DE69735547T2

DE69735547T2 - Verfahren zur induzierung von immunsupprimierten zellen und vorrichtung zu deren kultivierung

Info

Publication number: DE69735547T2
Application number: DE69735547T
Authority: DE
Inventors: Kenji Takasago-shi YAMASHITA; Takeshi Akashi-shi FUKUCHI; Tomoko Himeji-shi NISHINO
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 1996-09-03
Filing date: 1997-08-29
Publication date: 2007-03-08
Anticipated expiration: 2017-08-30
Also published as: EP0957160A4; US6764688B2; EP0957160B1; AU4031997A; DE69735547D1; EP0957160A1; US20020045252A1; WO1998010055A1; US20010024822A1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Induzierung von immunsupprimierten Zellen und eine Züchtungsvorrichtung, die dabei verwendet werden kann. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Induzierung von immunsupprimierten Zellen, indem man menschliche Zellen unter Verwendung einer Züchtungsvorrichtung mit einer Affinität für Protein züchtet, und die dazu verwendete Züchtungsvorrichtung.
STAND DER TECHNIK
Autoimmunkrankheiten und die Abstoßung bei der Transplantation werden durch folgendes verursacht: die Wirtszellen erkennen selbst-Zellen oder ein transplantiertes Organ als einen Fremdkörper und zerstören die selbst-Zellen oder das transplantierte Organ. Einige Fälle dieser Krankheiten zeigen daß sie durch eine Abnormität von immunsupprimierten Zellen bei der Quantität oder Qualität verursacht werden (vgl. Macintosh und Drachman, Science Bd. 232, S. 401 (1986)). Balashov et al. berichten, daß MS (Multiple Sklerose)-Patienten wegen einer autologen gemischten Lymphocytenreaktion eine merklichen Minderung bei der Effizienz der Induzierung von immunsupprimierten T-Zellen zeigen und daß dieses Phänomen die Ursache für einen Ausfall der MS-Krankheit ist (vgl. Balashov et al., Journal of Clinical Investigation, Bd. 95, S. 2711 (1995)). Dementsprechend erwägt man, daß die Erholung der immunsupprimierten Zellen dieser Patienten bei einem therapeutischen Verfahren für solche Patienten wirksam sein könnte. So wird von mehreren Beispielen der Induzierung von immunsupprimierten T-Zellen in einem System unter Verwendung von Tieren wie Mäusen berichtet zum Beispiel von Fresno et al. (vgl. Fresno et al., Journal of Experimental Medicine, Bd. 163, S. 1246 (1980)). Weiterhin gibt es als ein Beispiel der Induzierung von immunsupprimierten Zellen beim Menschen ein Verfahren, das die autologe gemischte Lymphozytenreaktion verwendet, das in der obigen Referenz beschrieben ist, über das kürzlich berichtet wurde (Balashov et al., (1995) J. Clin. Invest. 95: 2711–2719). Dieses Verfahren erfordert jedoch die Zugabe eines Kulturmediums von humanen Zellen, die mit PHA, Con A oder Anti-CD3-Antikörper oder mehreren Cytokinen behandelt wurden zu der Kultur. Somit ist das Verfahren bei der Ausführung kompliziert. Da darüberhinaus das vorstehend erwähnte Verfahren ein Suspensionskultur-System ist, adhärieren Fremdkörper wie Lektine (PHA oder ConA), die bei der Behandlung verwendet werden, an den Zellen. Da diese Fremdkörper durch Waschen nicht vollständig von den Zellen entfernt werden können, besteht weiterhin bei dem vorstehend erwähnten Verfahren die Möglichkeit der Verunreinigung mit Fremdkörpern. Dementsprechend wurde das Verfahren nie als wünschenswert betrachtet und konnte damals auch nicht zur Induzierung von immunsupprimierten Zellen außerhalb des Körpers eines Patienten verwendet werden. Die vorliegende Erfindung stellt ein effizientes therapeutisches System für Autoimmunkrankheiten bereit, welches die folgenden Schritte umfaßt: die Entnahme von Blutzellen aus dem Patienten; die effiziente Induzierung von immunsupprimierten Zellen, insbesondere immunsupprimierten T-Zellen, unter Verwendung eines Systems mit immobilisiertem Protein; und die Rückführung der resultierenden Blutzellen an den Patienten.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben versucht eine Technik für die Gewinnung von Zellen zu verbessern, die selektiv die Hypersensitivität des Immunsystems unterdrücken, die Autoimmunkrankheiten wie die vorstehend erwähnten verursacht, insbesondere immunsupprimierte T-Zellen, und sie haben die vorliegende Erfindung ausgeführt.
Die vorliegende Erfindung stellt bereit:

1. Verfahren zur Induzierung immunsupprimierter Zellen, umfassend das Züchten von menschlichen Zellen unter Verwendung einer Züchtungsvorrichtung mit einer Affinität für Protein, wobei die Züchtungsvorrichtung zuvor mit einem oder mehreren Cytokin(en) beschichtet wird.
2. Verfahren zur Induzierung immunsupprimierter Zellen, umfassend das Züchten von menschlichen Zellen unter Verwendung einer Züchtungsvorrichtung mit einer Affinität für Protein, wobei die Züchtungsvorrichtung zuvor mit einem oder mehreren Anti-CD3-Antikörper(n) beschichtet wird.
3. Verfahren zur Induzierung immunsupprimierter Zellen, umfassend das Züchten von menschlichen Zellen unter Verwendung einer Züchtungsvorrichtung mit einer Affinität für Protein, wobei die Züchtungsvorrichtung zuvor mit zwei oder mehreren Antikörpern beschichtet wird, und wobei die zwei oder mehreren Antikörper einen Anti-CD2-Antikörper und einen Anti-CD3-Antikörper umfassen.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei mindestens einer der Anti-CD2-Antikörper der Anti-CD2-Antikörper ist, der von dem Hybridom HB-195 (ATCC-Zugangs-Nummer HB 195) hergestellt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei mindestens einer der Anti-CD2-Antikörper gegen ein CD2-Protein von Jurkat-Zellen (ATCC TIB 152) gerichtet ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei mindestens einer der Anti-CD2-Antikörper ein F(ab)₂-Fragment ist.
7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Cytokin IL-2 oder GM-CSF ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei 0,5 bis 10 Volumen-% Serum bezogen auf das Kulturmedium in die Kultur gemischt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei kein Serum mit dem Kulturmedium in die Kultur gemischt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Züchtungsdauer zwischen 1 und 7 Tagen liegt.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Züchtungsvorrichtung aus einem Material mit einer Affinität für Protein gemacht ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Züchtungsvorrichtung aus Plastikmaterial oder Glas gemacht ist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Züchtungsvorrichtung ein geschlossenes, flaches Plattengefäß oder ein geschlossenes Gefäß ist, das mit sphärischen Feinpartikeln versehen ist.
14. Züchtungsvorrichtung, umfassend mehrstufige Platten zur Induzierung von immunsupprimierten Zellen durch Züchten menschlicher Zellen, wobei die Vorrichtung zuvor mit einem oder mehreren Cytokin(en) beschichtet wird.
15. Züchtungsvorrichtung, umfassend mehrstufige Platten zur Induzierung von immunsupprimierten Zellen durch Züchten menschlicher Zellen, wobei die Vorrichtung zuvor mit einem oder mehreren Anti-CD3-Antikörper(n) beschichtet wird.
16. Züchtungsvorrichtung, umfassend mehrstufige Platten zur Induzierung von immunsupprimierten Zellen durch Züchten menschlicher Zellen, wobei die Vorrichtung zuvor mit zwei oder mehreren Antikörpern beschichtet wird, und wobei die zwei oder mehreren Antikörper einen Anti-CD2-Antikörper und einen Anti-CD3-Antikörper umfassen.
17. Züchtungsvorrichtung nach Anspruch 16, wobei mindestens einer der Anti-CD2-Antikörper der Anti-CD2-Antikörper ist, der von dem Hybridom HB-195 (ATCC-Zugangs-Nummer HB 195) hergestellt wird.
18. Züchtungsvorrichtung nach Anspruch 16, wobei mindestens einer der Anti-CD2-Antikörper gegen das CD2-Protein von Jurkat-Zellen (ATCC TIB 152) gerichtet ist.

KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 ist eine Ansicht zur Erklärung einer Ausführungsform der Züchtungsvorrichtung der vorliegenden Erfindung; (a) ist der Schnitt der Ansicht der Vorrichtung, wenn humane Zellen in die Vorrichtung gegeben werden; (b) ist der um 90 Grad gedrehte Schnitt der Ansicht zur Erklärung der Vorrichtung (a); und (c) ist die Draufsicht auf (b).
2 ist der Schnitt der Ansicht zur Erklärung einer anderen Ausführungsform der Züchtungsvorrichtung der vorliegenden Erfindung.
3 ist eine graphische Darstellung, die die immunsupprimierende Wirkung von immunsupprimierten Zellen, die gemäß der vorliegenden Erfindung gewonnen wurden ((a) von BEISPIEL 1), auf die T-Zellaktivierungsreaktion zeigt.
4 ist eine graphische Darstellung, die die immunsupprimierende Wirkung von immunsupprimierten Zellen, die gemäß der vorliegenden Erfindung gewonnen wurden ((b) von BEISPIEL 1), auf die T-Zellaktivierungsreaktion zeigt.
5 ist eine graphische Darstellung, die die immunsupprimierende Wirkung von immunsupprimierten Zellen, die gemäß der vorliegenden Erfindung gewonnen wurden ((c) von BEISPIEL 1), auf die T-Zellaktivierungsreaktion zeigt.
6 ist eine graphische Darstellung, die die immunsupprimierende Wirkung von immunsupprimierten Zellen, die gemäß der vorliegenden Erfindung gewonnen wurden ((d) bis (f) von BEISPIEL 1), auf die T-Zellaktivierungsreaktion zeigt.
7 ist eine graphische Darstellung, die die immunsupprimierende Wirkung von immunsupprimierten Zellen, die gemäß der vorliegenden Erfindung gewonnen wurden (BEISPIEL 2), auf die T-Zellaktivierungsreaktion zeigt.
BESTE AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG
Der Ausdruck „eine Affinität für Protein haben" bedeutet die Eigenschaft zu haben, daß ein Protein mittels einer Bindung wie einer hydrophoben, einer kovalenten oder ionischen Bindung immobilisiert werden kann.
Die Züchtungsvorrichtung der vorliegenden Erfindung kann ein Material sein, das eine Affinität für Protein hat, wobei es nicht-zytotoxisch und sterilisierbar ist. Vorzugsweise wird die Vorrichtung aus einem Material gemacht, das eine Affinität für Protein hat, und das Material ist vorzugsweise ein Plastikmaterial oder ein Glasmaterial. Plastikmaterial bedeutet ein thermostabiles Harz oder ein thermoplastisches Harz. Ein Polymer ist wegen seiner guten Formbarkeit bevorzugt. Polystyrol ist besonders bevorzugt, weil Polystyrol eine hohe Affinität zu Protein hat und weil es farblos und transparent ist. Glasmaterial bedeutet Silikat, Borat, Phosphat und dergleichen, das ohne Kristallbildung fest wird (Glasumwandlung). Wegen der starken Tendenz zur Glasumwandlung wird Silikatglas mehr bevorzugt. Kristallisiertes Glas, das bei Hitzebehandlung von Silikatglas entsteht, ist besonders bevorzugt, weil es eine gute Formbarkeit und gute Stoßfestigkeit hat. Um der Züchtungsvorrichtung eine Affinität für Protein zu verleihen, kann das Material zur Erhöhung der Absorbierbarkeit von Protein behandelt werden. Die übliche Züchtungsvorrichtung wird mit einem Protein wie Kollagen beschichtet, so daß die Absorbierbarkeit von Protein vermindert wird. Das ist für die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung nicht bevorzugt. Bei der Züchtungsvorrichtung der vorliegenden Erfindung ist die Form des Materials, an das sich die Zellen direkt anheften, vorzugsweise die ebene Form oder die Kugelform, weil es erforderlich ist, das Protein gleichmäßig zu immobilisieren, und außerdem ist es erforderlich, daß die Zellen daran gleichmäßig und effizient adsorbieren. Mehr bevorzugt ist die Züchtungsvorrichtung ein geschlossenes, ebenes Plattengefäß oder ein geschlossenes Gefäß, das mit kugelförmigen kleinen Partikeln beladen ist. Als ebenes Gefäß kann ein herkömmlicher Kulturkolben, eine Kulturplatte, ein Gefäß mit einer kulturplattenähnlichen Form oder eine Platte mit mehreren Ebenen, wie in der 1(a) bis 1(c) gezeigt, verwendet werden.
Die Platte mit mehreren Ebenen, wie in der 1 gezeigt, ist eine Ausführungsform der Züchtungsvorrichtung der vorliegenden Erfindung. Wie in 1(a) gezeigt, wird eine Zellsuspension (2), die humane Zellen (1) enthält, aus der Richtung, die durch den Pfeil angegeben wird, auf die Platte gegeben. Wie in 1(b) gezeigt, ist in der Kultur die Vorrichtung um 90 Grad gedreht. Während der Züchtung wird 5 % CO₂ durch den gasdurchlässigen Filter (3) gegeben. Die induzierten immunsupprimierten Zellen können durch etwas starkes Schütteln des Gefäßes freigesetzt werden und durch die Zellgewinnungsöffnung (4) gewonnen werden. Die 1(c) ist eine Draufsicht auf 1(b). Wenn eine solche Platte mit mehreren Ebenen verwendet wird, hat es den Vorteil, daß man zur gleichen Zeit viele Zellen behandeln kann und daß man zur gleichen Zeit eine Vielzahl von Zelltypen, die verschiedene Funktionen haben, induzieren kann. Zum Beispiel können durch Änderung des für die Beschichtung verwendeten Antikörpers sowohl immunsupprimierte Zellen als auch Zellen mit der Fähigkeit der Aktivierung eines immunsuppressiven Mechanismus simultan induziert werden. Wenn das Material der Vorrichtung kugelförmig ist, können kleine Partikel (kleine kugelförmig Beads) in einem Gefäß verwendet werden, wie es in 2 gezeigt ist.
Das in 2 gezeigte Gefäß ist eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. In der 2 kann die Zellsuspension (22) einschließlich humaner Zellen durch den gasdurchlässigen Filter (23) mit 2,5 % CO₂ versorgt werden. Die kugelförmigen kleinen Partikel (25) sind in der Zellsuspension (22) anwesend und adsorbieren die humanen Zellen. Die induzierten immunsupprimierten Zellen werden in der adsorbierenden Form auf den kugelförmigen kleinen Partikeln durch Öffnung des Hahns (26) gewonnen. Die Nummer (27) zeigt eine Seitenwand. Und dann können die induzierten Zellen von den kleinen Partikeln durch Waschen der kleinen Partikel mit zum Beispiel Salzlösung gewonnen werden.
Bei der vorliegenden Erfindung wird besonders bevorzugt eine ebene Plastikplatte als Vorrichtung verwendet, wie sie vor allem bei ELISA-Reaktionen verwendet wird.
Der Ausdruck "humane Zellen" bedeutet Zellen, aus denen der humane Körper aufgebaut ist, und von solche Zellen abgeleitete Zellen. Als humane Zellen der Erfindung können zum Beispiel humane periphere Blutzellen, humane peritoneale Zellen, humane Thymocyten, humane Knochenmarkszellen, etablierte humane T-Zellen und dergleichen verwendet werden. In den Fällen, bei denen ein Patient tatsächlich mit einem Verfahren behandelt wird, bei dem Zellen in den Patienten eingebracht werden, ist es angesichts der immunologischen Abstoßung oder des immunsuppresiven Effekts am meisten bevorzugt, die Zellen des Patienten zu verwenden. Unter den Zellen des Patienten sind die humanen peripheren Blutzellen des Patienten bevorzugt, weil sie leicht zu gewinnen sind. Humane periphere Blutzellen können aus folgendem gewonnen werden: von einem Menschen gewonnenes venöses Blut wird auf Ficoll (Ficoll-paque, hergestellt von Pharmacia Biotech) in einem Polystyrolröhrchen von 50 ml geschichtet und 20 Minuten mit 1500 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert und dann wird eine Lymphozytenfraktion und eine Monocytenfraktion gewonnen, die sich an der Grenzfläche bilden und werden 3 mal mit RPMI-1640-Medium gewaschen (Ficoll-Zentrifugationsverfahren). Die resultierenden humanen peripheren Blutzellen werden in einem Kulturmedium inokuliert und übernacht gezüchtet und es werden Suspensionszellen gewonnen, um T-Zellen zu ergeben.
Der Ausdruck "Antikörper gegen Oberflächenantigene" bedeutet einen Antikörper gegen ein Protein, das die interzelluläre Adhäsion vermittelt; ein Antikörper gegen ein Protein, das bei der Adhäsion sekundär an der Bindung an ein Molekül auf der anderen Zelle teilnimmt; und ein Antikörper gegen einen Rezeptor für verschiedene Cytokine. Als Antikörper können zum Beispiel ein Antikörper gegen die Immunglobulin-Superfamilie, ein Antikörper gegen die Integrin-Superfamilie, ein Antikörper gegen Cadherin oder ein Antikörper gegen den IL2-Rezeptor verwendet werden. Unter ihnen ist der Antikörper gegen die Immunglobulin-Superfamilie bevorzugt, und ein Antikörper, der eine Affinität für das CD2-Antigen oder das CD3-Antigen der humanen T-Zellen oder Analoga davon hat, ist insbesondere bevorzugt.
Der Ausdruck "zwei oder mehr Antikörper gegen Oberflächenantigene, wobei jeder der Antikörper ein unterschiedliches Epitop erkennt" bedeutet zwei oder mehr Antikörper, die jeder eine unterschiedliche Stelle eines Oberflächenantigenmoleküls als ein Antigen erkennen und an die jeweils unterschiedliche Stelle binden. Dabei handelt es sich bevorzugt um zwei Antikörper. Als ein konkretes Beispiel der Antikörper können zum Beispiel zwei Antikörper bevorzugt verwendet werden, die das CD2-Molekül erkennen und ein unterschiedliches Epitop erkennen. Eine Kombination des Anti-CD2-Antikörpers TS2/18 und eines Antikörpers, der von dem Hybridom S33H2NO1O produziert wird, kann mehr bevorzugt verwendet werden (vgl. das folgende REFERENZBEISPIEL 2, BEISPIEL 2 und TESTBEISPIEL 2). Das Verhältnis der Kombination dieser beiden Antikörper ist bevorzugt 1:9 bis 9:1 (Gewichtsverhältnis), insbesondere bevorzugt 1:1 (äquivalentes Gewicht).
Als der "Antikörper gegen das CD2-Antigen (Anti-CD2-Antikörper)" kann zum Beispiel ein monoclonaler Antikörper gegen jedes der verschiedenen Epitope von CD2 oder ein polyclonaler Antikörper gegen das CD2-Molekül oder dergleichen verwendet werden. Ein F(ab)₂-Fragment eines solchen Antikörpers kann auch verwendet werden. Darunter sind der Anti-CD2-Antikörper TS2/18 und sein F(ab)₂-Fragment mehr bevorzugt, weil sie eine starke Affinität zu CD2 haben.
Der "Anti-CD2-Antikörper, der an die Stelle von CD2 binden kann, die an der Bindung von LFA-3 an CD2 beteiligt ist", welches ein bevorzugter Antikörper gegen Oberflächenantigene ist, bedeutet einen Anti-CD2-Antikörper mit der Fähigkeit zur Inhibierung der Bindung des LFA-3-Moleküls an das CD2-Molekül. Konkret wird dieser Typ von Antikörper durch die Messung beurteilt, ob die Bindung von Schaferythrocyten an einen humanen T-Zellstamm (Rosettenbildungsreaktion; vgl. Current Protocols in Immunology, Bd. 1, Sektion 7.2.1 (1991)), wie T-Zellen des peripheren Bluts oder Jurkat-Zellen (vgl. U. Schnider et al., Int. J. Cancer, Bd. 19, S.621 (1977)), inhibiert wird.
Der "Anti-CD2-Antikörper, der an eine andere Stelle von CD2 binden kann als eine Stelle von CD2, die an der Bindung von LFA-3 an CD2 beteiligt ist", welches ein bevorzugter Antikörper gegen Oberflächenantigene ist, bedeutet einen Antikörper, der nicht die Fähigkeit zur Inhibierung der Rosettenbildung hat.
Als der "Antikörper gegen das CD3-Antigen (Anti-CD3-Antikörper)" kann zum Beispiel ein monoclonaler Antikörper, ein polyclonaler Antikörper oder ein F(ab)₂-Fragment davon verwendet werden, die das CD3-Molekül erkennen können. Unter ihnen ist der Anti-CD3-Antikörper (OKT3) mehr bevorzugt, weil er eine starke Affinität für CD3 und die Fähigkeit zur T-Zellaktivierung hat.
Als das "Cytokin" können zum Beispiel IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-8-Rezeptorfamilie, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, GM-CSF, G-CSF, TGF-β, TNF-α, TNF-β, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, ein Macrophagen aktivierender Faktor, ein inhibierender Faktor für die Macrophagenmigration oder dergleichen verwendet werden. Insbesondere sind IL-2 und GM-CSF bevorzugt, weil sie beim Wachstum von T-Zellen und bei der Produktion von Cytokinen wirksam sind. Diese Cytokine können allein oder in Kombination verwendet werden. IL-2 und GM-CSF können aus peripherem Blut oder mittels eines rekombinanten gentechnischen Verfahrens isoliert werden.
Der Ausdruck "immunsupprimierte Zellen" bedeutet Zellen, die die Fähigkeit haben, die Immunreaktion zu inhibieren. Die Messung der Fähigkeit zur Inhibierung der Immunreaktion kann unter Verwendung eines Reaktionssystems vorgenommen werden, bei dem periphere Blutzellen, die aus zwei oder mehreren verschiedenen Individuen gewonnen wurden, gemischt werden (MLR) oder eines Reaktionssystems, bei dem periphere Blutzellen eines Individuums, das T-Zellen hat (Gedächtnis-T-Zellen), die auf ein gewisses Antigen reagieren, und das Antigen gemischt werden, und dergleichen. Wie in den folgenden TESTBEISPIELEN 1 und 2 erklärt, werden in vitro Zellen, die wahrscheinlich immunsuppressive Aktivität haben, gemischt mit humanen peripheren Blutlymphocyten (hier im folgenden auch PBL genannt), die frisch von der selben Person gewonnen wurden. Mit dem resultierenden Gemisch wird PPD (Gereinigtes Proteinderivat; hergestellt von Japan B.C.G. Seizo Co., Ltd.) gemischt und unter den Bedingungen von 37°C mit 5 % CO₂ mehrere Tage gezüchtet, gefolgt von Mischen mit [³H]-Thymidin. Nach weiteren 5 bis 16 Stunden Züchten bei 37°C wird die Radioaktivität in den Zellen mit einem Szintillationszähler gezählt, womit die Fähigkeit zur Inhibierung der Immunreaktion gemessen wird.
Immunsupprimierte Zellen können durch Züchten von humanen Zellen in der Züchtungsvorrichtung oder in der Züchtungsvorrichtung, an die der Antikörper gegen Oberflächenantigene und/oder das Cytokin immobilisiert oder nicht immobilisiert ist, erhalten werden; oder immunsupprimierte Zellen können durch Züchten von humanen Zellen in einem System erhalten werden, wo der Antikörper gegen Oberflächenantigene und/oder das Cytokin mit dem Kulturmedium gleichzeitig oder zuvor oder danach gemischt wird. In dem Fall, daß die humanen Zellen zuerst in die Vorrichtung eingebracht werden, ist eine kurze Zeit für das Mischen des Antikörper und/oder das Cytokins (innerhalb von 3 Tagen) bevorzugt. Mehr bevorzugt werden die humanen Zellen später (innerhalb eines Tages) oder gleichzeitig eingebracht. Besonders bevorzugt werden die humanen Zellen gleichzeitig eingebracht. Die Menge an den Proteinen, die immobilisiert oder zugegeben werden sollen, hängt von dem zu verwendenden Protein ab und deshalb gibt es hier keine spezielle Limitierung. Die bevorzugte Menge bewegt sich 0,1 und 10 μg/ml gegen das Kulturmedium. Wenn die Menge zu gering ist, kann die Induktion der immunsuppressiven Aktivität nicht auftreten und wenn die Menge im Überschuß ist, können die Zellen geschädigt werden.
Als Kulturmedium kann zum Beispiel ein Kulturmedium für tierische Zellen verwendet werden, D-MEM oder RPMI-1640. Das Medium kann nicht mit Serum oder es kann damit gemischt werden. Wenn mit Serum gemischt wird, wird bevorzugt autologes Serum verwendet. Autologes Serum bedeutet ein Serum, das von dem selben Individuum gewonnen wurde wie die humanen Zellen, die gezüchtet oder gewonnen werden sollen. Autologes Serum ist am meisten bevorzugt, weil die Zellwachstumsrate gut ist und weil eine nicht-spezifische Immunreaktion kaum auftritt, wenn autologes Serum verwendet wird. Die Menge an Serum, das zugemischt werden soll, ist nicht speziell limitiert. Im allgemeinen bewegt sich die Menge zwischen 0,5 und 10 Volumen-% (V/V %). Die immunsupprimierten Zellen können durch Züchtung von humanen Zellen in dem vorstehend erwähnten Medium gewonnen werden, üblicherweise unter den Bedingungen von 37°C mit 5 % CO₂, vorzugsweise 1 bis 7 Tage, mehr bevorzugt 1 bis 5 Tage, am meisten bevorzugt 1 bis 3 Tage.
Da die immunsupprimierten Zellen in dem immobilisierten System induziert werden, können die immunsupprimierten Zellen mit einem herkömmlichen Verfahren freigesetzt und gewonnen werden; zum Beispiel durch etwas heftiges Schütteln der Züchtungsvorrichtung.
Es gibt keine Limitierung bezüglich des Dosierungsweges für die immunsupprimierten Zellen, die mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung induziert wurden; die systemische oder lokale Verabreichung unter Verwendung von medizinischen Vorrichtungen wie einem Katheter ist bevorzugt.
Die Menge der zu verabreichenden Zellen ist abhängig vom Zweck der Verabreichung, wie der Art der Erkrankung und dem Ausmaß der Symptome des Patienten, der behandelt werden soll. Es werden zwischen 10⁶ und 5 × 10⁸ Zellen für einen Erwachsenen als tägliche Dosis verabreicht, vorzugsweise zwischen 10⁶ und 10⁸ Zellen, am meisten bevorzugt ab 10⁶ Zellen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein simples und effizientes Verfahren für die Induktion von immunsupprimierten Zellen bereit und stellt auch ein therapeutisches Verfahren zur Behandlung verschiedener Autoimmunerkrankungen und für die Unterdrückung der Abstoßung eines transplantierten Organs bereit.
Die vorliegende Erfindung wird mittels der folgenden BEISPIELE im Einzelnen beschrieben und erklärt. Die vorliegende Erfindung wird durch die BEISPIELE nicht eingeschränkt.
REFERENZBEISPIEL 1
Herstellung der F(ab)₂-Fragmente des Anti-CD2-Antikörpers TS2/18
Ein ml der Antikörperlösung einschließlich 10 mg/ml (PBS) von TS2/18 (American Type Culture Collection (ATCC):HB195) wurde gegen 200 ml 20 mM Acetatpuffer, pH 4,5, über Nacht dialysiert. Nach der Dialyse wurde die Antikörperprobe mit 0,25 ml Pepsin-immobilisiertem Träger (von Pierce hergestellt) gemischt, der zuvor mit 20 mM Acetatpuffer ins Gleichgewicht gebracht worden war, gefolgt von 4 Stunden Inkubation bei 37°C unter starkem Schütteln. Die Reaktion wurde durch Mischen mit 1,5 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, gestoppt. Die resultierenden F(ab)₂-Fragmente wurden unter Verwendung einer Gelfiltrationssäule (Säule: Sephacryl S-200, Pharmacia Biotech; Lösungsmittel: PBS, Flußrate: 0,6 ml/Min.) isoliert.
BEISPIEL 1
Herstellung von immunsupprimierten Zellen durch Züchten von humanen peripheren Blutzellen unter Verwendung der Züchtungsvorrichtung hergestellt aus einer Plastikplatte.
Unter Verwendung von RPMI-1640 (hergestellt von Sigma) einschließlich 10 (V/V %) (hier nachstehend als 10 % bezeichnet) autologem Serum wurde mit 1,5 × 10⁶ Zellen/ml einer Zellsuspension aus normalem humanen peripheren Blut, die hergestellt wurde aus peripherem Blut, das von einem normalen Menschen gewonnen worden war. Jeweils 100 μl der Zellsuspension wurde in insgesamt 20 Mulden einer ELISA-Platte mit 96 Mulden (hergestellt von Corning Inc.) ausgesät und die Züchtung wurde gestartet (a). Jede der 20 Mulden in den ELISA-Platten mit 96 Mulden wurde zuvor mit GM-CSF (hergestellt von RD Systems) und IL-2 (hergestellt von Becton Dickinson Immuncytometry Systems) mit einer Konzentration von 10 ng/ml (PBS) und 20 U/ml (PBS) beschichtet (b); beschichtet mit 10 μg/ml (PBS) F(ab)₂-Fragmenten des Anti-CD2-Antikörpers TS2/18, der in REFERENZBEISPIEL 1 hergestellt wurde (c); beschichtet mit 10 μg/ml (PBS) des Anti-CD3-Antikörpers (OKT3) (hergestellt von Orth Diagnostic Systems Inc.) allein (d); beschichtet mit 10 μg/ml (PBS) des Anti-CD3-Antikörpers und 10 μg/ml (PBS) des Anti-CD2-Antikörpers TS2/18 (ATCC:HB195)(e); und beschichtet mit einem Gemisch von 10 μg/ml (PBS) des Anti-CD3-Antikörpers und 10 μg/ml (PBS) des F(ab)₂-Fragments des Anti-CD2-Antikörpers TS2/18 gleichzeitig (4°C, über Nacht) (f). Die resultierenden Platten wurden mit PBS gewaschen und es wurden jeweils 100 μl von 1,0 × 10⁶ Zellen/ml (weniger als die vorstehend erwähnte Zellzahl) an normalen humanen peripheren Blutzellen zugegeben und die Züchtung wurde gestartet. Danach wurden die Platten in einem Inkubator mit 5 % CO₂ 7 Tage bei 37°C gezüchtet, die Zellen wurden durch Pipettieren gewonnen und 3 mal mit PBS gewaschen, und dann wurden die Zellen mit einer Endkonzentration von 3 × 10⁶ Zellen/ml in RPMI-1640 suspendiert, das 10 % autologes Serum enthielt.
VERGLEICHSBEISPIEL 1
Beschichtung von normalen Züchtungsvorrichtungen mit Cytokinen und Antikörpern und Züchtung Die Züchtungsvorrichtungen wurden auf dieselbe Weise beschichtet wie in BEISPIEL 1, außer daß übliche Kulturplatten mit 96 Mulden (hergestellt von Corning Inc.) verwendet wurden. Die für die Beschichtung verwendeten Cytokine und Antikörper wurden ausgewaschen.
Die humanen Zellen wurden auf dieselbe Weise wie bei (a) von BEISPIEL 1 in 20 nicht beschichtet Mulden gesät, um Zellsuspensionen zu ergeben.
TESTBEISPIEL 1
Die Suppression der Aktivierung einer Antigen (PPD)-spezifischen T-Zelle durch immunsupprimierte Zellen, die von humanen peripheren Blutzellen gewonnen wurden.
Unter Verwendung von RPMI-1640 (hergestellt von Sigma), das 10 autologes Serum enthielt, wurde aus peripheren Blutzellen, die von einem normalen Menschen gewonnen wurden, eine Zellsuspension von 1 × 10⁶ Zellen/ml hergestellt. Jeweils 100 μl der Zellsuspension wurde in Platten mit 96 Mulden mit rundem Boden (hergestellt von Corning Inc.) pipettiert. In jede Mulde wurde mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml PPD (hergestellt von Japan B.C.G Seizo Co., Ltd.) gegeben. Gleichzeitig wurden jeweils Zellen, die in BEISPIEL 1 (a) bis (f) gewonnen wurden, in RPMI-1640, das 10 % autologes Serum enthielt, suspendiert, und jeweils 30 μl der Zellsuspensionen, die 0,25 × 10⁵ Zellen/Mulde und/oder 0,5 × 10⁵ Zellen/Mulde enthielten, in jede Mulde gegeben und 5 Tage gezüchtet (bei 37°C in dem Inkubator mit 5 % CO₂). Nach dem Beimischen von 1 μ Ci [³H] Tymidin zu jeder Mulde und 15 Stunden Züchten wurden die Zellen unter Verwendung eines Zellerntegeräts (LABO MASH; hergestellt von LABO SCIENCE) geerntet. Die durch ³H in die Zellen eingebrachte Radioaktivität wurde unter Verwendung des Scintillationszählers LSC-700 (hergestellt von Aloka) gemessen. Als positive Kontrolle wurden in die Mulden anstelle der Zellen von BEISPIEL 1 30 μl an RPMI-1640, das 10 % autologes Serum enthielt, eingebracht und gemessen.
Die Ergebnisse sind in den 3 bis 6 gezeigt. Wenn die Zellen, die gemäß BEISPIEL 1(a) behandelt worden waren, mit einem Viertel oder der Hälfte der Zahl an humanen Zellen gemischt wurden, die mit einem PPD-T-Zellaktivierungssytem behandelt worden waren, wurden etwa 30 % Suppression beobachtet (3). In dem Fall, wo die Zellen verwendet wurden, die in BEISPIEL 1 (b) in der Gegenwart von Cytokinen behandelt worden waren, wurden etwa 55 % Suppression beobachtet (4). Die Suppression war etwa 20 %, wenn die Zellen verwendet wurden, die gemäß BEISPIEL 1 (c) behandelt worden waren (5) und wenn jeweils die Zellen verwendet wurden, die gemäß BEISPIEL 1 (d), (e) und (f) behandelt worden waren, wurden jeweils etwa 50 %, 67 % und 78 % Suppression beobachtet (6).
Die Zellen, die in VERGLEICHSBEISPIEL 1 erhalten worden waren, wurden auf die gleiche Weise wie vorstehend erwähnt in dem Kulturmedium suspendiert und jeweils 30 μl der Zellsuspension, die 1,0 × 10⁵ Zellen/Mulde oder 0,5 × 10⁵ Zellen/Mulde enthielten, wurden in jede der Mulden gebracht und wie vorstehend beschrieben gezüchtet.
Die Ergebnisse zeigten etwa –50 % beziehungsweise etwa –30 Suppression. Das heißt, daß wenn die humanen Zellen in der üblichen Züchtungsvorrichtung gezüchtet werden, immunsupprimierte Zellen nicht induziert wurden, sondern eher die Immunreaktion verstärkt wurde.
REFERENZBEISPIEL 2
Herstellung von Anti-humanen CD2-Antikörpern
Anti-humane CD2-Antikörper können wie folgt hergestellt werden: (a) Gewinnung von CD2-Protein aus der humanen T-Zelllinie: Jurkat-Zelle (ATCC TIB (Tumor Immunology Bank) 152); (b) Immunisieren von Mäusen mit dem resultierenden CD2-Protein, um Hybridome zu ergeben; und (c) mittels ELISA unter Verwendung des CD2-Proteins Durchmusterung auf Hybridome, die Anti-CD2-Antikörper produzieren können. Die Verfahren dazu sind wie folgt:
(a) Gewinnung des CD2-Proteins aus Jurkat-Zellen
Die Jurkat-Zellclone mit 5,8 × 10⁸ Zellen wurden in 2500 ml RPMI-1640 (hergestellt von Sigma), das 10 % FCS (fötales Kälberserum) enthielt, bei 37°C in einem Inkubator mit 5 % CO₂ bis zu einer Konzentration von 7 × 10⁵ Zellen/ml gezüchtet und 1,75 × 10⁹ Zellen der Clone wurden einer Reinigung unterzogen. Die Clone wurden in 40 ml Lysepuffer (0,01 M Tris-HCl (pH 8,0), 0,15 M NaCl, 1 % Triton X-100, 1 mM Iodacetamid (hergestellt von Sigma), 1 mM PMSF) suspendiert und mit dem Mini-Disk-Rotor (hergestellt von Biocraft) 1 Stunde bei 4°C behandelt. Nach 15 Minuten Zentrifugation mit 3615 G bei Raumtemperatur wurde NaDOC (Natriumdesoxycholat: hergestellt von Sigma) mit einer Endkonzentration von 0,5 % NaDOC zugemischt und der Überstand wurde durch Ultrazentrifugation (mit 158.000 G, 4°C, 60 Minuten) gewonnen. Die resultierende Probe wurde unter Verwendung der Antikörpersäule als Jurkat-gereinigter Überstand der Reinigung unterworfen.
Die Antikörpersäule wurde unter Verwendung von Affi-Gel 10 (hergestellt von Bio-Rad Laboratories, Inc.) als ein Träger durch Immobilisierung des Anti-CD2-Antikörpers TS2/18 (ATCC HB195) auf dem Träger (1 mg/ml Gel) hergestellt. Eine Econo-Säule (Φ: 1 cm, Höhe: 10 cm, hergestellt von Bio-Rad Laboratories, Inc.) wurde mit 5 ml immobilisiertem Gel beladen. Die Probe wurde aufgebracht (1ml/Min.), mit 50 ml PBS gewaschen, gefolgt von der Elution mit 100 ml Elutionspuffer (0,1 M Trinatriumcitrat (pH 3)). Die eluierte Probe wurde unter Verwendung des Neutralisationspuffers (1 M Tris-HCl (pH 11)) auf einen neutralen pH-Wert gebracht.
Der Elutionspuffer wurde mit der Dialysekassette (hergestellt von Pierce) durch PBS ersetzt und der Proteingehalt in der Probe gemessen. Als Ergebnis wurde bestätigt, daß etwa 150 μg CD2-Protein erhalten wurden. Darüber hinaus wurde als Immunisierungsantigen das Antigen verwendet, das mit PEG 20.000 (hergestellt von Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.) gereinigt worden war.
(b) Immunisierung von Mäusen mit dem CD2-Protein und Isolierung von Hybridomen
Das gereinigte humane CD2, das vorstehend unter (a) erhalten wurde, wurde mit einem kompletten Adjuvans-Titer MAX (hergestellt von CytRX Corporation) gemischt. Das resultierende Gemisch wurde insgesamt 4 mal mit einem Abstand von einer Woche (25 μg/Injektion/Maus) peritoneal in 5 Wochen alte Balb/c-Mäuse (gekauft bei Japan SLC Co., Ltd.) injiziert. Die in den immunisierten Mäusen gebildeten Antikörper wurde unter Verwendung der Platte, die mit CD2-Protein beschichtet war, mittels ELISA in ihrem Titer bestätigt (Bestätigung ob ein ausreichender Titer an Antikörpern erhalten wurde) und den Mäusen wurde die Milz entnommen. In IMDM (hergestellt von Sigma)/10 % FCS-Kulturmedium wurden fünfzehn ml Milzzellsuspension hergestellt. Danach wurde die Suspension bei Raumtemperatur mit 1000 U/Min. 10 Minuten zentrifugiert und es wurden Zellen gewonnen. Zehn ml 0,17 M NH₄Cl wurden für die Hämolyse mit den Zellen gemischt. Die Suspension wurde erneut wie vorstehend beschrieben zentrifugiert und in 10 ml IMDM/10 % FCS-Kulturmedium suspendiert, um eine Lösung herzustellen, die 1 × 10⁸ der Milzzellen enthielt.
Um die Hybridome herzustellen wurden die Milzzellen und die Maus-Myelomzellen SP2/O-Ag14 (ATCC CRL (Cell Repository Lines)1581) verwendet. Die Zellen wurden mit IMDM-Kulturmedium gewaschen und mit einer Endkonzentration von 2 × 10⁷ bis 3 × 10⁷ Zellen gewonnen.
Die Zellen wurden durch Mischen der Milzzellen und der Myelomzellen in einem Verhältnis von 5:1 (Milzzellen: 1 × 10⁸ Zellen und Myelomzellen: 2 × 10⁷ Zellen) fusioniert und die resultierenden fusionierten Zellen wurden 5 Minuten bei Raumtemperatur mit 1000 U/Min. zentrifugiert und dann gewonnen. Nachdem die Zellen mit 30 ml IMDM-Kulturmedium gewaschen worden waren, wurden 2 ml an 50 -igem PEG 1500 (hergestellt von Boehringer Mannheim GmbH) langsam damit gemischt, und unter starkem Schütteln für 1 Minute wurden innerhalb von 2 Minuten 4 ml IMDM-Kulturmedium damit gemischt. Innerhalb von 2 bis 3 Minuten wurden noch einmal 16 ml IMDM-Kulturmedium damit gemischt, und erneut wie vorstehend erwähnt zentrifugiert und Zellen gewonnen. Als nächstes wurden die resultierenden Zellen in 5 %-igem Briclone (hergestellt von Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.)-HAT (hergestellt von GIBCO BRL)-IMDM/10 % FCS-Kulturmedium suspendiert, um eine Suspension von 3 × 10⁶ Zellen/ml zu ergeben. Die Zellen wurden in einer Platte mit 96 Mulden und flachem Boden (hergestellt von IWAKI GLASS) mit 100 μl/Mulde ausgesät. Nach 7 Tagen Züchtung bei 37°C in dem Inkubator mit 5 % CO₂ wurde das Kulturmedium gegen HT (hergestellt von GIBCO BRL)-IMDM/10 % FCS ausgetauscht. Das Kulturmedium wurde alle 3 Tage gewechselt, um die Hybridome zu isolieren.
(c) Selektion der Anti-CD2-Antikörper produzierenden Hybridomen
50 μl von humaner CD2-Lösung (5 μg/ml PBS), die gemäß dem vorstehend erwähnten Verfahren (a) hergestellt wurden, wurden in jede Mulde eingebracht und die ELISA-Platte mit 96 Mulden (hergestellt von Corning Inc.) wurde bei 4°C über Nacht mit der Lösung beschichtet. Nach dem Waschen mit PBS/0,05 %-igem Tween 20 wurde unter Verwendung von 4-fach verdünnter Blockace (hergestellt von Nakalai Tesque) für 2 Stunden bei Raumtemperatur eine Blockierungsbehandlung durchgeführt. Nach Waschen mit PBS/0,05 %-igem Tween 20 wurden jeweils 50 μl Überstand der Hybridome in jeder der Mulden plaziert und 1 Stunde bei Raumtemperatur gelassen. Nach Waschen mit PBS/0,05 %-igem Tween 20 wurden wurde mit HRP (Meerrettich-Peroxidase) (hergestellt von Cappel) markierter, 1000-fach verdünnter Anti-Maus-IgG-Antikörper damit gemischt, für 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen, mit PBS/0,05 %-igem Tween 20 gewaschen, und 100 μl an Chromophor-Flüssigkeit (10 mg an O-Phenylendiamin-Tablette (hergestellt von Sigma) und 10 μl H₂O₂ wurden in Citrat-Phosphat-Puffer gelöst) damit gemischt und 10 Minuten reagieren gelassen. Die gefärbten Clone wurden als die Anti-CD2-Antikörper produzierenden Hybridome selektiert.
BEISPIEL 2
Herstellung von humanen peripheren Blutzellen, gezüchtet auf einer Plastikplatte mit immobilisiertem Antikörper
Von den Hybridomen, die in REFERENZBEISPIEL 2 erhalten wurden, wurden sieben Clone mit einer hohen Reaktivität im ELISA selektiert. Die Clone wurden in serumfreiem Medium 4 Tage bei 37°C in dem Inkubator mit 5 % CO₂ gezüchtet und somit wurden Kulturmedien erhalten, die jeweils Antikörper enthielten. Dann wurden jeweils 20 Mulden einer ELISA-Platte (hergestellt von Corning Inc.) mit 96 Mulden mit jedem dieser Antikörper enthaltenden Medien und dem Anti-CD2-Antikörper TS2/18 beschichtet (10 μl des Kulturmediums von jedem Clon und 0,5 μg an TS2/18 wurden in jede Mulde gegeben und bei 4° über Nacht stehen gelassen). Nach dem Waschen mit PBS wurden jeweils 100 μl einer Suspension von normalen humanen peripheren Blutzellen, die unter Verwendung von RPMI-1640 (hergestellt von Sigma), das 10 % autologes Serum enthielt, auf eine Konzentration von 1,0 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt worden war, in allen Mulden ausgesät. In ähnlicher Weise wurden jeweils 100 μl derselben Zellsuspension in 20 Mulden ausgesät, die mit 0,5 μg an TS2/18 allein beschichtet worden waren und in 20 Mulden ohne Beschichtung. Nach 7 Tagen Inkubation bei 37°C in dem Inkubator mit 5 % CO₂ wurden alle Zellen in allen Mulden gewonnen und dreimal mit PBS gewaschen. Dann wurden die Zellen in RPMI-1640-Kulturmedium (hergestellt von Sigma), das 10 % autologes Serum enthielt, mit einer Endkonzentration von 3 × 10⁶ Zellen/ml suspendiert.
TESTBEISPIEL 2
Bewertung der Zellen, die mit dem immobilisierten Antikörper behandelt worden waren, bezüglich der Fähigkeit zur Suppression der Antigen (PPD)-spezifischen T-Zellaktivierungsreaktion
In eine Platte mit 96 Mulden mit rundem Boden (hergestellt von Corning Inc.) wurden jeweils 100 μl einer Suspension von normalen humanen peripheren Blutzellen geschüttet, die unter Verwendung von RPMI-1640 (hergestellt von Sigma), das 10 % autologes Serum enthielt, auf eine Konzentration von 1,0 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt worden war. In jede der Mulden wurde PPD (hergestellt von Japan B.C.G Seizo Co., Ltd.) mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml gegeben. Simultan wurden jeweils 30 μl der Zellsupensionen, die 10⁵ Zellen/Mulde der Zellen enthielten wie hergestellt in BEISPIEL 2, in die Mulden gegeben und 5 Tage gezüchtet (bei 37°C in dem Inkubator mit 5 % CO₂). Dann wurde 1 μCi [³H] Thymidin zu jeder Mulde zugegeben, 15 Stunden gezüchtet und die Zellen wurden unter Verwendung eines Zellerntegeräts (LABO MASH; hergestellt von LABO SCIENCE) geerntet. Die durch ³H die Zellen eingebrachte Radioaktivität wurde unter Verwendung des Scintillationszählers LSC-700 (hergestellt von Aloka) gemessen.
Wie in 7 gezeigt, wurde bei 4 Clonen (S31A2NO1, S32D7NO9, S33H2NO10 und L12A9NO22) von 7 Clonen gefunden, daß sie die PPD-T-Zellaktivierung signifikant unterdrücken, wenn sie mit TS2/18 kombiniert werden. Ihre Suppressionsraten waren: S31A2NO1 (47 %), S32D7NO9 (29 %), S33H2NO10 (74 %) beziehungsweise L12A9NO22 (34 %). Speziell wurde bei dem System, welches S33H2NO10 verwendete, beobachtet, daß es die immunsupprimierten Zellen stark induziert. Das vorliegende Experiment wurde mit n = 2 durchgeführt und die Werte in den Figuren entsprechen dem Mittelwert der Experimente.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Gemäß der vorliegenden Erfindung können immunsupprimierte Zellen durch die immobilisierte Züchtung effizient induziert werden. Somit kann die vorliegende Erfindung ein effizientes therapeutisches System mit weniger Nebenwirkungen bereitstellen, mit dem Krankheiten mit einer Hypersensitivität des Immunsystems effizient behandelt werden können.

Claims

Verfahren zur Induzierung immunsupprimierter Zellen, umfassend das Züchten von menschlichen Zellen unter Verwendung einer Züchtungsvorrichtung mit einer Affinität für Protein, wobei die Züchtungsvorrichtung zuvor mit einem oder mehreren Cytokin(en) beschichtet wird.
Verfahren zur Induzierung immunsupprimierter Zellen, umfassend das Züchten von menschlichen Zellen unter Verwendung einer Züchtungsvorrichtung mit einer Affinität für Protein, wobei die Züchtungsvorrichtung zuvor mit einem oder mehreren Anti-CD3-Antikörper(n) beschichtet wird.
Verfahren zur Induzierung immunsupprimierter Zellen, umfassend das Züchten von menschlichen Zellen unter Verwendung einer Züchtungsvorrichtung mit einer Affinität für Protein, wobei die Züchtungsvorrichtung zuvor mit zwei oder mehreren Antikörpern beschichtet wird, und wobei die zwei oder mehreren Antikörper einen Anti-CD2-Antikörper und einen Anti-CD3-Antikörper umfassen.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei mindestens einer der Anti-CD2-Antikörper der Anti-CD2-Antikörper ist, der von dem Hybridom HB-195 (ATCC-Zugangs-Nummer HB 195) hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei mindestens einer der Anti-CD2-Antikörper gegen ein CD2-Protein von Jurkat-Zellen (ATCC TIB 152) gerichtet ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei mindestens einer der Anti-CD2-Antikörper ein F(ab)₂-Fragment ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Cytokin IL-2 oder GM-CSF ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei 0,5 bis 10 Volumen-% Serum bezogen auf das Kulturmedium in die Kultur gemischt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei kein Serum mit dem Kulturmedium in die Kultur gemischt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Züchtungsdauer zwischen 1 und 7 Tagen liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Züchtungsvorrichtung aus einem Material mit einer Affinität für Protein gemacht ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Züchtungsvorrichtung aus Plastikmaterial oder Glas gemacht ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Züchtungsvorrichtung ein geschlossenes, flaches Plattengefäß oder ein geschlossenes Gefäß ist, das mit sphärischen Feinpartikeln versehen ist.
Züchtungsvorrichtung, umfassend mehrstufige Platten zur Induzierung von immunsupprimierten Zellen durch Züchten menschlicher Zellen, wobei die Vorrichtung zuvor mit einem oder mehreren Cytokin(en) beschichtet wird.
Züchtungsvorrichtung, umfassend mehrstufige Platten zur Induzierung von immunsupprimierten Zellen durch Züchten menschlicher Zellen, wobei die Vorrichtung zuvor mit einem oder mehreren Anti-CD3-Antikörper(n) beschichtet wird.
Züchtungsvorrichtung, umfassend mehrstufige Platten zur Induzierung von immunsupprimierten Zellen durch Züchten menschlicher Zellen, wobei die Vorrichtung zuvor mit zwei oder mehreren Antikörpern beschichtet wird, und wobei die zwei oder mehreren Antikörper einen Anti-CD2-Antikörper und einen Anti-CD3-Antikörper umfassen.
Züchtungsvorrichtung nach Anspruch 16, wobei mindestens einer der Anti-CD2-Antikörper der Anti-CD2-Antikörper ist, der von dem Hybridom HB-195 (ATCC-Zugangs-Nummer HB 195) hergestellt wird.
Züchtungsvorrichtung nach Anspruch 16, wobei mindestens einer der Anti-CD2-Antikörper gegen das CD2-Protein von Jurkat-Zellen (ATCC TIB 152) gerichtet ist.