DE69634074T2

DE69634074T2 - Thiole zur Förderung des Wachstums von Hömatopoietischen Vorläuferzellen

Info

Publication number: DE69634074T2
Application number: DE69634074T
Authority: DE
Inventors: L. Robert CAPIZZI; F. Alan LIST
Original assignee: Arizona Board of Regents of University of Arizona; MedImmune LLC; University of Arizona
Current assignee: Arizona Board of Regents of University of Arizona; MedImmune LLC; University of Arizona
Priority date: 1995-02-17
Filing date: 1996-02-16
Publication date: 2006-01-19
Anticipated expiration: 2016-02-17
Also published as: JP4057648B2; ES2235183T3; AU694847B2; EP0809437A4; EP0809437B1; PT809437E; JPH11504000A; MX9706255A; DE69634074D1; CA2213322A1; EP0809437A1; WO1996025045A1; US5846958A; ATE285177T1; US5906984A; CA2213322C; AU4986996A

Description

1. EINFÜHRUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen zur Stimulierung des Wachstums von hämatopoietischen Vorläuferzellen. Insbesondere betrifft sie die Verwendung von Thiolen und verwandten Verbindungen zur Herstellung eines Medikaments zur Stimulation des Wachstums von hämatopoietischen Vorläuferzellen in vitro und in vivo. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung dieser Verbindungen zur Behandlung von Zuständen des Knochenmarksversagens und von Immunschwäche-Erkrankungen, zu denen, ohne darauf beschränkt zu sein, myelodysplastische Syndrome und die erworbene Immunschwäche (AIDS) gehören.
2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Eine Vielzahl von Krankheiten und krankhaften Störungen, zu denen Malignität, eine manifeste Malignität und Immunschwäche, gehört, sind mit einer Funktionsstörung des lympho-hämatopoietischen Systems verbunden. Einige dieser Krankheitszustände könnten verbessert und/oder geheilt werden, indem man das lympho-hämatopoietische System mit Vorläuferzellen neu besiedelt, die dann, wenn ihre Differenzierung ausgelöst wird, den Mangelzustand des Patienten überwinden würden. Die Fähigkeit, die Hämatopoiese auszulösen und zu steuern, ist daher von großer Bedeutung (McCune et al., 1988, Science 241: 1632).
Bei Menschen ist eine Form einer erfolgreichen Therapie die Knochenmarkstransplantation. Außer einer Anwendung der Knochenmarkstransplantation bei der Behandlung von Leukämie wird diese heute häufig bei anderen Tumorbildungen verwendet (Epstein und Slease, 1985, Surg. Ann. 17: 125). Dieser Therapietyp ist jedoch zweifach schmerzhaft (für den Spender und den Empfänger), und zwar aufgrund der Anwendung invasiver Prozeduren, und kann schwere und sogar tödliche Komplikationen beim Empfänger auslösen, insbesondere mit Allogentrans plantaten und damit verknüpften Transplantat-Wirts-Erkrankungs-Folgen (GVHD; "Graft Versus Host Disease"). Das Risiko von GVHD beschränkt die Anwendung einer Knochenmarkstransplantation auf Patienten mit ansonsten tödlichen Erkrankungen. Ein alternativer Ansatz für eine Therapie von hämatopoietischen Störungen ist die Verwendung von Wachstumsfaktoren oder Cytokinen zur Stimulierung der Blutzellenentwicklung bei einem Empfänger (Dexter, 1987, J. Cell Sci. 88: 1; Moore, 1991, Annu. Rev. Immunol. 9: 159).
Es wurde gezeigt, daß der Prozeß der Bildung von Blutzellen, bei dem eine geringe Anzahl von selbsterneuernden Stammzellen abstammungsspezifische Vorläuferzellen erzeugen, die anschließend einer Vermehrung und Differenzierung unter Bildung der reifen zirkulierenden Blutzellen unterliegen, wenigstens teilweise durch spezifische Hormone gesteuert werden. Diese Hormone sind allgemein bekannt als hämatopoietische Wachstumsfaktoren (Metcalf, 1985, Science 229: 16; Dexter, 1987, J. Cell Sci. 88: 1; Golde and Gasson, 1988, Scientific American, July: 62; Tabbara and Robinson, 1991, Anti-Cancer Res. 11: 81; Ogawa, 1989, Environ. Health Presp. 80: 199; Dexter, 1989, Br. Med. Bull. 45: 337). Mit dem Aufkommen der rekombinanten DNA-Technologie wurde eine Anzahl dieser Moleküle kloniert und in rekombinanter Form exprimiert (Souza et al., 1986, Science 232: 61; Gough et al., 1984, Nature 309: 763; Yokota et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 1070; Kawasaki et al., 1985, Science 230: 291).
Diese Wachstumsfaktoren wurden bezüglich ihrer Struktur, Biologie und selbst ihres therapeutischen Potentials studiert. Einige der am besten charakterisierten Faktoren schließen ein Erythropoietin (EPO), Stammzellen-Faktor (SCF), Granulocyten-Makrophagen Koloniestimulierender Faktor (GM-CSF), Makrophagen Koloniestimulierender Faktor (M-CSF), Granulocyten Koloniestimulierender Faktor (G-CSF) sowie die Interleukine. Diese Faktoren wirken auf unterschiedliche Zelltypen in unterschiedlichen Zuständen während der Blutzellentwicklung, und ihre potentiellen Verwendungen in der Medizin schließen ein eine Verminderung der Notwendigkeit von Bluttransfusionen, eine Beschleunigung der Erholung des Knochenmarks im Anschluß an eine Transplantation und eine cytotoxische Krebstherapie, die Korrektur von immunsuppressiven krankhaften Störungen, die Wundheilung und die Aktivierung der Immunreaktion (Golde and Gasson, 1988, Scientific American, July: 62). Außer der Auslösung einer Vermehrung und Differenzierung von hämatopoietischen Vorläuferzellen konnte auch gezeigt werden, daß derartige Cytokine eine Anzahl von Funktionen von reifen Blutzellen aktivieren (Stanley et al., 1976, J. Exp. Med. 143: 631; Schrader et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 323; Moore et al., 1980, J. Immunol. 125: 1302; Kurland et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76: 2326; Handman and Burgess, 1979, J. Immunol. 122: 1134; Vadas et al., 1983, Blood 61: 1232; Vadas et al., 1983, J. Immunol. 130: 795), einschließlich einer Beeinflussung der Wanderung von reifen hämatopoietischen Zellen (Weibart et al., 1986, J. Immunol. 137: 3584).
Obwohl gezeigt wurde, daß diese Wachstumsfaktoren proliferative und/oder differenzierende Wirkungen auf verschiedene hämatopoietische Zell-Familien haben, haben sie sich in zahlreichen klinischen Krankheits-Anwendungsfällen als nicht wirksam erwiesen. Beispielsweise umfassen myelodysplastische Syndrome (MDS) eine verschiedengestaltige Gruppe von hämatopoietischen Stammzell-Störungen, die durch eine ineffiziente Blutzellproduktion, progressive Cytopenie und ein unterschiedliches Risiko einer fortschreitenden Entwicklung zu einer akuten Leukämie charakterisiert sind (List et al., 1990, J. Clin. Oncol. 8: 1424). Klinische Versuche mit MDS-Patienten, die mit rekombinantem humanem Granulocyten-Makrophagen Koloniestimulisierendem Faktor und rekombinantem humanem Granulocyten Koloniestimulisierendem Faktor behandelt wurden, haben gezeigt, daß obwohl diese Cytokine die Granulocytopoiese in behandelten Patienten wieder herstellen können, die Wirksamkeit auf die Granulocyten/Monocyten-Familie beschränkt ist, bei nur geringer oder keiner Verbes serung der Hämoglobin- und/oder Blutplättchen-Zahlen (Schuster et al., 1990, Blood 76 (Suppl. 1): 318a). Wenn derartige Patienten in jüngerer Zeit mit rekombinantem humanem Erythropoietin behandelt wurden, wurde eine anhaltende Verbesserung beim Hämoglobin und/oder eine Verminderung des Transfusionsbedarfs nur bei weniger als 25% der Patienten erreicht (Besa et al., 1990, 76 (Suppl. 1): 133a; Hellstrom et al., 1990, 76 (Suppl. 1): 279a; Bowen et al., 1991, Br. J. Haematol. 77: 419). Es bleibt daher ein Bedarf nach einem wirksamen Mittel zur Behandlung von Zuständen des Knochenmarksversagens wie beispielsweise MDS.
Außerdem sind Cytokine nur sowohl schwierig als auch teuer herstellbar. Da diese Faktoren Proteine sind, ist ihre Herstellung mittels einer direkten chemischen Synthese nicht machbar. Außerdem machen ihre niedrigen endogenen Expressionsgrade und die begrenzte Wachstumsgeschwindigkeit von menschlichen Zellen die natürliche Herstellung dieser Proteine extrem teuer. Ihre Herstellung mittels rekombinanter Verfahren beinhaltet auch hohe wirtschaftliche Kosten und technische Schwierigkeiten. Somit stellt keines der bisher beschriebenen Moleküle sowohl einen biologisch aktiven und einfach synthetisierten Stimulator für hämatopoietische Vorläuferzellen für eine in vivo-Verabreichung dar.
3. KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Thiolen und verwandten Verbindungen bei der Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung von hämatopoietischen Vorläuferzellen. Derartige Thiolverbindungen werden unter Anwendung der Lehren des US-Patents Nr. 3 892 824 einfach synthetisiert. Die Erfindung beruht teilweise auf der Entdeckung der Anmelder einer vorher unbekannten Wirksamkeit einer Thiolverbindung, Amifostin, bei der Stimulierung von hämatopoietischen Vorläuferzellen. Die hämatopoietischen Vorläuferzellen können dadurch stimuliert werden, daß man die Zellen kultiviert und sie mit den Thiolverbindungen in vitro behandelt. Alternativ können die Medikamente direkt einem Patienten verabreicht werden, der eine höhere Zahl von Blutzellen benötigt. Somit kann die Erfindung zur Behandlung von Krankheitszuständen eingesetzt werden, die eine Vermehrung von hämatopoietischen Vorläuferzellen benötigen, zu denen Zustände des Knochenmarksversagens wie beispielsweise MDS und eine Immunschwäche gehören.
4. BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 Knochenmarks-Koloniebildungs-Assay. Knochenmarkszellen, die aus vier Patienten mit MDS isoliert worden waren, wurden mit Amifostin behandelt, gewaschen und in Methylcellulose als Kultur angelegt. Kontrollproben blieben mit dieser Verbindung unbehandelt. Jede Probe wurde dann auf CFU-GEMM, BFU-E und CFU-GM-Koloniebildung untersucht.
5. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beruht teilweise auf der Entdeckung der Anmelder, daß Amifostin hämatopoietische Vorläuferzellen in vitro stimuliert. Auf dieser Basis umfaßt die Erfindung die Verwendung von Thiolen und Polyaminen und ihrer funktionellen Derivate oder Analogen bei der Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Krankheitszuständen, die ein Wachstum hämatopoietischer Zellen benötigen.
5.1. VERBINDUNGEN
Die Stimulierung von hämatopoietischen Vorläuferzellen gemäß der Erfindung kann durch die Behandlung mit Thiolverbindungen erreicht werden, die bei minimaler Toxizität für eine Verwendung bei Menschen geeignet sind. Insbesondere betrifft die Erfindung Aminothiole mit der Formel RNH(C_nH_2n)NH(C_nH_2n)SPO₃H₂, worin R Wasserstoff, eine Aryl-, eine Acyl- oder eine Alkyl-Gruppe ist, die von 1 bis 7 Kohlenstoffatome enthält, und jedes n einen Wert von 2 bis 6 aufweist; oder Hydrate oder pharmazeutisch annehmbare Salze davon, wie beispielsweise Halogensalze und/oder Alkalimetallsalze. Derartige Verbindungen und ihre Synthese sind in Einzelheiten beschrieben in Piper and Johnston, Patent der Vereinigten Staaten Nr. 3 892 824. Derartige Verbindungen beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Aminofostin, Glutathion, N-Acetylcystein, Natriumthiosulfat und dergleichen, und sie können nach Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann gut bekannt sind, siehe z.B. F. Cortese, "Organic Syntheses", Coll. bol. II, A. H. Blatt, Ed., John Wiley and Sons, Inc, New York, N.Y., 1943, Seiten 91–93; S. Akerfeldt, Acta Chem Scand., 1960, 14: 1980; und J. R. Piper et al., Chem. Ind. (London), 1966, Seite 2010.
Die Herstellung der bevorzugten Verbindung 2-5-(3-Aminopropylamino)ethyl-dihydrogenphosphoro-thioat-monohydrat H₂N(CH₂)₃NHCH₂CH₂SPO₃H₂·H₂O (Amifostin oder WR 2721) wurde im Einzelnen auch in Piper und Johnston, Patent der Vereinigten Staaten Nr. 3 892 824 beschrieben. Die dephosphorylierte Form der Verbindung ist ihr aktiver Metabolit (WR 1065) in Form ihres freien Thiols. Zusätzlich wurde auch eine bei Raumtemperatur stabile Trihydratform synthetisiert.
Für die orale Verabreichung ist die bevorzugte Verbindung WR 151327 (chemische Nomenklatur: 1-Propanthiol-3-[[3-(methylamino)propyl]amino]-dihydrogenphosphothiorat), das wie folgt dargestellt wird: CH₃NH(CH₂)₃NH(CH₂)₃SPO₃H₂.
WR 151327 ist ein Thiophosphat-Reduktionsmittel mit einer Kapazität zum Einfangen freier Sauerstoffradikale (Grdina et al., 1991, supra), das seine Anti-HIV-Aktivität ausübt, ohne Zellen zu töten oder deren Wachstum zu inhibieren. WR 151326 ist das dephosphorylierte freie Thiol.
5.2. VERWENDUNGEN DER VERBINDUNGEN
Die Medikamente können direkt Patienten zur Behandlung irgendwelcher Krankheitszustände verabreicht werden, bei denen verminderte Zahlen von zirkulierenden Blutzellen auftreten, und zu denen, ohne darauf beschränkt zu sein, gehören Anämie, Leukopenie, Thrombocytopenie individuell oder als Pancytopenie und unterschiedliche Formen von Immunschwächezuständen. Alternativ können diese Medikamente dazu verwendet werden, die Zahlen von hämatopoietischen Vorläuferzellen in Kultur zu erhöhen, und die Zellen werden dann intravenös per Infusion einem Patienten verabreicht. Für die in vitro- oder ex vivo-Inkubation von Knochenmark oder Stammzellen des periphären Bluts mit Thiolen liegt eine bevorzugte Dosis zwischen 0,1 μM bis 5 mM. Die Verwendungen der Erfindung können zur Behandlung irgendwelcher Krankheitserscheinungen nützlich sein, die mit verminderten Zahlen von Blutzellen verknüpft sind, die, ohne darauf beschränkt zu sein, einschließen erworbene oder ererbte Zustände eines Knochenmarksversagens und Immunschwächesyndrome wie Fanconi-Anämie, ererbte Neutropenie und MDS und eine cytotoxische Krebstherapie.
Die in vivo-Verabreichung der oben in 5.1. beschriebenen Verbindungen kann auf die folgende Weise erfolgen. Gruppen von Patienten mit Knochenmarksversagen können zuerst eine intravenöse Infusion von abgestuften Dosen der Verbindungen bei 100 mg/m², 200 mg/m², 400 mg/m² oder 740 mg/m² erhalten, um die maximale tolerierte Dosis zu bestimmen. Danach können die Patienten mit der vorher bestimmten Dosis dreimal pro Woche über drei Wochen behandelt werden. Im Anschluß an eine Ruheperiode von vierzehn Tagen können die Patienten im Hinblick auf ihre hämatologische Reaktion mittels Zellzählung und Koloniebildung bewertet werden. Auf die Behandlung ansprechende Patienten können mit der Behandlung fortfahren, bis die Zahlen der peripheren Zellen auf normales Niveau zurückkehren.
5.3. PHARMAZEUTISCHE FORMULIERUNGEN UND VERABREICHUNGSWEGE
Die identifizierten Verbindungen können einem menschlichen Patienten als solche oder in pharmazeutischen Verbindungen verabreicht werden, in denen sie mit geeigneten Trägern oder einem oder mehreren Hilfsstoff(en) vermischt sind, in Dosen, um eine Vielzahl von Krankheitserscheinungen zu behandeln oder zu verbessern, zu denen, ohne darauf beschränkt zu sein, MDS gehört. Eine therapeutisch wirksame Menge bezieht sich außerdem auf die Menge der Verbindung, die ausreicht, zu einer Erhöhung der Zahlen der Blutzellen zu führen, und zwar verglichen mit dem Zustand vor der Behandlung. Techniken zur Formulierung und Verabreichung der Verbindungen der vorliegenden Anmeldung können gefunden werden in "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, neueste Ausgabe.
5.3.1. VERABREICHUNGSWEGE
Geeignete Verabreichungswege können beispielsweise beinhalten eine orale, rektale, transmucosale, transcutane oder intestinale Verabreichung; eine parenterale Zufuhr, einschließlich intramuskulärer, subkutaner, intramedulärer Injektionen, sowie intrathecale, direkte intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale, intranasale oder intraoculare Injektionen.
Alternativ kann man die Verbindung auf eher lokale als systemische Weise verabreichen, beispielsweise auf dem Wege einer Injektion der Verbindung direkt in das Knochenmark, häufig in einer Depotformulierung oder einer Formulierung mit verzögerter Freisetzung.
Außerdem kann man die Verbindung in einem zielgerichteten Wirkstoff-Zufuhrsystem verabreichen, beispielsweise in einem Liposom und/oder konjugiert mit einem zellspezifischen Antikörper. Die Liposomen und zellspezifischen Antikörper werden auf Knochenmarkszellen ausgerichtet und von diesem selektiv aufgenommen.
5.3.2. ZUSAMMENSETZUNG/FORMULIERUNG
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auf irgendeine Weise hergestellt werden, die als solche bekannt ist, z.B. durch herkömmliches Mischen, Auflösen, Granulieren, durch Dragee-Herstellung, durch Pulverisieren, Emulgieren, Verkapseln, Einschließen oder durch Gefriertrocknen.
Pharmazeutischen Zusammensetzungen für eine Verwendung gemäß der vorliegende Erfindung können somit auf herkömmliche Weise formuliert werden, wobei man einen oder mehrere physiologisch annehmbare Träger verwendet, die Vehikel und Hilfsstoffe umfassen, die die Verarbeitung der aktiven Verbindungen in Präparate erleichtern, die pharmazeutisch verwendet werden können. Eine ordnungsgemäße Formulierung hängt ab von dem gewählten Verabreichungsweg.
Für die Injektion kann die erfindungsgemäße Verbindung in geeigneten wäßrigen Lösungen formuliert werden, wie beispielsweise in physiologisch kompatiblen Puffern wie Hanks's-Lösung, Ringer s-Lösung oder in einem physiologischen Kochsalzpuffer. Für eine transmucosale und transcutane Verabreichung werden für die zu durchdringende Barriere geeignete Penetrationsmittel in der Formulierung verwendet. Derartige Penetrationsmittel sind dem Fachmann allgemein bekannt.
Für eine orale Verabreichung können die Verbindungen auf einfache Weise dadurch formuliert werden, daß man die aktiven Verbindungen mit dem Fachmann gut bekannten pharmazeutisch annehmbaren Trägern kombiniert. Derartige Träger machen es möglich, die erfindungsgemäßen Verbindungen als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Sirupe, Aufschlämmungen, Suspensionen und dergleichen für eine orale Aufnahme durch den zu behandelnden Patienten zu formulieren. Pharmazeutische Präparate für eine orale Anwendung können durch Mischen mit einem festen Vehikel, gegebenenfalls Vermahlen einer erhaltenen Mischung und die Verarbeitung der Mischung zu Granulaten, gewünschtenfalls nach Zugabe geeigneter Hilfsstoffe, verarbeitet werden, um Tabletten oder Dragee-Kerne zu erhalten. Geeignete Vehikel sind insbesondere Füllstoffe wie Zucker, einschließlich Lactose, Saccharose, Mannit oder Sorbit; Cellulose-Präparate wie beispielsweise Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Tragantgummi, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon (PVP). Gewünschtenfalls können Zerfallshilfsmittel zugesetzt werden, wie beispielsweise das vernetzte Polyvinylpyrrolidon, Agar oder Alginsäure oder ein Salz davon wie beispielsweise Natriumalginat.
Drageekerne werden mit geeigneten Überzügen versehen. Für diesen Zweck können konzentrierte Zuckerlösungen verwendet werden, die gegebenenfalls Gummi arabicum, Talk, Polyvinylpyrrolidon, Carbopolgel, Polyethylenglycol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösemittel oder Lösemittelmischungen enthalten. Farbstoffe oder Pigmente können den Tabletten oder Drageeüberzügen zur Identifizierung oder zur Charakterisierung unterschiedlicher Kombinationen von Wirkstoffdosen zugesetzt werden.
Pharmazeutische Präparate, die oral verwendet werden können, schließen Steckkapseln aus Gelatine ein, sowie weiche verschlossene Kapseln aus Gelatine und einem Weichmacher wie beispielsweise Glycerin oder Sorbit. Die Steckkapseln können die aktiven Wirkstoffe in Mischungen mit Füllstoffen wie Lactose, Bindemitteln wie Stärken und/oder Gleitmitteln wie Talk oder Magnesiumstearat sowie gegebenenfalls Stabilisatoren enthalten. In weichen Kapseln können die aktiven Verbindungen in geeigneten Flüssigkeiten gelöst oder suspendiert sein, wie beispielsweise in fetten Ölen, flüssigem Paraffin oder flüssigen Polyethylenglykolen. Zusätzlich können Stabilisatoren zugesetzt werden. Alle Formulierungen für die orale Verabreichung sollten in Dosierungen vorliegen, die für eine derartige Verabreichung geeignet sind.
Für eine bukkale Verabreichung können die Zusammensetzungen die Form von Tabletten oder Pastillen annehmen, die auf herkömmliche Weise formuliert werden.
Für eine Verabreichung durch Inhalieren können die Verbindungen für die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung in Form einer Aerosolspray-Darreichung aus Überdruckverpackungen oder einem Vernebler zugeführt werden, unter Verwendung eines geeigneten Treibmittels, z.B. von Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid und einem anderen geeigneten Gas. Im Falle eines Druckaerosols kann die Dosierungseinheit dadurch bestimmt werden, daß man ein Ventil zur Verabreichung einer abgemessenen Menge vorsieht. Kapseln und Patronen aus z.B. Gelatine zur Verwendung in einem Inhalator oder Pulverzerstäuber können formuliert werden, die eine Pulvermischung der Verbindung und einer geeigneten Pulverbasis wie beispielsweise Lactose oder Stärke enthalten. Die Verbindungen können für eine parenterale Verabreichung durch Injektion formuliert werden, z.B. durch eine Bolusinjektion oder eine kontinuierliche Infusion. Formulierungen für eine Injektion können in einer Einheitsdosisform dargeboten werden, z.B. in Ampullen oder in Multidosis-Behältern, mit einem zugesetzten Konservierungsmittel. Die Zusammensetzungen können Formen wie beispielsweise Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wäßrigen Trägern aufweisen, und sie können Formulierungshilfsmittel wie Suspendier-, Stabilisier- und/oder Dispergiermittel enthalten.
Pharmazeutische Formulierungen für eine parenterale Verabreichung schließen ein wäßrige Lösungen der aktiven Verbindungen in wasserlöslicher Form. Zusätzlich können Suspensionen der aktiven Verbindungen als geeignete ölige Injektionssuspensionen hergestellt werden. Geeignete lipophile Lösemittel oder Träger schließen ein fette Öle wie Sesamöl oder synthetische Fettsäureester, wie beispielsweise Ethyloleat oder Triglyceride oder Liposomen. Wäßrige Injektionssuspensionen können Substanzen enthalten, die die Viskosität der Suspension erhöhen, wie beispielsweise Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbit oder Dextran. Gegebenenfalls kann die Suspension auch geeignete Stabilisatoren oder Mittel enthalten, die die Löslichkeit der Verbindungen erhöhen, um die Herstellung von hochkonzentrierten Lösungen zu ermöglichen.
Alternativ kann die Wirksubstanz in Pulverform für eine Zubereitung mit einem geeigneten Träger, z.B. sterilem pyrogenfreiem Wasser, vor der Verwendung, vorliegen.
Die Verbindungen können auch in rektalen Zusammensetzungen formuliert werden, wie beispielsweise als Suppositorien oder Retentions-Klistiere, z.B. solche, die herkömmliche Suppositorienbasen wie beispielsweise Kakaobutter oder andere Glyceride enthalten.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Formulierungen können die Verbindungen auch als Depot-Präparat formuliert werden. Derartige langwirkende Formulierungen können durch Implantation (beispielsweise subkutan oder intramuskulär) oder durch intramuskulare Injektion verabreicht werden. So können die Verbindungen beispielsweise mit geeigneten Polymeren oder hydrophoben Materialien (beispielsweise als Emulsion in einem annehmbaren Öl) oder Ionenaustauschharzen formuliert werden, oder als schlecht lösliche Derivate, beispielsweise als schlecht lösliches Salz.
Ein pharmazeutischer Träger für die hydrophoben Verbindungen ist ein Co-Lösemittelsystem, das Benzylalkohol, ein nicht-polares Tensid, ein wassermischbares organisches Polymer und eine wäßrige Phase umfaßt. Das Co-Lösemittelsystem kann das VPD-Co-Lösemittel-System sein. VPD ist eine Lösung von 3% Gewicht/Volumen Benzylalkohol, 8% Gewicht/-Volumen des nicht-polaren Tensids Polysorbat 80 und 65 Gewicht/Volumen Polyethylenglykol 300, das in absolutem Ethanol auf das gewünschte Volumen gebracht wird. Das VPD-Co-Lösemittelsystem (VPD:5W) besteht aus VPD, 1:1 verdünnt mit einer 5%-igen Lösung von Dextrose in Wasser. Dieses Co-Lösemittelsystem löst hydrophobe Verbindungen gut auf, und erzeugt selbst bei einer systemischen Verabreichung eine nur geringe Toxizität. Natürlich können die Anteile eines Co-Lösemittelsystems erheblich variiert werden, ohne daß seine Löslichkeits- und Toxizitäts-Kennwerte zerstört werden. Darüber hinaus kann die Identität der Co-Lösemittel-Bestandteile variiert werden: beispielsweise können an Stelle von Polysorbat 80 andere niedertoxische nicht-polare Tenside verwendet werden; die Fraktionsgröße des Polyethylenglycols kann variiert werden, andere biokompatible Polymere können Polyethylenglycol ersetzen, z.B. Polyvinylpyrrolidon; und andere Zucker oder Polysaccharide können die Dextrose ersetzen.
Alternativ können andere Verabreichungssysteme für hydrophobe pharmazeutische Verbindungen verwendet werden. Liposomen und Emulsionen sind gut bekannte Beispiele von Verabreichungsvehikeln oder Trägern für hydrophobe Arzneistoffe. Es können auch bestimmte organische Lösemittel wie Dimethylsulfoxid verwendet werden, allerdings normalerweise auf Kosten einer höheren Toxizität. Zusätzlich können die Verbindungen unter Verwendung eines Systems für die allmähliche Abgabe zugeführt werden, wie beispielsweise von semipermeablen Matrizen aus festen hydrophoben Polymeren, die das therapeutische Mittel enthalten. Es sind verschiedene Materialien für die andauernde Freisetzung eingeführt und dem Fachmann gut bekannt. Kapseln für die verzögerte Freisetzung können, in Abhängigkeit von ihrer chemischen Natur, die Verbindungen für einige wenige Wochen bis zu mehr als 100 Tagen freisetzen. In Abhängigkeit von der chemischen Natur und der biologischen Stabilität des therapeutischen Reagens können zusätzliche Strategien für eine Proteinstabilisierung angewandt werden.
Die pharmazeutischen Verbindungen können auch geeignete feste oder Gelphasen-Träger oder Vehikel umfassen. Beispiele für derartige Träger oder Vehikel schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, ein Calciumcarbonat, Calciumphosphat, verschiedene Zucker, Stärken, Cellulosederivate, Gelatine und Polymere wie beispielsweise Polyethylenglycol.
Viele der hämatopoietische Vorläuferzellen stimulierenden Verbindungen der Erfindung können als Salze mit pharmazeutisch verträglichen Gegenionen bereitgestellt werden. Pharmazeutisch kompatible Salze können mit vielen Säuren gebildet werden, zu denen, ohne darauf beschränkt zu sein, Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure usw. gehören. Salze sind normalerweise in wäßrigen und anderen protonischen Lösemitteln löslicher als die entsprechenden freien Basen.
5.3.3. WIRKSAME DOSIERUNG
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für eine Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen Zusammensetzungen ein, bei denen die Wirkstoffe in einer wirksamen Menge für die Erreichung des angestrebten Zwecks enthalten sind. Genauer bedeutet eine therapeutisch wirksame Menge eine Menge, die wirksam ist, die Entwicklung von Symptomen zu verhindern oder existierende Symptome des behandelten Patienten zu mildern. Die Bestimmung der wirksamen Mengen liegt im Bereich der Fähigkeiten des Fachmanns, insbesondere im Lichte der detaillierten Beschreibung, die hiermit geliefert wird.
Für irgendeine Verbindung, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, kann die therapeutisch wirksame Dose ursprünglich anhand von Zellkultur-Assays abgeschätzt werden. Beispielsweise kann eine Dosis in Tiermodellen formuliert werden, um einen Bereich einer zirkulierenden Konzentration zu erreichen, der die in Zellkultur bestimmte EC50 (wirksame Dosis für eine 50%-ige Zunahme) einschließt, d.h. die Konzentration der Testverbindung, die eine halbmaximale Stimulation einer Vervielfältigung von Knochenmarks-Vorläuferzellen erreicht, und zwar getestet durch Bildung von BFU-E, CFU-GEMM, CFU-GM usw.. Eine derartige Information kann dazu verwendet werden, die nützlichen Dosierungen bei Menschen genauer zu bestimmen.
Eine therapeutisch wirksame Dosis bezeichnet die Menge der Verbindung, die zu einer Milderung von Symptomen führt, die mit einer Erhöhung der Blutzellen-Zahlen oder einer Verlängerung des Überlebens in einem Patienten bewirkt. Die Toxizität und therapeutische Wirksamkeit von derartigen Verbindungen kann nach pharmazeutischen Standardprozeduren in Zellkulturen oder in Versuchstieren bestimmt werden, beispielsweise zur Bestimmung der LD50 (der für 50% der Population tödlichen Dosis) oder der ED50 (der für 50% der Population therapeutisch wirksamen Dosis). Das Dosisverhältnis zwischen toxischen und therapeutischen Effekten ist der therapeutische Index, und er kann als das Verhältnis von LD50 zu ED50 ausgedrückt werden. Verbindungen, die hohe therapeutische Indizies zeigen, sind bevorzugt. Die anhand derartiger Zellkultur-Assays und Tierversuche erhaltenen Daten können dazu verwendet werden, einen Bereich von Dosie rungen für die Verwendung bei Menschen zu formulieren. Die Dosierung derartiger Verbindungen liegt vorzugsweise innerhalb eines Bereichs von zirkulierenden Konzentrationen, die die ED50-Werte bei geringer oder fehlender Toxizität beinhalten. Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereichs in Abhängigkeit von der verwendeten Dosierungsform und dem zur Anwendung kommenden Verabreichungsweg variieren. Die genaue Formulierung, der genaue Verabreichungsweg und die Dosierung können von dem einzelnen Arzt im Hinblick auf den Zustand des Patienten gewählt werden (vergleiche z.B. Fingl et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1, p. 1).
Dosierungsmenge und -intervall können individuell eingestellt werden, um Plasmaspiegel der aktiven Spezies zu gewährleisten, die ausreichen, um die Vorläuferzellen-stimulierenden Wirkungen beizubehalten. Übliche Patientendosierungen für eine systemische Verabreichung liegen bei 100 bis 2000 mg/Tag. Angegeben im Verhältnis zur Körperoberfläche des Patienten, liegen übliche Dosierungen im Bereich von 50 bis 910 mg/m²/Tag. Übliche mittlere Plasmaspiegel sollten im Bereich von 0,1 bis 1000 μM gehalten werden.
Im Falle einer lokalen Verabreichung oder einer selektiven Aufnahme kann die wirksame lokale Konzentration des Arzneistoffs in keiner Beziehung zu der Plasmakonzentration stehen. Die Menge der verabreichten Zusammensetzung hängt selbstverständlich von dem behandelten Patienten ab, von der Körperoberfläche des Patienten, dem Ernst der Beeinträchtigung, der Art der Verabreichung und vom Urteil des zu verschreibenden Arztes.
5.3.4. VERPACKUNG
Die Zusammensetzungen können gewünschtenfalls in einer Verpackung oder einer Verabreichungsvorrichtung angeboten werden, die eine oder mehrere Einheitsdosisformen mit dem aktiven Wirkstoff enthalten können. Die Verpackung kann beispielsweise Metall- oder Kunststofffolie umfassen, wie beispielsweise eine Blisterpackung. Die Verpackung oder die Ab gabevorrichtung können von Verabreichungsanweisungen begleitet werden. Zusammensetzungen, die eine Verbindung der Erfindung formuliert in einem kompatiblen, pharmazeutischen Träger enthalten, können auch hergestellt werden, in einen geeigneten Behälter gegeben werden und mit einem Etikett für eine Behandlung eines angegebenen Erkrankungszustands etikettiert werden. Geeigneten Krankheitszustände, die auf dem Etikett angegeben werden können, können die Behandlung einer Immunschwäche einschließen.
6. BEISPIEL: AMIFOSTIN IST EIN STIMULATOR FÜR HEMATOPoieTISCHE VORLÄUFERZELLEN
Frühere Untersuchungen haben berichtet, daß verschiedene Sulfhydrylverbindungen bestimmte stimulatorische Wirkungen in vitro auf hämatopoietische Zellen aufweisen (Helgostad, et al., 1986, Blut 52: 1–8; Ash et al., 1981, Blood, 58: 309–316; Toohey, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 73–77; und Hankins and Krantz, 1979, J. Biol. Chem. 254: 5701–5707). Es wurde für diese Verbindungen jedoch nicht gezeigt, daß sie eine wachstumsfördernde Wirkung in vivo aufweisen, und einige dieser Verbindungen sind tatsächlich aufgrund ihrer Toxizität nicht für eine in vivo-Verabreichung geeignet. Zusätzlich wurde vorgeschlagen, daß diese Verbindungen dadurch wirken, daß sie endogene Inhibitoren in wachstumsfaktorhaltigen konditionierten Medien aufgrund ihrer antioxidativen Wirkungen neutralisieren. Im Gegensatz dazu wird hierin gezeigt, daß Amifostin das Wachstum von Vorläuferzellen stimuliert. Es wurde festgestellt, daß seine das Zellwachstum fördernde Wirkung größer war als die der verschiedenen rekombinanten Cytokine. Außerdem war Amifostin, anders als Glutathion, selbst bei sehr hohen Konzentrationen nicht für Knochenmarks-Vorläuferzellen toxisch. Amifostin wurde ursprünglich als Zellschutzmittel gegen ionisierende Strahlung entwickelt. Während gezeigt wurde, daß es normale Gewebe gegen die Cytotoxizität von Strahlung, Alkylierungsmitteln und Platinanalogen schützt, wurde es vor der vorliegenden Erfindung nicht als das Zellwachstum förderndes Mittel getestet.
6.1. MATERIALIEN UND METHODEN
Knochenmarksproben wurden durch Markpunktion von normalen Personen oder Patienten mit MDS erhalten. Mononucleare Zellfraktionen wurden aus heparinisierten Markproben durch Ficoll Hypaque-Dichtezentrifugation isoliert. 2 × 10⁶ mononucleare Knochenmarkszellen wurden mit WR1065 (dem aktiven freien Thiolmetaboliten von Amifostin) oder Amifostin (WR2721) bei verschiedenen Konzentrationen inkubiert. Die Inkubation erfolgte für 15 Minuten und danach wurden die Zellen pelletiert, zweimal in 10 ml Kulturmedium gewaschen und zur Koloniebildung in Methylcellulose ausplattiert. Zu Vergleichszwecken wurden die Zellen auch mit Glutathion (GSH), Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-3 (IL-3) und Mastzellen-Wachstumsfaktor (MGF) inkubiert.
Das Wachstum von CFU-GM, BFU-E und CFU-GEMM-Kolonien aus mononuclearen Markzellen wurde unter Anwendung einer Modifikation von vorher beschriebenen Techniken bestimmt (Pile and Robinson, 1970, J. Cell. Physiol. 76: 77–84). Im Anschluß an die Wirkstoffeinwirkung wurden 1 ml Suspensionen von mononuclearen Zellen in Iscove Modified Dulbecco Medium, 0,8% Methylcellulose, 30% fötales Kälberserum, Erythropoietin und 5% Phytohämaglutinin-stimulierten Leukocyten-konditionieren Medien (PHA-LCM) oder fötalem Kälberserum jeweils dreifach in 35 ml Petrischalen ausplattiert und in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO₂ bei 37°C inkubiert.
Granulocyten/Makrophagen-Kolonien (CFU-GM), die 40 Zellen und Cluster (3 bis 40 Zellen) enthielten, wurden nach 7 Tagen bewertet und zwar unter Verwendung eines invertierten Mikroskops, und die Ergebnisse wurden als mittlere Koloniezahl pro 2 × 10⁶ ausplattierten Zellen ausgedrückt. BFU-E und CFU-GEMM wurden nach 14 Tagen Inkubation bewertet. Die mittlere Koloniezahl wurde in Anwesenheit oder Abwesen heit von Amifostion oder WR-1065 verglichen und als Prozent des Kontrollwerts ausgedrückt.
6.2. ERGEBNISSE
WR2721 und WR1065 (3 mg/ml) erhöhten die CFU-GEMM und BFU-E-Recovery im normalen Mark bis zum 7-fachen (Median, 3-fach), während eine geringfügige Stimulierung von CFU-GM beobachtet wurde (Bereich: 1,5 bis 3-fach). Eine dosisabhängige Stimulierung des Wachstums von Vorläuferzellen erfolgte mit jedem Thiol innerhalb einer Konzentration von 0,1 bis 1000 μM; obwohl GSH bei höheren Konzentrationen cytotoxisch war. Eine Verlängerung der Einwirkung des Thiols bis zu 24 Stunden führte zu keiner weiteren Erhöhung der Vorläufer-Recovery. Verglichen mit MGF, IL-1 und IL-3 (100 U/ml) lieferte eine Vorinkubation mit WR2721 (10 μM) oder WR1065 (1,0 μM) bei niedrigen physiologischen Konzentrationen eine bis 3-fach höhere Recovery von BFU-E und CFU-GEMM. Diese Ergebnisse zeigen, daß WR2721 und WR1065 potente Stimulanzien für das Wachstum von hämatopoietischen Vorläuferzellen sind, die bezüglich ihrer Wirkung die getesteten rekombinanten Cytokine übertrafen.
Ergebnisse einer Behandlung von Knochenmark aus 4 Patienten mit MDS sind in 1 gezeigt. Marksuspensionen wurden entweder 100 oder 500 μM Amifostin ausgesetzt und dann ausplattiert. Die Stimulation des Wachstums von Markvorläufern war wie folgt: CFU-GEMM-Koloniewachstum war bei 2 von 4 Patienten um 225% der Kontrollen erhöht; das BFU-E-Koloniewachstum war bei 3 von 4 Patienten um 300 bis 650 der Kontrollen erhöht; CFU-GM war bei 2 von 4 Patienten um 150 bis 350% der Kontrollen erhöht. Somit stimulieren die hierin offenbarten Thiole das Wachstum hämatopoietischer Zellen sowohl in normalem als auch in erkranktem Knochenmark.

Claims

Verwendung eines Aminothiols mit einer Formel RNH(C_nH_2n)NH(C_nH_2n)SPO₃H₂, worin R Wasserstoff, eine Aryl-, eine Acyl- oder eine Alkyl-Gruppe ist, die von 1 bis 7 Kohlenstoffatome enthält, und jedes n einen Wert von 2 bis 6 aufweist, oder von Hydraten, Alkalimetallsalzen oder Halogensalzen davon bei der Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung von hämatopoietischen Vorläuferzellen und dazu, die hämatopoietischen Vorläuferzellen zu einer Entwicklung zu Blutzellen zu stimulieren.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Aminothiolverbindung 2-5-(3-Aminopropylamino)ethyl-dihydrogenphosphoro-thioat-monohydrat H₂N(CH₂)₃NHCH₂CH₂SPO₃H₂·H₂O ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Aminothiolverbindung 2-5-(3-Aminopropylamino)ethyl-dihydrogenphosphorothioat-trihydrat ist.
Verwendung nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Verbindung ein entphosphoryliertes freies Aminothiol oder sein Metabolit ist.
Verwendung eines Aminothiols mit einer Formel RNH(C_nH_2n)NH(C_nH_2n)SPO₃H₂ worin R Wasserstoff, eine Aryl-, eine Acyl- oder eine Alkyl-Gruppe ist, die von 1 bis 7 Kohlenstoffatome enthält, und jedes n einen Wert von 2 bis 6 aufweist, oder Hydraten, Alkalimetallsalzen oder Halogensalzen davon bei der Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung von hämatopoie tischen Vorläuferzellen und zur Stimulierung einer erhöhten Zahl von Blutzellen in einem Patienten.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei die Aminothiolverbindung 2-S-(3-Aminopropylamino)ethyl-dihydrogenphosphorothioat-monohydrat H₂N(CH₂)₃NHCH₂CH₂SPO₃H₂·H₂O ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei die Aminothiolverbindung 2-5-(3-Aminopropylamino)ethyl-dihydrogenphosphorothioat-trihydrat ist.
Verwendung nach Anspruch 5, 6 oder 7, wobei die Verbindung ein entphosphoryliertes freies Aminothiol oder sein Metabolit ist.
Verwendung eines Aminothiols mit einer Formel RNH(C_nH_2n)NH(C_nH_2n)SPO₃H₂ worin R Wasserstoff, eine Aryl-, eine Acyl- oder eine Alkyl-Gruppe ist, die von 1 bis 7 Kohlenstoffatome enthält, und jedes n einen Wert von 2 bis 6 aufweist, oder Hydraten, Alkalimetallsalzen oder Halogensalzen davon bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Zustands des Versagens des Knochenmarks und zur Stimulierung einer erhöhten Anzahl von Blutzellen bei einem Patienten, der an einem Zustand des Versagens des Knochenmarks leidet.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Aminothiolverbindung 2-S-(3-Aminopropylamino)ethyl-dihydrogenphosphorothioat-monohydrat H₂N(CH₂)₃NHCH₂CH₂SPO₃H₂·H₂O ist.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Aminothiolverbindung 2-5-(3-Aminopropylamino)ethyl-dihydrogenphosphorothioat-trihydrat ist.
Verwendung nach Anspruch 9, 10 oder 11, wobei die Verbindung ein entphosphoryliertes freies Aminothiol oder sein Metabolit ist.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei der Zustand des Versagens des Knochenmarks das myelodysplastische Syndrom ist.