
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 101100148606 Caenorhabditis elegans pst-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 239000003637 basic solution Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 3
- WERYXYBDKMZEQL-UHFFFAOYSA-N butane-1,4-diol Chemical compound OCCCCO WERYXYBDKMZEQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 3
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 3
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 101150052159 maeA gene Proteins 0.000 description 3
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 3
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YEJRWHAVMIAJKC-UHFFFAOYSA-N 4-Butyrolactone Chemical compound O=C1CCCO1 YEJRWHAVMIAJKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 2
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000002238 fumaric acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 2
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 2
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- QISOBCMNUJQOJU-UHFFFAOYSA-N 4-bromo-1h-pyrazole-5-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C=1NN=CC=1Br QISOBCMNUJQOJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026400 ADP/ATP translocase 4 Human genes 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 241000606125 Bacteroides Species 0.000 description 1
- MUCNWCFMOQRVMY-UHFFFAOYSA-N C(C)(C)C(S)C(O)CO Chemical compound C(C)(C)C(S)C(O)CO MUCNWCFMOQRVMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010061765 Chromosomal mutation Diseases 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 101100108280 Homo sapiens SLC25A31 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 101150058595 MDH gene Proteins 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000605860 Prevotella ruminicola Species 0.000 description 1
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 239000012080 ambient air Substances 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000009604 anaerobic growth Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 235000010338 boric acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 235000012489 doughnuts Nutrition 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012526 feed medium Substances 0.000 description 1
- 239000011554 ferrofluid Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000004868 gas analysis Methods 0.000 description 1
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 230000036244 malformation Effects 0.000 description 1
- -1 malic Chemical class 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 238000000424 optical density measurement Methods 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 210000000090 ruminant stomach Anatomy 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000003444 succinic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 238000013022 venting Methods 0.000 description 1
- 239000000052 vinegar Substances 0.000 description 1
- 235000021419 vinegar Nutrition 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/44—Polycarboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/44—Polycarboxylic acids
- C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/848—Escherichia
- Y10S435/849—Escherichia coli
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/853—Lactobacillus
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás dikarbonsavak előállítására, közelebbről egy fermentációs eljárás egy Escherichia coli törzs alkalmazásával, amely eljárás során nagy mennyiségben keletkeznek dikarbonsavak. mint almasav, fumársav és borosés származékaikat kiterjedten használják különösen mint olyan vegyszereket, amelyek a polimerek területén, az élelmiszer- és gyógyszeriparban és kozmetikumok előállítására alkalmazhatók. A borostyánkősav pl felhasználható olyan műanyag prekurzorok gyártására, amilyen az i ,4-bután-díoí /BDOZ, tetrahidrofurán és a gamma-butírolakton. A borostyánkösavból folyamatosan fejlesztenek ki űj termékeket, ideértve a poliészter kifejlesztését. A poliésztert a borostyánkősav és a BDO összekapcsolásával állítják elő. A borostyánkösav-észterek általában - új, „zöld” oldószerek lévén - képesek, arra, hogy felváltsák a károsabb oldószereket és prekurzofként szolgáljanak évente több millió kilogramm vegyszer előállításához, amelynek teljes piaci értéke több, mint 1 milliárd dollár.
Az említett karbonsavak, mint almasav, fumársav és borostyánkősav megújítható tápanyagokból (ebben az esetben fermentációs eljárásokkal) való előállítása alternatívát képvisel azokhoz az intenzívebb energia-felhasználást igénylő eljárásokhoz képest, amelyekkel nem reoíklizálható forrásokból termelnek Ilyen savakat.
A borostyánkósav-só köztítermékként képződik propionsav baktériumokkal végzett anaerób fermentációk esetében, de ezek az eljárások alacsony kitermeléseket és koncentrációkat eredményeznek.
Számos borostyánkősav-termelő organizmust különítettek el, igy a kérőzök gyomrából az anaerób Bacteroides ruminicola és Bacteroides amylophílus baktériumot. A kérőzök gyomrából származó organizmusok azonban a fermentációs eljárásokban általában nem stabilak. Egy borostyánkősavat termelő másik ismert organizmus az Anaeroblospinllum sucoiniproducens /A. suecmíproducens/, Több szabadalom született ezen organizmusnak borostyánkősav anaerob fermentációs eljárással valő előállítására történő felhasználása alapján. Az egyik ilyen szabadalmi leirés /US 5 143 834/ ezen organizmus fermentációs eljárásokban való alkalmazását tárgyalja borostyánkösav természetes úton, mérsékelt kitermelésekkel való előállítására, Az A, suceiniproóueens-t alkalmazó fermentációs eljárások azonban egy sor nehézséggel járnak. Az egyik probléma az, hegy az organizmus szigorúan anaorőb, tenyésztését oxigéntől teljesen mentes közegben kell végezni Ezen organizmus tenyésztése ipari méretű fermentációs özemben bonyolult és magas szakképzettségű munkaerőt Igényel. Az A. succlniproőucens még a laboratóriumi gyakorlatban is nehezen kezelhető és kedvezőtlen körtömények között degenerálódásra hajlamos, amely irreverzibilis. Az organizmust üzemi méretű fermentációs eljárásban még soha nem használták, Más szóval: ezzel a konkrét organizmussal kapcsolatban nem ismeretes üzemi léptékű fermentációs gyakorlat. Ezenkívül: magas bomstyánkösav kitermeléshez az organizmusnak külső széndioxid betáplálásra van szüksége: a fermentációs eljárás során tiszta széndioxid áramot kell, buborékolfatással, bevezetni a ferrnenflébe. Az A, sucoiniproducens bomstyánkösav és eeelsav elegyét termeli szukeínát/aoefát kb, 2 mól-arányban- Bcetsav magas koncentrációban való jelenléte a íermenflében növeli a borostyánkősav tisztítási költségeit. Az ecetét melléktermék termelése arra mutat, hogy a drága glukóz 1/3-a nem alakul át sxukcináftá. Az A, sucoiniproducens gazdatörzsről továbbá kimutatták, hogy nem nagyon ozmotoleráns, azaz nem visel el magas sókonoenfrációkaf és a termék még mérsékelt koncentrációban is gátolja a törzset. Az A, succiniprodueens alkalmazásának további hátránya hogy az inokulum táptalaj előkészítéséhez trlpfofán adagolásra van szükség és emellett 4 különböző oldatot kell összekeverni, amelyek közül az egyik a korrozív és toxikus R?S-t tartalmazza.
·»*>·>
¢. Φ φ > X φ φ X φ y X φ
ΦΦΦ X .*· y φφ φφ
Régóta Ismert, hogy az E. coli fermentációja során savkeverék képződik AJ.L, Stokes, X Bact. 57, p, 147-158, 1948/, Minden mól fermentált glukózból azonban csak 1,2 mól hangyasav, 0,.1-0,2 mól tejsav és 0,3-0,4 mól borostyánkősav keletkezik. A karbonsavak fermentáció útján való előállítására Irányuló kísértetek ezért arra az eredményre vezettek, hogy aránylag nagy mennyiségű tápanyag (pl. a glukóz) nem alakul át a keresett termékké,
Egy vizsgálat /3. Bact. 171, p. 342-348,1939/, amelyet a fermentativ NAO-hez kötött laktát-dehidrogenázra ,/ldh/ deficiens Izolált E, coli mutánsokkal végeztek, arra mutatott, hogy a növekedés anaerob körülmények között nem károsodik, ha nem áll fenn egyidejűleg píruvátdonníát-liáz /pfl/ deficiencia. Kettős - /pfl Idh/ - mutánsok nem képesek anaerob módon glukózon vagy más cukrokon növekedni még akkor sem, ha aoetátot adunk a táptalajhoz, míg a pfl mutánsok képesek orré. Az említett tanulmány nem tárgyalta vagy nem tette vizsgálat tárgyává a borostyánkősav vagy díkarhonsavak termelését.
Bár a szukcinát ion közös köztitermék több anaerób mikroorganizmus metabolizmusában, szükség van ezen a technikai területen egy olyan fermentációs eljárásra, amellyel gazdaságosan, nagy mennyiségben vagy magas kitermeléssel állítható elő a horostyánkősav, valamint más karbonsavak, pk az almasav és a fumársav. Az eljárás során célszerűen olcsó tápanyagokat és szubsztrátumokat kellene alkalmazni és a magas termelékenység érdekében a fermentáció sebességének és a forroentléhen a termék koncentrációjának magasnak kellene lennie,
Az előbbiekkel összhangban a találmány tárgya javított, praktikus és gazdaságos eljárás díkarhonsavak /borostyánkősav, almasav és fumársav/ magas kitermelésekkel való előállítására, amely mentes a technika állása szerinti hátrányoktól ás problémáktól.
V Φ*
A találmány szerint fermentációs eljárást hajtunk végre, két változatban, az említett E. coli mutáns alkalmazásával, az oxigén-bevitel, a glukóz-szintek, a pH és a tápanyag adagolási sebességek pontos meghatározása mellett.
A találmány egyik vonatkozása szerint az előbbi célokat egy olyan karbonsav előállítási módszerrel érjük el, amely a következő lépésekből áll;
i) egy szénforrást tartalmazó táptalajt beoltunk a biomasszával rendelkező, dikarbonsav-termelő organizmussal;
II) a dtkarhonsav-iermeiő organizmust stabil pH érték mellett aerob atmoszférában inkubáljuk az organizmus gyors növekedésének - ezzel a biomassza tömege növekedésének - elősegítésére;
III) az aerob atmoszféra fenntartására ellenőrzött módon oxigént vezetünk be;
iv) a megnővekedett biomasszával rendelkező organizmust tartalmazó farmentiébe ellenőrzött módon hozzáadjuk a szénforrást tartalmazó oldatot, mi mellett a szénforrás koncentrációját a kb, Q,5 g/l - kb. 1 g/t tartományban tartjuk:
v) az oxlgéntartaímü aerob atmoszférát megszüntetjük és anaerob atmoszférát alakítunk ki, ami az organizmus anaerob metahoh'zmusra való áttérését Idézi elő; és vi) a megnövekedett biomasszával rendelkező organizmust tartalmazó fermentléhez ellenőrzött módon a szénfonrást tartalmazó oldatot adunk, mi mellett a táptalajban a szénforrás koncentrációját a legalább 1 g/í értéken tartjuk.
Az organizmus anaerob mefabollzmusa segítségével a szónforrást ily módon dikarbonsavakká aiakitjuk át.
A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a karbonsav előállítási módszer a következő lépésekből áll:
I) egy szénforrást tartalmazó táptalajt beoltunk a dikarbonsav-termelő, biomasszával rendelkező organizmussal;
fr fr XX fr frfrfr fr frfrfrfr %· fr fr « fr fr fr frXfr fr frXfr X fr fr frfrfr frfr Xfr.fr Xfr.
il) az organizmust stabil pH értékű közegben aerob atmoszférában Inkubáljuk az organizmus gyors növekedésének - ezzel a biomassza tömege növekedésének elősegítésére;
isi) az aeréb atmoszféra fenntartására ellenőrzött módon oxigént vezetünk be;
iv) ellenőrzött módon beadagoljuk a szánforrást tartalmazó oldatot, ml mellett a táptalajban a szénfwás koncentrációját a kb, 0,5 g/l - kb. 1 g/l tartományban tartjuk;
v) a megnövekedőit biomasszával rendelkező organizmust áfuisszuk egy anaerob atmoszférája termelő fermentorba, ami az organizmus anaerob metabollzmusra való áttérését idézi elő; és vi) ellenőrzött módon szénforrást tartalmazó oldatot adagolunk, ml mellett a termelő fermentorban a szénforrás koncentrációját legalább 1 g/l értéken tartjuk.
Az organizmus anaerob rnetabollzmusa segítségével a szénforrást ily módon dikarbonsavakké alakítjuk át
A találmány jobb megértése érdekében a következő leírásra és igénypontokra hivatkozunk, amelyeket a rajzokkal együtt kell ágyelembe venni; ez utóbbiak közül az 1, ábra az 1. példában leírt kisédet eredményeit mutatja be;
a 2. ábra a 2, példában leírt kísérlet eredményeit mutatja be;
a 3, ábra a 3. példában leírt kísérlet eredményeit mutatja be;
a 4. ábra a 4, példában leírt kísérlet eredményeit mutatja be;
az. 5, ábra az 5. példában leírt kísérlet eredményeit mutatja be;
a 8. ábra a 6. példában leírt kísértet eredményeit mutatja be;
a 7. ábra a 7, példában leírt kísérlet eredményeit mutatja be..
A találmány tárgya tehát új, praktikus ás gazdaságos eljárás borostyánkösav, almasav és fumársav nagy mennyiségekben való előállítására, a technika állása szerinti problémák kiküszöbölésére, egy ellenőrzött fermentációs folyamatban. A találmány szerinti fermentációs eljárásban az előbbiek szerint egy E. coli törzset - AFP-111 ~ alkalφ φ Φ φ Α φ Φ χ χ. «Φ mázunk Az AFP-111 - egy ΝΖΝ-111 Ε, coli mutáns - fakultatív- aerób organizmus. Az
E. coli nagyon könnyen kezelhető; molekuláris biológiája és fiziológiája jórészt Ismert. Az. eljárás javítása ezért könnyen elérhető a molekuláris biológia, az eljárás paramétereinek módosítása vagy mindkét eszköz segítségével. Az E. colit: továbbá kiterjedten használják fermentációs eljárásokban gyógyszerek és vegyszerek előállítására. Ezzel az organizmussal kapcsolatban igen sok üzemi léptékű tapasztalat áll rendelkezésre.
Az E. coli tehát borostyánkősav és ecetsav keverékét termeli, a borostyánkősav/ecetsav mólarány azonban még nem optimalizált körülmények között is 3 vagy ennél nagyobb. Ez az arany lényegesen növelhető. A fermenflé alacsonyabb ecetsav-koncentrációja lényegesen csökkenti a borostyánkösav tisztítási költségeit. .Az E. eoii-nek ezenkívül nem feltétlenül van szüksége külső széndioxiddal való ellátásra ahhoz, hogy magas borostyánkösav kitermelést érjünk el. A borostyánkösav kitermelés - széndioxid átbuborékoitatás nélkül - a termelés csúcs-periódusában azzal hasonlítható össze, amelyet A. suocíníproducens-szel széndioxid bevezetés mellett érünk ei.
A vad E. coli típus anaerob körülmények kőzett rendszerint fermentációs termékek keverékét eredményezi, amelyek között a borostyánkösav viszonylag kisebb mennyiségű. Ha azonban az AFP-111-ei anaerób körülmények között tenyésztjük, a borostyánkösav a nagyobb mennyiségben termelt metabolit. Az.AFP-1 11-ben egyetlen helyen spontán kromoszóma mutáció következett be és ennek eredményeként a törzs borostyánkősav, ecetsav és etanol keverékét állítja elő, ahol a fő termék a borostyánkösav. Az AFP-111-gyel elérhető maximális kitermelés 99 tömeg% borostyánkősav/glukóz tömeg. Az AFP-111 alkalmazása jelentősen csökkenti a borostyánkösav fennentációs úton történő előállítása költségeit,
A fermentációs eljárás E. coli-vei .2 lépésből áll Az elsőben az AFP-111 törzset aeröb körülmények között tenyésztjük, alacsony glukóz tartalmú táptalajban annak érdekében, hogy a ferment.orban magas sejtsűruseget érjünk el A találmány szerint a glukózt széntörrásként alkalmazzuk mind az organizmus tömege növesztéséhez, mind a dikarbonsavak előállításához. A kívánt sejtsőröség elérése után a második lépésben a levegő-bevezetést megszüntetjük és igy kényszerítjük az organizmust az anaerőb metabolizmusra való áttérésre, ami dikarbonsavak termelését eredményezi, Ideértve az almasavat, fumársavat és borostyánkősavat mint végterméket. A találmány szerinti egyik megvalósítási mód esetében ezt a kétfázisú eljárást egyetlen készülékben hajtjuk végre, .Az. E> colí-val végzett borostyánkősav előállítás biokémiai útja egy ser konverziós lépést foglal magában, A píroszőíösav először oxáíecetsawá, ez almasavvá, ez fumársavvá alakul át és a végtennék a borostyénkősav, Ezen savak közül iparilag az almasav, a fumársav és a borostyánkősav fontos. Az AFP-111 végtermékként, borostyánkösavat halmoz fel a közegben. Ha a keresett termék a fumársav, ki kell küszöbölnünk azt a gént /deléció/, amely a fumársav borostyánkősavvá való konverziójáért felelős enzimet kódolja és a kapott organizmus fumársavat termel borostyánkősav helyett. Hasonlóképpen: ha a keresett termák az almasav, ki keli küszöbölnünk azt a gént /deléció/, amely az almasav fumársawé való konverziójáért felelős enzimet kódolja és így almasavat termelő organizmust állítunk elő, A molekuláris biológiai módszerekre vonatkozó jelenlegi technika állása és az. E. coli teljes géntérképe ismeretében agy konkrét gén delécíója egyszerit feladat, Egy borostyénkősav előállítására Irányuló fermentációs eljárás könnyen alkalmazható almasav ill, fumársav előállítására, ha az almasavat ili. fumársavat termelő organizmust alkalmazzuk,
A teljes eljárás szakaszos betápláláson alapul. Ezen eljárás szerint egy tömény glukóz oldatot - amely híg kukoricalekvárt (áztatóvlzef) Is tartalmaz szerves nitrogén és növekedési faktor forrásként és a szervetlen tápanyagokat betápláljuk a fermentorba kellő sebességgel ahhoz, hogy a maradék glukóz koncentrációt 1 g/l vagy ennél alacsonyabb értéken tartsuk. Alacsony glukóz koncentrációra azért van fr fr frfr « frfrfr fr-fr X « fr X fr «Xfr fr-fr szükség, hogy megelőzzük az eoeísav nagy mennyiségben való képződését. Az ecetsav négy mennyiségben való képződése ez anaerob növekedési fázisban végül leállítja az organizmus növekedését és nem tudunk elérni magas sejtsörűséget Az. anaerob termelési fázisban magas ecetsav koncentrációk csökkentik a borostyánkősav termelődés sebességét és végül teljesen le is állíthatják azt Az AFP-111 alkalmazása jelentősen csökkentheti a fermentációs úton történő borostyánkősav termelés költségét.
Az alacsony glukóz koncentráció fenntartása kereskedelmi fermentorokban könnyen elérhető a glukóz adagolási sebesség számítógépes ellenőrzése révén /a kimenő gáz elemzése vagy az on-ilne glukóz elemzés alapján/, Ez nagyon elterjedt gyakorlattá vélt az Iparban,
Az anaerob fermentáció a legősibb anyagcsere-öt energia nyerésére olyan kiindulási anyagokból,, amilyen a glukóz. Anaerob sejtekben ez az egyetlen energiatermelő eljárás. A legtöbb fakultatív sejtben ez a kötelező első lépés a glukózlebontásban, amelyet a fermentációs termékek aerob oxidációja követ a fríkarbonsavciklusban.
A legelterjedtebben alkalmazott fermentációs típus a glikoiizis, amelyben utolsó előtti termékként piroszőiösav képződik. A plruvát kiválasztás attól függ, hogy az organizmusban milyen gének vannak jelen, Lakiát-dehidrogenáz enzim /Idh/ jelenlétében a glikoiizis azzal feleződik be, hogy a plruvát NADH és H' hatására laktatta redukálódik, Piruvát-dekarboxiléz és aikohol-dehidrogenáz jelenlétében etanol képződik. Pirnvál-formiát-liáz Zpfl/ jelenlétében a fermentáció acetát, etanol és fenéiét vagy hidrogén és széndioxid képződésével fejeződik be.
Ha a bakteriális genomban egy vagy több mutáció révén kiiktatódnak az organizmusnak a piruvát-lehonlásért felelős génjei, a plruvát felhalmozódik. Az anaerób módon tenyésztett E, coléban ezek a gének a pfl és a Idh, Az E, coll NZN-111 mindkét génben mutációt hordoz, amennyiben az E. coll kromoszóma DNS szekvenciában <«· φφ Φ
Λ «· * végbement változások hatására mind a ptl mind az Idh inaktlválódoti Így az NZN-111 fermentációs úton nem tenyészthető. Az AFP-111, amelyet további genetikai változtatások: segítségével az NZN-W-hö! éllitnltonk elő# anaerob körülmények között borostyánkösav, ecetsav és etanol keverékét termeli, amelyek közül a borosiyánkősav a több termék.
Azt találtok, hogy az NZN-111-ben történő további változások - amelyek spontán módon következnek be, vagy szelektív tenyésztés vagy plazmid transzformáció révén - eredményezik végső soron az AFP 111 megjelenését, amely fö termékként borostyánkősavat állít elő.
Spontán kromoszóma mutációk, amelyek az AFP-111 típusú jellemzőkhöz vezetnek, akkor fordulnak elő az NZN-111-ben, amikor sorozattenyésztési technikák során szelektív környezeti feltételeket alkalmazunk, Az első lépésben az NZN-111 biomasszát növeljük aerob körülmények közöli tápanyagokban gazdag táptalajon, amilyen a Luria Bertáin! /LB/ húsleves ; 0,5% élesztőkívonat, 1% Inpton, 1% NaCI, pH
7,5, Az elérni kívánt kitermelés kb. 10&~10u' seji/mt, Az inkubáíési periódus változhat ugyan, az 5-7 őrás időtartamú növekedési fázis 3?°C~on és standard nyomáson azonban biztosítja az előbbi koncentrációkat
Második lépésben a felhalmozódott biomasszát anaerób körülmények közé visszük át, glukózban gazdag táptalajban, csupán azon sejtek /mutánsok/ növekedésének megkönnyítésére, amelyek képesek pimvátot metabolizálni. Ügy járunk el pl,, hogy a sejteket 1,5%-os agar lemezeken szélesztjük, amelyek kb. 1-30 g/l - előnyösen 10 g/l - glukózt és 30 pg/ml kanamicint tartalmaznak. A kanamicin rezisztencia gént az NZN-111 laktát-dehidrogenáz génjébe visszük be. A tenyészeteket 24 órán át 37’C-on tenyésztjük ellenőrzött anaerób atmoszférában. Az egyik, jó eredményeket szolgáltató anaerób atmoszféra egy széndioxid/Wdrogén elegy, amelyet egy atmoszféra-ellenőrző berendezés alkalmazásával állítottunk elő /Becton-Dickrnson, oekeysviile, Maryland, GASPÁK*/..
* X ί
φ * ••φ ίο
Az inkubálási periódus során számos AFP-111 (kb, 2/W sejt) telep képződött és ezeknek kb. fele képes volt arra, hogy folyékony táptalajban növesztve a termékek keresett keverékét termelje,
Plazmiddal végzett transzformáció esetében, amikor az ΝΖΝ-111-et a pMDH13 plazmiddal transzformáljuk - ez tartalmazza a mdh gént a mutáns malátdehldrogenáz enzimhez - újra Indul a plruvát lebontás laktál termelése .közben. Ennek a transz-formánsnak <NZN-111{pMDH13)) a sorozattenyésztése a spontán kromoszóma-mutációt hordozó AFP-111-hez vezet. Az AFP-111 borostyánkősav, ecetsav és etanol mint fermentációs termékek keverékét termeli; ezek közöl a borostyánkősav a táptalajba bevitt glukóz tömegére vonatkoztatva max. 99 f% mennyiségben képződik. A pMDH13 kifejlesztése és a transzformációs eljárás hasonló ahhoz, amelyet W,E, Boernke et al, ír le /Archives of Biochemlstry and Blophysics 322, No. 1, p. 4352,1995/, amelyet e hivatkozás révén a leírás részévé teszünk.
Az itt leírt törzsek kísérleti értékelésére a sejteket aerób módon tenyésztettük glukóz mentes táptalajban /túrta Broth/, amíg 0,5-10 ODmo értéket nem értőnk el
Miután az AFP-111-gyel elértük ezt a megfelelő biomassza tömeget, a sejtekét lezárt fermentációs reaktorkamrába injektáltuk vagy más módon ebbe vittük, át és ebben tartottuk, A húslevest glukózzal vagy más megfelelő szénhidráttal - amilyen a xilóz, galaktőz vagy arabinóz - kevertük össze kh. 10-30 g/l között változó koncentrációban, A kapott keveréket atmoszféra-váltásnak vetettük alá, amelynek során anaerob körülményeket teremtettünk. Az atmoszféra-váltás végrehajtásának egyik eszköze egy olyan szellőztető berendezés, amelynek segítségével a széndioxidot környezeti levegőre cseréljük ki,
Mielőtt a keveréket bevezetnénk a fermentációs reaktorkamrába, a kamrába megfelelő mennyiségű puffer-kőzeget töltünk /MgCOs, CaCO3 vagy CaMg/CtW közel semleges pH fenntartására. Általában kh. 4-8 tömeg% megfelelő pufferkapaciiásü puffer-kőzeget alkalmazunk. Különösen jő eredményeket érünk el, ha a
Φ ψΜφ **·>*
X Φ Φ'*)Φ Φ ? φ φ φφφ * · * ' ** Μ putter-közeg szilárd alakban van jelen, így időben elnyújtott puffer-kapacítást biztosít a fermentációs közegnek.
Az előbbi eljárás magas böFostyánkősav-kítermeléseket eredményez. így pl 6:1 tömegaránya borostyánkősav/ecetsav termelés érhető el, 99%~os kitermeléssel. A borostyánkősav/ecetsav arány még tovább növelhető, ha a fermentációt hidrogéngáz jelenlétében végezzük, kb, 26-100% közötti Hs koncentrációk mellett. Ezek az eredmények ama mutatnak, hogy a technika állása szerinti organizmusoktól eltérően a mutáns AFP-111 redukáló-szerként exogén hidrogént használ fel. Ha pl. túrta húsleves, glukóz, puffer és hídrogén/széndioxid gázkeverék van jelen /a CO2 a pufféiból szabadul fel/: 9:1 körüli borostyánkősav/ecetsav arányok érhetők el. Ez az eredmény a glukóz keresett termékekké - nem kívánt, aeetát-termelő mellékreakciök nélkül - való lebontása kiválasztásának egy további előnyére mutat rá.
Az 1. táblázat a dikarbonsav-termékek eloszlását mutatja be a kiindulási W148S törzs /amely a Southern Illinois Uníversiiy-től is beszerezhető/, az NZ.N-111 és az AFP-111 esetében..
1, Táblázat
A kiindulási glukózra vonatkoztatott termék-kitermelés /mól6/»/
| Termék | Eredeti szülő WUSS | Közvetlen szülő NZH411 | ktutáns AFP-111 |
| borostyánkősav | 17 | 2 | 109 |
| tejsav | 24 | 0 | 0 |
| piroszülösav | 1 | 17 | 0 |
| hangyasav | 26 | 0 | 0 |
| ecetsav | 51 | 6 | 49 |
| etanol | _80 | 47_ | |
| ossz-kitermelés | 193% | 41 % | 296 %* |
* A moláris kitermelési értékek elméletben 200%-osak lehetnek, mivel 1 molekula glukóz valamennyi termékből 2 moh szolgáltat.
Ha 1 öö%-os széndioxid atmoszférát alkalmazunk, a borostyánkösav-tenmelés fokozódik: a borostyánkósav-konmnbádó megközelítheti a kb, 45 g/i értéket, a termelékenység kb, 1,6 g/l/őra értéket érhet el, a gramm borostyánkősav/gramm glukóz %-os kitermelés 99%-ot ér et a borostyánkősav/eeetsav tömeg arány pedig kb, 6,
Borostyánkősav akkor is termelődik, ha az IMZN-111-ben E, coli NAD-függő aímasav enzim van jelen /a maeA gén bevitele és indukciója hatására/. Ebben az esetben a pMEE2-1 indukálható plazmidot alkalmazzuk az almasav enzim génnek a transzformans NZN-111 (pMEE2-1)-ben való kifejeződése tehetővé tételére.
Az E. coli MCI 061-bői izolált genom DNS-t használtuk templátként az almasav enzim PCR-rel való klónozásához. Az E, coli MC1ö6t-et Hind III és Pst I restrikciós endonukleázzal emésztettük, és a kapott emésztett anyag méretet 1%-os TAE agaróz gélen határoztuk meg. Az almasav enzim gént. tartalmazó genom DNS méretét Southern Biot elemzés segítségével határoztuk meg a PbotoGene Nucteíc Acid Detection System-mel /Kát, 8192SAZ az előbbiekben leírtak szerint,
A primerek a gén ismert részleges DNS szekvenciáján alapultak: szenz:CGAAGAACAAGCGGAACGAGCAT; entiszenz; GGCAGCAGGTTCGGCATCTTGTC,
Ezeket a primereket 1 mtkmliterben /μ.Μ/ kb, 20 nanogramm /ng/ genom ONSsel keverjük össze standard 100 mikroílteres PCR reakcióban, amellyel az almasav gén várt 0,8 kilobázis nagyságú fragmentumát állítottuk elő. A PCR terméket Üiaex Gél Extrae-tion Kit /Qiagen, Inc., Chatswerth, CA/ alkalmazásával tisztítottuk és BioNick Labeiling System /GibcoBRL, Gaithersburg, Marytand/ alkalmazásával hiötiniieztük, A blotinilezett PCR terméket használtuk mintaként az E. coli DNS Southern Biot elemzésében, amelyet Hind lll-mnt és még egy másik endonukleázzal t φφ V Φφ *>
* Φ. X φ Φ hasítottunk, A maghatározás szerint az almasav enzim gén a 2,0-2,6. kb /Hind lil-mal és Pst i-gyel emésztett/ DNS fragmentumot tartalmazó régióban helyezkedik el, mikrogramm E, coll DNS-t Hind llbmal és Psi 1-gyel emésztünk és 1%-os preparativ TAE agaróz gélen szélesztünk. A 2,0-2,5 kb tartományba tartozó DNS fragmentumokat elkülönítjük és a öiaex Gél Extrec-tion Kit alkalmazásával tisztítjuk. A tisztított DNS fragmentumokat a pUG19 polilinker régiójába itgáljnk, amelyet Hind ill-maí és Pst í-gyei emésztettünk és garnélarák lúgos foszfafázzal hasítottunk. A ligáit anyagot használtuk tamplátként a teljes almasav enzim gén PCR reakcióban való amplifikálásához. Egy mikrollter ligációs keveréket használtunk tempiátként 1 μΜ GATGCCCCATGGATATTCAAAAAAGAGTGAGT szenz primőrrel, amely ez almasav enzim gént célozta meg és 0,25 μΜ
TTTTCCGAGTCACGACGTTG antíszenz primamal, amely a ligáit pUGIS DNS-t célozta meg. Az amplífikálásl paraméterek; denalurálás 94*C~on, hlhhélzáiés 55»C-on 1 percen át és extenzié ?2*C-on 3 percen át összesen 36 ciklusban. A PCR terméket 1%-os TAE agaróz gélen elemeztük és elkülönítettük az 1,8 kh fragmentumot, amelyet Qiaex Gél Exfracfion Kit alkalmazásával tisztítottunk. A PCR termék egy részét Bci-lel és Bgi-lel emésztettük annak kimutatására, hogy a tennék nem tartalmazza az almasav enzim gént. A PCR termék fennmaradó részét Pst 1-gyel és Neo Τ-gyei elbontottuk, gélből elkülönítettük, ismét tisztítottuk, majd ligáink a pTRGÜOa/ Pharmacia, Piscataway, New Jersey/ expressziós vektor polilinker régiójába, amelyet Neo 1-gyel és Pst 1-gyel hasítottunk. Az E. coll NZN 111 törzset a ligációs keverékkel standard módszerekkel transzformáltuk és a kapott telepeket /4 telep a kísérletből és 2 telep a kontroliból/ restrikciós fragmentum elemzéssel Xmn alkalmazásával screeneltük az almasav enzim gén jelenlétére /0,7 kb, 1,4 kb és 3,9 kb nagyságú fragmentumokra számítottunk/, A klónozott almasav enzim gént tartalmazó plazmidot pMEE3-nak neveztük el.
$ φ X φ * * φ *· X ** *** Α<“
ΝΖΝ{ρΜΕΕ3)4 100 mi-es tenyészkőzeghen 1 éjszakán át tenyésztettünk és a plazmidot Qíagen Plasmid' Kit alkalmazásával izoláltuk. Az elkülönített plazmidot templátként használtak a PCR reakcióhoz, Egy éj prímért terveztünk egy alternatív Mterminálissal, amely 81 bázispárral lejjebb helyezkedett ei az. almasav enzim első klónozásakor alkalmazott phmerhez képest. Templátként 20 nanogramm plazmidot használtunk 1 μΜ
AGGATCCATGGAACCAAAACAAAAAC szenz primőrrel és
CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC antíszenz primerrel Az amplifikációs paraméterek a fent megadottakhoz hasonlók voltak, A PCR termák egy hányadát Ismét azonosítottuk restrikciós feltérképezéssel, Bd I ás Bd II alkalmazásával, és azt az eredményt kaptuk, hogy a termék tartalmazza az almasav enzim gént A PCR termék fennmaradó részét Pst 1-gyel és Nco 1-gyel elbontottuk, gélből elkülönítettük. Ismét tisztítottuk, majd ligáitok a pTRC99a/ Pharmacia, Píscataway, New Jersey/ expressziós vektor elkülönítettük, ismét tisztítottuk, majd ligáitok a pTRCOÜa/ Pharmacia, Plscatawey, New Jersey/' expressziós vektor poiiiinker régiójába, amelyet Nco 1-gyel és Pst 1-gyel hasítottunk. Az E. coli JM 109 törzset a ligáoíés keverékkel standard módszerekkel transzformáltuk és a kapott telepeket /3 kísérleti klón és 1 kontroll klón / restrikciós fragmentum elemzéssel screeneitük a keresett ínszert jelenlétére. Az almasav enzim gén ezen változatát tartalmazó plazmidot pMEE2-nak neveztük el ml - 1ÖÖ pg/rnl ampiciiíinl tartalmazó - L.B húslevest beoltunk 1,8 ml egy éjszakán át tenyésztett pMEE2 kultúrával. 2 órai növesztés után a 30 ml-nyi tenyészetet szétosztottuk három, 10-10 mi-es alkvotra. 0, 100 uM és 10 μΜ ízopropil-tíogalak-tozlddal ZIPTG/ Indukáltuk az enzlmakfivitásl Ö, 1, 2, 3 és 4 óra időpontban 2 mi-es mintát veszünk mindegyik tenyészetből. A fehérjét standard módszerek szerint különítjük el és az aktivitást a fent leírtak szerint határozzuk meg.
Az enzimtermelést az idő függvényében a 2, táblázatban muta fr φ >· φ φ χ Φ * φ >
2, Táblázat
PTG-vat LB húslevessel Indukált almasav enzim termelés
| Idő (óra) | l IPTG nélkül | | 100 μΜ IPTG í ug/perc/mg fehérje | 10 μΜ 1RTG pg/perc/mg fehérje |
| 0 1 | 3,09 | 4,83 | | 28,6 | 5,84 |
| *3 ií. | | 4,26 | | 38,2 | 10,06 |
| 3 | | 8,46 | | 75.3 | 32,7 |
| 4 | l 0,92 | | 88,2 | 38,95 |
Két-két aerób tenyésztést végeztünk az N2 111{pMEE2)--vei és kontrollként N2M 111 (pTRC99a)-val 2 ml, amplcillint tartalmazó 18 táptalajban. A két tenyészet kézül ez egyiket 10 μΜ IFTG-vel indukáltuk. 3 éra múlva az ÖDseo 0,6-ről 4,8-re nőtt, A tenyészetek 1 ml-éval lezárt 58 ml-es fiolákat oltottunk be, amelyek 10 ml 18 táptalajt /összetétel: 20 g/l glukóz, 1 g/l acetát és 0,5 g szilárd MgCCV tartalmaznak. Az atmoszféra levegő:bídrogén:széndiox!d ™ 1:1:2, a nyomás a normát /atmoszfénkus/ nyomás kétszerese, A tenyészetből mintát vettünk azonnal, majd az Inkubálás során időközönként, 3?*Oon 100 forrt,/perc sebességgel végzek rézatés mellett. A 3. Táblázat a termék-kitermelés összehasonlítását szemlélteti nyers (pTRCOOa) vektorral ill, oMEE2-vel transzformáit NZN 111 esetében.
χ. ΦΦΦΧ ΦΧΦΦ
almasav enztm expreesziojara
| Termék 1 | Vektor g/I | i maeA g/ |
| borostyánkősav j | 0,3 | I 6,5 |
| tejsav i | 0,4 | ! 0,4 |
| eoetsav j | 0 | 0 |
| etanol Ϊ | 0 | ΐ Λ |
A 3. táblázatban bemutatott adatok kb. 19-42 órás inkubálás! periódus eredményei.
Az almasav; a borostyánkősav prekorzora elvben előnyösebb végtermék, mint a borostyánkősav, mivel termelése eggyel kevesebb reduktív lépést Igényét Az almasav termelés elméleti sztöchiometdája: 1 mól glukóz és 2 mél CO2 alakul át 2 mél almasavvá. Ily mérten az almasav termelésé glukóz-veszteség nélkül mehet végbe. Fumársav, amely az almasav debldratációs terméke és a borostyánkősav prekurzora a redukciós sorban, ugyancsak keletkezhet Mind az almasav, minő a fumársav tehát melléktermék nélkül képződhet, de a nagyüzemi termelési folyamatokhoz a magasabb oldhatóság miatt az almasavat részesítjük előnyben.
Megfelelő baktériumoknak az almasav enzim termelődéséért felelés génnel /amilyen a maeA/ való transzformációja malát felesleghez vezethet.
A következő, a karbonsavak előállítására vonatkozó példákban alkalmazott vegyszerek;
w élesztőkivonat és Inpton /Difco/, • glukóz /A..E, Staley kukorioacfaldolgozé özem, London, Tn/( * híg kukoncslekvér /Α.Ε» Staley kukohcafelrtolgozé özem, London, Tn/,
ΦΦ X Φ XX ΦX * szervetlen vegyszerek /£.. Merck Science vagy d.T, Baker, reagens minőség/. Az alkalmazott berendezések:
L fermentor A/irtis/,
L fermentor /New Bronswok, Blottow 3000/, szivattyúk /Cole-Parmen Mester Ftexó pH mintavevők /Cole-Rarmer/, pH ellenőrzők /Cole-Farmer, Chem, Cadet/, oldott oxigén mérek /Cole-Parmer 01971-00/, oldott oxigén mintavevők /Ingeid/', autoklávok /Amsco, Eagle 3000/, rézéherendezések /New Brunswick/, kriogén fiolák /Colé Farmer/,
A glukóz-elemző a Yellow Springs Instrument Company terméke ZYS1 2700 Select/. Az OD mérésekhez használt spektrofotométer a Milton Roy /SFEC 21D/ gyártmánya.
Az AFP-111 E. coli törzset az Argonná National Laboratory-töl szereztük he. Ez a törzs az N2N-111 származéka. A törzstenyészet előállítására 1 g magnéziumkarbonátot AMgCO-y' bemérünk egy 250 ml-s lombikba, ezt lezárjuk egy hab-dugóval és 20 percen át 121*C~on aaloklávozzuk. Ezután előállítunk 500 ml, következő öszszetéteiü táptalajt:
Inpton 10 g/l, élesztőkivonat 5 g/l, glukóz 5 g/l, nátrium-klorid /NaCI/10 g/l, dikálíum-foszfát /KJ-IPOd 7 g/1, kálium-foszfát /ΚΗ ^ΡΟ,ν 3 g/l .
<· ν »
IS
A táptalajt 121*C-on 20 percen át auiöklávozzuk és hagyjuk lehűlni szoba mérsékletre. 50 ml táptalajt sterilen áfviszünk az első, a magnézium-karbonátot tartalmazó lombikba, A lombikot ezután beoltjuk egy teljes oltökacsnyl AEP-W-gyel egy, az. Argonná National Laboratory-ból származó ferdeagsrró!, A beoltott lombikot 25ö férd, /perc sebességgel 37°C-on főzőgépen Inkubáljuk.
Ezután 1 liter táptalajt állítunk elő, amelynek összetétele a következe: inpton 10 g/l, élesztökivcnat 5 g/l, glukóz 5 g/l,
HaCI 10 g/l,
O1PÖ4 7 g/l,
KH2PÖ4 3 g/l és magnézium-szulfát /MgSCW 0,2 g/l
A táptalajt 12PC-on 20 percen át eutoklávozzuk és hagyjuk lehűlni 350 ml táptalajt sterilen átviszünk egy 1 literes fennentorba.
A 250 ml-es lombik 16 órás inkubálása után a lombik teljes tartalmát sterilen átvisszük az 1 literes fermentorba. A fermentorf 37°C~on és pH 7,0-n működtetjük, A fermentor aljába levegőt buborékoltatunk és a keverő sebességét 500 íorrt,/pero vagy ennél magasabb értékre állítjuk be annak érdekében, hogy biztosítsuk az oxigén megfelelő átvitelét a ferrnenflébe és elkerüljük az oxigénhiányos állapotot. A pH értékét 7-en tartjuk egy pH-beállítö segítségével, amely szükség esetén egy szivattyút hoz működésbe és ez bázisos oldatot adagol a fermentorba,
A bázisos oldatot úgy sülijük elő, hogy 250 ml ionmentesített vizet bemérünk egy keverőrudat tartalmazó 500 ml-es kalibrált hengerbe, A kalibrált hengert befedjük rélegnyí autoklávezott papír fedővel és 12ΓΟ-οη 20 percen át eutoklávozzuk, majd hagyjuk lehűlni szobahőmérsékletre. Ezután 250 ml 30%-os ammőnlum-hidroxidot /NH^ÖH/ adagolunk. Az ammónia eltávozásának megelőzésére egy felső olajréteget alakítunk ki. Az olajat a hengerbe való bevitel előtt 12ΓΟ-οη 20 percen át autoklávozzuk. Az. oldatot mágneslapon keverjük. A kapott bázisos oldat 15%-os NH4OH oldat
Glicerin oldat előállítására 15 g glicerint bemérünk egy kis lombikba, amely 15 ml ionmentesített vizet tartalmaz. Egy kisméretű keverőrúdat viszünk be a lombikba, majd befedjük habdugóval és mágneses lapon keverjük 50%-os glicerin oldat előállítására. A glicerin oldatot 121’C-on 20 percen át autoklávozzuk, majd hagyjuk lehűlni szobahőmérsékletre.
Amikor a fermenforban a glukóz koncentráció kb, 1 g/1 értéket ér el, a fermeníor tartalmából 30 rnl-t sterilen kiveszünk és beadagolunk az 50%-os glicerint tartalmazó lombikba. Ezután az elegyet mágneses lapon keverjük. A keveréket ezután sterilen bemérjük kriogén fiolákba Ab, 1,2 ml/üola/, amelyeket csomagolás előtt a gyártó sterilezőit A fiolákat lezárjuk és -?CEC-ös hűtőben tároljuk. Ezek a fiolák szolgáltak ΑΕΡΙ 11 törzsíenyészeíként a kővetkező példákhoz.
Az inokulumot rázólombikban készítettük elő, A táptalaj összetétele a következő:
Inpton 10 g/l, élesztőkivonat 5 g/1, glukóz 5 g/l,
NaC110 g/l,
K.HPÖ4 14 g/l,
KH2PÖ4 5 g/I, /NH4/5SO4 2 g/l és
MgSG4 0,2 g/l.
ml táptalajt bemérünk egy 250 ml-es lombikba, A lomblkot lezárjuk, 12VC~on 20 percen át autoklávozzuk, szobahőmérsékletre hagyjuk lehűlni és beoltjuk 1 ml200 χχ-Φ φ φφφ
ΧΦΦ φφ X X X φ
X Φ ΐ.φ rci egy, a törzstenyészetet tartalmazó ampullából A tenyésztést 37:>C~on forck/pere mellett 16 erén át folytatjuk, A fermentációs táptalaj összetétele:
Inpton 10 g/l, élesztőklvonat S g/l. glukóz 5 g/l
NaC110 g/l, K2HPÖ41,4 g/1, KH2PÖ4 0,5 g/1, /NbUCSCC 2 g/1 és MgSÜU 0/2 g/l.
liter táptalajt állítunk elé, ezt 121X»on 20 percen át aufoklávozzuk és hagyjuk lehűlni szobahőmérsékletre, majd 860 ml-t átviszünk agy 1 literes fermentorba. A fermenforf a lombik teljes tártaiméval inokuíáljuk. /A fermentációs táptalaj alacsony, 10 g/1 alatti koncentrációban tartalmaz glukózt/. A fermentációt 37cC-on végezzük pH 7,0 értéken levegőztetés mellett.. A pH-t 15%-os NH4OH oldat szükség szehnti adagolásával a pH beállító segítségével levegőztetés közben 7,0 értéken tartjuk.. Ha a fermentlé kiindulási glukóz-tartalma kimerül, bekapcsolunk egy fápszlvaityüt tápoídatnak a fermentorba való adagolásához.
A tápoídat /1. oldat/ összetétele:. 250 g glukóz ós 50 g híg kukorlcalekvar 400 ml ionmentesitett vízben. Ezt az 1. oldatot 12VC-00 20 percen át autokíavozzuk és szobahőmérsékletre bűfjük, A 2, oldat előállításához a következőket:.
NaCI 0 g/n K.HFCu 7 g.'l KH2PO4 3 g/í< /NH4ÁSÖ4 22,5 g/l és MgSO.41 g/l
Φ X frfrfr frfrfrfr frfr * x frfrfr fr
Ϊ fr fr fr fr *
5« ** χ frfr ** frfr χχ·
108 ml ionmentesltett vízben oldjuk. Ezt az oldatot 121°C-on 20 percen át auloktávozzuk, szobahőmérsékletre hűljük és hozzáadjuk az 1. oldathoz. A kapott oldatot használjuk fel a fermentor táplálására.
A tápszívattyű sebességét kézi úton ellenőriztük annak érdekében, hogy a fermentorban a maradék glukóz koncentrációt 1 g/l vagy ennél alacs< tartsuk. Ha a glukóz koncentrációja 1 .g/l fölé emelkedett, a szivattyú sebességét csökkentettük. Ha a glukóz koncentrációja fúl magas, kb. 5 g/l vagy ennél magasabb, a szivattyút leállítottuk, amíg a glukóz koncentráció 1 g/l alá csökken. Az első 24 órában a fermentöít levegőztetjük aeréb viszonyok megteremtése érdekében, amely lehetővé tette a magas sejtsürüség eléréséig való növekedést. A 24, órában a 800 nm-en mért optikai sűrűség /O(W 24, Ekkor leállítjuk a levegő bevezetést, anaerob környezet megteremtése érdekében, hegy kényszentsük az organizmust a borostyánkősav termeléshez szükséges anaerob metabolizniusra. .Az eneeröb viszonyokat a kísérlet végéig fenntartottuk. Az anaerob fázisban a glukóz koncentrációt 1 g/l vagy ennél magasabb értéken tartottuk.
Az 1. példa eredményeit az 1, ábrán mutatjuk be és a 4. Táblázatban összegezzük.
Végső borostyánkösav koncentráció fg/ij összkitermelés (g hörosfyánkősav/g glukóz)
Kitermelés a termelő fázisban (g borostyánkősav/g glukóz)
Ossz-fermelékenység (g/iiter, óra)
Tennelékenység a termelő fázisban (g/titer, óra) Borostyánkösav koncentráció a 47, órában (g/liter) Kitermelés a 47. órában (g/líter; éra)
Végső borostyánkősav/acetát móiarány
40,5
0,54
0,95
0,21
0,24
17,9
0,38
1,36 •'ϊ ·>
*φ φ φ * * * -φ φ * φ φ φ X * φφφ X φ φ: Φ
Φ ΧΦ ¥Φ ,χ
A kísérletet pontosan ugyanúgy végeztük, mint az 1,. példában, azzal a különbséggel, hogy a levegőt 24 óra helyett 6 óra után kapcsoltuk ki. A levegő bevezetés leállítása időpontjában az optikai sűrűség /00W 6.
Az eredményeket a 2. ábrán mutatjuk be és az 5, tábk
| Fermentációs idő (őre) | i 24 | 47 | |
| Borostyánkősav koncentráció (g/l) | | 16,0 | 29,20 |
| Kitermelés (g/liter, ere) | 1 0,67 | 0,02 |
ények arra mutatnak, hogy jelentős javulás következik be, ha korábban térünk át az aerob viszonyokról az anaerob viszonyokra a fermentorban.
Az ebben a példában alkalmazott fermentációs táptalaj összetétele.'
NaCI 2 g/l <
KHsRÜ4 1,3 g/l /NH4/2SO4 2 g/l
MgSÖ4 0,5 g/l,
CaCix ö,u g/l és
MnCI2 0,01 g/l.
Az 5 literes fermentorban 4 fermentációt végeztünk. Ezekben a kísérletekben a pH-t 0,2; 6,6; 7,0 és 7,4 értékre állítottuk be szükség esetén 5N NaOH adagolásával.
Az inokulumot rázőlombikban állítottuk elő ugyanilyen, pH 7,0 táptalajjal, A fennen··$
Φ
Χφ '*
I , , φφ * φ* φ* ί ♦ φ φφφ φΧ*Φ *
* * *·* torokban a sejteket aerób módon tenyésztettük levegő bevezetésével és 500 íonl/perc keverö-sebesség mellett, amíg az OD® 6 értéket ér el /kb. 5-6 óra/. A keverést ezután 250 lord./perc értékre csökkentjük és az öl váltjuk fel
A 3. példa eredményeit a 3, ébrén mutatjuk be és a 6. tébláz«ru«i zük. A 6, Táblázatban a különböző pH értékek mellett a 1ÖÖ. órára elért fermentációs eredményeket hasonlítjuk össze.
| pH i Bomsiyankősav kaicenkádó (g/l) í Ecetsav koncentráció (g/l)
I Felhasznált g glukóz i Á fenrsentlé térfogata /liter/ i Kitermelés (g borosiyánkősav/g glukóz) | Bomstyánkösav/acetát mólarány
| 6,2 | 6,0 | 7,0 | 7,4 |
| ‘7<3 O | 35,7 | 30,1 | 27,5 |
| 3,3 | 6,3 | 6,3 | 6,0 |
| 123 | 224 | 133 | 164 |
| 4,3 | 4,4 | 4,5 | |
| 0,67 | 0,66 | 0,60 | 0,67 |
| 3,0 | 3,4 | 2,4 | 2,3 |
Az eredmények arra mutatnak, hogy a borostyánkösav tág pH-tartományban, előnyösen kb. pH 6,6-7,0 értéken előállítható.
Ebben a példában az élesztőkivonatot és a triptont híg kukoricalekvárral helyettesítjük, amely a kukorica feldolgozó iparban nagyon olcsó melléktermék. A híg áztató levet úgy készítjük el, hogy az áztató víz pH-ját 50%-os HaOH-öal 7,0-ra állítjuk be. A * ¥ fr* © ifrfr fr-fr frfrfr x frfr*fr frfr fr * *.*'* -κ * V * * * Λ .Λ frfr « 99 szuszpendált szilárd anyagokat Whatman Nö.2 szűrőpapíron való szűréssel távolitjuk et A fermentációs kísérletekben a tiszta szürletet használjuk fel
Az Inokuiumot rázéiombikhan készítjük el. A táptalaj összetétele a következő; NaCI 20 g/l, &2HPÖ4 20 g/l,
KH2PÖ412 g/l, /NH4ASO4 4 g/l és MgSÖ4 0,4 g/f.
Az oldatot 1.2VC~on 20 percen át autokiávozzuk, Ezután egy 250 ml-es lombikba 30 ml big áztatőlé szürletet adagolunk, A lombikot lezárjuk. 121öC-on 20 percen át autokiávozzuk, majd hagyjuk szobahőmérsékletre hűlni. Ezután a lombikba 30 ml
1. oldatot /I. az 1, példát/ adagolunk. Ez a közeg tehát 50% híg áztató viz szürletet tartalmaz. A lombikot beoltjuk a glicerines törzstenyészetet tartalmazó ampullából 0,1 mi-rei /1 példa/ és 10 órán át 35aC»on 200 forct/perc mellett tenyésztjük.
Előállítunk egy 2. oldatot, amelynek összetétele a következő;
NaCI 20 g/l,
K2HPO4 2,8 g/l,
KW2PÖ4 1,2 g/l, /NH4/SSO4 4 g/l és MgSCU 0,4 g/1
Ezt az oldatot 121aC-cn 20 percen át autokiávozzuk és hagyjuk szobahőmérsékletre hűlni. Az 1 literes fermentorba beadagolunk 425 ml híg áztatőlé szűrletet, A fermentort 121°C~on 20 percen át autokiávozzuk és hagyjuk szobahőmérsékletre hűlni. Ezután az. 1 literes fermentorba beadagolunk 425 ml 2, oldatot, igy a fermentációs közeg 50% hig áztatőlé szürletet tartalmaz. A fermentort beoltjuk a rázólomhik teljes tartalmával. A fermentációt 37°C~on pH 7,0-n végezzük. A pH-t szükség esetén 1 <5 M nátrium-karbonát oldat adagolásával 7,0 érléken tadjuk. Ezt az oldatot előzőleg
ΧνΦ * «β X* Χ»φ*
ΦΦ Φ«Φ **
121*C~on végzett autöklávozással sterilizáltuk, A sejteket kezdetben aerób úton tenyésztjük oly módon, hogy 6 órán át levegőt vezetünk he a fermentorha. Ezen idő alatt mérjük az oldott oxigént. Az oldott oxigén színt esetenként a telítési érték 6%-a alá csökkent, de a levegő folyamatos bevezetése hatására a fermentorban még aerób viszonyok álltak fenn. Ezen időszak végén a levegő bevezetését leállítottuk annak érdekében, hogy az organizmus anaerób metabolizmusa segítségével meginduljon a borostyánkősav termelés. Ugyanekkor beindítottuk a szivattyút, amely kb. 590 g/l glukózt tartalmazó oldatot táplál a fermentorhe, A tápszivattyú sebességét kézi úton állítottuk be acélból, hogy a fermentlében a glukóz-koncentrációt 1 g/l vagy ennél nagyobb értéken tartsuk,
A 4. példa eredményeit a 4. ábrán mutatjuk he és a 7. táblázatban összegezzük. A 7, táblázat, a feorostyánkősav felhalmozódását mutatja be olyan fermentációs táptalajban, amely 50% híg áztató levet tartalmaz.
| j Fennentáclós k | lő /óra/ | 1 24 | 48 | 99 |
| I Borostyánkősav | koncentráló (g/í) | 1 11,9 | 25,5 | 51,9 |
| | Kitermelés (g/lít | er, óra) | j 0,60 | 0,53 | 0,52 |
Ezek az eredmények arra mutatnak, hogy a borostyánkősav előállítható egy olcsó táptalajban, amelyben a drága élasztöklvonatot és tríptont az olcsó hig áztató lével helyettesítettük.
Ebben a példában a híg áztató lé koncentrációját mind a rázélombikban, mind a fermentációs táptalajban 25%~ra csökkentettük, A többi körülmény teljesen azonos ,SV φ Φφ Ν <Χ φ φ * ** ** φ Φ Φ ' ' zh volt a 4, példában megadottal. A kisebb mennyiségű híg áztató lével összefüggő térfogathiány kompenzálására vizet adagoltunk.
Az eredményeket az 5, ábrán mutatjuk be és a 8. Táblázatban összegezzük. A 8. táblázat a borostyánkősav felhalmozódását mutatja be olyan fermentációs táptalajban, amely 25% híg áztató levet tartalmaz.
| Fermentációs idő /óra/ | | 48 I 97 i | ||
| Öorostyánkősav koncentráció (g/l) | | 20,9 | 35,7 | | 46,3 |
| Kitermelés (g/liter, őrá | l 0,87 | I 0,74 | | I 0.48 |
Az eredmények arra mutatnak, hogy a borostyánkősav előállítható egy még gazdaságosabb közegben is, amelyben a híg áztató lé koncentrációját 25%-ra csökkentettük.
Ebben a példában a híg áztató lé koncentrációját mind a rázól· a fermentációs táptalajban 25%-ra állítottuk be és bázisként 1,5 M ammónlum-karhónától alkalmaztunk. A körülmények egyébként azonosak voltak a 4, példában leinAz eredményeket a 6, ábrán mutatjuk be és a 9. tábla amely a borostyánkösav felhalmozódását mutatja be olyan fermentációs táptalajban, amely 25% hig áztató levet tartalmaz és amelyben ammónium-karbonátoi tünk a pH szabályozására.
| Φ ΑΦ s «·'-· | -Síit Φ ii Φ Φ x*x ·. v. Φ * . •>..v V | |
| 9, Táblázat | ||
| Fermentációs idő (óra) ΐ | .24 | | 48 ! |
| 5 Borostyánkösav koncentráció (g/l) I | 14,8 | I 24,9 |
| Kitermelés (g/IHer, óra) | | 0,82 | I 0,52 |
Az eredmények arra mutatnak, hogy a nátrium-karbonáttól különböző karbonátok, pl. az ammönium-karbonát, magnézium-karbonát stb. Is felhasználhatók a pH beállítására a borostyánkösav fermentációs eljárásban.
Ebben a példában 4 kísérletet írunk le, 2 kísérletben a híg áztató lé koncentrációját mind a rázólombikban, mind a fermentációs táptalajban 25%-ra állítottuk be és bázisként 2 M NaOH-t alkalmaztunk. A másik két kísérletben a híg áztató lé koncentrációja 5ö% és bázisként 15%-os NH«OH-í használtuk fel. Mindkét kísédetsomzaton beiül, amelyekben ugyanazt a bázist alkalmaztuk a pH ellenőrzésére, az egyik összeállításban tiszta széndioxidot buborékoltatok a fermentorba kb. 100 ml/perc sebességgel az anaerób fázisban,· a borostyánkösav anaerób meiabolizmus keretében való előállítására.
Az eredményeket a 7, ébrén mutatjuk be ás a 10, táblázatban Össze* lö, táblázat a borostyánkösav felhalmozódását mutatja be olyan fermentációs táptalajban, amely hig áztató levet tartalmaz és amelyben ammánlum-hidrcxidof és náfrium-bídroxidöt alkalmaztunk a pH beállításéra.
Φ »
Λ .♦
Φφχ *χ * φφ
X Φ χχ
| 10. Táblázat | ||
| Bázis; NaOH | ||
| QOg-dal | Cögnélkül | |
| Fermentációs Idő /éra/ | 48 72 | 48 '72 |
| Bomsíyánkosav konr^ntnádó (g/l) | 17,5 23,9 | 8,0 6,0 |
| Kitermelés (g/iíler, óra | 0,38 0,33 | 0,13 0,08 |
| Bázis: NH<OH | ||
| Cözdal | CO? nélkül | |
| Fermentációs idő /óra/ | 48 72 | 48 52 |
| 22 8 84 4 | ö 7 ÍS 4. | |
| Kitermelés (g/lifer, óra | 0,47 0,46 | 0,19 0,18 |
Az eredmények arra mutatnak., hogy karbonátnak a pH beállítására való alkalmazása esetén jelentős horostyánkősav termelés eléréséhez arra van szükség, hogy az anaerob fázisban széndioxid gázt buborékolfassunk be a farmentorba,
A találmány tehát eljárást biztosít almasav fermentációs ütőn való előállítására. Az almasav, a horostyánkősav prekurzora elvben jobb végtermék, mint a borostyánkősav, mivel előállítása eggyel kevesebb reduktív tépést Igények Az almasavtermelés elméleti szíoehlometríája; 1 mól glukóz és 2 mól széndioxid alakul át 2 mól almasavvá. Ily mórion az almasav-termelés glukóz-veszteség nélkül mehet végbe. Fumársav, amely az almasav dehidratádós terméke és a szűkeinél prekurzora a redukciós metabollzmusban, ugyancsak keletkezhet Almasav ás fumársav tehát egyaránt keletkezhet melléktermék képződése nélkül, de az almasavat a nagyüzemi termeléshez magasabb oldhatósága előnyösebbé teszi.
Φ X
A találmány tárgya lehet egy folytonos eljárás Is, amelynek során egy fermentort és egy ülepítő tankot alkalmazunk. Az ülepítő tank aljára kiülepedő sejteket visszaviszszük a fermentorba a sejtkoncenfráció nevelésére, ami viszont fokozza a termelékenységet, Megfigyeltük, hegy a sejtek a keverés leállítása után összecsapódtak és enjótük
A borostyánkősav ugyancsak előállítható folytonos fermentációs eljárásseb amelynek során egy fermentort és egy ultraszürö egységet alkalmazunk. Az ebben az egységben összegyűjtött sejteket visszaosszuk a fermentorba a sejlkoncentrácáó növelésére, amely viszont fokozza a termelékenységet. A fermentációs termék/ek/ ultraszűréssel való eltávolításé a fermentléböl csökkenti a termék gátló hatását és növeli a kitermelést.
A borostyánkősav előállítható olyan folytonos fermentációs eljárással is, amelynek során egy adszorbenst adagolunk és ezt folyamatosan eltávolítjuk a fermentorbót A fermentációs termék/ek/ eltávolítása a fermentléböl csökkenti a termék gátló hatását és növeli a kitermelést.
A borostyánkősav előállítható szakaszos eljárással is, amelynek során 2 sorba kapcsolt fermentort alkalmazunk. Az első fermentorban /tenyésztő fermentor/ az organizmust magas sejtsőrüségig tenyésztjük. A biomasszát ezután étvisszük a második fermentorha /termelő fermentor/,, amelyben anaerób körülményeket alkalmazunk a borostyánkösav termelésének elősegítésére. A tenyésztő fermentor eközben kitisztítható és felhasználható további biomassza előállításához, amelyet egy másik termelő fermentorba vihetünk át, Mivel a termelési idő sokkal hosszabb, mint tenyésztési idő, ogy tenyésztő fermentor több termelő fermentor biomasszával való ellátására használható fel.
Az előbbiekben a találmány jelenleg kitüntetettnek tekintett megvalósítási módjait mutattok be és irtuk le. A szakember számára azonban nyilvánvaló, hegy ezekben *<>
ΦΦΧΦ χ*ΦΦ Φ Φ φ
χχχ Φφ^ különböző változtatások ás módosítások hajthatók végre anélkül, hogy a találmány nak az igénypontok által meghatározott oltalmi köréből kik
ΦΦ X *
SS,$63/DE
POOGIte?
W, öklébe!'
Claims (16)
1. Eljárás karbonsavak előállítására, azzal jellemezve, hogy
I) egy szénforrást tartalmazó táptalajt beoltunk egy biomasszával rendelkező, karbonsav-termelő organizmussal;
II) az organizmust aerób atmoszférában inkubáljuk az organizmus gyors növekedésének - ezzel a biomassza tömege növekedésének - elősegítésére;
iii) az aerób atmoszféra fenntartására ellenőrzött módon oxigént, vezetünk be; ív) az organizmust ellenőrzött módon a szénforrást tartalmazó oldattal látjuk el, mimellett a táptalajban a szénforrás koncentrációját a 0,5 g/l - 1 g/i
v) az oxigéntartalmö aerób atmoszférát megszűntetjük és anaerób atmoszférát alakítunk ki, ami az organizmus anaerób metabolizmusra való áttérését Idézi elő;
vi) az organizmust ellenőrzött módon a szénforrást tartalmazó oldattal látjuk el, mimellett a táptalajban a szénforrás koncentrációját az 1 g/l vagy ennél nagyobb értéken tartjuk, és vlí) az organizmus anaerob metabolízmusa segítségével a szénforrást karbonsavakká alakítjuk át
2, Az 1, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy organizmusként
Escherichla colit vegy Lacfebacillusokat alkalmazunk, s: <
3, Az M. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ozmoíoleráns organizmusokat alkalmazunk, amelyek a metaboiízmus bármiféle gátlása nélkül k« szerves savak termelésére.
4, A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Escherichla colikéi olyan baktériumot alkalmazunk, amelyet a píruvát-formiát-líáz és a laktáf-dehidrecenáz gének nélküli szülő törzsből állítottuk elő.
SS.S-S3/0E »0001» 2Ö10. október * X «*«» * x XX X
X X y χ χ * > X χχ«χ χ χ <. * X X XX χ χ χ χ <
8. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy génmanipulált organizmust alkalmazunk, amelyben kifejeződik egy enzim és ez képessé teszi az organizmust a piruvát dlkarbonsawá velő átalakítására.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan génmanipulált organizmust alkalmazunk, amelyben az almasav enzim fejeződik ki.
7, A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy anaerob metabolizmus útján fötermékként borostyánkósavat, valamint ecetsavat és etanolt állítunk elő,
8. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy anaerőb metabolizmus útján fötermékként almasavat, valamint ecetsavat és etanolt állítunk elő.
9. A 8, igénypont szerinti eljárás, azzaí jellemezve, hogy anaerob mefabolizmus útján főtermékként fumársaval, valamint ecetsavat és etanolt állítunk elő.
10. Eljárás karbonsavak előállítására, azzal jellemezve, hogy
I) egy szénforrást tartalmazó táptalajt beoltunk egy biomasszával rendelkező, karbonsav-termelö organizmussal;
ii) az organizmust rögzített pH érték mellett aerób atmoszférában inkubáijuk az organizmus gyors növekedésének - ezzel a biomassza tömege növekedésének elősegítésére;
iii) . az. aeréb atmoszféra fenntartására ellenőrzőit módon oxigént vezetünk be;
ív) az organizmust ellenőrzött módon a szénforrást tartalmazó oldattal latjuk el, mimelleit a táptalajban a szénforrás koncentrációját a kb. 0,5 g/1 - kb. 1 g/1 tarv) a megnövekedőt! biomasszával rendelkező organizmust álvisszük egy anaerőb afmoszférájű termelő fermenforba, ami az organizmus anaerőb metabolizmusra való áttérését idézi elő;
ví) az organizmust ellenőrzött módon a szénforrást tartalmazó oldattal látjuk el, mimellett a táptalajban a szénforrás koncentrációját az 1 g/l vagy ennél nagyobb értéken tartjuk és
SS.5S3/OS FOÖOIW 2010. október »«'♦ 0 0 < .♦ * « V **#·
00CX 00 « vii) az organizmus anaerób metabolizmusa segítségével a szénforrást karbonsavakká alakítjuk át
11. A 18, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy organizmusként Escherichia colit vagy Laotobaoillusokaf alkalmazunk.
12. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ozmotoleráns organizmusokat alkalmazunk, amelyek a metabolizmus bármiféle gátlása nélkül képesek szerves savak termelésére.
13. A 11, Igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Escherichia coliként olyan baktériumot alkalmazunk, amelyet a plruvát-formiát-líáz és a iaktát-dehidrogenáz gének nélküli szülő törzsből állítottunk elő.
14. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy génmanipulált organizmust alkalmazunk, amelyben kifejeződik egy enzim és ez képessé teszi az organizmust a piruvát dikarbonsavvá való átalakítására.
15. A 14. Igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan génmanipulált organizmust alkalmazunk, amelyben az almasav enzim fejeződik ki.
18, A lő, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az organizmus anaerób metabolizmus útján főtermékként borostyánkösavat, valamint ecetsavat és etanolt állítunk elő.
17, A 16, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az organizmus anaerob metabolizmus útján fofermékként almasavat, valamint eoetsavat és etanolt állítunk elő.
18. A lő, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az organizmus anaerób metabolizmus útján főtermékként fumársavat, valamint ecetsavat és etanolt állítunk elő,
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/792,655 US5869301A (en) | 1995-11-02 | 1997-01-31 | Method for the production of dicarboxylic acids |
| PCT/US1998/001877 WO1998033930A1 (en) | 1997-01-31 | 1998-01-30 | A method for the production of dicarboxylic acids |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0001997A2 HUP0001997A2 (hu) | 2000-10-28 |
| HUP0001997A3 HUP0001997A3 (en) | 2002-01-28 |
| HU227509B1 true HU227509B1 (en) | 2011-07-28 |
Family
ID=25157624
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0001997A HU227509B1 (en) | 1997-01-31 | 1998-01-30 | A method for the production of dicarboxylic acids |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5869301A (hu) |
| EP (1) | EP1012323B1 (hu) |
| JP (1) | JP3681404B2 (hu) |
| CN (1) | CN1121500C (hu) |
| AT (1) | ATE360084T1 (hu) |
| AU (1) | AU724274B2 (hu) |
| BR (1) | BR9806822B1 (hu) |
| CA (1) | CA2278892C (hu) |
| DE (1) | DE69837607T2 (hu) |
| DK (1) | DK1012323T3 (hu) |
| ES (1) | ES2285757T3 (hu) |
| HU (1) | HU227509B1 (hu) |
| PT (1) | PT1012323E (hu) |
| WO (1) | WO1998033930A1 (hu) |
Families Citing this family (86)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10129711B4 (de) * | 2001-06-22 | 2007-08-23 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pyruvat |
| US8183350B2 (en) | 2002-05-04 | 2012-05-22 | Acorda Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for promoting neuronal outgrowth |
| DE10220234B4 (de) * | 2002-05-06 | 2013-05-23 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren sowie Mikroorganismen zur mikrobiellen Herstellung von Pyruvat aus Kohlenhydraten sowie Alkoholen |
| WO2004017044A2 (en) * | 2002-08-15 | 2004-02-26 | Acorda Therapeutics, Inc. | Chimeric protein |
| US7959914B2 (en) | 2003-05-16 | 2011-06-14 | Acorda Therapeutics, Inc. | Methods of reducing extravasation of inflammatory cells |
| CA2525804C (en) * | 2003-05-16 | 2017-04-25 | Acorda Therapeutics, Inc. | Use of chondroitinase abc enzyme for the treatment of cns injuries |
| AU2004247026B2 (en) * | 2003-05-16 | 2009-09-24 | Acorda Therapeutics, Inc. | Proteoglycan degrading mutants for treatment of CNS |
| JP4469568B2 (ja) * | 2003-07-09 | 2010-05-26 | 三菱化学株式会社 | 有機酸の製造方法 |
| WO2005010182A1 (ja) * | 2003-07-29 | 2005-02-03 | Research Institute Of Innovative Technology For The Earth | コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるジカルボン酸の製造方法 |
| EP1672077B1 (en) * | 2003-08-28 | 2015-01-21 | Mitsubishi Chemical Corporation | Process for producing succinic acid |
| EP1672067B1 (en) * | 2003-09-17 | 2015-11-11 | Mitsubishi Chemical Corporation | Process for producing non-amino organic acid |
| JP4631706B2 (ja) * | 2003-09-30 | 2011-02-16 | 味の素株式会社 | 発酵液からのコハク酸の精製方法 |
| WO2005045049A1 (ja) * | 2003-11-07 | 2005-05-19 | Mitsubishi Chemical Corporation | 有機酸アンモニウム溶液の製造方法 |
| JP2005295998A (ja) * | 2003-11-07 | 2005-10-27 | Mitsubishi Chemicals Corp | 有機酸アンモニウム溶液の製造方法 |
| WO2005112986A2 (en) * | 2004-05-18 | 2005-12-01 | Acorda Therapeutics, Inc. | Purifying chondroitinase and stable formulations thereof |
| CN1989239B (zh) * | 2004-05-20 | 2013-07-10 | 味之素株式会社 | 生产琥珀酸的细菌和生产琥珀酸的方法 |
| BRPI0510919A (pt) * | 2004-05-20 | 2008-05-20 | Ajinomoto Kk | bactéria produtora de ácido succìnico e processo para produzir ácido succìnico |
| EP3130676A1 (en) | 2004-08-27 | 2017-02-15 | Rice University | Mutant e. coli strain with increased succinic acid production |
| WO2006034156A2 (en) * | 2004-09-17 | 2006-03-30 | Rice University | High succinate producing bacteria |
| JP4537862B2 (ja) * | 2005-01-18 | 2010-09-08 | 財団法人地球環境産業技術研究機構 | 好気性細菌による高効率な有機酸の製造方法 |
| EP3925996A3 (en) | 2005-04-22 | 2022-04-20 | Mitsubishi Chemical Corporation | Biomass-resource-derived polyester and production process thereof |
| JP4380654B2 (ja) * | 2005-04-22 | 2009-12-09 | 三菱化学株式会社 | ポリエステル及びその製造方法 |
| JP4380653B2 (ja) * | 2005-04-22 | 2009-12-09 | 三菱化学株式会社 | ポリエステル及びその製造方法 |
| US20070111294A1 (en) * | 2005-09-09 | 2007-05-17 | Genomatica, Inc. | Methods and organisms for the growth-coupled production of succinate |
| ES2393748T3 (es) | 2005-09-26 | 2012-12-27 | Acorda Therapeutics, Inc. | Composiciones y métodos de uso de condroitinasa ABCI mutantes |
| BRPI0617491B1 (pt) * | 2005-10-18 | 2021-04-27 | Ajinomoto Co., Inc | Processo para produção de ácido succínico |
| US7335066B2 (en) * | 2005-12-16 | 2008-02-26 | James A. Carroll | Network connector and connection system |
| US7993888B2 (en) * | 2006-02-24 | 2011-08-09 | Mitsubishi Chemical Corporation | Bacterium having enhanced 2-oxoglutarate dehydrogenase activity |
| EP1842843A1 (de) * | 2006-04-04 | 2007-10-10 | Basf Aktiengesellschaft | Verfahren zur Herstellung eines Carbonsäurealkylesters |
| CN104962586A (zh) | 2006-07-21 | 2015-10-07 | 希乐克公司 | 生物质转化*** |
| CA3009034C (en) | 2006-10-10 | 2020-08-18 | Acorda Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of using chondroitinase abci mutants |
| WO2008091627A2 (en) * | 2007-01-22 | 2008-07-31 | Genomatica, Inc. | Methods and organisms for growth-coupled production of 3-hydroxypropionic acid |
| LT2821494T (lt) | 2007-03-16 | 2017-04-25 | Genomatica, Inc. | 1,4-butandiolio ir jo pirmtakų biosintezės būdai ir kompozicijos |
| KR101631719B1 (ko) * | 2007-03-20 | 2016-06-24 | 유니버시티 오브 플로리다 리서치 파운데이션, 인크. | 유효한 숙시네이트 및 말레이트 제조를 위한 물질 및 방법 |
| DE102007019184A1 (de) | 2007-04-20 | 2008-10-23 | Organo Balance Gmbh | Mikroorganismus zur Herstellung von Bernsteinsäure |
| DK2164975T3 (da) | 2007-07-06 | 2012-05-29 | Basf Se | Fremgangsmåde til fremstilling af en koncentreret vandig glukoseopløsning af majs |
| US7947483B2 (en) | 2007-08-10 | 2011-05-24 | Genomatica, Inc. | Methods and organisms for the growth-coupled production of 1,4-butanediol |
| WO2009045637A2 (en) * | 2007-08-10 | 2009-04-09 | Genomatica, Inc. | Methods for the synthesis of acrylic acid and derivatives from fumaric acid |
| US8735112B2 (en) * | 2007-11-20 | 2014-05-27 | Dsm Ip Assets B.V. | Dicarboxylic acid production in a recombinant yeast |
| FR2925068B1 (fr) * | 2007-12-13 | 2010-01-08 | Roquette Freres | Procedes de production d'acide succinique |
| BRPI0722315A2 (pt) * | 2007-12-28 | 2014-06-10 | Roquette Freres | Método de cultura microbiana em larga escala |
| JP2011509691A (ja) | 2008-01-22 | 2011-03-31 | ジェノマティカ， インコーポレイテッド | 合成ガスまたは他のガス状炭素源およびメタノールを利用するための方法および生物体 |
| EP2262901B1 (en) | 2008-03-05 | 2018-11-21 | Genomatica, Inc. | Primary alcohol producing organisms |
| CN102066551B (zh) | 2008-03-27 | 2013-10-09 | 基因组股份公司 | 用于产生己二酸和其他化合物的微生物 |
| JP2011519561A (ja) | 2008-05-01 | 2011-07-14 | ジェノマティカ， インコーポレイテッド | メタクリル酸の産生のための微生物 |
| EP2304039B1 (en) * | 2008-06-17 | 2019-08-21 | Genomatica, Inc. | Microorganisms and methods for the biosynthesis of fumarate, malate, and acrylate |
| CN107267562A (zh) | 2008-07-08 | 2017-10-20 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 通过在低pH下发酵生产二羧酸 |
| US20100021978A1 (en) * | 2008-07-23 | 2010-01-28 | Genomatica, Inc. | Methods and organisms for production of 3-hydroxypropionic acid |
| WO2010030711A2 (en) | 2008-09-10 | 2010-03-18 | Genomatica, Inc. | Microorganisms for the production of 1,4-butanediol |
| DE102008051727A1 (de) | 2008-10-17 | 2010-04-22 | Organo Balance Gmbh | Mikroorganismus zur Herstellung von Bernsteinsäure |
| WO2010057022A1 (en) * | 2008-11-14 | 2010-05-20 | Genomatica, Inc. | Microorganisms for the production of methyl ethyl ketone and 2-butanol |
| AU2009327490A1 (en) * | 2008-12-16 | 2011-07-28 | Genomatica, Inc. | Microorganisms and methods for conversion of syngas and other carbon sources to useful products |
| FR2941959B1 (fr) * | 2009-02-12 | 2013-06-07 | Roquette Freres | Procedes de production d'acide succinique |
| JP2012522515A (ja) | 2009-04-02 | 2012-09-27 | ユニバーシティ オブ フロリダ リサーチ ファンデーション インコーポレーティッド | コハク酸生産経路の工学処理 |
| JP2012525156A (ja) | 2009-04-30 | 2012-10-22 | ゲノマチカ， インク． | イソプロパノール、ｎ−ブタノール、及びイソブタノールの産生のための微生物 |
| US9017983B2 (en) * | 2009-04-30 | 2015-04-28 | Genomatica, Inc. | Organisms for the production of 1,3-butanediol |
| JP5773990B2 (ja) | 2009-05-07 | 2015-09-02 | ゲノマチカ， インク． | アジペート、ヘキサメチレンジアミン、及び６−アミノカプロン酸の生合成のための微生物及び方法 |
| WO2010132845A1 (en) * | 2009-05-15 | 2010-11-18 | Genomatica, Inc. | Organisms for the production of cyclohexanone |
| CN107384846B (zh) | 2009-06-04 | 2021-08-10 | 基因组股份公司 | 生产1,4-丁二醇的微生物和相关方法 |
| CA2764368C (en) * | 2009-06-04 | 2017-08-01 | Genomatica, Inc. | Process of separating components of a fermentation broth |
| EP2440669A4 (en) * | 2009-06-10 | 2013-08-28 | Genomatica Inc | MICROOGANISMS AND PROCEDURES FOR THE CARBON EFFECTIVE BIOSYNTHESIS MEK AND 2-BUTANOL |
| WO2011017560A1 (en) | 2009-08-05 | 2011-02-10 | Genomatica, Inc. | Semi-synthetic terephthalic acid via microorganisms that produce muconic acid |
| EA026438B1 (ru) * | 2009-08-27 | 2017-04-28 | ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. | Способ ферментативного получения дикарбоновых кислот |
| JP2013504326A (ja) | 2009-09-09 | 2013-02-07 | ジェノマティカ・インコーポレイテッド | イソプロパノールならびに第一級アルコール、ジオールおよび酸の共生成のための微生物ならびに方法 |
| CN105441374A (zh) * | 2009-10-13 | 2016-03-30 | 基因组股份公司 | 生产1,4-丁二醇、4-羟基丁醛、4-羟基丁酰-coa、腐胺和相关化合物的微生物及其相关方法 |
| KR20180014240A (ko) | 2009-10-23 | 2018-02-07 | 게노마티카 인코포레이티드 | 아닐린의 제조를 위한 미생물 |
| WO2011066076A1 (en) | 2009-11-25 | 2011-06-03 | Genomatica, Inc. | Microorganisms and methods for the coproduction of 1,4-butanediol and gamma-butyrolactone |
| WO2011071682A1 (en) | 2009-12-10 | 2011-06-16 | Genomatica, Inc. | Methods and organisms for converting synthesis gas or other gaseous carbon sources and methanol to 1,3-butanediol |
| MX2012008738A (es) * | 2010-01-29 | 2012-08-31 | Genomatica Inc | Microorganismos y metodos para la biosintesis de p-toluato y tereftalato. |
| US8048661B2 (en) * | 2010-02-23 | 2011-11-01 | Genomatica, Inc. | Microbial organisms comprising exogenous nucleic acids encoding reductive TCA pathway enzymes |
| US8637286B2 (en) * | 2010-02-23 | 2014-01-28 | Genomatica, Inc. | Methods for increasing product yields |
| US9023636B2 (en) | 2010-04-30 | 2015-05-05 | Genomatica, Inc. | Microorganisms and methods for the biosynthesis of propylene |
| WO2011140171A2 (en) | 2010-05-05 | 2011-11-10 | Genomatica, Inc. | Microorganisms and methods for the biosynthesis of butadiene |
| US20110306734A1 (en) | 2010-06-02 | 2011-12-15 | Bayer Materialscience Ag | Thermoplastically processable polyurethanes based on succinic acid propionates |
| CN103038302B (zh) | 2010-06-08 | 2014-07-09 | 由俄勒冈州高等教育管理委员会代表的俄勒冈州立大学 | 植物油基压敏粘合剂 |
| MX2013001071A (es) | 2010-07-26 | 2013-06-28 | Genomatica Inc | Microorganismos y metodos para la biosintesis de aromaticos, 2, 4-pentadienoato y 1, 3-butadieno. |
| EP2686293A1 (en) | 2011-03-14 | 2014-01-22 | Dow Global Technologies LLC | Processes for producing terephthalic acid and terephthalic esters |
| CN102242074B (zh) * | 2011-04-12 | 2014-08-06 | 叶春 | 一种兼性厌氧菌的筛选方法 |
| US8580096B2 (en) | 2011-09-29 | 2013-11-12 | Uchicago Argonne, Llc | Bioprocess utilizing carbon dioxide and electrodeionization |
| WO2013045546A1 (de) | 2011-09-30 | 2013-04-04 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Homogene extrudierte artikel aus thermoplastisch verarbeitbaren polyurethanen auf basis von polyesterdiolen aus bernsteinsäure und 1,3 -propandiol |
| AU2012376541B2 (en) | 2012-04-09 | 2016-05-12 | Avery Dennison Corporation | Pressure sensitive adhesives based on renewable resources, UV curing and related methods |
| WO2013166075A1 (en) | 2012-04-30 | 2013-11-07 | Woods Hole Oceanographic Institution | Cobalamin acquisition protein and use thereof |
| WO2013184602A2 (en) | 2012-06-04 | 2013-12-12 | Genomatica, Inc. | Microorganisms and methods for production of 4-hydroxybutyrate, 1,4-butanediol and related compounds |
| WO2017192925A1 (en) * | 2016-05-05 | 2017-11-09 | William Marsh Rice University | Improved microbial production of fats |
| CN110951660B (zh) * | 2019-12-19 | 2021-12-03 | 江南大学 | 一株固定co2产苹果酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用 |
| CN114350718B (zh) * | 2021-12-31 | 2024-06-07 | 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 | 一种发酵生产苹果酸的方法 |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5543759B2 (hu) * | 1972-06-28 | 1980-11-07 | ||
| US4190495A (en) * | 1976-09-27 | 1980-02-26 | Research Corporation | Modified microorganisms and method of preparing and using same |
| JPS60114197A (ja) * | 1983-11-25 | 1985-06-20 | Agency Of Ind Science & Technol | 微生物によるジカルボン酸の製造法 |
| US4871667A (en) * | 1984-11-26 | 1989-10-03 | Agency Of Industrial Science & Technology | Process for preparing muconic acid |
| US5143834A (en) * | 1986-06-11 | 1992-09-01 | Glassner David A | Process for the production and purification of succinic acid |
| US5168055A (en) * | 1986-06-11 | 1992-12-01 | Rathin Datta | Fermentation and purification process for succinic acid |
| EP0249773B1 (en) * | 1986-06-11 | 1992-12-16 | Michigan Biotechnology Institute | A process for the production of succinic acid by anaerobic fermentation |
| US5182199A (en) * | 1987-05-27 | 1993-01-26 | Hartley Brian S | Thermophilic ethanol production in a two-stage closed system |
| WO1990012888A1 (en) * | 1989-04-27 | 1990-11-01 | Biocontrol Systems, Incorporated | Precipitate test for microorganisms |
| US5416020A (en) * | 1992-09-29 | 1995-05-16 | Bio-Technical Resources | Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus strain and fermentation process for producing L-(+)-lactic acid |
| FR2702492B1 (fr) * | 1993-03-12 | 1995-05-24 | Rhone Poulenc Chimie | Procédé de production par fermentation d'acide itaconique. |
| NZ267894A (en) * | 1993-06-25 | 1997-10-24 | Du Pont | Enzymatic preparation of pyruvic acid |
| WO1995001449A1 (en) * | 1993-07-01 | 1995-01-12 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | An improved method of preparing glyoxylic acid/aminomethylphosphonic acid mixtures using a microbial double-transformant |
| US5521075A (en) * | 1994-12-19 | 1996-05-28 | Michigan Biotechnology Institute | Method for making succinic acid, anaerobiospirillum succiniciproducens variants for use in process and methods for obtaining variants |
| US5504004A (en) * | 1994-12-20 | 1996-04-02 | Michigan Biotechnology Institute | Process for making succinic acid, microorganisms for use in the process and methods of obtaining the microorganisms |
-
1997
- 1997-01-31 US US08/792,655 patent/US5869301A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-01-30 DE DE69837607T patent/DE69837607T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-30 WO PCT/US1998/001877 patent/WO1998033930A1/en active IP Right Grant
- 1998-01-30 CA CA002278892A patent/CA2278892C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-01-30 PT PT98903871T patent/PT1012323E/pt unknown
- 1998-01-30 BR BRPI9806822-9A patent/BR9806822B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-01-30 ES ES98903871T patent/ES2285757T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-30 HU HU0001997A patent/HU227509B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-01-30 CN CN98802169A patent/CN1121500C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-01-30 DK DK98903871T patent/DK1012323T3/da active
- 1998-01-30 AU AU60523/98A patent/AU724274B2/en not_active Ceased
- 1998-01-30 JP JP53314198A patent/JP3681404B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-01-30 AT AT98903871T patent/ATE360084T1/de active
- 1998-01-30 EP EP98903871A patent/EP1012323B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2000515389A (ja) | 2000-11-21 |
| EP1012323A4 (en) | 2002-01-16 |
| AU724274B2 (en) | 2000-09-14 |
| EP1012323A1 (en) | 2000-06-28 |
| DE69837607D1 (de) | 2007-05-31 |
| DE69837607T2 (de) | 2007-12-27 |
| HUP0001997A2 (hu) | 2000-10-28 |
| BR9806822B1 (pt) | 2009-05-05 |
| DK1012323T3 (da) | 2007-06-18 |
| CN1121500C (zh) | 2003-09-17 |
| ATE360084T1 (de) | 2007-05-15 |
| CA2278892C (en) | 2009-02-24 |
| US5869301A (en) | 1999-02-09 |
| PT1012323E (pt) | 2007-05-31 |
| CN1246155A (zh) | 2000-03-01 |
| AU6052398A (en) | 1998-08-25 |
| WO1998033930A1 (en) | 1998-08-06 |
| EP1012323B1 (en) | 2007-04-18 |
| CA2278892A1 (en) | 1998-08-06 |
| JP3681404B2 (ja) | 2005-08-10 |
| ES2285757T3 (es) | 2007-11-16 |
| BR9806822A (pt) | 2000-05-09 |
| HUP0001997A3 (en) | 2002-01-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU227509B1 (en) | A method for the production of dicarboxylic acids | |
| AU724822B2 (en) | A mutant E.coli strain with increased succinic acid production | |
| CN101883853B (zh) | 具有生产1,4-丁二醇能力的突变体和使用该突变体制备1,4-丁二醇的方法 | |
| WO2004043881A2 (en) | A method to produce succinic acid from raw hydrolysates | |
| CN111635898A (zh) | 谷氨酸脱羧酶突变体及其在制备γ-氨基丁酸中的应用 | |
| CN110373370B (zh) | 一种耦合atp再生***的催化体系及其在生产谷胱甘肽过程中的应用 | |
| KR20100109902A (ko) | 대규모 미생물 배양 방법 | |
| CN110387379B (zh) | 一种用于生产谷胱甘肽的重组大肠杆菌的混合培养工艺及其应用 | |
| CN113122488B (zh) | 克雷伯氏菌工程菌及其生产甘油和二羟基丙酮的应用 | |
| JPH09508013A (ja) | 乳酸桿菌属に表現型が密接に関係した桿菌属の細菌株、培養方法および使用 | |
| KR20010102256A (ko) | Ｌ-소르보스의 제조 방법 | |
| CN117645985B (zh) | 一种乙酰氨基葡萄糖-6磷酸磷酸酶突变体及其应用 | |
| Zeman et al. | Enzyme synthesis of L-tryptophan | |
| CN110872595A (zh) | 抗酸表达盒及其在发酵产有机酸中的应用 | |
| CN113957073B (zh) | 一种tkt基因启动子突变体及其在生产L-赖氨酸中的应用 | |
| CN115125180B (zh) | 一种利用双途径产乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用 | |
| RU2731289C2 (ru) | Способ конструирования на основе бактерий рода Rhodococcus штамма-биокатализатора, обладающего нитрилазной активностью и повышенной операционной стабильностью, рекомбинантный штамм бактерий Rhodococcus rhodochrous, полученный таким способом, способ синтеза акриловой кислоты с использованием этого штамма в качестве биокатализатора | |
| CN117304283A (zh) | 一种mreC突变体及其在L-缬氨酸发酵生产中的应用 | |
| CN117802025A (zh) | 一种生产丁二胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用 | |
| CN116640810A (zh) | 一种赖氨酸生产方法、突变体及重组微生物与应用 | |
| MXPA99007104A (en) | A method for the production of dicarboxylic acids | |
| WO2023168233A1 (en) | Genetically modified yeast and fermentation processes for the production of 3-hydroxypropionate | |
| CN117737028A (zh) | 一种β-1,3-半乳糖基转移酶突变体及利用该突变体制备乳糖-N-四糖的应用 | |
| CN118525102A (zh) | 用于发酵制备邻氨基苯甲酸的葡萄糖和木糖的混合物 | |
| JP2016503650A (ja) | Ｄｌ−アラニンを生産する遺伝子操作細菌、及び前記遺伝子操作細菌を用いることによってｄｌ−アラニンを生産する方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |