DE4207365C2 - Verfahren zur in-vitro-Immunisierung von Lymphocyten sowie zum Testen auf die Immunisierung stimulierende Aktivität - Google Patents
Verfahren zur in-vitro-Immunisierung von Lymphocyten sowie zum Testen auf die Immunisierung stimulierende AktivitätInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur extrem effektiven in vitro-Immunisierung von Lym
phocyten für die Herstellung von gegen ein Antigen spezifischen Antikörpern, sowie ein Ver
fahren zum Testen auf die Immunisierung stimulierende Aktivität durch Verwendung des
oben verwendeten Zellkultursystems.
Seit Köhler und Milstein 1975 ein Verfahren etabliert haben, monoklonale Antikörper produ
zierende Mäuse-Hybridomzellinien in vitro zu erzeugen (Nature 1975, 265, 495-497), sind
unzählige monoklonale Antikörper, die von Mäusen stammen, entwickelt worden, die gegen
verschiedene Antigene gerichtet sind, und viele von diesen werden gegenwärtig für in vitro-
Diagnosezwecke, wie etwa Serumdiagnose, eingesetzt.
Obgleich menschliche monoklonale Antikörper ebenfalls durch Anwendung der Methode von
Köhler und Milstein produziert werden können und diese Antikörper mit Mäuse- und Human
ursprung für therapeutische Zwecke denkbar sind, ist bisher kein monoklonaler Antikörper in
der praktischen Therapie eingesetzt worden.
Es ist ein allgemein akzeptiertes Konzept, daß monoklonale Antikörper mit Humanursprung
gegenüber solchen mit Mäuseursprung zur Verabreichung an Menschen bevorzugt sind. Der
Einsatz menschlicher monoklonaler Antikörper im klinischen Bereich ist jedoch bisher behin
dert worden, und zwar teilweise wegen des Fehlens effektiver Verfahren zur Bereitstellung
menschlicher, mit den erforderlichen Antigenen immunisierter Lymphocyten, die für die Er
zeugung von betreffenden Hybridomen unverzichtbar sind, und teilweise wegen ethischer
Überlegungen, daß Immunisierungen mit geeigneten Antigenen direkt in Menschen nicht
möglich sind. In diesem Zusammenhang sind ausgedehnte Anstrengungen unternommen
worden, effiziente in vitro-Immunisierungsverfahren zu etablieren, um diese Schwierigkeiten
zu überwinden (J. Immunol. 1985, 135, 3831-3838; Human Hybridoma and Monoclonal An
tibody, Plenum Press, 1985, S. 71-91).
In "In vitro Immunsation in Hybridoma Technology", herausgegeben von Borrebaeck Else
vier Science Publishers B. V., Amsterdam, 1988, S. 277-284, wird ein Verfahren zur Herstel
lung humaner monoklonaler Antikörper gegen spezifischen Antigene durch in vitro-
Immunisierung beschrieben, wobei die Lymphocyten in einem Medium kultiviert werden, das
Muramyl-Dipeptid und Interleukin-II enthält.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, das Verfahren für die antigenspezifi
schen und effiziente in vitro-Immunisierung von Lymphocyten, die die Erzeugung von Hy
bridomen mit menschlichem und tierischem Ursprung, die antigenspezifische monoklonale
Antikörper produzieren, erleichtern kann, zu verbessern. Weiterhin soll ein einfaches Verfah
ren zum Testen auf die Immunisierung stimulierende Aktivität vorgesehen werden.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur in vitro-Immunisierung
von Lymphocyten nach Anspruch 1 und ein Verfahren zum Testen auf die Immunisierung
stimulierende Aktivität nach Anspruch 6.
Weitere Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß bei dem erfindungsgemäßen Ver
fahren zur in vitro-Immunisierung von Lymphocyten, bei dem Lymphocyten, die spezifisch
auf ein Antigen ansprechen, durch Kultivieren in einem Medium, das ein Adjuvans und ein
oder mehrere Lymphokine enthält, in Abwesenheit eines polyklonalen Aktivators immunisiert
werden, gegenüber im Stand der Technik bekannten Verfahren eine besonders effiziente Im
munisierung dann erfolgt, wenn das Adjuvans Muramyl-Dipeptid oder OK-432 ist und die
beiden Lymphokine Interleukin-2 und Interleukin-6 im Medium enthalten sind. Die immuni
sierten Lymphocyten können, falls erwünscht, immortalisiert werden. Wenn der polyklonale
Aktivator zur obigen Mischung zugegeben wird, sinkt die Immunisierungseffizienz signifi
kant ab. Der Gegenstand des Patentes ist nicht auf Lymphocyten aus speziellen Geweben be
schränkt, sondern die in vitro-Immunisierung der vorliegenden Erfindung kann bei jedem
Lymphocyten angewendet werden.
Die in vitro immunisierten Lymphocyten, die die antigen
spezifischen monoklonalen Antikörper produzieren, können
entweder durch Hybridisierung mit Zellen einer geeigneten
Lymphocyten-Zellinie oder durch Infizieren mit Epstein-Barr-
Virus immortalisiert werden, was die effiziente Produktion
des antigenspezifischen monoklonalen Antikörpers er
leichtern kann. Anwendungen menschlicher monoklonaler Anti
körper sind bisher aufgrund der Schwierigkeiten behindert
worden, eine genügend hohe Spezifizität gegenüber dem ge
wünschten Zielantigen sowie eine angemessene Produktion zu
erreichen. Die vorliegende Erfindung eröffnet vielver
sprechende Möglichkeiten für weite Anwendungen menschlicher
monoklonaler Antikörper für die Prävention, Diagnose und
Therapie, indem sie die prompte und effiziente Produktion
gewünschter antigenspezifischer monoklonaler Antikörper
erleichtert.
Das Verfahren zum Testen auf die Immunisierung stimulierende
Aktivität kann es erleichtern, verschiedene wirksame
Materialien, die die Immunisierungs-Effizienz erhöhen, durch
Messen ihrer Wirkungen auf die Immunisierungsreaktion
während der Kultivierung der Lymphocyten in dem Medium, das
die Testmaterialien in Gegenwart von Adjuvans, Lymphokinen
und Antigen enthält, zu erleichtern.
Bei der vorliegenden Erfindung werden bevorzugt unlösliche
Antigene verwendet, wie etwa Krebszellen bekannter Linien
und Latexteilchen, auf denen lösliche Antigene adsorbiert
sind.
Für das Adjuvans wird bevorzugt entweder Muramyl-Dipeptid
(MDP) oder OK-432, das von Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.,
Japan, erhältlich ist, verwendet. MDP-Konzentrationen im
Kultivierungsmedium, die von 0,1-1000 µg/ml und bevorzugt
von 0,5-50 µg/ml variieren, sind erfolgreich verwendet
worden. Für OK-432 sind die effektiven Konzentrationen im
Kultivierungsmedium 25-25000 ng/ml, bevorzugt 50-10000
ng/ml.
Als Lymphokine wird eine Kombination aus Interleukin-2 und Interleukin-6 (ILe) verwendet.
Die effektiven
Konzentrationen der ILe im Kultivierungsmedium sind: für
IL-2: 1-1000 Einheiten/ml, bevorzugt 2-500 Einheiten/ml; für
IL-6: 1-1000 Einheiten/ml, bevorzugt 2-500 Einheiten/ml.
Eine extrem hohe Effizienz der in-vitro-Immunisierung wird
mit der kombinierten Verwendung von IL-2 und IL-6 erzielt.
Obwohl die Kultur erfolgreich in einem Medium, wie
Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), Hams F12, RPMI
1640, RDF (eine 2 : 1 : 1-Mischung von RPMI 1640, DMEM und Hams
F12) und ERDF (RDF, das an Aminosäuren und Vitaminen ange
reichert ist), durchgeführt werden kann, sind die letzteren
zwei Medien bevorzugt.
Frische Lymphocyten mit beliebigen Ursprung, wie etwa aus
peripherem Blut, chirurgisch dissizierten Lymphknoten und
Milz, können für die in-vitro-Immunisierung gemäß der vor
liegenden Erfindung erfolgreich eingesetzt werden.
Bei diesem Verfahren für die in-vitro-Immunisierung von
Lymphocyten werden signifikante Abnahmen in der
Immunisierungs-Effizienz in Gegenwart von polyklonalen Akti
vatoren, wie etwa Endotoxinen, Dextransulfat und Lectinen,
einschließlich Phytohämagglutinin, Phytolacca americana-
Mitogen (pokeweed mitogen), Concanavalin A etc., die üb
licherweise bei den herkömmlichen Verfahren verwendet
werden, beobachtet. Demgemäß ist es für die in-vitro-
Immunisierung der vorliegenden Erfindung wesentlich erfor
derlich, Kultivierungsmedien zu verwenden, die frei von
polyklonalem Aktivator sind.
Die in-vitro-Immunisierung wird während der Verlaufs der
Kultur für 4 bis 10 Tage durchgeführt, nachdem eine Lympho
cyten-Suspension im Kulturmedium, das ein Adjuvans und ein
oder mehrere Lymphokine enthält, zum unlöslichen Antigen,
wie etwa den Krebszellen oder den oben beschriebenen latex
gebundenen Antigenen, zugesetzt worden ist.
Die so für die in-vitro-Immunisierung kultivierten Lympho
cyten werden geerntet und, falls erforderlich, entweder
durch Hybridisierung mit Zellen einer geeigneten
Lymphocyten-Zellinie oder durch Infizieren mit Epstein-Barr-
Virus immortalisiert. Durch die Immortalisierung können neue
Zellinien geschaffen werden, die unbegrenzt antigen
spezifische monoklonale Antikörper produzieren, was die
Produktion von monoklonalen Antikörpern erleichtert. Die in-
vitro-Immunisierung mit menschlichen Lymphocyten führt zur
Bildung von Zellinien, die menschliche monoklonale
Antikörper produzieren, diejenige mit tierischen Lymphocyten
führt zur Bildung von Zellinien, die tierische monoklonale
Antikörper der entsprechenden eingesetzten tierischen
Spezies produzieren.
Der Test auf die Immunisierung stimulierende Aktivität kann
durch die in-situ-Immunanfärbung von Antikörpern durchge
führt werden, die aus immunisierten Lymphocyten ausge
schieden und in Vertiefungen des Kulturgefäßes an das Anti
gen gebunden worden sind. Der Stimulierungseffekt des Test
materials auf die Immunisierungs-Effizienz kann als
Differenz der Anzahl immunangefärbter Tupfen von Anti
körpern die, während der Kultivierung der Lymphocyten an das
überschichtete Antigen gebunden worden sind, in Gegenwart
oder bei Abwesenheit des Testmaterials bewertet werden. Die
vorliegende Erfindung ist im folgenden mit Beispielen weiter
veranschaulicht.
Es werden die Wirkungen von Adjuvantien und Lymphokinen auf
die in-vitro-Immunisierung von Lymphocyten gezeigt.
Die in-vitro-Immunisierung von Lymphocyten mit Antigen-
Zellen wurde durchgeführt, wie unten beschrieben. Zellen der
A549-Linie (eine menschliche Lungen-Carcinomzellinie, ATCC
CCL-185), suspendiert in ERDF-Medium, das 10% fötales
Kalbsserum (FCS) enthält, bei einer Dichte von 1 × 104
Zellen/ml, wurden in aliquoten Teilen von 1 ml auf eine
Platte mit 24 Vertiefungen verteilt und für 36 h bei 37°C
kultiviert. Die normalen Lymphocyten, eingestellt auf eine
Dichte von 2 × 106 Zellen/ml, die aus der Fraktionierung mit
Ficoll-Paque (erhältlich von Pharmacia LKB Biotechnology AB,
Upsala, Schweden) von peripherem Blut von einem gesunden
Freiwilligen, gefolgt von viermaliger Waschung mit ERDF-
Medium, gewonnen worden waren, wurden in aliquoten Teilen
von 0,5 ml zur obigen Kultur von A549-Zellen in den Ver
tiefungen zugegeben. Gleichzeitig wurden MDP, OK-432, die
ILe-2 und -6 (erhältlich von Genzyme Corp., MA, USA) in ver
schiedenen Konzentrationskombinationen, einschließlich einer
Kombination von 250 ng/ml, 10 µg/ml, 100 Einheiten/ml bzw.
10 Einheiten/ml, in die Kultur eingebracht. Die
Kultivierung wurde für 4 Tage bei 37°C fortgesetzt.
Die die Immunisierung stimulierenden Aktivitäten der
Adjuvantien und Lymphokine wurden mit den so kultivierten
Lymphocyten in situ getestet. Nach Entfernung des über
stehenden Mediums zusammen mit den Lymphocytenzellen aus
oben beschriebener Kultur wurden die an der Vertiefung an
haftenden A549-Zellen mit 0,06% Glutaraldehyd für 15 min
bei 4°C fixiert, gefolgt von dreimaliger Waschung mit ERDF.
Die Vertiefungen, die immobilisierte Antigenzellen ent
hielten, an die von den immunisierten Lymphocyten ausge
schiedene antigenspezifische Antikörper gebunden worden
waren, wurden dreimal mit einer phosphatgepufferten Koch
salzlösung (PBS), die 0,05% Tween 20 enthielt, gewaschen,
gefolgt von Blockierung mit 0,2% Gelatine-0,5% Rinder
serum-Albumin in PBS für 2 h bei 37°C. Nach Verwerfen der
Blockierungslösung wurde eine Mischung von biotinyliertem
anti-Human-IgG und biotinyliertem anti-Human-IgM zugegeben
und für 1 h bei 37°C inkubiert. Nach extensivem Waschen der
Vertiefungen wurde Avidin-Peroxidase-Konjugat zugesetzt und
die Reaktion für 1 h bei 37°C fortgesetzt, gewaschen und
schließlich wurden die Tupfen von an die Antigen-Zellen
gebundenen Antikörpern durch die Abscheidung von farbigen
Materialien sichtbar gemacht, die durch die Aktivität von
Peroxidase unter Verwendung von 3,3'-Diaminobenzidin (DAB)
als Substrat gebildet wurden. Die die Immunisierung
stimulierenden Aktivitäten von Adjuvantien sowie diejenigen
der ILe wurden durch mikroskopisches Auszählung der Anzahl
angefärbter Tupfen in jeder Vertiefung, d. h. der Anzahl von
Lymphocyten, die die antigenspezifischen Immunglobuline
produzierten, bestimmt.
Die Wirkungen von Adjuvantien und Lymphokinen auf die in-
vitro-Immunisierung sind in den Tabellen 1 und 2 zusammenge
faßt.
Die Tabellen 1 und 2 zeigen, daß die Zugabe eines Adjuvans
und eines Lymphokins in Kombination und das Auftreten von
Lymphocyten, die auf A549-Zellen ansprechende Antikörper
produzieren, sehr viel effektiver ist als die jeweils unab
hängige Zugabe der Additive, insbesondere in der Kombi
nation: MDB, IL-2 und IL-6.
Ein ähnliches Experiment wie in Beispiel 1 wurde mit den
Lymphocyten aus Lymphknoten von zwei Krebspatienten sowie
mit solchen aus peripherem Blut dreier gesunder Freiwilliger
durchgeführt.
Wie in Tabelle 3 gezeigt, kann kein signifikanter Unter
schied in der in-vitro-Immunisierung-Effizienz zwischen den
Lymphocyten aus Lymphknoten und denjenigen aus peripherem
Blut beobachtet werden, was darauf hinweist, das Lymphocyten
aus jedem Gewebe in gleicher Weise für die in-vitro-
Immunisierung der vorliegenden Erfindung verwendbar sind.
Es wurden die Wirkungen polyklonaler Aktivatoren, wie etwa
Lectinen und Lipopolysacchariden, auf die in-vitro-
Immunisierung untersucht. Die experimentellen Bedingungen
waren dieselben wie in Beispiel 1, mit der Ausnahme, daß 1%
Phytolacca americana-Mitogen (pokeweed mitogen, PWM) oder 25
µg/ml Lipopolysaccharid (LPS) in das Kultivierungsmedium
einbezogen wurden.
Die in Tabelle 4 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die
polyklonalen Aktivatoren die gegenwärtige in-vitro-
Immunisierung signifikant hemmen, obgleich diese Aktivatoren
im allgemeinen für die herkömmlichen in-vitro-Immunisierungs
verfahren erforderlich sind.
Dieses Beispiel zeigt, daß die effiziente Erzeugung von
Human-Hybridomen, die antigenspezifische Antikörper in das
Kultivierungsmedium ausscheiden, durch die Immortalisierung
der Lymphocyten, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren
in vitro immunisiert worden sind, erreicht werden kann.
Lymphocyten aus peripherem Blut eines gesunden Freiwilligen
wurden in einem Medium kultiviert, das MDP, IL-2 und IL-6
enthielt, in Gegenwart von A549-Zellen als Antigen. Die so
immunisierten Lymphocyten wurden gesammelt und mit dem her
kömmlichen Verfahren unter Verwendung von Polyethylenglykol
mit Zellen von RF-S1 (hinterlegt beim Fermentation Research
Institute unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-3751), die
eine mutante Lymphocyten-Zellinie ist, die aus Myelomen mit
Human- und Mäuse-Ursprung abgeleitet ist, hybridisiert. Nach
der Hybridisierung mit RF-S1-Zellen wurden die Lymphocyten in
Platten mit 96 Vertiefungen verteilt und kultiviert. Die
verbrauchten Medien wurden mit einem enzymverknüpften immun-
sorbierenden Test (ELISA), wie unten beschrieben, auf
antigenspezifische Antikörper getestet. Die verbrauchten
Medien, die auf die 96 Vertiefungen der Platte verteilt
worden waren, in denen bis zu Konfluenz gezüchtete A549-
Zellen mit Glutaraldehyd fixiert und in derselben Weise, wie
in Beispiel 1 beschrieben, blockiert worden waren, wurden für
1 h bei 37°C inkubiert, gefolgt von einer weiteren Inkubation
mit Avidin-Peroxidase-Konjugat. Die Menge an Immunglobulinen,
die an die immobile Phase gebunden waren, wurden durch Messen
der gebundenen Peroxidase-Aktivität unter Verwendung von
2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure)-Di
ammoniumsalz (ABTS) als Substrat photometrisch gemessen. Die
Vertiefungen, die positive Farbentwicklung zeigten, d. h.
diejenigen, die Antikörper enthielten, die mit A549-Antigen
spezifisch reaktiv waren, wurden ausgezählt.
Die in Tabelle 5 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß signi
fikant höhere Raten bei der Erzeugung von Hybridomen, die
antigenspezifische monoklonale Antikörper produzieren, mit
dem vorliegenden in-vitro-Immunisierungsverfahren erzielt
werden können.
Die in der vorstehenden Beschreibung sowie in den Ansprüchen
offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als
auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der
Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich
sein.
Claims (6)
1. Verfahren zur in vitro-Immunisierung von Lymphocyten, bei dem Lymphocyten, die
spezifisch auf ein Antigen ansprechen, durch Kultivieren in einem Medium, das ein
Adjuvans und ein oder mehrere Lymphokine enthält, in Abwesenheit eines polyklonalen
Aktivators immunisiert werden, dadurch gekennzeichnet, daß das Adjuvans Muramyl-
Dipeptid oder OK-432 ist und als Lymphokine Interleukin-2 und Interleukin-6 enthalten
sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß an die Immunisierung eine
Immortalisierung der immunisierten Lymphocyten anschließt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß besagte immunisierte
Lymphocyten dadurch immortalisiert werden, daß sie mit Zellen einer oder mehrerer
Lymphocyten-Zellinien hybridisiert oder mit Epstein-Barr-Virus hybridisiert werden.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als
Antigen Krebszellen oder unlöslich-gemachtes lösliches Material verwendet wird.
5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die
Lymphocyten aus Blut, Lymphknoten oder Milzen stammen.
6. Verfahren zum Testen auf die Immunisierung stimulierende Aktivität, dadurch
gekennzeichnet, daß Lymphocyten in einem Medium, das ein Adjuvans, welches
Muramyl-Dipeptid oder OK-432 ist, Interleukin-2 und Interleukin-6 und die Testsubstanz
enthält, in Abwesenheit eines polyklonalen Aktivators über der Antigen-Schicht kultiviert
und von den immunisierten Lymphocyten produzierte Immunglobuline nachgewiesen
werden.
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