KR100274552B1

KR100274552B1 - 피루브산의 제조 방법

Info

Publication number: KR100274552B1
Application number: KR1019950705919A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 레로이 안톤; 로버트 디코시모; 빈센트 게라르드 위터홀트
Original assignee: 더블유. 브루스 위톤; 유니버시티 오브 아이오와 리써치 파운데이션
Priority date: 1993-06-25
Filing date: 1994-06-15
Publication date: 2000-12-15
Also published as: HU213759B; CN1125961A; EP0705345A1; DE69417892T2; CA2165940C; EP0705345B1; HU9503773D0; JP3709202B2; CN1096500C; NZ267894A; HUT74223A; DE69417892D1; JPH08511689A; ZA944559B; AU686182B2; CA2165940A1; RU2123529C1; ES2132409T3; AU7056794A; GR3030756T3

Abstract

본 발명은 촉매, 글리콜레이트 산화효소 ((S)-2-히드록시산 산화효소, EC 1.1.3.15) 및 카탈라아제(EC 1.11.1.6). 존재하 수용액 중에서 L-락트산산과 산소의 효소적 반응이 관여하는 피루브산의 제조 방법에 관한 것이다. 생성물에 의한 실질적인 효소 억제 작용없이, 상업적으로 허용 가능한 농도 (통상적으로 0.5 M 이하)에서 고순도 (98% 나트륨염)의 피루베이트를 고수율(예를 들면, 96%)로 얻을 수 있다.

Description

[발명의 명칭]

피루브산의 제조 방법

[발명의 상세한 설명]

[발명의 배경]

[발명의 분야]

본 발명은 글리콜레이트 산화효소 ((S)-2-히드록시산 산화효소, EC 1.1.3.15)및 카탈라아제(EC 1.11.1.6)으로 이루어진 촉매 존재하, 수용액 중에서 L-락트산과 산소를 반응시키는 것으로 되는 피루브산의 제조 방법에 관한 것이다.

[관련 기술 분야에 대한 설명]

피루브산은 다양한 탄소원(즉, 글루코오스, 효모 추출물 및 펩톤)의 발효에 의하여 제조하여 왔으나 이들 방법은 일반적으로 생성되는 피루브산의 수율이 낮고(첨가된 탄소원 기준), 혼합물 중에서 하나의 성분으로서 발효 생성물의 농도가 비교적 낮다. 복합 발효액으로 부터 피루브산을 분리 및 단리하는 것은 일반적으로 어렵고 많은 비용이 소요된다.

광학적으로 순수한 D(-)-락트산을 미생물학적으로 산화하여 피루브산을 제조하는 것에 대해서는 쿠퍼(Cooper) 특허(미합중국 특허 제4,900,668호;1990년 2월 13일)에 기재되어 있다. 이 방법은 반응에 필요한 세포 매스(mass)를 생성하는 탄소원으로서 D-락트산을 사용하지 않는 다른 발효 경로를 개선하였지만, D-락트산의 발효적 전환 뿐만 아니라 세포 매스를 생성하기 위하여 제2 탄소원(즉, D(-)-만니톨 및 옥수수 침지액)을 포함하고 있는 생장 배지가 필요하다. 또한, D-락트산은 자연에 편재되어 있지 않고, L(+)-락트산에 비하여 제조 또는 판매 비용이 비싸다.

유럽 특허 제342,984호는 검체 중의 NAD(P)H의 농도를 측정하기 위하여 사용된 효소적 검정법을 개시하고 있다. 이 검정법은 반응물로서 락테이트 산화효소를 함유하는 혼합물을 사용한다. 이것은 본 발명의 산화효소는 아니다.

촉매로서 효소 L-락테이트 산화효소 (L-락테이트: 산소 산화환원효소, 비탈카르복실성, EC 1.1.3.2)를 사용하여 L-락트산을 피루브산으로 전환하는 반응이 알려져 있다[비.에이.부르딕 (B.A. Burdick) 및 제이.알. 샤퍼(JR. Schaeffer)의 문헌 (Biotech. Lett. 제9권, 제253 내지 258면, 1987))]. L-락테이트 산화효소(Pediococcus 유래)는 산소에 의해 L-락테이트가 피루베이트와 과산화수소로 산화하는 반응을 촉매한다.

L-락테이트 산화효소는 피루베이트가 부산물인 과산화수소에 의해 산화되어 아세테이트와 이산화탄소를 생성하는 것을 제한하기 위하여 카탈라아제와 함께 고정화되었다(산화효소:카탈라아제 = 1.281 (IU/IU)). pH 7에서 0.1M 인산염 완충액중의 49 mM L-락테이트 용액이 산화되면 최고 47% 수율로 피루브산이 생성된다(2,4-디니트로페닐히드라존 유도체로서 단리).

녹색 엽채 식물류 및 포유류 세포에서 통상적으로 발견되는 효소인 글리콜레이트 산화효소 ((S)-2-히드록시산 산화효소 EC. 1.1.3.15)는 글리콜산이 산화되어 글리옥실산으로 되는 반응을 촉매한다. 동이한 효소가 과산화수소의 생성과 함께 L-락트산이 피루브산으로 되는 산화 반응을 역시 촉매한다. 시.오. 클라겟(C.O.Clagett), 엔. 이. 톨버트 (N.E. Tolbert) 및 알. 에이취. 부리스 (R. H. Burris)의 문헌(J. Biol. Chem. 제178권 제977 내지 987면(1949))에서 최초로 여러가지 녹색 엽채 식물로부터 추출된 α-히드록시산 산화효소를 보고하고 있는데, 이 효소는 글리콜산의 산화 반응을 촉매하였고, 또한 락트산의 L-이성질체에 선택적이었다. 80 mM dl-락테이트의 산화를 위한 최적 pH는 7.6이었고, 이 때 반응 생성물은 확인되거나 또는 단리되지 않았다. 엔. 이. 톨버트(N.E. Tolbert)등의 문헌 (J. Biol. Chem, 제181권 제905 내지 914면(1949))에서는 pH 8에서 인산염 완충액 중의 약 113 mM dl-락트산을 산화하기 위하여 담배잎으로 부터 유래된 정제 α-히드록시산 산화효소를 사용하였는데, 반응물로부터 2,4-디니트로페닐히드라존으로서 단리된 피루브산의 양은 보고되어 있지 않으며 상당한 양의 이산화탄소가 생성된다. 그 이후에 케이.이. 리차드슨 (K.E. Richardson) 및 엔. 이. 톨버트 (N.E. Tolbert)의 문헌(J. Biol. Chem, 제236권 제1280 내지 1284면(1961))은 이 α-히드록시산 산화효소를 보다 보편적으로 글리콜산 산화효소로 명명하였다 (즉, 글리콜레이트 산화효소).

아이. 젤리취(I. Zelitch) 및 에스. 오코아 (S. Ochoa)의 문헌 (J. Biol. Chem. 제201권 제707 내지 718면(1953))에는 글리콜산 산화효소가, 분자 산소에 의 해 L-락트산이 산화되어 피루브산 및 과산화수소를 생성하는 반응을 촉매하고, 카탈라아제 부재하에서 과산화물은 비효소적으로 피루베이트와 반응하여 아세테이트, CO₂및 물을 생성한다고 보고되었다. 플라빈 모노뉴클레오티드(FMN)는 효소 보조인자로서 확인되었고, FMN을 효소 수용액에 첨가하면 글리콜산 산화효소의 안정성이 대단히 증가되었다. 첨가된 카탈라아제의 과잉 존재하에서 50 mM 인산염 완충액(pH 8.0)중의 3.3 mM L-락테이트 용액의 산화 반응에 의하여 3.2 mM의 피루브산이 생성되었으나(비색 측정) 생성물은 단리되지 않았다.

쥐 신장으로 부터 단리된 L-α-히드록시산 산화효소를 사용하여 락테이트를 피루베이트로 산화시키는 반응도 역시 알려져 있다 [엠. 블란차드 (M. Blanchard) 등의 문헌 (J. Biol. Chem. 제163권 제137 내지 144면 (1946))]. 첨가된 과잉의 카탈라아제 존재하, pH 8.0에서 0.167 M 인산염 완충액 중의 33 mM 락테이트 용액의 산화 반응에 의하여 79% 수율로 피루베이트를 제조하였다(2,4-디니트로페닐히드라존 유도체 단리). 가용성 효소에 의하여 촉매된 락트산을 피루브산으로 산화하는 반응에 대한 추가의 참고 문헌으로는 로빈슨 (J.C. Robinson) 등의 문헌 [J. Biol. Chem. 제237권 제2001 내지 2010면 (1962)] (돼지 신장 피질 L-α-히드록시산 산화효소), 어반 (P. Urban) 등의 문헌 [Biochemistry, 제27권 제7365 내지 제7371면 (1988)] (쥐 신장 L-α-히드록시산 산화효소), 프라이 (D.W. Fry) 및 리차드슨 (K.E. Richardson)의 문헌 [Biochim. Biophys. Acta, 제568권, 제135 내지 144면 (1979))(사람 간 글리콜산 산화효소], 엠스 (M.J. Emes) 및 에리스만(K.H. Erismann) 의 문헌[Int. J. Biochem, 제16권 제1373 내지 1378면 (1984)](Lemna minor L. 글리콜레이트 산화효소), 김 (H.S. Kim) 및 최 (J.D. Choi)의 문헌 [Korean Biochem. J., 제20권 제350 내지 356면 (1987)](시금치 글리콜레이트 산화효소)이 포함된다.

산소에 의한 L-락트산의 효소 촉매된 산화 반응이 공지되어 있음에도 불구하고, 피루브산에 대한 높은 선택성에 대해서는 하나의 실험 (여기서, L-락테이트의 농도는 3.3 mM 이었음)(I. Zelitch 및 S. Ochoa)에서만 입증되었다. 이와 같이 저농도의 L-락테이트는 과산화수소의 생성 농도를 제한하였고, 과잉의 카탈라아제 존재하에서도 역시 과산화수소와 피루베이트가 반응하여 아세테이트 및 이산화탄소를 생성하는 것을 제한하였다. 수성 반응 혼합물로 부터 이와 같이 낮은 농도의 피루베이트 (약 3.2 mM)를 회수하는 것은 경제적인 제조 공정으로는 비실용적이다.

[발명의 요약]

본 발명은 두가지 효소 촉매, 즉 글리콜레이트 산화효소 ((S)-2-히드록시산 산화효소, EC 1.1.3.15) 및 카탈라아제 (EC 1.11.1.6) 존재하, 수용액 중에서 L-락트산(또는 그의 염)을 산소로 산화시켜 피루브산(또는 그의 염, 이하에서 보다 상세하게 설명됨)을 제조하는 것에 관한 것이다. 그러므로, 본 발명은 고수율로 L-락트산을 피루브산으로 전환시키기에 충분한 시간 동안 수용액 중에서, 효소 촉매 글리콜레이트 산화효소 및 효소 촉매 카탈라아제 존재하에서 초기 농도가 약 0.1 내지 약 2.0 M인 L-락트산과 산소를 반응시킨 다음 이어서 피루브산을 회수하는 단계를 포함하는 개선된 피루브산의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 목적을 위해서 특히 pH 범위 6 내지 10의 수용액을 가리킬 때 사용된 용어 피루브산 및 L-락트산은 보다 구체적으로는 부분적으로 중화된 산 용액이 각각 피루베이트 및 L-락테이트 이온으로서 지배적으로 존재하고 있는 고해리 상태를 가리키는 것으로 이해되어야 한다. 피루브산은 정밀 화학제품, 농약 및 약품의 제조에 있어 화학 중간체로서 유용하다. 따라서, 또한 본 발명의 목적을 위해서 피루브산의 고수율 회수는, 상응하는 고수율로 다른 유용한 피루브산 유도체 화합물의 중간체로서 피루브산을 고유하게 생성하는 방법을 동등하게 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명에 의하여 피루브산은 0.5 M 이하 농도의 L-락트산으로부터 효소 촉매된 산화 반응을 경유하여 제조되고 96 %의 수율로 단리된다 (순도 98% 나트륨염). 사용되는 L-락트산의 초기 농도가 높기 때문에 글리콜레이트 산화효소의 기질 억제가 예상되는데, 이는 반응 속도 및/또는 생성물의 최종 농도를 제한하게 된다. 이와 유사하게, 0.5 M 농도의 피루브산은 효소의 생성물 억제를 초래하고, 다시 얻어지는 생성물의 농도를 제한하게 된다.

또한 본 발명에 의하여 pH를 조절하지 않고 완충화시키지 않은 반응에서 98 내지 99%의 높은 수율로 피루베이트를 얻을 수 있다는 것이 발견되었다. L-락테이트의 효소적 산화에 대한 이전의 모든 실험은 완충제, 일반적으로 인산염 완충액을 사용하여 수행되었다. 완충제 부재하에서 얻어진 피루베이트의 고수율은 첨가된 완충제의 존재하에서 얻어진 것과 동일하거나 또는 그 이상이었다. 첨가된 완충제의 부재하에서 피루베이트를 제조하면 반응 혼합물로 부터 생성물을 간단하게 단리할 수 있다. 촉매는 여과 또는 원심분리에 의해 제거되고, (예를 들면, 감압하에서 물의 스트리핑, 동결건조 등에 의하여) 물을 제거함으로써 용이하게 회수할 수 있는 피루브산염의 수용액이 남는다.

L-락테이트를 피루베이트로 산화하는 반응을 위하여, 유전자 처리되고, 투과 된 전세포 촉매(즉, 글리콜레이트 산화효소 및 카탈라아제를 함유하고 있는 미생물 형질 전환체)를 사용하는 것을 발견하였다. 본 발명에서 이와 같은 전세포 촉매를 사용하는 것은 촉매로서 가용성 효소를 사용하는 것 보다 많은 잇점을 제공한다. 전세포 촉매를 함유하고 있는 용액에 산소 또는 산소 함유 기체를 살포하면 반응 속도가 증가되고, 가용성 효소를 함유하는 반응 혼합물을 살포하는 것은 글리콜레이트 산화효소가 빠르고 비가역적으로 변성되도록 한다. 반응 종결 시점에서 전세포 촉매는 재사용을 위하여 여과 또는 원심분리에 의해 용이하게 회수할 수 있는 반면, 가용성 효소는 원심분리할 수 없고 여과에 의하여 대부분의 가용성 글리콜레이트 산화효소 활성이 소실된다. 각 촉매 재순환 후에도 전세포 촉매의 재사용 가능한 효소 활성의 회복은 아주 높은데 반하여(약 95% 이상), 하나의 반응 후 남아있는 가용성 글리콜레이트 산화효소의 측정된 활성은 보통 40% 내지 60%이다. 불활성 지지체에 부착되거나 또는 고정화된 글리콜레이트 산화효소 및 카탈라아제를 사용하면 이와 동일한 많은 잇점을 나타내고, 이는 본 발명의 목적을 위하여 동동한 것으로 간주된다.

동일한 반응 조건 하에서 1) 가용성 글리콜레이트 산화효소 (g.o.) 및 가용성 카탈라아제, 2) 한세눌라 폴리모르파(Hansenula Polymorpha) 투과된 세포 촉매 및 3) 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) 투과된 세포 촉매를 사용한 0.50 M L-락테이트 용액의 산화에 의하여 얻은 결과를 비교하여 하기 표에 나타내었다 (반응 조건에 대해서는 실시예 5,12 및 13 참조).

촉매로서 가용성 글리콜레이트 산화효소 및 카탈라아제를 사용하는 것과 비교하여 투과된 촉매를 사용하였을 때 피루베이트의 수율은 더 높고 부산물인 아세테이트의 생성은 더 낮다. 가용성 효소 실험에서와 동일한 글리콜레이트 산화효소 농도에서 한세눌라 폴리모르파 투과된 세포 촉매를 사용할 때, 비록 반응 혼합물에 존재하는 내인성 세포 카탈자아제의 농도가 가용성 효소 반응에서의 절반이더라도 더 적은 량의 아세테이트(부산물인 과산화수소와 피루베이트의 반응에 의하여 생성됨)가 생성된다. 이들 결과 및 이후의 실시예의 결과는 촉매로서 투과된 세포 형질 전환체를 사용하였을 경우 피루베이트의 수율이 예상하지 못한 정도로 향상된다는 것을 증명하고 있다.

[바람직한 실시 태양에 대한 설명]

L-락트산 또는그의 적합한 염의 촉매적 산화 반응은 L-락트산과 O₂가 반응하여 피루브산을 생성하는 반응을 촉매하는 효소 촉매 존재하에서 L-락트산을 분자산소원과 접촉시켜 간편하게 수행한다. 이와 같은 촉매중 하나가 글리콜산 산화효소로도 알려진 효소 글리콜레이트 산화효소 (EC 1.1.3.15)이다. 글리콜레이트 산화 효소는 당 기술 분야에 공지된 다양한 효소원으로부터 단리될 수 있다 (상기 참조). 반응에 사용되는 글리콜레이트 산화효소는 유효한 농도, 일반적으로 약 0.01 내지 약 1000 IU/mL, 바람직하기로는 약 0.1 내지 약 10 IU/mL로 존재하여야 한다. IU(국제 단위)는 1분당 기질 1 마이크로몰의 형질 전환을 촉매하는 효소의 양으로 정의한다. 이러한 효소의 검정 방법은 아이. 젤리취 (I, Zelitch) 및 에스. 오코아 (S. Ochoa)의 문헌(J. Biol. Chem. 제201권, 제707 내지 제718면 (1953)에 기재되어 있다. 이 방법은 회수 또는 재순환된 글리콜레이트 산화효소의 활성을 검정하는 데도 사용한다.

L-락트산을 피루브산으로 산화적 전환시키는 반응에 촉매로서 글리콜레이트 산화효소를 사용함에 있어서 반응 용액에 과산화수소를 분해시키는 촉매를 첨가하면 최적의 결과를 얻는다. 글리콜레이트 산화효소와 함께 효과적으로 사용할 수 있는 이러한 과산화물 분해 촉매는 효소 카탈라아제 (EC 1.11.1.6)이다. 카탈라아제는 과산화수소를 물과 산소로 분해하는 반응을 촉매하고, 글리콜레이트 산화효소로 촉매된 락트산과 O₂의 반응에서 피루브산과 함께 생성된 과산화수소의 분해를 촉진함으로써 본 발명에서 피루브산의 수율을 향상시키는 것으로 이해된다. 카탈라아제의 농도는 50 내지 50,000 IU/mL, 바람직하기로는 2,000 내지 15,000 IU/mL라야 한다. 글리콜레이트 산화효소에 대한 카탈라아제의 비율 (각 효소에 대해 IU로 측정)이 적어도 약 250 : 1이 되도록 하기 위하여 카탈라아제와 글리콜레이트 산화효소의 농도를 상기 범위내로 조절하는 것이 바람직하다.

촉매로서 가용성 효소를 사용하는 것이외에, 본 발명에서 내인성 카탈라아제 활성 뿐 만 아니라 글리콜레이트 산화효소 활성을 나타내는 미생물 형질 전환체를 제조하고, 이를 미생물 촉매로서 사용하는 것이 밝혀졌다. 본 발명에서 사용되는 미생물 세포 촉매는 한세눌라 폴리모르파 (메틸로트포픽(methylotrophic) 효모)의 형질 전환체이다. 충분한 글리콜레이트 산화효소 활성을 가진 한세눌라 폴리모르파 형질 전환체 수종은 포르메이트 탈수소 효소 (FMD) 프로모터의 제어하에 글리콜레이트 산화효소의 DNA를 발현 벡터내에 삽입시켜 제조하였다. 이 벡터를 사용하여 한세눌라 폴리모르파를 형질 전환시키고, 고농도의 글리콜레이트 산화효소를 생성하는 균주를 선택하여 한세눌라 폴리모르파 GO1 (일리노이주 페오리아 소재 U.S.D.A. 인 ARS Patent Culture Collection에 Northern Regional Reserarch Laboratory 수탁번호 Y-21065로 기탁됨)로 명명하였다.

한세눌라 폴리모르파 세포 촉매는 통상적으로 먼저 pH 4.4dml YPD (Difco사제품) 500 mL 중에서 한세눌라 폴리모르파 형질 전환체 접종원을 배양시켜 제조하였다. 이 배양물을 pH 5.0에서 아미노산 결여 효모 질소 기재 (YNB, Difco사 제품)(14 g), 황산암모늄 (50 g) 및 메탄올(100 g)의 배지 10 L를 포함하는 발효기에 접종시켰다. 발효기는 온도 37℃, 교반 속도 400 rpm, 일정한 pH 5.0, (조절된) 용존 산소 40%, 및 공기 2.0 x 10⁵Pa (14 psig)에서 42.5 시간 동안 작동시켰다. 발효 종결 시점에 글리세롤 1.0 kg을 첨가하고 원심 분리하여 회수한 세포를 액체 질소 중에서 동결시켜 -80℃에서 보관하였다.

본 발명에서 사용되는 제2 미생물 세포 촉매는 내인성 카탈라아제 뿐만 아니라 시금치로 부터 유래된 글리콜레이트 산화효소를 발현하는 피치아 파스토리스 (메틸로트로픽 효모)의 형질 전환체이다. 충분한 글리콜레이트 산화효소 활성을 지닌 피치아 파스토리스 형질 전환체 수종은 시금치 글리콜레이트 산화효소 유전자를 포함하고 있는 DNA 단편을 메탄올 유도성 알코올 산화효소 I 프로모터 제어하에 있도록 피치아 파스토리스 발현 벡터 (pHIL-D4)에 삽입하고, 플라스미드 pMP1을 생성시켜 제조하였다. 피치아 파스토리스 균주 GTS115 (NRRL Y-15851)은 플라스미드 pMP1에 의해 형질 전환시키고, 선형화된 플라스미드 pMP1을 염색체 얄콜 산화효소 I 유전자좌에 삽입하여 알콜 산화효소 유전자를 글리콜레이트 산화효소 유전자로 대체할 수 있도록 선별하였다. 이어서 이러한 형질 전환체 풀은 삽입된 발현 카세트 카피 수가 최대가 되도록 선별하였다. 피치아 파스토리스 균주 GS115-MSP10 으로 명명된 카피 수가 높은 형질 전환체를 단리하여 NRRL 제 Y-21001호로 기탁하였다.

피치아 파스토리스 세포는 통상적으로 1% 글리세롤을 포함하는 YNB 100mL에서 접종원을 배양시켜 제조하였다. 30℃ 에서 48시간 배양 후, 세포를 아미노산 결여 효모 질소 기재 (YNB)(134 g), 글리세롤 (100 g) 및 비오틴 (20 mg)으로 구성된 배지 10 L를 포함하고 있는 발효기로 옮겼다. 발효는 (NH₄OH로 조절된) pH 5.0, 온도 30℃, 교반 속도 200 rpm, 통기 5 slpm 및 공기 1.4 x 10⁵Pa (5 psig)에서 수행하고, 용존 산소는 포화 상태의 50% 보다 낮지 않도록 유지하였다. 글리세롤이 소모되었을 때, 글리세롤 대신에 메탄올(50 g)을 사용하는 것을 제외하고는 동일한 배지에서 배양하여 글리콜레이트 산화효소를 발현하도록 세포를 유도하였다. 유도 중의 글리콜레이트 산화효소의 활성은 효소 검정에 의해 관찰하였다. 24 시간 유도 후, 글리세롤 (1 kg)으로 처리하여 세포를 회수하였다. 세포를 회수한 후 액체 질소 중에서 동결하고, -80℃에서 보관하였다.

한세눌라 폴리모르파 및 피치아 파스토리스 세포 형질 전환체는 글리콜산을 글리옥실산으로 산화시키는 반응에서 촉매로 사용하기 전에 투과시켜야 한다. 공지된 여러가지 투과 방법이 충분한 글리콜레이트 산화효소 활성을 지닌 세포의 제조에 유용하였다 (펠릭스, 에이취 (Felix, H.)의 문헌 [Anal. Biochemistry 제120권 제211 내지 234면 (1982)] 참조). 일반적으로, 0.1 % (v/v) "트리톤"X-100/20 mM 인산염 완충액(pH 7.0)중의 습식 세포 10 중량%의 현탁액을 15분 동안 혼합한 후 액체 질소 중에서 동결하고, 녹인 후 20 mM 인산염/0.1 mM FMN 완충액 (pH 7.0)으로 세척하였다. 제2의 투과 방법에서는 0.2 % (w/v) 염화 벤잘코늄/20 mM 인산염 완충액 (pH7.0)중의 습식 세포 10 중량%의 현탁액을 60분 동안 혼합한 후 투과된 세포를 20 mM 인산염/0.1 mM FMN 완충액 (pH 7.0)으로 세척하였다. 일단 투과시킨 후, 반응 혼합물에 첨가할 전세포 촉매량은 상기한 바와 같은 가용성 효소에 대응하는 글리콜레이트 산화효소 및 카탈라아제 활성에 필요한 농도를 제공하도록 결정하였다. 초기 값의 100%를 초과하는 글리콜레이트 산화효소 및 카탈라아제 활성 회복율은 반응 과정에서 전세포 촉매의 투과가 증가되었기 때문이다.

미생물 세포 형질 전환체의 글리콜레이트 산화효소 활성은 습식 세포 (과잉의 수분을 제거하기 위하여 여과지상에 흡수시킴) 약 5 내지 10 mg을 정밀히 재어 자석 교반봉과 2,6-디클로로페놀-인도페놀(DCIP) 0.12 mM 및 트리스(트리스(히드록시메틸)아미노메탄) 완충액 (pH 8.3) 80 mM인 용액 2.0 ml를 포함하고 있는 3 mL 수정 큐베트 (cuvette)중에 넣어 검정하였다. 큐베트는 고무 격벽으로 마개를 하고 5분 동안 질소 기포에 의해 산소를 제거하였다. 그리고 나서 주사기를 사용하여 1.0 M 글리콜산/1.0 M 트리스(pH 8.3) 40 μL를 큐베트에 첨가하고, 605 nm(ε=22,000)에서 시간의 경과에 따른 흡광도의 변화를 측정하면서 혼합물을 교반하였다. 카탈라아제 활성은 습식 세포 (과잉의 수분을 제거하기 위하여 여과지상에 흡수시킴) 약 2 내지 5 mg을 정밀히 재어 자석 교반봉과 증류수 2.0 mL를 포함하고 있는 3 mL 수정 큐베트 중에 넣은 후 50 mM 인산염 완충액 (pH 7.0) 중의 59 mM 과산화수소 1.0mL를 첨가하고, 240 nm(ε=39.4)에서 시간의 경과에 따른 흡광도의 변화를 측정하여 검정하였다. 다른 배지에서 배양된 (투과된) 한세눌라 폴리모르파 또는 P. pastoris 습식 세포의 글리콜레이트 산화효소와 카탈라아제의 활성은 글리콜레이트 산화효소에 대해서는 20 내지 120 DCIP IU/습식 세포 그람이고, 내인성 카탈라아제에 대해서는 30,000 내지 20,000 IU/습식 세포 그람 범위 내였다.

임의적이지만 종종 반응 용액에 유익한 성분인 플라빈 모노뉴클레오티드(FMN)는 일반적으로 최고 약 2.0 mM, 바람직하기로는 약 0.01 내지 약 0.2 mM의 농도로 사용된다. FMN은 글리콜레이트 산화효소의 생산성을 증가시키는 것으로 여겨지는데, 이는 단위 효소당 글리콜산이 글리옥실산으로 전환하는 양을 의미한다. FMN은 종종 효소 제조 과정 중에 효소에도 첨가되기 때문에, 첨가된 FMN 농도는 효소와 함께 존재하는 모든 FMN을 합한 것으로 이해된다. FMN의 구조 및 그 분석 방법은 케이. 야가이 (K. Yagai)의 문헌 [Methods of Biochemical Analysis 제X권 제 319 내지 355면 (1962년 뉴욕 소재 Interscience 출판사 발행)]에 기재되어 있다.

L-락트산은 시판되고 있다. 본 발명의 반응에 있어서 초기 농도는 0.10 M 내지 2.0 M. 바람직하기로는 0.25 M 내지 1.0 M의 범위이다. 반응에서는 산으로서 또는 그의 상용성 염, 즉 수용성이고 염의 양이온이 요구되는 L-락트산의 피루브산으로의 전환을 간섭하지 않는 염으로서 사용될 수 있다. 적합한 상용성 염의 형성을 위한 양이온 그룹은 시험을 통해 용이하게 결정된다. 이러한 염으로서 대표적인 것은 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 암모늄, 치환된 암모늄, 포스포늄 및 치환된 포스포늄염이 있다. 발효를 통해서 생성되는 L-락트산은 발효액으로 부터 정제 또는 단리할 필요없이, 발효기에서 직접 여과된 용액으로서 기질로 사용될 수 있다.

L-락트산을 피루브산으로 전환하는 반응은 수성 매질 중에서 편리하고 바람직하게 수행된다. 반응 혼합물의 pH는 6 내지 10, 바람직하기로는 7 내지 9로 조정한다. 알칼리 금속 수산화물, 카르보네이트, 이카르보네이트 및 포스페이트를 포함하는(이에 한정되지 않음) 상용성의 간섭하지 않는 염기이면 어느 것이나 첨가하여 이러한 pH 범위내에서 정확한 값으로 조정하여 목적하는 pH를 얻을 수 있다. 완충화되지 않은 반응 혼합물의 pH는 반응이 진행되면서 pH 단위 약 2 까지 감소하므로, 최고 효소 활성을 나타내는 pH 범위 상부 종점 근처, 약 9.0 내지 8.5에서 반응을 시작하여 반응 도중에 pH가 낮아지도록 하는 것이 유용하다. 통상적으로, 완충화되지 않은 반응 혼합물의 최종 pH 범위는 약 6.7 내지 7.5이다. pH 7.5 근처에서 L-락테이트 산화 반응을 위한 최적 효소 활성이 나타나므로, pH 7.5 근처에서 어떤 완충능을 갖고 간섭하지 않는 유기 완충제 또는 무기 완충제를 별도로 첨가하여 임의로 pH를 유지할 수 있다. 적합한 완충제를 사용할 때, 초기 pH는 7.5이다. L-락트산 및 피루브산은 물 중에서 많이 해리되고, pH 7 내지 10 사이에서 전부 아니면 대부분 L-락테이트 및 피루베이트 이온으로 존재하는 것으로 이해된다.

L-락트산을 피루브산으로 전환시키는 산화제인 산소(O₂)는 기체-액체 계면에서 액체를 교반하거나 또는 산소 투과성막을 통하여 기체 상태로 반응에 첨가할 수 있다. 투과된 전세포 촉매를 사용하는 경우에, 산소는 산소 또는 기체를 포함하는 산소를 반응 혼합물 중에 살포(기포화)하여 첨가할 수 있다. 대부분의 조건에서 반응 속도는 적어도 부분적으로는 산소가 수성 매질에 용해할 수 있는 속도에 의해 조절된다. 그러므로, 산소는 공기로서 반응에 첨가할 수 있지만, 비교적 순수한 형태의 산소를 사용할 수도 있다. 산소 압력의 상한값은 알려져 있지 않지만, 최고 50 기압의 압력으로 산소를 사용할 수 있고, 상한값 15 기압이 바람직하다. 교반은 산소 용해(결과적으로 반응)속도를 높게 유지하기 위하여 중요하다. 휘젓는 것과 같은 편리한 형태의 어떠한 교반도 유용하다. 고전단 교반 또는 기포를 형성하는 교반은 가용성 효소(들)의 활성을 감소시킬 수 있으므로 가용성 효소 촉매를 사용할 때에는 피해야 한다.

반응 온도는 반응 속도 및 효소의 안정성에 영향을 주므로 중요한 변수이다. 통상적으로 약 40 ℃ 이하의 반응 온도가 실질적인 촉매 활성의 소실없이 사용될 수 있으나, 바람직한 반응 온도는 약 0 ℃ 내지 약 15 ℃ 범위이다. 바람직한 온도 범위에서 반응 조작을 하면 반응 종결시에 효소의 활성의 회복을 최대화한다. 반응 온도는 수용액이 동결하기 시작할 정도로 낮아서는 안된다. 반응 온도는 자켓(jacket)을 입힌 반응 용기를 사용하고 자켓을 통하여 적합한 온도의 액체를 통과시키는 것과 같은 통상적인 방법에 의하여 조절할 수 있지만, 반응 온도 조절 방법은 이에 제한되는 것은 아니다. 반응 용기는 반응 성분에 불활성인 어떤 물질로도 만들어 질 수 있다.

반응이 종결되었을 때, 가용성 효소 촉매는 여과 또는 원심 분리에 의하여 제거될 수 있고, 임의로 재사용될 수 있다. 또 다른 방법으로, 가용성 효소 촉매는 예를 들면 70 ℃에서 5분간 가열함으로써 변성시켜 침전시킬 수 있고(또는) 가용성 효소의 존재가 방해가 되지 않는다면, 반응 혼합물에 그대로 남겨 둘 수도 있다. 투과된 세포 촉매는 재순환을 위하여 여과 또는 원심 분리하여 반응 혼합물로 부터 분리할 수 있다. 가용성 효소 또는 미생물 세포 촉매를 제거한 후, 용액을 활성탄과 접촉시켜 임의로 플라빈 모노뉴클레오티드(FMN)를 제거할 수 있다. 이어서, 목적하는 피루브산 (즉, 피루브산 및 피루베이트염)을 용액 그 자체로서 회수하거나 또는 결과물인 용액을 농축하고 예를 들면, 감압하에서 물 제거, 동결 건조, 또는 기타 당업계에서 일반적으로 알려진 어떠한 방법을 사용하여 물을 제거하여 피루브산을 회수할 수 있다.

본 발명을 더욱 설명하기 위한 하기 실시예에서, 달리 기재가 없는 한 피루베이트 및 아세테이트의 수율 및 L-락테이트의 회수 수율은 반응 시작시 존재한 L-락트산의 총량을 기준으로 한 백분율이다. 반응 혼합물의 분석은 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 수행하는데, 유기산 분석은 Bio-Rad HPX-87H 컬럼을 사용하였다.

[실시예 1]

pH 8.9에서 85.05 g 피셔-포터 (Fischer-Porter) 유리 에어로솔 반응 용기에 자석교반봉과 L-락트산 리튬 (0.75 M), FMN (0.01 mM), 이소부티르산 (HPLC 내부 표준, 0.100 M), 비신 완충액 (0.788 M), 시금치 글리콜레이트 산화효소 (1.0 IU/mL) 및 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger) 카탈라아제 (1,400 IU/mL)를 포함하고 있는 수용액 10 mL를 넣었다. 반응 용기를 밀봉하고 반응 혼합물을 5℃로 냉각한 후 , 교반하면서 5.8 x 10⁵Pa로 가압하고 대기압이 되도록 배출하는 것을 5회 하여 반응 용기에 산소를 공급하였다. 반응 용기를 다시 산소 5.8 x 10⁵Pa로 가압하고 5 ℃에서 혼합물을 교반하였다. 반응의 진행 정도를 모니터하기 위한 HPLC 분석을 위하여 일정한 간격마다 (용기의 압력 손실없이) 견본 채취구를 통하여 주사기로 액적 (0.10 ml)을 채취하였다. 28.5 시간 후, 피루베이트 및 아세테이트의 HPLC 수율은 각각 47.7% 및 43.6%였고 11.5%의 락테이트가 잔존하였다. 글리콜레이트 산화효소와 카탈라아제의 잔존 활성은 각각 초기값의 40% 및 100%였다.

[실시예 2]

pH 8.1 및 5 ℃에서 L-락트산 (96% L-이성질체, 4% D-이성질체, 0.750 M), KH₂PO₄(0.750 M), FMN (0.01 mM), 이소부티르산 (HPLC 내부 표준, 0.100 M), 시금치 글리콜레이트 산화효소 (1.0 IU/mL) 및 가용성 아스퍼질러스 나이거 카탈라아제 (14,000 IU/mL)를 포함하고 있는 수용액 10 mL를 사용하여 실시예 1에 기재된 방법을 되풀이하였다. 48 시간 후, 피루베이트 및 아세테이트의 HPLC 수율은 각각 79.6% 및 3.8%였고 20.2%의 락테이트가 잔존하였다. 반응 18 시간 후 글리콜레이트 산화효소와 카탈라아제의 잔존 활성은 각각 초기값의 22% 및 100%였다.

[실시예 3]

pH 8.3 및 5 ℃에서 L-락트산 (96% L-이성질체, 4% D-이성질체, 0.500 M), KH₂PO₄(0.50 M), FMN (0.01 mM), 이소부티르산 (HPLC 내부 표준, 0.100 M), 시금치 글리콜레이트 산화효소 (2.0 IU/mL) 및 가용성 아스퍼질러스 나이거 카탈라아제 (14,000 IU/mL)를 포함하고 있는 수용액 10 mL를 사용하여 실시예 1에 기재된 방법을 되풀이하였다. 18 시간 후, 피루베이트 및 아세테이트의 HPLC 수율은 각각 90.5% 및 4.2%였고 6.4%의 락테이트가 잔존하였다. 글리콜레이트 산화효소와 카탈라아제의 잔존 활성은 각각 초기값의 57% 및 100%였다.

[실시예 4]

pH 9.0 (50% NaOH로 조정) 및 15 ℃에서 완충제를 첨가하지 않고 L-락트산 나트륨(0.500M), 이소부티르산 (HPLC 내부 표준, 0.100 M), 시금치 글리콜레이트 산화효소 (2.0 IU/mL) 및 가용성 아스퍼질러스 나이거 카탈라아제 (20,000 IU/mL)를 포함하고 있는 수용액 10 mL를 사용하여 실시예 1에 기재된 방법을 되풀이하였다. 7시간 후, 피루베이트 및 아세테이트의 HPLC 수율은 각각 91.6% 및 0.6%였고 7.1%의 락테이트가 잔존하였다. 글리콜레이트 산화효소와 카탈라아제의 잔존 활성은 각각 초기값의 21% 및 100%였다.

[실시예 5]

pH 9.0 (50% Na0H로 조정) 및 15 ℃에서 완충제를 첨가하지 않고 L-락트산 나트륨(0.500M), 이소부티르산 (HPLC 내부 표준, 0.100 M), 시금치 글리콜레이트 산화효소 (6.0 IU/mL) 및 가용성 아스퍼질러스 나이거 카탈라아제 (10,000 IU/mL)를 포함하고 있는 수용액 10 mL를 사용하여 실시예 1에 기재된 방법을 되풀이하였다. 5 시간 후, 피루베이트 및 아세테이트의 HPLC 수율은 각각 95.3% 및 0.9%였고 4.5%의 락테이트가 잔존하였다. 글리콜레이트 산화효소와 카탈라아제의 잔존 활성은 각각 초기값의 68% 및 100%였다.

[실시예 6]

pH 9.0 (50% NaOH로 조정)에서 85.05 g 피셔-포터 (Fischer-Porter) 유리 에어로솔 반응 용기에 자석교반봉과 L-락트산 나트륨 (0.500 M), KH₂PO₄(0.50 M) 및 이소부티르산 (HPLC 내부 표준, 0.100 M)을 포함하고 있는 수용액 10 mL를 넣고, 용액을 5℃로 냉각하였다. 이어서 0.1% 염화벤잘코늄 ("LONZA BARQUAT" OJ-50)으로 처리하여 투과시킨 피치아 파스토리스 형질 전환체 GS115-MSP10(65.2 IU 글리콜레이트 산화효소 및 101,000 IU 카탈라아제) 0.75 g을 첨가한 후 반응 용기를 밀봉하고 반응 혼합물은 5 ℃까지 냉각시켰다. 교반하면서 5.8 x 10⁵Pa로 가압하고 대기압이 되도록 배출하는 것을 5회 하여 반응 용기에 산소를 공급하고, 이어서 반응 용기를 산소 5.8 x 10⁵pa로 가압하고 5 ℃에서 혼합물을 교반하였다. 반응의 진행 정도를 모니터하기 위한 HPLC 분석을 위하여 일정한 간격마다 (용기의 압력 손실없이) 견본 채취구를 통하여 주사기로 액적(0.10 ml)을 채취하였다. 5 시간 후, 피루베이트 및 아세테이트의 HPLC 수율은 각각 97.6% 및 2.5%였고 0.3%의 락테이트가 잔존하였다. 글리콜레이트 산화효소와 카탈라아제의 투과된 세포의 잔존 활성은 각각 초기값의 104% 및 105%였다.

[실시예 7]

KH₂PO₄(0.50 M) 대신에 비신 완충제 (0.5 M)를 사용하여 실시예 6의 반응을 되풀이 하였다. 5 시간 후, 피루베이트 및 아세테이트의 HPLC 수율은 각각 93.1% 및 6.3%였고 0.4%의 락테이트가 잔존하였다. 글리콜레이트 산화효소와 카탈라아제의 투과된 세포의 잔존 활성은 각각 초기값의 107% 및 122%였다.

[실시예 8]

pH 9.0 (50% Na0H로 조정)에서 L-락트산 나트륨 (0.500 M) 및 이소부티르산 (HPLC 내부 표준, 0.100 M)을 포함하고, 여기에 0.1% 염화벤잘코늄 ("LONZA BARQUAT" OJ-50)으로 처리하여 투과시킨 피치아 파스토리스 형질 전환체 GS115-MSP10 (65.2 IU 글리콜레이트 산화효소 및 101,000 IU 카탈라아제) 0.75 g 을 첨가한 수용액 10 mL을 사용하여 실시예 6에 기재된 방법을 되풀이 하였다. 완충제는 첨가하지 않았다. 5 시간 후, 피루베이트 및 아세테이트의 HPLC 수율은 각각 99.0% 및 0.7%였고 0.4%의 락테이트가 잔존하였다. 글리콜레이트 산화효소와 카탈라아제의 투과된 세포의 잔존 활성은 각각 초기값의 119% 및 113%였다.

[실시예 9]

pH 9.0 (50% Na0H로 조정)에서 L-락트산 나트륨 (0.500 M) 및 이소부티르산 (HPLC 내부 표준, 0.100 M)을 포함하고, 여기서 0.1% 염화벤잘코늄 ("LONZA BARQUAT" OJ-50)으로 처리하여 투과시킨 피치아 파스토리스 형질 전환체 GS115-MSP10 (22.6 IU 글리콜레이트 산화효소 및 50,000 IU 카탈라아제) 0.35 g 을 첨가한 수용액 10 mL을 사용하여 실시예 6에 기재된 방법을 되풀이 하였다. 완충제는 첨가하지 않았다. 8 시간 후, 피루베이트 및 아세테이트의 HPLC 수율은 각각 97.4% 및 2.3%였고 0.4%의 락테이트가 잔존하였다. 글리콜레이트 산화효소와 카탈라아제의 투과된 세포의 잔존 활성은 각각 초기값의 123% 및 150%였다.

[실시예 10]

pH 9.0 (50% Na0H로 조정)에서 L-락트산 나트륨 (0.500 M) 및 이소부티르산 (HPLC 내부 표준, 0.100 M)을 포함하고, 여기서 0.1% 염화벤잘코늄 ("LONZA BARQUAT" OJ-50)으로 처리하여 투과시킨 피치아 파스토리스 형질 전환체 GS115-MSP10 (11.3 IU 글리콜레이트 산화효소 및 25,000 IU 카탈라아제) 0.18 g 을 첨가한 수용액 10 mL을 사용하여 실시예 6에 기재된 방법을 되풀이 하였다. 완충제는 첨가하지 않았다. 10 시간 후, 피루베이트 및 아세테이트의 HPLC 수율은 각각 92.9% 및 5.0%였고 3.3%의 락테이트가 잔존하였다. 글리콜레이트 산화효소와 카탈라아제의 투과된 세포의 잔존 활성은 각각 초기값의 121% 및 228%였다.

[실시예 11]

pH 9.0 (50% Na0H로 조정)에서 L-락트산 나트륨 (1.00 M) 및 이소부티르산 (HPLC 내부 표준, 0.100 M)을 포함하고, 여기에 0.1% 염화벤잘코늄 ("LONZA BARQUAT" OJ-50)으로 처리하여 투과시킨 피치아 파스토리스 형질 전환체 GS115-MSP10 (45.9 IU 글리콜레이트 산화효소 및 100,000 IU 카탈라아제) 0.71 g 을 첨가한 수용액 10 mL을 사용하여 실시예 6에 기재된 방법을 되풀이 하였다. 완충제는 첨가하지 않았다. 8 시간 후, 피루베이트 및 아세테이트의 HPLC 수율은 각각 89.1% 및 8.4%였고 1.3%의 락테이트가 잔존하였다. 글리콜레이트 산화효소와 카탈라아제의 투과된 세포의 잔존 활성은 각각 초기값의 124% 및 145%였다.

[실시예 12]

pH 9.0 (50% Na0H로 조정)에서 L-락트산 나트륨 (0.50 M) 및 이소부티르산 (HPLC 내부 표준, 0.100 M)을 포함하고, 여기서 0.1% 염화벤잘코늄 ("LONZA BARQUAT" OJ-50)으로 처리하여 투과시킨 피치아 파스토리스 형질 전환체 GS115-MSP10 (62.7 IU 글리콜레이트 산화효소 및 100,000 IU 카탈라아제) 0.66 g 을 첨가한 수용액 10 mL을 사용하여 실시예 6에 기재된 방법을 되풀이 하였다. 완충제는 첨가하지 않았다. 반응 온도는 15℃ 이고 산소압은 5.8 x10⁵Pa (70 psig)였다. 3 시간 후, 피루베이트 및 아세테이트의 HPLC 수율은 각각 98.2% 및 1.2%였고 0.6%의 락테이트가 잔존하였다. 글리콜레이트 산화효소와 카탈라아제의 투과된 세포의 잔존 활성은 각각 초기값의 124% 및 130%였다.

[실시예 13]

pH 9.0 (50% Na0H로 조정)에서 L-락트산 나트륨 (0.50 M) 및 이소부티르산 (HPLC 내부 표준, 0.100 M)을 포함하고, 여기에 0.1% 염화벤잘코늄 ("LONZA BARQUAT" OJ-50)으로 처리하여 투과시킨 한세눌라 폴리모르파 형질 전환체 G01(64.7 IU 글리콜레이트 산화효소 및 50,000 IU 카탈라아제) 1.04 g 을 첨가한 수용액 10 mL을 사용하여 실시예 12에 기재된 방법을 되풀이 하였다. 완충제는 첨가하지 않았다. 반응 온도는 15℃ 이고 산소압은 5.8 x10⁵Pa (70 psig)였다. 2 시간 후, 피루베이트 및 아세테이트의 HPLC 수율은 각각 97.0% 및 2.5%였고 0.4%의 락테이트가 잔존하였다. 글리콜레이트 산화효소와 카탈라아제의 투과된 세포의 잔존 활성은 각각 초기값의 99% 및 155%였다.

[실시예 14]

5℃ 및 산소압은 9.3 x10⁵Pa (120 psig)에서 실시예 13에 기재된 반응을 되풀이 하였다. 4 시간 후, 피루베이트 및 아세테이트의 HPLC 수율은 각각 93.1% 및 3.7%였고 2.2%의 락테이트가 잔존하였다. 글리콜레이트 산화효소와 카탈라아제의 투과된 세포의 잔존 활성은 각각 초기값의 66% 및 180%였다.

[실시예 15]

30℃ 및 산소압 5.8 x10⁵Pa (70 psig)에서 실시예 13에 기재된 반응을 되풀이 하였다. 3 시간 후, 피루베이트 및 아세테이트의 HPLC 수율은 각각 89.9% 및 6.5%였고 0.6%의 락테이트가 잔존하였다. 글리콜레이트 산화효소와 카탈라아제의 투과된 세포의 잔존 활성은 각각 초기값의 45% 및 140%였다.

[실시예 16]

디스퍼시맥스 임펠러 (Dispersimax Impeller, 오토클레이브 엔지니어)를 장착한 300 mL EZE-밀봉 교반 오토클레이브 반응기에 L-락트산 나트륨 (5.50 g, 0.50 M)을 포함하고 있는 용액 100 mL를 채웠다. 반응기에 0.1% 염화벤잘코늄("LONZA BARQUAT" 0J-50)으로 처리하여 투과시킨 피치아 파스토리스 형질 전환체 균주 GS115-MSP10 (670 IU 글리콜레이트 산화효소 및 1,177,000 IU 카탈라아제) 6.70 g을 첨가하고, 50% Na0H를 사용하여 혼합물의 pH를 9.0으로 조정하여 5℃ 로 냉각하였다. 반응기에 산소를 퍼지한 후 750 rpm에서 혼합물을 교반하여 5℃ 및 산소압 3.8 x 10⁵Pa 하에서 터어빈 임펠러의 작용에 의하여 혼합물에 산소 기포를 통과시켰다. 일정 시간 간격으로 반응 혼합물의 0.40 mL 액적을 취하여, 밀리포어 울트라프리 (Milipore Ultrafree)-MC 10,000 NMWL 필터 유니트를 사용하여 여과하고 내부 표준으로서 샘플에 첨가한 0.10 M 이소부티르산을 사용하여 HPLC로 여액을 분석하는 방법으로 반응을 모니터하였다. 3 시간 후, 피루베이트 및 아세테이트의 HPLC 수율은 각각 99.2% 및 1.4%였고 0.6%의 락테이트가 잔존하였다. 글리콜레이트 산화효소와 카탈라아제의 투과된 세포의 회복 활성은 각각 초기값의 107% 및 106%였다.

반응 혼합물을 원심 분리하여 투과된 세포 촉매를 제거하고 얻은 상등액은 0.2 mm 나일론 필터를 통하여 여과하였다. 여액의 pH는 1.0 N HCl을 사용하여 4.6으로 맞추고 이어서 용액을 동결하고 동결조건에 의하여 물을 제거하여 피루브산 나트륨 5.20 g을 제조하였다 (단리된 수율 96%, HPLC 분석에 의하여 확인된 피루브산 나트륨 98%).

[실시예 17]

락트산 암모늄 109.9 g/L (L-락테이트 97.8%, D-락테이트 2.2%), 아세테이트 0.8 g/L 및 말토오스 2.8 g/L를 포함하고 있는 발효액을 원심 분리하여 입자를 제거하고, 이어서 0.45 mm 필터를 통하여 여과하였다. 얻은 용액에서의 락트산 암모늄의 농도는 1.10 M(118.6 g/L, HPLC 분석에 의하여 확인)였다. 디스퍼시맥스 임펠러 (Dispersimax Impeller, 오토클레이브 엔지니어)를 장착한 300 mL EZE-밀봉 교반 오토클레이브 반응기에 1.10 M의 여과된 발효액 45 mL를 넣고, 이어서 증류수 55 mL를 첨가하여 0.50M 락트산 나트륨을 함유하고 있는 수용액 100 mL을 제조하였다. 반응기에 0.1% 염화벤잘코늄("LONZA BARQUAT" 0J-50)으로 처리하여 투과시킨 피치아 파스토리스 형질 전환체 균주 GS115-MSP10 재순환물 (666 IU 글리콜레이트 산화효소 및 1,107,000 IU 카탈라아제) 6.70 g을 첨가하고, 50% Na0H를 사용하여 혼합물의 pH를 7.5으로 조정하여 5℃ 로 냉각하였다. 반응기에 산소를 퍼지한 후 750 rpm에서 혼합물을 교반하여 5℃ 및 산소압 3.8 x 10⁵Pa 하에서 터어빈 임펠러의 작용에 의하여 혼합물에 산소 기포를 통과시켰다. 일정 시간 간격으로 반응 혼합물의 0.40 mL 액적을 취하여, 밀리포어 울트라프리-MC 10,000 NMWL 필터 유니트를 사용하여 여과하고 내부 표준으로서 샘플에 첨가한 0.10 M 이소부티르산을 사용하여 HPLC로 여액을 분석하는 방법으로 반응을 모니터하였다. 3.0 시간 후, 피루베이트 및 아세테이트의 HPLC 수율은 각각 94.1% (L-락테이트를 기준으로 하여 96.2%) 및 2.8%였고 2.5%의 락테이트가 잔존하였다. 글리콜레이트 산화효소와 카탈라아제의 투과된 세포의 회복 활성은 각각 초기값의 101% 및 56%였다.

이상과 같이 본 발명을 어느 정도 구체적으로 기술하고 예시하였지만, 하기 특허 청구 범위는 이에 한정되지 않고 특허 청구 범위에 기재된 각 구성 요소 및 그의 균등물에 상응하는 권리 범위를 갖는 것으로 이해해야 한다.

Claims

고수율로 L-락트산을 피루브산으로 전환시키기에 충분한 시간 동안 수용액 중에서, 효소 촉매인 글리콜레이트 산화효소 및 효소 촉매인 카탈라아제를 포함하고 있는 투과된 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)의 형질 전환체로 이루어진 군에서 선택된 전세포 촉매 존재하에서 초기 농도가 0.1 내지 2.0 M인 L-락트산과 산소를 반응시킨 다음 이어서 피루브산을 회수하는 단계를 포함하는 피루브산의 제조 방법.
제1항에 있어서, 추가의 완충제를 첨가하지 않고 반응 도중에 pH를 조정하지 않는 방법.
제1항에 있어서, 반응은 pH 6 내지 10에서 수행되며, 글리콜레이트 산화효소 활성이 0.01 내지 1,000 IU/ml이고 카탈라아제 활성이 50 내지 50,000 IU/ml인 방법.
제2항에 있어서, 글리콜레이트 산화효소 활성이 0.1 내지 10 IU/ml이고 카탈라아제 활성이 2,000 내지 15,000 IU/ml이며 글리콜레이트 산화효소 활성에 대한 카탈라아제의 활성의 IU/ml비는 적어도 250:1인 방법.