DE69532965T2

DE69532965T2 - Gegebenenfalls durch tc oder re radioaktiv markierte n3s2-chelate, geeignet für diagnostische oder therapeutische anwendungen

Info

Publication number: DE69532965T2
Application number: DE69532965T
Authority: DE
Inventors: J. Richard FLANAGAN; Jean-Marc Dufour; T. Keith HOGAN
Original assignee: Merck Frosst Canada and Co
Current assignee: Merck Frosst Canada and Co
Priority date: 1994-10-13
Filing date: 1995-10-11
Publication date: 2005-06-09
Anticipated expiration: 2015-10-12
Also published as: CA2199145A1; EP0785928B1; DE69532965D1; ATE265443T1; CA2199145C; WO1996011918A1; EP0785928A1; AU3602695A; US5632969A

Description

Radiopharmazeutische Chelatsysteme wurden zur Kopplung mit Peptiden und Proteinen verwendet, um eine diagnostische Bildgebung durchzuführen. Viele dieser Chelatsysteme weisen einen zentralen „N₂S₂"- oder „N₃S₃"-Rest auf. Einige wenige dieser Verbindungen weisen einen „N₃S₂"-Rest auf.
Das N₃S₂-enthaltende System ist aufgrund der Kombination einer zentralen Alkylaminogruppe mit zwei anderen Alkyl/Amid-Stickstoffatomen und zwei Thiolen bevorzugt, die für die Chelatisierungseigenschaften verantwortlich sind und die mit Metallen der Gruppe VIIb bei vernünftigen Temperaturen (d. h. ≤ 60°C) stabile Verbindungen bilden und die auch unter wässrigen Bedingungen eine einfache Bindung an Peptide und Proteine erlauben.
Die US-PS 5,101,041 beschreibt generisch bestimmte Triaminverbindungen, die zur Bindung an Antikörper oder Fragmente davon und zur Komplexierung von radioaktiven Metallionen zur Herstellung therapeutischer und/oder diagnostischer Mittel geeignet sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen chelatisierenden N₃S₂-Liganden, nämlich 4-Isothiocyanato-N-[2-(3,3,5,11,13,13-hexamethyl-1,2-dithia-5,8,11-triazacyclotridecan-8-yl)ethyl]benzamid, der, wenn er an Peptide und Proteine gebunden und mit geeigneten metallischen Radioisotopen chelatisiert ist, zur Behandlung geeigneter Rezeptor-positiver Tumore oder als diagnostisches in-vivo-Bildgebungsmittel geeignet ist.
Der Ligand wird unter Verwendung eines cyclischen Synthesewegs hergestellt.
Bei dem cyclischen Syntheseweg wird Tris(2-aminoethyl)amin mit dem geeigneten Dithiodialdehyd in einem geeigneten Lösungsmittel wie z. B. einem niederen Alkanol unter Rückfluss umgesetzt. Danach wird das cyclische Amin gegebenenfalls an den sekundären Aminogruppen umgesetzt, um die gewünschten Gruppen bereitzustellen, dann mit dem geeigneten N-Hydroxysuccinimidester in Triethylamin und Dichlormethan und anschließend mit Thiophosgen umgesetzt, um die entsprechenden Isothiocyanatoderivate zu erhalten.
Der neue N₃S₂-Ligand kann dann mit dem geeigneten Radioisotop durch Umsetzen mit dem Radioisotop in Form eines Transferchelats wie z. B. eines Glucoheptonatkomplexes (käuflich) und 1 bis 4 Stunden Erhitzen bei 40 bis 80°C markiert werden. Alternativ kann der N₃S₂- Ligand mit dem geeigneten Peptid oder Protein gekoppelt und dann mit einem entsprechenden Verfahren radiomarkiert werden.
Nach der Markierung ist der N₃S₂-Ligand als Radiographiemittel oder als Radiotherapiemittel zur Behandlung geeigneter Tumore geeignet. Wenn der Ligand zuerst mit dem Peptid oder Protein gekoppelt wird, wird die Isothiocyanatgruppe zuerst für die Umsetzung mit der Aminogruppe des Peptids oder Proteins hergestellt und dann mit dem geeigneten Radioisotop chelatisiert.
Das bevorzugt zu verwendende Peptid oder Protein umfasst natürliches und synthetisches Somatostatin und Analoga davon, atrialer natriuretischer Faktor-Peptide, Peptide der Fibrinbindenden Domäne und monoklonale Antikörper oder Fragmente davon, F(ab)₂-, Fab-, Fv-Regionen, Oxytocin, Substanz P, Vasopressin, sowie beliebige Peptidomimetika, die eine Aminogruppe enthalten.
Das bevorzugte Radioisotop ist eines von Rhenium oder Technetium, vorzugsweise Re-186, Re-188 oder Tc-m99.
Es können auch andere Radioisotope verwendet werden, bei denen es sich um ein beliebiges nachweisbares Element handelt. Mit dem Ausdruck nachweisbares Element ist ein beliebiges Element gemeint, vorzugsweise ein Metallion, das die Eigenschaft aufweist, dass es mit therapeutischen Techniken oder diagnostischen in-vivo-Techniken nachweisbar ist, z. B. ein Metallion, das eine nachweisbare Strahlung emittiert oder ein Metallion, das NMR-Relaxations-eigenschaften beeinflussen kann, und das mit dem N₃S₂-System ein Chelat bilden kann.
Geeignete nachweisbare Metallionen umfassen z. B. Ionen schwerer Elemente oder Seltenerdionen, z. B. paramagnetische Ionen, wie z. B. Gd³⁺, Fe³⁺, Mn²⁺ und Cr²⁺, fluoreszierende Metallionen, z. B. Eu³⁺, und Radionuklide, z. B. γ-emittierende Radionuklide, β-emittierende Radionuklide, α-emittierende Radionuklide und Positronen-emittierende Radionuklide, wie z. B. ⁶⁸Ga.
Die erfindungsgemäßen Produkte sind entweder als diagnostisches Bildgebungsmittel geeignet, z. B. zur Visualisierung spezieller (Peptid-) Rezeptor-positiver Tumore und Metastasen, wenn diese mit einem paramagnetischen Ion, einem γ-emittierenden Metallion oder einem Positronen-emittierenden Radionuklid komplexiert sind, oder als therapeutisches Radiopharmazeutikum zur in-vivo-Behandlung (Peptid-) Rezeptor-positiver Tumore und Metasta sen, wenn diese mit einem α- oder β-Radionuklid komplexiert sind, wie es von Standardtests angezeigt wird.
Das ausgewählte spezielle Radioisotop ist für das Organ oder System relevant, das einer Radiographie unterworfen werden soll. Beispielsweise wurde in den letzten Jahren in einer Vielzahl von Tumoren beim Menschen, z. B. Hypophysentumoren, Tumoren des Zentralnervensystems, Brusttumoren, Magen-Darm-Bauchspeicheldrüsen-Tumoren und deren Metastasen ein starkes Auftreten von Somatostatin-Rezeptoren gezeigt. Bei vielen dieser Tumoren handelt es sich um kleine oder langsam wachsende Tumore, die mit herkömmlichen Diagnoseverfahren nur schwer genau zu lokalisieren sind, jedoch wurde mittels Autoradiographie von Tumorgewebe unter Verwendung radioiodierter Somatostatin-Analoga eine in-vitro-Visualisierung von Somatostatin-Rezeptoren durchgeführt.
Wenn die erfindungsgemäßen Produkte als Bildgebungsmittel verwendet werden, können sie parenteral, vorzugsweise intravenös z. B. in Form injizierbarer Lösungen oder Suspensionen, vorzugsweise in einer einzelnen Injektion verabreicht werden. Die geeignete Dosierung wird natürlich beispielsweise abhängig von dem jeweiligen chelatisierenden Liganden und der Art des verwendeten nachweisbaren Elements, z. B. des Radionuklids variieren. Eine geeignete zu injizierende Dosis liegt in einem Bereich, der die Bildgebung mittels bekannter Photoabtastverfahren ermöglicht. Es kann vorteilhaft sein, dass die erfindungsgemäßen Produkte in einer Dosis mit einer Radioaktivität von 0,1 bis 50 mCi, vorzugsweise 0,1 bis 30 mCi, mehr bevorzugt 0,1 bis 20 mCi verabreicht werden. Ein angegebener Dosierungsbereich kann bei 1 bis 200 μg Produkt liegen, das mit 0,1 bis 50 mCi, vorzugsweise 0,1 bis 30 mCi markiert ist, z. B. abhängig von dem verwendeten γ-emittierenden Radionuklid mit 3 bis 15 mCi eines γ-emittierenden Radionuklids.
Die Anreicherung der Produkte in den tumorbildenden Stellen kann mit den entsprechenden Bildgebungstechniken verfolgt werden, z. B. unter Verwendung von nuklearmedizinischen Bildgebungsgeräten, beispielsweise eines Scanners, einer planaren oder rotierenden γ-Kamera, die jeweils vorzugsweise computergestützt sind, eines PET-Scanners (Positronenemissionstomographie) oder eines MRI-Geräts.
Diese Produkte können auch zur in-vivo-Behandlung von Peptidrezeptor-positiven Tumoren und Metastasen in einem Lebewesen eingesetzt werden, das einer solchen Behandlung bedarf, wobei die Behandlung das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge des Produkts an das Lebewesen umfasst.
Dosierungen, die bei der Durchführung der therapeutischen Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, werden natürlich abhängig z. B. von dem jeweils zu behandelnden Zustand, z. B. dem Volumen des Tumors, dem jeweils eingesetzten Produkt, z. B. der Halbwertszeit des Produkts im Tumor, und der gewünschten Therapie variieren. Im Allgemeinen wird die Dosis auf der Basis der Radioaktivitätsverteilung für jedes Organ und von der festgestellten Aufnahme durch das Ziel berechnet. Beispielsweise kann das Produkt in einem täglichen Dosierungsbereich mit einer Radioaktivität von 0,1 bis 3 mCi/kg Körpergewicht, z. B. 1 bis 3 mCi, vorzugsweise 1 bis 1,5 mCi/kg Körpergewicht verabreicht werden. Ein geeigneter täglicher Dosierungsbereich liegt bei 1 bis 200 μg des Liganden, der mit 0,1 bis 3 mCi/kg Körpergewicht, z. B. mit 0,1 bis 1,5/kg Körpergewicht eines α- oder β-emittierenden Radionuklids markiert ist, und der zweckmäßig in aufgeteilten Dosen bis zu viermal am Tag verabreicht wird.
Diese Produkte können über einen beliebigen herkömmlichen Weg verabreicht werden, insbesondere parenteral, z. B. in Form injizierbarer Lösungen oder Suspensionen. Sie können auch vorteilhaft durch Infusion verabreicht werden, z. B. durch eine Infusion während 30 bis 60 min. Abhängig von dem Ort des Tumors können sie so nahe wie möglich an dem Ort des Tumors z. B. mittels eines Katheters verabreicht werden. Der ausgewählte Verabreichungsmodus kann von der Dissoziationsgeschwindigkeit des verwendeten Produkts und der Ausscheidungsgeschwindigkeit abhängen.
Diese Produkte können in freier Form oder in einer pharmazeutisch verträglichen Form, wie z. B. als Salze, verabreicht werden, die in herkömmlicher Weise hergestellt werden und die gleiche Aktivitätsgrößenordnung aufweisen wie die freien Verbindungen.
Die Produkte zur Verwendung in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung können vorzugsweise kurz vor der Verabreichung an ein Lebewesen hergestellt werden, d. h. die Radiomarkierung mit dem gewünschten nachweisbaren Metallion, insbesondere mit dem gewünschten α-, β- oder γ-Radionuklid kann kurz vor der Verabreichung durchgeführt werden.
Die Produkte sind zur Bildgebung oder Behandlung von Tumoren wie z. B. Hypophysentumoren, Magen-Darm-Bauchspeicheldrüsen-Tumoren, Tumoren des Zentralnervensystems, Brusttumoren, Prostatatumoren, Eierstock- oder Kolontumoren, kleinzelligem Lungenkarzinom, Paraganglioma, Neuroblastoma, Phäochromocytoma, medullären Schilddrüsenkarzinomen, Myeloma, usw., und Metastasen davon, sowie von Lymphoma geeignet.
Gemäß eines weiteren Aspekts der Erfindung wird

i. eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das erfindungsgemäße radiomarkierte Produkt in freier oder in pharmazeutisch verträglicher Salzform zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern oder Verdünnungsmitteln dafür umfasst; oder
ii. eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die ein erfindungsgemäßes Chelat-Peptid-Produkt in freier oder in pharmazeutisch verträglicher Salzform zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern oder Verdünnungsmitteln dafür umfasst.

Solche Zusammensetzungen können in herkömmlicher Weise hergestellt werden.
Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung kann auch in einer separaten Packung mit Anweisungen zum Mischen des Chelat-Peptid-Produkts mit dem Metallion und zur Verabreichung des resultierenden radiomarkierten Produkts bereitgestellt werden. Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung kann auch in einer Doppelpackungsform bereitgestellt werden, d. h. als einzelne Packung, die separate Einheitsdosierungen des Liganden und des nachweisbaren Metallions mit Anweisungen zum Mischen des Liganden und des nachweisbaren Metallions und zur Verabreichung des Produkts enthält. In den Einheitsdosierungsformen kann ein Verdünnungsmittel oder Träger vorliegen.
Eine bevorzugte Verwendung der N₃S₂-Liganden dieser Erfindung ist die Kopplung an ein neues synthetisches Somatostatinrezeptor-bindendes Peptid. Das beste Somatostatinrezeptor-bindende Peptid ist ein synthetisches Hexapeptid
worin Phe, Tyr, Trp, Lys, Val und Lys die üblichen Aminosäuren sind. Dieses und andere geeignete Peptide sind in Tet. Letters, Band 32, Nr. 36, Seiten 4675–4678, 1991 beschrieben. Dieses cyclische Hexapeptid kann über den Isothiocyanatorest an einen beliebigen N₃S₂-Liganden in dieser Anmeldung gebunden und dann mit Tc-99 markiert werden. Das chelatisierte und/oder radiomarkierte Produkt ist bzw. sind kein Teil dieser Erfindung, ist bzw. sind jedoch in einer separaten Anmeldung, Anwaltsaktenzeichen 19312, beschrieben und beansprucht, die gleichzeitig mit der vorliegenden Anmeldung eingereicht worden ist.
Experimenteller Teil
Materialien und Verfahren
Falls nichts anderes angegeben ist, wurden alle Reaktionen in ofengetrockneten Kolben bei Raumtemperatur in einer Argonatmosphäre und magnetischem Rühren durchgeführt. Nach der Extraktion wurden die organischen Lösungsmittel über MgSO₄ getrocknet, filtriert und mit einem Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck entfernt. Lösungsmittel in Reagenzqualität, Ausgangsmaterialien und deuterierte Lösungsmittel wurden von Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI) erworben und ohne weitere Reinigung verwendet.
Die ¹H-NMR-Spektren wurden mit einem Bruker Modell AM 500, AM 400 und AM 300 aufgenommen. Die Proben wurden in CDCl₃, MeOD₄ oder DMSO-d₆ gelöst und die chemischen Verschiebungen sind als δ-Werte mit dem Lösungsmittel oder der Tetramethylsilan-Resonanz als internem Standard angegeben. Die Multiplizität ist als s (Singulett), d (Dublett), t (Triplett), q (Quartett) und m (Multiplett) definiert. Die relativen Peakhöhen der Resonanzen sind nach der Multiplizität als ganze Zahlen angegeben. ¹³C-NMR-Spektren wurden mit einem Bruker AM 300-Spektrometer bei 75,5 MHz aufgenommen und der Substitutionsgrad jedes Kohlenstoffatoms wurde durch vollständige Entkopplung und DEPT bestimmt, die aus 135°-Pulssequenzexperimenten bestand. Bei ¹³C wurden die Kohlenstoff- und Protonensignale mittels Heterokorrelationsexperimenten zugeordnet.
Die Infrarotspektren (IR) (Lösungszellen, CDCl₃ als Lösungsmittel) wurden mit einem Perkin Elmer 681-Infrarotspektrophotometer aufgenommen. Die Schmelzpunkte wurden mit einer Thomas Hoover-Kapillarschmelzpunktvorrichtung bestimmt und sind unkorrigiert. Die Massenspektren (MS) wurden entweder im CI-Modus (Methangas) oder im FAB-Modus unter Verwendung eines Finnigan 4500-Einzelquadrupol-Massenspektrometers von Oneida Research Services, Inc. (Whitesboro, NY) aufgenommen. Eine Flash-Chromatographie wurde im Wesentlichen so durchgeführt, wie es in der Literatur¹ beschrieben ist, und zwar unter Verwendung von Merck Silicagel 60 (230 bis 400 Mesh) als stationäre Phase unter Verwendung der folgenden Lösungsmittel: Methanol (M), Methylenchlorid (C), Ammoniumhydroxid (H).
Teil 1: Cyclischer Syntheseweg für N₃S₂-Chelate
Synthese des N₃S₂-Isothiocyanats (11) TPPBI
3,3,13,13-Tetramethyl-1,2-dithia-5,8,11-triazacyclotridecan-8-yl-ethanamin (4)
Ein Rundkolben wurde mit Tris(2-aminoethyl)amin (1) (989 mg, 6,76 mmol), α,α'-Dithiodiisobutyraldehyd (2) (1380 mg, 6,69 mmol, gemäß Literatur 2b hergestellt) und Ethanol (200 ml) beschickt. Das Gemisch wurde 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann 3 Stunden unter Rückfluss gehalten. Nach dem Abkühlen wurden die flüchtigen Materialien unter vermindertem Druck entfernt, wobei das rohe Diimin (3) als glasartiger Feststoff erhalten wurde. Eine ¹H-NMR-Analyse des Diimins (3) ergab drei Singuletts, die bei 7,58 ppm lagen (17 : 67 : 17), was die Bildung eines Imins bestätigte.
Dem rohen Diimin 3 in Ethanol (200 ml) wurde während 3,5 Stunden unter Rückfluss Natriumborhydrid (1,346 g, 35,58 mmol) in zwei Portionen zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde insgesamt 17 Stunden unter Rückfluss gehalten und Aceton (100 ml) wurde zugesetzt, um überschüssiges Reagenz zu zerstören. Nach dem Abkühlen wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, Wasser wurde zugesetzt und das Produkt wurde mit 5 MeOH/CH₂Cl₂ extrahiert. Die organische Schicht wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert, wobei ein gelbes Öl erhalten wurde. Eine Flash-Chromatographie dieses Öls unter Verwendung von 82,5% C/15,0% M/2,5% H ergab das Amin 4 als hellgelbes viskoses Öl (1,268 g, 59,5% Ausbeute).
¹H-NMR (in CDCl₃): δ 2,83 (t, J = 5,9 Hz, 2H, N-CH₂CH₂-NH₂), 2,72 (s, 4H, 2N-CH₂-C-S), 2,70 (m, 4H, 2N-CH₂CH₂-NH), 2,58 (m, 4H, 2N-CH₂-CH₂-NH), 2,50 (t, J = 5,9 Hz, 2H, N-CH₂CH₂-NH₂), 1,73 (br s, 4H, 4NH), 1,33 (s, 12H, 4CH₃-C-S) ppm. ¹³C-NMR (in CDCl₃): 59,2 (t, 2NH-CH₂-C-S), 56,6 (t, N-CH₂CH₂-NH₂), 54,5 (t, 2N-CH₂CH₂-NH), 50,5 (s, 2CH₃-C-S), 47,4 (t, 2N-CH₂CH₂-NH), 39,6 (t, N-CH₂CH₂-NH₂), 27,4 (q, 4CH₃-C-S) ppm. MS (m/z, CI): 321 (100, M⁺ + 1). IR (CDCl₃): 3350, 2940, 2820, 1455, 1360, 1120 cm^–1.
3,3,13,13-Tetramethyl-1,2-dithia-5,8,11-triazacyclotridecan-8-yl-(2'-N-phthaloyl)-ethanamin (5)
Ein Rundkolben wurde mit dem Amin 4 (111,2 mg, 0,347 mmol), N-Carboethoxyphthalimid (108,3 mg, 0,494 mmol) und Dichlormethan (10 ml) beschickt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Eine Flash-Chromatographie des Rückstands unter Verwendung von 90% C/9,5% M/0,5% H ergab das Phthalat (5) als gelbliches Öl (119,2 mg, 76,3%).
¹H-NMR (in CDCl₃): δ 7,86 (m, 2H, H₂ & H₅-Ar), 7,71 (m, 2H, H₃ & H₄-Ar), 3,84 (t, J = 6,4 Hz, 2H, N-CH₂CH₂-NPhth), 2,81 (t, J = 6,4 Hz, 2H, N-CH₂CH₂-NPhth), 2,69 (m, 4H, 2N-CH₂CH₂-NH), 2,66 (m, 4H, 2N-CH₂CH₂-NH), 2,59 (s, 4H, 2N-CH₂-C-S), 1,87 (br m, 2H, 2NH), 1,23 (s, 12H, 4CH₃-C-S) ppm. ¹³C-NMR (in CDCl₃): 168,1 (s, 2CO), 133,7 (d, C₃ & C₄-Ar), 131,9 (s, C₁ & C₆-Ar), 123,3 (d, C₂ & C₅-Ar), 58,7 (t, 2NH-CH₂-C-S), 53,9 (t, 2N-CH₂CH₂-NH), 52,8 (t, N-CH₂CH₂-NPhTh), 50,2 (s, 2CH₃-C-S), 47,6 (t, 2N-CH₂CH₂-NH), 35,8 (t, N-CH₂CH₂-NPhTh), 27,3 (q, 4CH₃-C-S) ppm. MS (m/z, CI): 451 (100, M⁺ + 1). IR (CDCl₃): 3400, 2950, 2810, 1770, 1705, 1465, 1395 cm^–1.
3,3,5,11,13,13-Hexamethyl-1,2-dithia-5,8,11-triazacyclotridecan-8-yl-ethanamin (7)
Ein Rundkolben wurde mit dem Phthalat 5 (775,7 mg, 1,72 mmol), Ameisensäure (10 ml, 265 mmol) und Formaldehyd (37 Gew.-% in Wasser, 15 ml, 200 mmol) beschickt. Das Reaktionsgemisch wurde 20 Stunden unter Rückfluss gehalten und dann abkühlen gelassen und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Dem festen Rückstand wurde eine 10%ige KOH-Lösung zugesetzt und die Verbindung wurde mit 5% MeOH/CH₂Cl₂ extrahiert. Das organische Lösungsmittel wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert, wobei rohes 6 als viskoses Öl erhalten wurde.
Ein Rundkolben wurde mit rohem 6, Hydrazinmonohydrat (1 ml, 20,6 mmol) und Ethanol (40 ml) beschickt. Das Reaktionsgemisch wurde 20 Stunden unter Rückfluss gehalten und dann abkühlen gelassen. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, Wasser wurde zugesetzt und der Rückstand wurde mit 5% MeOH/CH₂Cl₂ extrahiert. Das organische Lösungsmittel wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert, wobei ein gelbliches viskoses Öl erhalten wurde. Eine Flash-Chromatographie des Rohprodukts unter Verwendung von 80% C/19,5% M/1,0% H ergab das Dimethyltetramin 7 als hellgelbes Öl (375 mg, 62,4% Gesamtausbeute ausgehend von 4).
¹H-NMR (in CDCl₃): δ 2,78 (t, J = 5,9 Hz, 2H, N-CH₂CH₂-NH₂), 2,72 (t, J = 5,5 Hz, 4H, 2N-CH₂CH₂-NCH₃), 2,63 (s, 4H, 2N-CH₂-C-S), 2,60 (t, J = 5,5 Hz, 4H, 2N-CH₂CH₂-NCH₃), 2,42 (t, J = 5,9 Hz, 2H, N-CH₂CH₂-NH₂), 2,36 (s, 6H, 2NCH₃), 1,77 (br s, 2H, NH₂), 1,28 (s, 12H, 4CH₃-C-S) ppm. ¹³C-NMR (in CDCl₃): 67,2 (t, 2N-CH₂-C-S), 57,9 (t, 2N-CH₂CH₂-NCH₃), 55,6 (t, N-CH₂CH₂-NH₂), 52,1 (t, 2N-CH₂CH₂-NCH₃), 51,3 (s, 2CH₃-C-S), 45,1 (q, 2NCH₃), 39,5 (t, N-CH₂CH₂-NH₂), 27,4 (q, 4CH₃-C-S) ppm. MS (m/z, CI): 349 (100, M⁺ + 1). IR (CDCl₃): 2960, 2800, 1455, 1355, 1310, 1100 cm^–1.
4-Amino-N-[2-(3,3,5,11,13,13-hexamethyl-1,2-dithia-5,8,11-triazacyclotridecan-8-yl)ethyl]benzamid (10)
Ein Rundkolben wurde mit dem Dimethyltetramin 7 (514,9 mg, 1,48 mmol), t-Boc-p-aminobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (8) (493,8 mg, 1,48 mmol, gemäß der Literatur 3 hergestellt), Triethylamin (0,21 ml, 1,51 mmol) und Dichlormethan (40 ml) beschickt. Das Reaktionsgemisch wurde 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, wobei rohes 9 erhalten wurde.
Ein Rundkolben wurde mit dem rohem 9, Dichlormethan (10 ml) und Trifluoressigsäure (10 ml) beschickt und das resultierende Gemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und eine Reinigung des Rückstands mittels Flash-Chromatographie unter Verwendung von 94,5% C/5,0% M/0,5% H ergab das Anilin 10 als gelblich-weißen Feststoff (345,8 mg, 50,8% Gesamtausbeute ausgehend vom Dimethyltetramin 7).
¹H-NMR (in CDCl₃): δ 7,65 (d, J = 8,6 Hz, 2H, H₂ & H₆-Ar), 6,87 (br s, 1H, NH-CO), 6,67 (d, J = 8,6 Hz, 2H, H₃ & H₅-Ar), 3,95 (s, 2H, NH₂), 3,49 (t, J = 5,4 Hz, 2H, N-CH₂CH₂-NCO), 2,74 (m, 4H, 2N-CH₂CH₂-NCH₃), 2,65 (m, 4H, 2N-CH₂CH₂-NCH₃), 2,61 (s, 4H, 2N-CH₂-C-S), 2,53 (t, J = 5,4 Hz, 2H, N-CH₂CH₂-NCO), 2,30 (s, 6H, 2NCH₃), 1,29 (s, 12H, 4CH₃-C-S) ppm. ¹³C-NMR (in CDCl₃): 167,1 (s, NHCO), 149,6 (s, C₁-Ar), 128,6 (d, C₃ & C₅-Ar), 123,9 (s, C₄-Ar), 113,9 (d, C₂ & C₆-Ar), 67,2 (t, N-CH₂-C-S), 57,6 (t, 2N-CH₂CH₂-NCH₃), 53,7 (t, N-CH₂CH₂-NHCO), 53,4 (s, 2CH₃-C-S), 51,4 (t, 2N-CH₂CH₂-NCH₃) 45,0 (q, 2NCH₃), 37,0 (t, N-CH₂CH₂-NHCO), 27,2 (q, 4CH₃-C-S) ppm. MS (m/z, FAB): 468,2 (100, M⁺ + 1). IR (CDCl₃): 3405, 2960, 2800, 1620, 1495, 1280, 1100, 835 cm^–1.
4-Isothiocyanato-N-[2-(3,3,5,11,13,13-hexamethyl-1,2-dithia-5,8,11-triazacyclotridecan-8-yl)ethyl]benzamid (11) [TPPBI]
Ein Rundkolben mit dem Anilin 10 (53,3 mg, 0,114 mmol) und Dichlormethan (5 ml) wurde mit einer 0,2007 M-Lösung von Thiophosgen (0,60 ml, 0,120 mmol) in Dichlormethan beschickt. Das heterogene Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, wobei das Isothiocyanat 11 als rötlicher Feststoff erhalten wurde (67,8 mg, 116%).
¹H-NMR (in DMSO-d₆): δ 8,88 (br s, 1H, NH-CO), 7,99 (d, J = 8,4 Hz, 2H, H₂ & H₆-Ar), 7,54 (d, J = 8,4 Hz, 2H, H₃ & H₅-Ar), 3,49 (m, 2H, N-CH₂CH₂-NCO), 3,40 (m, 8H, 2N-CH₂CH₂-NCH₃), 3,01 (s, 4H, 2N-CH₂-C-S), 2,89 (s, 6H, 2NCH₃), 2,71 (m, 2H, N-CH₂CH₂-NCO), 1,45 (s, 12H, 4CH₃-C-S) ppm. MS (m/z, CI): 510 (100, M⁺ + 1). IR (CDCl₃): 3400, 2960, 2100, 1640, 1600, 1545, 1500, 1470, 1300 cm^–1.
Herstellung von Somatoscan(Fmoc)TPPBI (13)
In einem 5 ml Reacti-Vial (Pierce) wurde eine Lösung von Somatoscan-Fmoc (12) [Cyclo(TrpLys(Fmoc)ValLysNMe-Phe-Tyr] (1,97 mg, 1,515 μmol), TPPBI (11) (8,4 mg, 16,495 μmol) und DMF (400 μl) gerührt, während ein Hydrogencarbonat/Phosphat-Puffer (0,2 M, pH 8,2, 100 μl, frisch hergestellt) zugesetzt wurde. Die heterogene Lösung wurde mittels HPLC kontrolliert und 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde mit 1 N HCl (300 μl) und MeOH (100 μl) verteilt. Die Reinigung dieser Lösung mittels HPLC (präparative Säule Hamilton PRP-1, 12–20 μm, 250 × 21,5 mm) unter Verwendung eines 30% bis 100%-Gradienten aus Acetonitril : Wasser (das 0,1% TFA enthielt) während 40 min (Flussrate 12 ml/min) ergab reines Somatoscan(Fmoc)TPPBI (13) (R_t = 20,64 min).
MS (Elektrospray, Hypermasse) 799,4 (z = 2), berechnete Verbindungsmasse = 1596,8, gemessene Verbindungsmasse = 1597,8.
Teil 2: Acyclische Synthesewege zu N₃S₂-Chelaten
Synthese acyclischer Dimercaptoanisidinarylisothiocyanaten
Synthese von offenkettigem N₃S₂-Arylisothiocyanat (21)
Bis(2'-phthalimidoethyl)amin (15)
Diese Verbindung wurde gemäß der Literatur 4 hergestellt.
Phthalsäureanhydrid (32 g, 0,22 mol) wurde in 333 ml heißem Chloroform gelöst und das Gemisch wurde filtriert, um Phthalsäure zu beseitigen. Eine Lösung von Diethylentriamin 14 (7,97 g, 0,077 mol) in Chloroform (64 ml) wurde dem Phthalsäureanhydridgemisch, das bei einer Temperatur von 50°C gehalten wurde, langsam (während 50 min) zugesetzt. Nach dem Ende der Zugabe wurde die Temperatur auf 110°C erhöht. Das Reaktionsgemisch wurde dann 48 Stunden gerührt und langsam konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde dann mit Aktivkohle behandelt. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wurden 31,8 g eines gelben Feststoffs gewonnen. Der Feststoff wurde nacheinander mit Ether und Ethanol behandelt und dann in Methylenchlorid gelöst. Die Methylenchloridlösung wurde dann mit einer 10%igen Natriumcarbonatlösung (3 × 500 ml), Wasser und einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen. Die organische Phase wurde mit Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Es wurde ein blass-gelber Feststoff (14,47 g, 52%) erhalten. Ein Teil (4,45 g) dieses Produkts wurde mittels Flash-Chromatographie (Silicagel) unter Verwendung eines Gemischs aus Methylenchlorid, Ethylacetat und Triethylamin als Elutionssystem (79/20/1) gereinigt. Die Reinigung ergab 2,798 g Bis(phthalimidoethyl)amin (15).
*6,96 g Phthalsäure wurden zurückgewonnen.
¹H-NMR (in CDCl₃): δ 7,70 (m, 8H, H-Ar(phth)), 3,77 (t, J = 6 Hz, 4H, -NH(-CH₂-CH₂-NPhth)₂), 2,95 (t, J = 6 Hz, 4H, -NH(-CH₂-CH₂-NPhth)₂), 1,41 (breit, 1H, -NH(-CH₂-CH₂-NPhth)₂) ppm. IR (in CDCl₃/NaCl): 3460 (N-H, w, sek. Amin), 2940–2820 (C-H), 1770–1710 (C=O, Phth), 1465, 1425, 1390, 1360, 1185, 1035 cm^–1. MS (EI; m/z): 363 (0,4, M⁺), 364 (4, M⁺ + 1), 216 (3, M⁺-Phth), 204 (18), 203 (100, M+-(Phth-CH₂ ^·)), 174 (57, Phth-CH₂-CH₂ ⁺), 160 (5), 147 (6), 130 (12) und 56 (6).
N'-(4-Nitrobenzyl]bis(2'-phthalimidoethyl)amin (16)
(Vgl. Literatur 4) In einem 250 ml-Rundkolben wurde Kaliumhydroxid (1,6 g, 28 mmol) in heißem Ethanol (100 ml) gelöst. Der ethanolischen Lösung wurde Bis(2'-phthalimidoethyl)amin (15) (10,02 g, 28 mmol) zugesetzt. Die Lösung wurde magnetisch gerührt und 2,5 Stunden unter Rückfluss gehalten, bevor p-Nitrobenzylbromid (5,95 g, 28 mmol, 1 Äqu.) zugesetzt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde weitere 16 Stunden unter Rückfluss erhitzt und dann heiß filtriert. Der so erhaltene Feststoff wurde mit absolutem Ethanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet, wobei 7,441 g (54%) eines weißen Feststoffs (p-Nitrobenzylbisphthalimid) erhalten wurden. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingedampft, wobei 8,19 g eines gelben Feststoffs erhalten wurden. Dieser Rückstand wurde mittels Flash-Chromatographie (Silicagel: 400 g) unter Verwendung eines Methylenchlorid-Methanol-Systems (98/2) als Elutionsmittel gereinigt. Die Reinigung mittels Chromatographie ergab 3,13 g (23%) des gewünschten Produkts. Die Alkylierungsreaktion ergab 10,571 g N'-(4-Nitrobenzyl)bis(2'-phthalimidoethyl)amin (16).
¹H-NMR (in CDCl₃): δ 7,70 (m, 10H, H-Ar(Phth) + o(H)-Ar-NO₂), 7,20 (d, J = 9 Hz, 2H, m(H)-Ar-NO₂), 3,75 (t, J = 6 Hz, 4H, -NH(-CH₂-CH₂-NPhth)₂), 3,71 (s, 2H, -N-CH₂-Ar-NO₂) und 2,80 (t, J = 6 Hz, 4H, -NH(-CH₂-CH₂-NPhth)₂) ppm. MS (EI; m/z): 498 (1, M⁺), 499 (0,6, M⁺ + 1), 362 (1, M⁺-^·CH₂Ar-NO₂), 339 (32, M⁺ + 1-(Phth-CH₂), 338 (100, M⁺-(Phth-CH₂ ^·), 324 (2, M⁺-(Phth-CH₂-CH₂ ^·)), 174 (58, Phth-CH₂-CH₂ ⁺), 173 (42), 165 (6), 163 (8), 161 (6), 160 (43), 149 (12), 136 (24), 130 (12), 106 (21), 105 (12), 104 (17), 90 (22), 89 (18), 78 (23), 77 (21) und 76 (12).
Hydrolyse von N'-(4-Nitrobenzyl)bis(2'-phthalimidoethyl)amin
In einen mit einem Kühler ausgestatteten 250 ml-Rundkolben wurden N'-(4-Nitrobenzyl)bis(2'-phthalimidoethyl)amin (16) (2,80 g, 5,62 mmol) und 6 N Chlorwasserstoffsäure (150 ml) eingebracht. Das Reaktionsgemisch wurde 23 Stunden gerührt und unter Rückfluss gehalten. Die Lösung wurde mit einem Eisbad gekühlt und filtriert. Das Filtrat wurde mit Ether (3 × 100 ml) gewaschen und unter verminderten Druck getrocknet, wobei ein gelbes, schaumartiges Material erhalten wurde (2,17 g). Der Rückstand wurde in Wasser (10 ml) gelöst und der pH-Wert dieser Lösung wurde mit 1 N Natriumhydroxid (25 ml) basisch gemacht. Dann wurde das Gemisch mit Methylenchlorid (3 × 75 ml) extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, mit Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und zur Trockne eingedampft, wobei 1,347 g N'-(4-Nitrobenzyl)bis(2'-aminoethyl)amin (17) als helloranges Öl erhalten wurden (das mit der Zeit dunkelrot wurde).
Anmerkung
Das p-Nitrobenzyltriamin (17) wird für eine kurzzeitige Lagerung lichtgeschützt und in einer Argon-Inertgasatmosphäre gelagert. Für eine Langzeitlagerung ist es besser, diese Verbindung als Hydrochloratform aufzubewahren.
¹H-NMR (in CDCl₃): δ 8,13 (d, J = 9 Hz, 2H, o(H)-Ar-NO₂), 7,46 (d, J = 9 Hz, 2H, m(H)-Ar-NO₂), 3,65 (s, 2H, -N-CH₂-Ar-NO₂), 2,74 (t, J = 6 Hz, 4H, -N(-CH₂-CH₂-NH₂)₂), 2,50 (t, J = 6 Hz, 4H, -N(-CH₂-CH₂-NH₂)₂) und 1,43 (breites s, 4H, -N(-CH₂-CH₂-NH₂)₂) ppm. IR (Film): 3370–3290 (N-H, -NH₂), 2940–2800 (C-H), 1605 (C=C, Ar), 1510 (N=O, Ar), 1450, 1340 (N=O, Ar), 1105, 1010, 850 (C-N, Ar-NO₂) und 730 cm^–1.
N'-4-Aminobenzyldiethylentriamin (18)
Diese Verbindung wurde gemäß der Literatur 4 hergestellt.
¹H-NMR (in CDCl₃): δ 7,08 (d, J = 8,3 Hz, 2H, H₃ & H₅-Ar), 6,64 (d, J = 8,3 Hz, 2H, H₂ & H₆-Ar), 3,62 (br s, 2H, Ar-NH₂), 3,48 (s, 2H, N-CH₂-Ar), 2,74 (t, J = 6,0 Hz, 4H, 2N-CH₂CH₂-NH₂), 2,50 (t, J = 6,0 Hz, 4H, 2N-CH₂CH₂-NH₂), 1,52 (br s, 4H, 2NH₂) ppm.
N,N''-Bis[2-((4-methoxybenzyl)thio)-2-methylpropionyl]-N'-(4-aminobenzyl)-diethylentriamin (20)
Einer Lösung des Anilins 18 (230 mg, 1,10 mmol, frisch hergestellt) in Ethanol (20 ml) wurde während 15 min eine Lösung von 2-[(p-Methoxybenzyl)thio]-2-methylpropionsäurechlorid 15 (1,33 g, 5,10 mmol, gemäß der Literatur 5 hergestellt) in Dichlormethan (10 ml) zugesetzt. Die resultierende Lösung wurde 48 Stunden gerührt und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, 1 N NaOH wurde zugesetzt und das Produkt wurde mit CH₂Cl₂ extrahiert. Die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert, wobei ein rotes Öl erhalten wurde. Eine Flash-Chromatographie dieses Öls unter Verwendung von 5% MeOH/CH₂Cl₂ ergab das Anilin 20 als gelbes Öl (126 mg, 17,5% Ausbeute).
¹H-NMR (in CDCl₃): δ 7,15 (d, J = 8,6 Hz, 4H, 2H₃ & H₅-Ar-OCH₃), 7,07 (t, J = 8,2 Hz, 2H, H₃ & H₅-Ar-NH₂), 7,07 (m, 2H, 2NHCO), 6,78 (d, J = 8,6 Hz, 4H, 2H₂ & H₆-Ar-OCH₃), 6,58 (d, J = 8,2 Hz, 2H, H₂ & H₆-Ar-NH₂), 3,74 (s, 6H, 2CH₃O), 3,72 (br s, 2H, NH₂), 3,65 (s, 4H, 2S-CH₂-Ar), 3,49 (s, 2H, N-CH₂-Ar), 3,24 (q, J = 5,9 Hz, 4H, 2N-CH₂CH₂-NHCO), 2,55 (t, J = 6,2 Hz, 4H, 2N-CH₂CH₂-NHCO), 1,50 (s, 12H, 4CH₃-C-S) ppm. ¹³C-NMR (in CDCl₃): δ 174,6 (s, 2NCO), 158,9 (s, 2Cl-Ar-OCH₃), 146,0 (s, Cl-Ar-NH₂), 130,2 (d, C₃ & C₅-Ar-NH₂ + 2C₃ & C₅-Ar-OCH₃), 129,6 (s, 2C₁ & C₄-Ar-OCH₃), 129,1 (s, C₄-Ar-NH₂), 115,4 (d, C₂ & C₆-Ar-NH₂), 114,3 (d, 2C₂ & C₆-Ar-OCH₃), 58,3 (t, N-CH₂-Ar), 55,5 (q, 2CH₃O), 53,0 (t, 2N-CH₂CH₂-NHCO), 50,3 (s, 2S-C-CH₃), 37,8 (t, 2N-CH₂CH₂-NHCO), 34,4 (t, 2S-CH₂-Ar), 27,1 (q, 4CH₃-C-S) ppm. MS (m/z, FAB): 653,5 (100, MH⁺). IR (CDCl₃): 3380, 3000, 2930, 2835, 1665, 1510, 1245, 1195, 1175, 1035 cm^–1.
N,N''-Bis[2-((4-methoxybenzyl)thio)-2-methylpropionyl]-N'-(4-isothiocyanatobenzyl)-diethylentriamin (21)
Einem Rundkolben mit dem Anilin 20 (55,7 mg, 0,0853 mmol) und Dichlormethan (5 ml) wurde eine 0,2011 M-Lösung von Thiophosgen (0,42 ml, 0,0845 mmol) in Dichlormethan zugesetzt. Das heterogene Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, wobei das Isothiocyanat 21 als brauner Feststoff erhalten wurde (68,9 mg, 116%).
¹H-NMR (in CDCl₃): δ 7,72, (m, 2H, 2NHCO), 7,65 (d, J = 8,3 Hz, 2H, H₂ & H₆-Ar-NCS), 7,25 (t, J = 8,3 Hz, 2H, H₃ & H₃-Ar-NCS), 7,17 (d, J = 8,5 Hz, 4H, 2H3 & H5-Ar-OCH₃), 6,80 (d, J = 8,5 Hz, 4H, 2H₂ & H₆-Ar-OCH₃), 4,14 (s, 2H, N-CH₂-Ar), 3,77 (s, 6H, 2CH₃O), 3,70 (s, 4H, 2S-NHCO), 1,53 (s, 12H, 4CH₃-C-S) ppm. IR (CDCl₃): 3300, 2930, 2080, 1655, 1605, 1510, 1245, 1170, 1030 cm^–1.
Teil 3: Synthese acyclischer Dimercaptoanisidinalkylisothiocyanate
Synthese des offenkettigen N₃S₂-Alkylanisidins 26
N,N-Bis(2-aminoethyl)-N'-tert-butyloxycarbonyl-1,2-ethandiamin (22)
Eine Lösung von Tris(2-aminoethyl)amin (1) (19,5 g, 133,6 mmol) in CH₂Cl₂ (300 ml) wurde in einem Trockeneis-Aceton-Bad auf –78°C gekühlt, während Di-tert-butyldicarbonat (14,6 g, 66,9 mmol) in CH₂Cl₂ (100 ml) langsam während 30 min zugegeben wurden. Das Reaktionsgemisch wurde langsam auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und 18 Stunden gerührt. 1 N NaOH wurde zugesetzt und die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert, wobei das Amin 22 als hellgelbes Öl erhalten wurde (9,07 g, 55%).
¹H-NMR (in CDCl₃): δ 5,62 (br m, 1H, NH-CO), 3,18 (m, 2H, N-CH₂CH₂-NCO), 2,98 (m, 4H, 2N-CH₂CH₂-NH₂), 2,80 (m, 4H, 2N-CH₂CH₂-NH₂), 2,57 (m, 2H, N-CH₂CH₂-NHCO), 2,57 (m, 4H, 2NH₂), 1,44 (s, 9H, 3CH₃-C-O) ppm. MS (m/z, CI): 247 (100, MH⁺). IR (CDCl₃): 3280, 2965, 2815, 1695, 1500, 1165, 905, 730 cm^–1.
N,N''-Bis[2-((4-methoxybenzyl)thio)-2-methylpropionyl]-N'-[2-(N-tert-butoxycarbonyl]aminoethyl]-diethylentriamin (23)
Eine Lösung des ^tBoc-Derivats 22 (555,3 mg, 2,25 mmol) in CH₂Cl₂ (25 ml) wurde auf 0°C gekühlt, während 2-[(p-Methoxybenzyl)thio]-2-methylpropionsäurechlorid 19 (1,54 g, 6,85 mmol, das gemäß der Literatur 5 hergestellt worden ist) in Dichlormethan (10 ml) während 5 min zugegeben wurden. Die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und 12 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter verminderten Druck entfernt, 1 N NaOH wurde zugesetzt und das Produkt wurde mit CH₂Cl₂ extrahiert. Die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert, wobei ein gelbes Öl erhalten wurde. Eine Flash-Chromatographie dieses Öls unter Verwendung von 5% MeOH/CH₂Cl₂ ergab das ^tBoc-Derivat 23 als gelbes Öl (938 mg, 60,2% Ausbeute).
¹H-NMR (in CDCl₃): δ 7,16 (d, J = 8,5 Hz, 4H, 2H₃ & H₅-Ar-OCH₃), 7,07 (t, J = 5,2 Hz, 2H, 2NH-CO), 6,81 (d, J = 8,5 Hz, 4H, 2H₂ & H₆-Ar-OCH₃), 4,98 (br s, 1H, NH-CO), 3,77 (s, 6H, 2CH₃O), 3,63 (s, 4H, 2S-CH₂-Ar), 3,17 (m, 6H, 3N-CH₂CH₂-NHCO), 2,56 (m, 6H, 3N-CH₂CH₂-NHCO), 1,53 (s, 12H, 4CH₃-C-S), 1,42 (s, 9H, 3CH₃-C-O) ppm. MS (m/z, CI): 691 (9, MH⁺). IR (CDCl₃): 3380, 2970, 2930, 2830, 1700, 1650, 1500, 1245, 1170, 1030, 830 cm^–1.
N,N''-Bis[2-((4-methoxybenzyl)thio)-2-methypropionyl]-(2-aminoethyl)-diethylentriamin (24)
Eine Lösung von 23 (858,3 mg, 1,24 mmol) in 50% TFA in CH₂Cl₂ (30 ml) wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, 1 N NaOH wurde zugesetzt und das Produkt wurde mit CH₂Cl₂ extrahiert. Die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert, wobei ein gelbes Öl erhalten wurde. Eine Flash-Chromatographie dieses Öls unter Verwendung von 90,5% C/9,5% M/0,5% H ergab das Amin 24 als gelbes Öl (734 mg, 95,1% Ausbeute).
¹H-NMR (in CDCl₃): δ 7,25 (m, 2H, 2NH-CO), 7,16 (d, J = 8,5 Hz, 4H, 2H₃ & H₅-Ar-OCH₃), 6,81 (d, J = 8,5 Hz, 4H, 2H₂ & H₆-Ar-OCH₃), 3,77 (s, 6H, 2CH₃O), 3,69 (s, 4H, 2S-CH₂-Ar), 3,23 (q, J = 6,1 Hz, 4H, 2N-CH₂CH₂-NHCO), 2,72 (t, J = 5,9 Hz, 2H, N-CH₂CH₂-NH₂), 2,54 (m, 6H, N-CH₂CH₂-NH₂ + 2N-CH₂CH₂-NH-CO), 1,60 (br s, 2H, NH₂), 1,52 (s, 12H, 4CH₃-C-S) ppm. ¹³C-NMR (in CDCl₃): δ 174,3 (s, 2NH-CO), 158,3 (s, 2Cl-Ar-OCH₃), 129,6 (d, 2C₂ & C₆-Ar-OCH₃), 128,9 (s, 2C₄-Ar-OCH₃), 113,6 (d, 2C₃ & C₅-Ar-OCH₃), 54,8 (q, 2CH₃O), 54,2 (t, N-CH₂CH₂-NH₂), 53,6 (t, 2N-CH₂CH₂-NHCO), 49,4 (s, 2S-C-CH₃), 38,5 (t, 2N-CH₂CH₂-NHCO), 37,6 (t, N-CH₂CH₂-NH₂), 33,6 (t, 2S-CH₂-Ar), 26,4 (q, 4CH₃-C-S) ppm. MS (m/z, CI): 591 (31, MH⁺). IR (CDCl₃): 3770, 2930, 2830, 1655, 1510, 1245, 1170, 1030, 830 cm^–1.
N,N''-Bis[2-((4-methoxybenzyl)thio)-2-methylpropionyl)-N'-(2-isothiocyanoethyl)-diethylentriamin (25)
Einem Rundkolben, der das Anilin 24 (28,8 mg, 0,0487 mmol) und Dichlormethan (10 ml) enthielt, wurde eine 0,2211 M-Lösung von Thiophosgen (0,22 ml, 0,0509 mmol) in Dichlormethan zugesetzt. Das heterogene Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Eine Flash-Chromatographie dieses Rohprodukts unter Verwendung von 100% EtOAc ergab das Isothiocyanat 25 als klares Öl (18,9 mg, 61,3% Ausbeute).
¹H-NMR (in CDCl₃): δ 7,17 (d, J = 8,5 Hz, 4H, 2H₃ & H₅-Ar-OCH₃), 7,07 (m, 2H, 2NH-CO), 6,82 (d, J = 8,5 Hz, 4H, 2H₂ & H₆-Ar-OCH₃), 3,78 (s, 6H, 2CH₃O), 3,70 (s, 4H, 2S-CH₂-Ar), 3,49 (t, J = 5,9 Hz, 2H, N-CH₂CH₂-NCS), 3,21 (q, J = 6,2 Hz, 4H, 2N-CH₂CH₂-NHCO), 2,78 (t, J = 5,9 Hz, 2H, N-CH₂CH₂-NCS), 2,58 (t, J = 6,4 Hz, 4H, 2N-CH₂CH₂-NHCO), 1,54 (s, 12H, 4CH₃-C-S) ppm. MS (m/z, CI): 633 (25, MH⁺). IR (CDCl₃): 3370, 2950, 2920, 2850, 2100, 1720, 1655, 1610, 1510, 1245, 1170, 1030, 830 cm^–1.
N,N''-Bis[2-((4-methoxybenzyl)thio)-2-methylpropionyl]-N'-(2-[[[4-methoxyphenyl)amino]thioxomethyl]aminoethyl]-diethylentriamin (26)
Eine Lösung des Isothiocyanats 25 (18,9 mg, 0,02986 mmol), Triethylamin (7,26 mg, 0,07175 mmol), Anisidin (6,9 mg, 0,05602 mmol) und CHCl₃ (15 ml) wurde 3 Stunden unter Rückfluss gehalten und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Eine Flash-Chromatographie dieses Rohprodukts unter Verwendung von 100% EtOAc ergab das Anisidinderivat 26 als klares Öl (19,8 mg, 87,6% Ausbeute).
¹H-NMR (in CDCl₃): δ 8,17 (brs, 1H, NH-CS-NH-Ar), 7,28 (d, J = 8,8 Hz, 2H, H₂ & H₆-Ar-N), 7,15 (d, J = 8,6 Hz, 4H, 2H₃ & H₅-Ar-OCH₃), 7,06 (brs, 1H, NH-CS-NH-Ar), 7,06 (t, J = 5,7 Hz, 2H, 2NH-CO), 6,90 (d, J = 8,9 Hz, 2H, H₃ & H₅-Ar-N), 6,82 (d, J = 8,6 Hz, 4H, 2H₂ & H₆-Ar-OCH₃), 3,79 (s, 3H, CH₃O-Ar-N), 3,77 (s, 6H, 2CH₃O-Ar-CH₂), 3,67 (s, 4H, 2S-CH₂-Ar), 3,61 (q, J = 5,3 Hz, 2H, N-CH₂CH₂-NHCS), 3,14 (q, J = 6,2 Hz, 4H, 2N-CH₂CH₂-NHCO), 2,69 (t, J = 5,6 Hz, 2H, N-CH₂CH₂-NHCS), 2,52 (t, J = 6,3 Hz, 4H, 2N-CH₂CH₂-NH-CO), 1,51 (br s, 12H, 4CH₃-C-S) ppm. ¹³C-NMR (in CDCl₃): δ 181,9 (s, N-CS-N), 175,2 (s, 2NH-CO), 158,8 (s, 3Cl-Ar-OCH₃), 130,0 (s, C₁-Ar-N), 130,0 (d, 2C₂ & C₆-Ar-OCH₃), 129,2 (s, 2C₄-Ar-OCH₃), 127,0 (d, C₂ & C₆-Ar-N), 114,5 (d, C₃ & C₅-Ar-
Teil 4: Markierung eines N₃S₂-Chelats (anhand einer Verbindung beispielhaft dargestellt, die nicht unter den Schutzbereich der Erfindung fällt)
Synthese von acyclischem Dimercapto-N,N,N-tris(2-aminoethyl)amin
Herstellung von N,N-Dimethyl-2-(3,3,5,11,13,13-hexamethyl-1,2-dithia-5,8,11-triazacyclotridecan-8-yl)ethylamin (27)⁶
2-(3,3,13,13-Tetramethyl-1,2-dithia-5,8,11-triazacyclotridecan-8-yl)-ethylamin 4 (202,6 mg, 0,63 mmol) in einem 25 ml-Rundkolben wurden konzentrierte Ameisensäure (4 ml) und eine 37%ige Formaldehydlösung (3,7 ml) zugesetzt. Das Gemisch wurde 25 Stunden unter Rückfluss erhitzt und gerührt. Die Lösung wurde dann auf Raumtemperatur gekühlt und dreimal mit Ether (50 ml) extrahiert. Die wässrige Phase wurde durch Zusetzen von 27%igem Ammoniumhydroxid basisch gemacht (etwa 10 bis 11) und mit Methylenchlorid (4 × 50 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde nacheinander mit Wasser (50 ml) und gesättigter Natriumchloridlösung (2 × 50 ml) gewaschen, mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, wobei 176 mg (74%) tetramethyliertes Tetraamindisulfid 27 als gelbes Öl erhalten wurden. Das Rohprodukt wurde mittels Flash-Chromatographie (Silicagel) unter Verwendung eines Gemischs aus Methylenchlorid, Methanol und Ammoniumhydroxid (84,5/15/0,5) als Elutionsmittel gereinigt. Durch das Reinigungsverfahren wurde reines N,N-Dimethyl-2-(3,3,5,11,13,13-hexamethyl-1,2-dithia-5,8,11-triazacyclotridecan-8-yl)ethylamin 27 (108 mg) gewonnen.
N,N-Dimethyl-2-(3,3,5,11,13,13-hexamethyl-1,2-dithia-5,8,11-triazacyclotridecan-8-yl)ethylamin (27)

¹H-NMR (300 MHz, in CDCl₃): δ 2,71 (t, J = 6 Hz, 4H, -N-CH₂-CH₂-N(CH₃)-), 2,64 (s, 4H, -N-CH₂-C(CH₃)₂-S-), 2,62 (t, J = 6 Hz, 4H, -N-CH₂-CH₂-N(CH₃)-), 2,52 (m, 2H, -CH₂-CH₂-N(CH₃)₂), 2,46 (m, 2H, -CH₂-CH₂-N(CH₃)₂), 2,37 (s, 6H, -CH₂-N(CH₃)-CH₂-), 2,25 (s, 6H, -CH₂-CH₂-N(CH₃)₂), und 1,28 (s, 12H, -S-C(CH₃)₂-) ppm. ¹³C-NMR (75 MHz, in CDCl₃): δ 74,8, 67,7, 57,6, 53,9, 51,7, 45,9, 45,1 und 26,9 ppm. MS (EI, m/z): 376 (4, M⁺), 377 (2, M⁺ + 1), 378 (0,6, M⁺ + 2), 318 (1, M⁺-((CH₃)₂-CH₂ ^·)), 262 (3), 255 (1), 246 (1), 187 (7), 156 (9), 144 (8), 133 (9), 130 (16), 113 (17), 101 (27), 99 (21), 98 (12), 72 (32), 71 (28), 70 (42), 58 (100), 56 (13), 55 (13), 43 (31) und 42 (38).

Reduktion von N,N-Dimethyl-2-(3,3,5,11,13,13-hexamethyl-1,2-dithia-5,8,11-triazacyclotridecan-8-yl)ethylamin (27)⁶
In einen mit einer Gaseinlassvorrichtung, einem Magnetrührstab, einem Stopfen und einem Trockeneiskühler ausgestatteten 50 ml-Dreihalskolben wurden 18,9 mg (0,5 μmol) des tetramethylierten Tetraamindisulfids (27) eingebracht. Der Kühler wurde mit Aceton und Trockeneis gefüllt und der Inhalt des Kolbens wurde mit einem Trockeneisbad gekühlt. Dann wurde in den Kolben so lange flüssiges Ammoniak eingebracht, bis etwa 25 ml zugegeben worden waren. Die Lösung wurde mehrere Minuten gerührt und 36 mg (1,6 mmol) Natrium wurden zugegeben. Das Gemisch wurde 30 min gerührt und Ammoniumchlorid (172 mg) wurde vorsichtig zugegeben. Das Kühlbad wurde dann entfernt, um das Ammoniak verdampfen zu lassen. Der weiße Rückstand wurde mit 45 ml Milli-Q-Wasser gelöst und konzentrierte Chlor-wasserstoffsäure wurde zugegeben, um den pH-Wert dieser Lösung auf 1 zu bringen. Das Gemisch wurde mit Ether (3 × 50 ml) extrahiert und der pH-Wert wurde mit 37%igem Ammoniumhydroxid auf etwa 9 angehoben. Die basische Lösung wurde viermal mit Ether (50 ml) extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt und nacheinander mit Wasser (1 × 30 ml) und Kochsalzlösung (2 × 30 ml) gewaschen. Die Etherphase wurde mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Anschließend wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, wobei 16 mg eines gelben Öls erhalten wurden. Dieses Öl wurde als solches zur Durchführung der ^99mTechnetium-Markierungsstudie verwendet.
Anmerkung
Die HPLC-Analyse dieses Öls zeigte, dass es sich dabei um ein Gemisch aus zwei Komponenten in einem Verhältnis von 2,5/1 handelte, nämlich um das Ausgangsmaterial und die reduzierte Verbindung. Die für diese Analyse eingesetzten HPLC-Bedingungen waren wie folgt: Analytische Säule Hamilton PRP-I, 10 μm, Gradient 10 bis 50% Acetonitril (mit 0,1 TFA) in 40 min. Retentionszeiten: Tetramethyltetraamindisulfid = 7,73 min; Tetramethyltetraamindithiol = 21,55 min.
^99mTechnetium-Markierung Gemischs, das aus der Reduktion von N,N-Dimethyl-2-(3,3,5,11,13,13-hexamethyl-1,2-dithia-5,8,11-triazacyclotridecan-8-yl)ethylamin erhalten worden ist
Experiment A
In einen konischen 1,5 ml-Kunststoffbehälter wurden 30 μl einer methanolischen Lösung (etwa 2 μg/μl) des Gemischs, das aus der Reduktion von N,N-Dimethyl-2-(3,3,5,11,13,13-hexamethyl-1,2-dithia-5,8,11-triazacyclotridecan-8-yl)ethylamin erhalten worden ist, und 0,1 ml Tc-m99-Technetiumglucoheptonat (hergestellt durch Rekonstitution aus einem Behälter von einem FROSSTIMAGE GLUCOHEPTONATE-Kit mit 1 ml Natrium-Tc-m99-pertechnetat) eingebracht. Diese Lösung wurde 20 s mit einem Vortex-Mischer gerührt und 2,5 Stunden bei 63°C erhitzt. Das Gemisch wurde dann mittels ITLC^@ (Instant Thin Layer Chromatography (Schnell-Dünnschichtchromatographie)) analysiert, die in Aceton und in normaler Kochsalzlösung durchgeführt wurde, wobei sich zeigte, dass 90% der Radioaktivität mit dem Chelat verbunden waren. Eine HPLC-Analyse^§ des Markierungsgemischs zeigte die Gegen wart von drei radioaktiven Produkten. Die erste radioaktive Verbindung wurde als
^99mTechnetiumglucoheptonat (R_T: 2,59 min, 19%) identifiziert, während die beiden anderen radioaktiven Verbindungen ^99mTc-N₃S₂-chelatisierte Spezies (R_T: 20,72 und 23,08 min, 68 bzw. 8%) sind.
Experiment B
In einen konischen 1,5 ml-Kunststoffbehälter wurden 30 μl einer methanolischen Lösung (etwa 2 μg/μl) des Gemischs, das aus der Reduktion von N,N-Dimethyl-2-(3,3,5,11,13,13-hexamethyl-1,2-dithia-5,8,11-triazacyclotridecan-8-yl)ethylamin erhalten worden ist, und 0,2 ml Tc-m99-Technetiumglucoheptonat (hergestellt durch Rekonstitution aus einem Behälter von einem FROSSTIMAGE GLUCOHEPTONATE-Kit mit 1 ml Natrium-Tc-m99-pertechnetat) eingebracht. Diese Lösung wurde 20 s mit einem Vortex-Mischer gerührt und 1 Stunden bei 65°C erhitzt. Das Gemisch wurde dann mittels ITLC^¶ (Instant Thin Layer Chromatography (Schnell-Dünnschichtchromatographie)) analysiert, die in Aceton und in normaler Kochsalzlösung durchgeführt wurde, wobei sich zeigte, dass 85% der Radioaktivität mit dem Chelat verbunden waren. Eine HPLC-Analyse^§ des Markierungsgemischs zeigte die Gegenwart von drei radioaktiven Produkten. Die erste radioaktive Verbindung wurde als Tc-m99-Technetiumglucoheptonat (R_T: 2,72 min, 30%) identifiziert, während die beiden anderen radioaktiven Verbindungen Tc-m99-N₃S₂-chelatisierte Spezies (R_T: 20,70 und 23,08 min, 56 bzw. 8%) sind
^¶: Gelman SG-Chromatographiepapier.
^§: Die Hochleistungsflüssigchromatographie wurde mit einem Waters 625LC-Gerät, das mit einer analytischen Säule Hamilton PRP-I, 10 μm, ausgestattet war, unter Verwendung eines 10 bis 50% Acetonitril (+ TFA)-Gradienten in 40 min und einer Flussrate von 1 ml/min durchgeführt.

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Claims

4-Isothiocyanato-N-[2-(3,3,5,11,13,13-hexamethyl-1,2-dithia-5,8,11-triazacyclotridecan-8-yl)ethyl]benzamid.
Verbindung nach Anspruch 1, welche mit Tc-m99, Re-186 oder Re-188 markiert ist.
Chelat, umfassend die Verbindung von Anspruch 1, gekoppelt mit einem Peptid oder Protein an der Isothiocyanat-Gruppe, und ein Tc- oder Re-Radioisotop.
Verbindung nach Anspruch 1, markiert mit einem Tc- oder Re-Radioisotop, zur Verwendung in der Radiographie oder in der radiotherapeutischen Behandlung eines Tumors.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines radiographischen Mittels oder eines radiotherapeutischen Mittels.
Injizierbare oder Infusionslösung, umfassend eine Verbindung nach Anspruch 1, markiert mit einem Tc- oder Re-Radioisotop, in einem pharmazeutisch verträglichen Injektions- oder Infusionsmedium.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung nach Anspruch 1, radiomarkiert mit einem Tc- oder Re-Radioisotop, in freier Form oder in Form eines pharmazeutisch verträglichen Salzes, in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Peptid oder ein Protein, gekoppelt an eine Verbindung nach Anspruch 1, in freier Form oder in Form eines pharmazeutisch verträglichen Salzes und markiert mit einem Tc- oder Re-Radioisotop, in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.