DD272473B3

DD272473B3 - Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen die epsilon-kettedes cd 3-antigens humaner t-lymphozyten

Info

Publication number: DD272473B3
Application number: DD31670088A
Authority: DD
Inventors: Helmut Professor Dipl-B Fiebig; Hartmut Dr Med Kupper; Wolfram Dipl-Biochem Eichler
Original assignee: Univ Leipzig
Priority date: 1988-06-13
Filing date: 1988-06-13
Publication date: 1993-01-21
Also published as: DD272473A1

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die mit einem Zellmembranantigen (p207) des CD3-Komplexes humaner T-Lymphozyten reagieren. Die monoklonalen Antikörper können zur medizinischen Diagnostik und zur Eliminierung von normalen und neoplastischen humanen T-Lymphozyten eingesetzt werden.

Charakterisierung der bekannten technischen Lösungen '

Es ist bereits bekannt, monoklonale Antikörper herzustellen. Die Prinziplösung der Hybrldomherstellung wurde von KÖHLER und MILSTEIN (Nature 256, (1975], S.495) beschrieben.

Es sind monoklonale Antikörper bekannt, die mit unterschiedlichen Zelloberflächenantigenen humaner T-Lymphozyten reagieren (P.CKUNG, G.GOLDSTEIN: Human T-lymphocyte differentiation antigens detected by monoclonal antibodies, Research Monographs in Immunology, Vol.3, S.5-15, Hrsg.: TURK, Elsevier/North Holland Biomedical Press, Amsterdam, New York, Oxford 1981 sowie J.A.LEDBETTER, A.E.FRANKEL, L.A.HERZENBERG: Human Leu T-cell differentiation antigens: quantitative expression on normal lymphoid cells and cell-lines, ebenda, S. 16-22). Zu den verbreitetsten monoklonalen Antikörpern, die mit der Gesamtheit der humanen T-Zellen reagieren, gehören OKT3 (US-PS 4515 893), OKT1 (US-PS 4515894), Anti-T12 (EP 0097518) und OKT11 (US-PS 4614720). Darüber hinaus sind weitere monoklonale Antikörper bekannt geworden, die ebenfalls T-Zell-spezifisch reagieren (OD 238168A 3) und sogar an den antigenspezifischen Rezeptorkomplex der humanen T-Zellen binden (DD-PS 250333).

Die monoklonalen At itikörper gegen humane Leukozyten sind für die medizinische Diagnostik von großer Bedeutung, so daß im Rahmen von bisher drei Workshops über Leukozytenantigene (Paris 1982, Boston 1984, Oxford 1986) eine internationale Standardisierung begonnen wurde, die zur CD-Nomenklatur („Cluster of Differentiation") der entsprechenden monoklonalen Antikörper geführt hat. Die monoklonalen Antikörper der CD-Gruppen 2,3,5,6 und 7 reagieren mit allen oder zumindest der großen Mehrheit der humanen T-Zellen (Leukocyte Typing II. Vol. 1-3, Hrsg.: E. L. REINHERZ et al.: Springer-Verlag, New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo 1986).

Kür den Nachwels der Gesamtheit der humanen T-Zellen wird vielfach der monoklonal Antikörper OKT3 (US-PS 4615893) eingesetzt. Ein Äquivalent ist der Anti-Leu 4 der Firma Becton/Dicklnson. Beide monoklonalen Antikörper sind dem CD3 zuzuordnen.

Die besondere Bedeutung dei Antikörper der CD3-Qruppe liegt in der engen Assozierung dieses CD3-Antigenkomplexes mit dem antlgenepezifischen T-Zellrezeptor. Sowohl der hauptsächlich vorkommende Alpha/Beta-Rezeptor, als auch die relativ seltenen Qamm/Qamma- bzw. Gam.na/Delta-Rezeptoren sind durch eine relativ feste nichtkovalente Bindung-mlt dem CD 3-Komplex auf der Zellmembran der reifen T-Lymphozyten verbunden. DIo Neuanordnung der Genstücke der Ketten des T-Zellrezeptors, deren Synthese und Zeiloberflächenexpression sind die determinierenden Ereignisse in der Ontogenese der T-Lymphozyten. Es gilt als sicher, daß der T-Zellrezeptor für die Realisierung seiner Signalweitergabefunktion der Kooperation mit dem CD3-Komplex bedarf. Es gibt bisher noch keine Hinwelse, daß der T-Zellrezeptor auf der Zellmembran ohne den CD3-Komplex vorkommt oder gar ohne ihn funktionell wirksam werden könnte. Diese strukturelle und funktioneile Assoziierung des antigenspezifischen T-Zellrezeptors und des CD3-Komplexes macht monoklonale Antikörper gegen die CD3-Antlgene zu solchen hochspezifischen Nachweisreagenzien für T-Lymphozyten.

Der CD3-Komplex besteht aus mindestens drei verschiedenen Ketten. Die Gamma-Kette ist ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 25kDa, wobei infolge der unterschiedlichen Glykosylierung aber auch Komponenten im gesamten Bereich von 25 bis 29kDa auftreten können. Die Delta-Kette ist ebenfalls ein Glykoprotein und besitzt ein M₁ von 2OkDa. Nach Deglykosylierung entstehen zwei Polypeptide mit Molekulargewichten von 14 und 16kDa (BORST, J., et al., Nature 312, (1984), S. 455-458). Die Epsilon-Kette hat ebenfalls ein M₁ von 20 kDa, ist aber im Gegensatz zu den anderen beiden Ketten nicht glykosyliert (BORST etal., Eur. J. Immunol. 13 (1983), S. 576-580).

Soweit bekannt, reagieren die meisten beschriebenen monoklonalen CD3-Antlkörper entweder mit der Gamma- oder Delta-Kette, wobei aufgrund der engen Assoziierung in unterschiedlichen Anteilen auch die anderen Ketten (epcilon, aber auch alpha und beta) mitisoliert werden können (Leucocyte Typing III, Hrsg.: A. J. McMICHAEL etal., Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo 1987). Es sind bisher nur zwei monoklonale Antikörper (3P6 und SP10) beschrieben worden, die mit der Epsilon-Kette reagieren (PESSANO etal., EMBO J.4, (1985), S.337-344). Diese monoklonalen Antikörper wurden durch Immunisierung mit der isolierten denaturierten Epsilon-Kette erzeugt und reagieren auch mit NDS-denaturierten Epitopen dieser Kette In Immunblottingexperimenten. Es sind bisher keine monoklonalen Antikörper mit nativen Molekülen des CD3-Komplexes selektiert worden, die mit der zellständigen Epsilon-Kette reagieren.

Ziel der Erfindung Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen spezifischerAntikörper für die Epsilon-Kette des CD3-Antigens (Protein

2OkDa) der humanen T-Lymphozyten gestattet.

Die monoklonalen Antikörper sollen eine hohe Affinität besitzen und mit einem Epitop der Epsilon-Kette des CD3-Antigens

reagieren, das sowohl auf ruhenden als auch auf aktivierten T-Lymphozyten exprimiert wird, und sie sollen sich dadurch zur qualitativen und quantitativen durchflußzytometrischen Analyse, zum immunhistologischen Nachweis von T-Zellen in

Kryostatgewebeschnitten sowie zur Eliminierung von normalen und neoplastischen T-Zellen aus Lymphozytenpräparationen

eignen.

Die monoklonalen Antikörper sollen stabil und lagerfähig sein. Sie sollen sich auch zur direkten Kopplung mit Fluoreszenzfarbstoffen eignen. Durch die Bereitstellung solcher monoklonalen Antikörper soll die medizinische Diagnostik von humanen T-Lymphozyten

qualifiziert werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung ' Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren anzugeben, in dessen Verlauf zunächst Hybridome

erzeugt werden, die leicht und unaufwendig handhabbar sind und deren Kultivierung in technisch und ökonomisch vorteilhafter

Welse möglich ist. Unter Verwendung dieser Hybridome sollen in anschließenden Verfahrensschritten monoklonale Antikörper

erzeugt werden, die mit der Epsilon-Kette des CD3-Antigens, einem Protein von 2OkDa, der humanen T-Zellen regieren.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß zunächst nach den bekannten Verfahren der Dichtegradientenzentrifugation Lymphozyten

aus dem peripheren Blut von gesunden Spendern isoliert werden. Durch Passage über Nylonwolle oder E-Rosettenbildung werden daraus T-Lymphozyten gewonnen.

Mit in der vorangehend beschriebenen oder auf eine andere ähnliche Weise gewonnenen humanen T-Lymphozyten werden Mäuse immunisiert. Vorzugsweise werden 6-8 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse verwendet. Die Immunisierung erfolgt

durch mehrmalige Applikation des Antigens.

Aus den Milzen derart hyperimmunisierter Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Lymphozyten dieses Zellgemisches werden mit Maus-B-Myelomzellen fusioniert. Die geeigneten Maus-Myelomzellen P3-X63 Ag 8.653 (KEARNEY etal., J. Immunol. 123, (1979), S. 1548) werden in RPMM640 mit 10% fetalem Kälberserum (FKS)

gehalten.

In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält (LITTLEFIELD, Science 145, (1964), S.709),

werden die gebildeten Hybridzellen von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß Zeilklone selektiert, die Antikörper der gewünschten Spezifität und der anderen in der Zielstellung genannten Eigenschaften sezernieren.

Die Selektion der Hybridome erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten

200^l-Kulturen aufgeteilt werden. Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die

Anwesenheit von Antikörpern getestet, die nur mit Zetloberflächenantigenen von humanen T-Lymphozyten reagieren. Hierzu

werden alle Kulturüberstände, die mit humanen Blutlymphozyten reagieren, mit B-Lymphozyten, die durch Eliminierung der

Τ-ΖβΙΙβη durch E-Rosettentechnlk und/oder Nylonwolloaeparatlon gewonnen werden, getestet. Nur diejenigen Kulturen werden welter verwendet, dnren Antikörper nicht mit B-Lymphozyten, wohl aber mit der großen Mehrheit der Blutlymphozyten und allen separierten T-Lympnozyten reagieren. DleTeetung der KulturOberstflnde mit den entsprechenden Zellen kann sowohl durch Indirekte Radiobindungstechnik als auch durch indirekte Immunfluoreszenz erfolgen.

So selektierte Kulturen müssen ab dieser Stufe Jedoch auf jeden Fall mit der indirekten Immunfluoreszenztechnik überprüft werden. Dadurch wird ausgeschlossen, daß Hybridoma weitergezogen werden, deren Antikörper mit B-Lymphozyton, Monozyten, Granulozyten, Thrombozyten und Erythrozyten reagieren.

Unter den in solcher Art vorselektierten Kybridomen werden nun erfindungsgemäß solche Klone gesucht, deren Antikörper nach Bindung an Lymphozyten und Entwicklung mit FITC-markiertem Anti-Mauslmmunglobulln und nachfolgender Zugabe von TRITC-marklertem Antl-Pan-B-Zellen-Antlkörper keine Doppelmarkierung von Zellen ergeben. Als Pan-B-Zell-Antlkörper können eingesetzt werden: BL-B 22 oder BL-B 20.

In einem weiteren Selektionsschritt wird durch Doppelmarkierung mit einem TRITC-marklertem Antl-Pan-T-Zell-Antikörper nachgeprüft, daß alle durch diesen Pan-T-Zell-AntikÖrper markierten Lymphozyten auch durch den Hybrldomüberstand markiert werden. Als Pan-T-Zell-Antikörper oignet sich besonders TRITC-BL-T/Rec.

Unter den so selektierten Hybridomen werden dann nur die weitergezogen, deren monoklonal Antikörper mit einem etablierten CD3-Antikörper komodulieren.

In einem anschließendem Selektionsschritt werden davon alle die Hybridome weiterkultiviert, deren Antikörper humane T-Lymphozyten nach Indirekter Markierung ausreichend stark anfärben, so daß die monoklonalen Antikörper sowohl zur qualitativen als auch zur quantitativen Analyse >r. durchflußzytometrischen Verfahren, wie z. B. der Analyse mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACS 440), eingesetzt werden können.

In einem weiteren Selektionsschritt werden die selektierten Hybridome überprüft, ob sie sich für die Markierung von antigentragenden Zellen in Kryostatschnltten lympholdei* Gewebe eignen und daß sie keine Nebenreaktionen mit anderen Geweben aufweisen.

In einem weiteren Selektionsschritt werden dann nur Hybridome weitergezogen, deren monoklonal Antikörper von den Membranen der T-Lymphozyten ein Antigen isolieren, welches ein apparentes Molekulargewicht von ca. 20 kDa, auch nach Deglykosylierung durch Endo-F, basitzt.

Zur Bestimmung des Molekulargewichtes werden die Oberflächenproteine von nativen humanen T-Lymphozyten nach der Laktoperoxidasemethode radioiodiert (125-lod) oder anderweitig markiert. Die Triton X-10O-Lysate solcher markierten T-Zellen werden mit den zu untersuchenden Hybridomüberständen inkubiert und anschließend diese Mausantikörper durch Zugabe von Antl-Mausimmunglobulin-Serumpräzipitiert.

Die von unspezifischen Komponenten freigewaschenen Präzipitate werden in Natriumdodecylsulfat-Puffer aufgelöst und anschließend einer NDS-Elektrophorese auf Polyacrylamidgelen (5-10%) unterzogen. An Hand von Referenzproteinen wird das apparente Molekulargewicht der radioiodierten, durch den entsprechenden monoklonalen Antikörper spezifisch abgetrennten T-Zellantigene bestimmt. Es werden solche Hybridome ausgewählt, deren monoklonale Antikörper mit Zelloberflächenantigenen von humanen T-Zellen reagieren, die im reduzierten Zustand ein apparentes Molekulargewicht von 2OkDe. auch nach Endo-F-Behandlung, aufweisen.

Die durch eine derartige Selektion erhaltenen Hybridome werden rekloniert und hochproduktive Subklone selektiert, die die gewünschten monoklonalen Antikörper stabil sezernieren. Die so erhaltenen Hybridome werden als H-BL-TP-3 bezeichnet. Die Herstellung des monoklonalen Antikörpers BL-TP-3 basiert auf einem Verfahren, welches auf die In-vitro- oder In-vivo-Kultur des Hybridoms H-BL-TP-3 ausgerichtet ist. Das Hybridom H-BL-TP-3 wird an der Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Universität Leipzig kultiviert bzw. liegt kryokonserviert vor und ist Interessenten zugänglich. Der monoklonale Antikörper BL-TP-3 hat die Registriernummer ZIM-0512 im Zentralinstitut für Molekularbiologie der AdW der DDR erhalten. Der durch In-vitro- oder In-vivo-Kultur erhaltene monoklonale Antikörper BL-TP-3 reagiert mit Leukozyten, anderen Blutzellen sowie lymphoiden Zellen aus bestimmten Organen in der in Tabelle 1 dargestellten Weise.

Das Reaktionsmuster des monoklonalen Antikörpers mit permanent wachsenden Zell-Linien ist in Tabelle 2 aufgeführt. Der monoklonale Antikörper BL-TP-3 kann nach den üblichen, dem Fachmann bekannten Verfahren mit FITC, TRITC, Phycoerythrin und Biotin gekoppelt werden. Diese direkt markierten Präparate zeigen eine starke Markierung der humanen T-Zellen.

Die wichtigsten Eigenschaften des monoklonalen Antikörpers BL-TP-3 sind in Tabelle 3 zusammengefaßt. Der monoklonale Antikörper BL-TP-3 gehört der (gG1-Subklassr an.

Ausführungsbeisplel Selektion des Hybridoms H-BL-TP-3 Zunächst werden nach dem bekannten Verfahren der Dichtegradientenzentrifugation Lymphozyten aus dem peripheren Blut

gesunder Spender Isoliert. Durch Passage über Nylonwolle und E-Rosettenbildung werden daraus T-Lymphozyten präpariert.

Mit diesen humanen T-Lymphozyten werden 8 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse immunisiert. Die Immunisierung erfolgt

durch mehrmalige Gabe des Antigens.

Vier Tage nach der letzten Immunisierung wird die Milz entnommen und eine Einzelzellsuspension hergestellt. Die B-Lymphozyten dieses Zellgemisches werden mit Maus-B-Myelomzellen fusioniert. Die geeigneten Maus-Myelomzellen P3-X63 Ag 8.653 (KEARNEY et al., J. Immunol. 123, (1979), S.1548) werden in RPMI-1640mit 10% fetalem Kälberserum (FKS)

gehalten.

In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält (LITTLEFIELD, Science 145, [1964], S. 709),

werden die gebildeten Hybridzellen von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt.

Die Selektion der Hybridome erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in 576 separate iCD ^-Kulturen

aufgeteilt werden. DieÜberstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von

Antikörpern getestet, die nur mit Zelloberflächenantigenen von humanen T-Lymphozyten reagieren. Hierzu werden alle Kulturüberstände, die mit humanen Blutlymphozyten reagieren, mit B-Lymphozyten, die durch Eliminierung der T-Zellen durch E-Rosettentechnlk und/oder Nylonwolleseparatlon gewonnen werden, getestet. Nur diejenigen Kulturen werden welter

verwendet, deren Antikörper nicht mit B-Lymphozyten, wohl aber mit der großen Mehrheit der Blutlymphozyten und allen über

Nylonwolle separierten T-Lymphozyten reagieren. Die Testung der Kulturüberstände mit den entsprechenden Zellen erfolgt

mittels I;.direkter Immunfluoreszenz.

So selektierte Kulturen müssen ab dieser Stufe Jedoch auf jeden Fall mit der Indirekten Immunfluoreszenztechnik überprüft

werden. Durch die Anwendung der Indirekten Immunfluoreszenztechnik wird ausgeschlossen, daß Hybridoma weitergezogen werden, deren Antikörpermit B-Lymphozyten, Monozyten, Granulozyten, Thrombozyten und Erythrozyten reagieren.

Unter den in solcher Art vorselektlerten Hybridomen werden nun solche Klone gesucht, deren Antikörper nach Bindung an Lymphozyten und Entwicklung mit FITC-marklertem Anti-Mauelmmunglobulin und nachfolgender Zugabe von TRITC-

marklertem Anti-Pan-B-Zellen-Antikörper keine Doppelmarkierung von Zellen ergeben. Als Pan-B-Zell-Antlkörper können eingesetzt worden: BL-B 22 oder BL-B 20.

In einem weiteren Selektlonsschritt wird durch Doppelmarkierung mit einem TRITC-markiertem Antl-Pan-T-Zell-Antlkörper

nachgeprüft, daß alle durch diesen Pan-T-Zell-Antlkörper markierten Lymphozyten auch durch den Hybrldomüberstand markiert werden. Als Pan-T-Zell-Antlkörper eignet eich besondere TRITC-BL-T/Rec.

Unter den so selektierten Hybridomen werden dann nur die weitergezogen, deren monoklonate Antikörper mit einem etablierten CD3-Antikörper komodulieren. In einem anschließendem Selektlonsschritt werden davon alle die Hybridoma weiterkultiviert, deren Antikörper humane T- Lymphozyten nach indirekter Markierung ausreichend stark anfärben, so daß die monoklonalen Antikörper sowohl zur

qualitativen als auch zur quantitativen Analyse in durchflußzytometrischen Verfahren, wie z. B. der Analyse mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACS 440), eingesetzt werden können.

In einem weiteren Selektionsschritt werden die selektierten Hybridomo überprüft, ob sie sich für die Markierung von

antigentragenden Zellen in Kryostatschnitten lympholder Gewebe (Tonsllle, Lymphknoten und Thymus) eignen und daß sie keine Nebenreaktion mit anderen Geweben, besonders mit Haut und Bindegewebe, aufweisen.

In einem weiteren Selektionsschritt werden dann nur Hybridome weitergezogen, deren monoklonal Antikörper von den Membranen der T-Lymphozyten ein Antigen isolieren, welches ein apparentes Molekulargewicht von ca. 20 kDa, auch nach Deglykosylierung durch Endo-F, besitzt. Zur Bestimmung des Molekulargewichtes werden die Oberflächenproteine von nativen humanen T-Lymphozyten nach der Laktoperoxidasemethode radloiodiert (125-lod). Die Triton X-100-Lysate solcher markierten T-Zelien werden mit den zu

untersuchenden Hybridomüberständen inkubiert und anschließend diese Ma¹ isantikörper durch Zugabe von Anti-

Mausimmunglobulin-Serumpräzipitiert. Die von unspezifischen Komponenten freigewaschenen Precipitate werden in Natriumdodecylsulfat-Puffer aufgelöst und

anschließend einer NDS-Elektrophorese auf Polyacrylamldgelen (10%) unterzogen. An Hand von Referenzproteinen wird das apparente Molekulargewicht der redioiodierten, durch den entsprechenden monoklonalen Antikörper spezifisch abgetrennte

T-Zellantlgene bestimmt. Es werden solche Hybridome ausgewählt, deren monoklonale Antikörper mit Zelloberflächenantigenen von humanen T-Zellen reagieren, die im reduzierten Zustand ein apparentes Molekulargewicht von

2OkDa, auch nach Endo-F-Behandlung, aufweisen.

Die durch eine derartige Selektion erhaltenen Hybridome werden reklnnlert und hochproduktive Subklone selektiert, die die

gewünschten monoklonalen Antikörper stabil sezernieren. Die so erhaltenen Hybridome werden als H-BL-TP-3 bezeichnet.

Die Herstellung des monoklonalen Antikörpers BL-TP-3 basiert auf einem Verfahren, welches auf die In-vitro- oder In-vivo-Kultur

des Hybridoms H-BL-TP-3 ausgerichtet Ist.

Ausführungsbeispiel Gewinnung des monoklonalen Antikörpers BL-TP-3

2 x 10*Zellen desauf flüssigem Stickstoff gelagerten Hybridoms H-BL-TP-3werden aufgetaut und nach zwelmaligerWaschung in 4 ml RPM11640-Zellkulturmedlum mit 10% fetalom Kälberserum aufgenommen. Davon werden vier separate 1 -ml-Kultu. en in

Gewebekulturplatten eus Polystyren angelegt. Nach Vermehrung der Zellen werden davon suksessiv 5-ml-, 200-ml- und 50-ml-Kulturen in Gewebekulturflaschen angelegt. Die zellfreien Kulturüberstände der in ausreichender Dichte und Zeitdauer kultivierten Hybridomzellon enthalten den

monoklonalen Antikörper BL-TP-3. Der monoklonale Antikörper kann nach einem üblichen Verfahren Isoliert oder angereichert werden.

Tabelle 1 Reaktionsmuster des monoklonalen Antikörpers BL-TP-3 mit humanen Blutzellen und Zellen aus lymphoiden Organen

Zelltyp	Markierte Zellen (%)
PBL	73+/-6
T-Lymphozyten	100
B-Lymphozyten	<3
LGL(NK)	<5
Monozyten	0
Granulozyten	0
Erythrozyten	0
l.ymphoblasten (PHA-stim.)	>90
Lymphoblasten (Con A-stim.)	>90
Thymozyten	32+/-5
Tonsillenlymphozyten	41+/-9

Tabelle 2 Bindungsmuster des monoklonalen Antikörpers BL-TP-3 mit permanent wachsenden humanen Zell-Linien

Zeil-Linie	Reaktion des mAK BL-TP-3	IgQI
	mit den Zellen	ρ 20; Epeilon-Kette des CD 3
T-Zellen:		Ja
CEM	+	je
MOLT-3	—	ja
MOLT-4	—
JURKAT	+	sehrgut
HSB-2	_	sehrgut
SKW-3	—	sehrgut
T-Zellklone (IL 2 abhängig):
AK-15	+++	sehrgut
KT-2	+++	sehrgut
B-Zellen:		sehr gut
REH	—
RAJI	_
IM-09	—
GM-607	—
HMy-2	—
Myeloide Linie:
U-937	—
Erythroide Linie:
K-562	-
Nachweis durch Indirekte Immunfluoreszenz:
+++: 1OO%starkmarktert
++: 100%schwach markiert
+: <100>25%
+/-: <25%
-: unniarklert
Tabelle 3






Charakteristika des monoklonalen Antikörpers BL-TP-3
Isotyp
Antigen
Modulation des CD 3/TCR
Komudulation mit CD 3-mAk
Komodulation mit BL-TRec/1
Eignung für
Immunzytologie
Durchflußzytometrie
Immunhistologie
Eignung zur Markierung
FITC
TRITC
Biotin

Claims

Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen die Epsilon-Kette des CD3-Antigenes humaner T-Lymphozyten durch Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit angereicherten humanen T-Lymphozyten, Fusion von aus den Milzen solcher Mäuse gewonnenen B-Lymphozyten mit murinen Myelomzellen, Selektion von Hybridomen, die monoklonale Antikörper mit Pan-T-Zellreaktivität sezernieren, dadurch gekennzeichnet,

- daß Hybridome, dere.i monoklonale Antikörper mit einem Protein von 20 kDa spezifisch reagieren, dergestalt selektiert werden,

- daß zuerst T-Lymphozyten-spezifische Klone ausgewählt werden,

- anschließend diejenigen Hybridome, deren monoklonalen Antikörper durch zwei aufeinanderfolgende Selektionsschritte, die auf der Doppelmarkierung der Lymphozyten mit den in den Kulturüberständen enthaltenen Antikörpern, die mit FITC-markiertem Anti-Mausimmunglobulin entwickelt werden, undTRITC-markierten Pan-B-Zell- und Pan-T-Zell-Antikörpern beruhen, die die Pan-T-Zell-Spezlf ität garantieren, ausgewählt werden,

- in einem vierten Selektionsschritt sichergestellt wird, daß die Antikörper mit CD3-Antikörpern komodulieren,

- wobei in einem fünften Selektionsschritt nur diejenigen monoklonalen Antikörper berücksichtigt werden, die bei indirekter Immunfluoreszenz und durchflußzytometrischer Auswertung eine für die stabile Markierung ausreichend hohe Affinität aufweisen,

- in einem sechsten Schritt die Antikörper ihre Eignung zur Markierung der T-Zellen in Kryostatgewebeschnitten bestätigen und keine Nebenreaktionen mit anderen nicht lymphoiden Geweben eingehen,

- in einem weiterem Selektionsschritt Hybridome ausgewählt werden, deren monoklonale Antikörper mit einem radiomarkierten, durch Detergensbehandlung der T-Zellen solubilisierten, nicht glykosylierten Zellmembranantigen mit einem Molekulargewicht von 2OkDa reagieren, selektiert werden,

- daß das so determinierte Hybridom H-BL-TP3 (Registriernummer ZIM-0152) in vitro und in vivo kultiviert wird und der sezernierte monoklonale Antikörper BL-TP3 isoliert, angereichert und gegebenenfalls mit Markern oder an feste Phasen gekoppelt wird.