JP4853637B2 - 細胞培養用基材およびその製造方法 - Google Patents
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Description
臨床科学34巻9号 白方裕司・橋本公二:再生医学、 X。皮膚 表皮の再生機構と培養表皮シートを用いた熱傷P1283〜1290 名古屋大学出版会1999/10/10発行「ティッシュ・エンジニアリング繊維工学の基礎と応用」上田実編 松崎恭一・熊谷憲夫:培養皮膚P107〜117 畠堅一郎・上田実:皮膚・粘膜 Pharma Media Vol.18 No.1 2000 P25〜P29 2000 名古屋大学出版会1999/10/10発行「ティッシュ・エンジニアリング繊維工学の基礎と応用」上田実編 畠堅一郎・上田実:口腔粘膜 P118〜P127
(1) 基体上に表面改質層を有し、前記表面改質層が、式(I)で表されるホルミル[2.2]パラシクロファンの化学蒸着により形成された式(II)で表される重合体に、モノマー単位に少なくとも1個のシッフ塩基を形成する能力のあるアミノ基(−NH2)を含む重合体を反応させて得られたアミノ基を有する重合体を含有する細胞培養用基材。
(2) 前記表面改質層が含有するアミノ基を有する重合体が式(III)で表される上記(1)の細胞培養用基材。
(3) 前記表面改質層が含有するアミノ基を有する重合体が式(IV)で表される上記(1)の細胞培養用基材。
(4) 前記式(III)または式(IV)におけるX中の重合体主鎖がポリエチレン、ポリエチレンイミン、またはポリメチレンアミドである上記(2)または(3)の細胞培養用基材。
(5) 前記式(III)または式(IV)において、Xが−CH2に対して炭素または窒素により結合する上記(2)〜(4)のいずれかの細胞培養用基材。
(6) クロロ置換[2.2]パラシクロファンの化学蒸着物を下地として、式(I)で表されるホルミル[2.2]パラシクロファンの化学蒸着により式(II)で表される重合体を形成した上記(1)〜(5)のいずれかの細胞培養用基材。
(7) 前記基体が、3次元構造物である上記(1)〜(6)のいずれかの細胞培養用基材
(8) 基体上に、式(I)で表されるホルミル[2.2]パラシクロファンを化学蒸着して式(II)で表される重合体の膜を得、この式(II)で表される重合体の膜に、モノマー単位に少なくとも1個のシッフ塩基を形成する能力のあるアミノ基(−NH2)を含む重合体を反応させて式(III)で表される重合体の膜を得、この重合体膜を表面改質層とした細胞培養用基材の製造方法。
(9) 前記アミノ基(−NH2)を含む重合体を含有する溶液に前記重合体を浸漬して反応させる上記(8)の細胞培養用基材の製造方法。
前記溶液中のアミノ基(−NH2)を含む重合体の濃度が、0.1〜0.00001%である上記(9)の細胞培養用基材の製造方法。
下記に示すように、[2.2]パラシクロファンから式(I)で表されるホルミル[2.2]パラシクロファンを合成した。
重合体膜の形成に先立って、基体としてポリスチレン製シャーレ(直径:90mm、高さ:15mm)上に下記のジクロロ[2.2]パラシクロファンからの化学蒸着膜を下地として3μm 厚に形成した。図1に示すような蒸着装置を使用して下地膜の形成を行った。図示例の蒸着装置において蒸発部に固体状の蒸着材料ジクロロ[2,2]パラシクロファン8.4gを導入した。蒸発部を、10〜30mTorr(1.33〜4.0Pa)の真空度に保ち、140から180℃に徐々に加熱すると、蒸着材料が気化してダイマーガスとなり、原料ガスが生成した。次いで、原料ガスは600℃に加熱してある分解部に導入した。この分解部では、導入された原料ガスは熱分解によりモノマーガスとなる。次に、得られたモノマーガスを蒸着部に導入した。蒸着部内は、最大30mTorr (4.0Pa)の真空度に保持されている。そして導入されたモノマーガスは蒸着部内に設置されたポリスチレン基体の表面で重合し、下地層の膜を形成した。この時、形成された下地層の膜の膜厚は3μmであった。
(1)重合体膜の形成
次いで、図1の蒸着装置において蒸発部に式(I)の構造を有する固体状の蒸着材料ホルミル[2.2]パラシクロファン10.0gを導入した。蒸発部を、10〜75mTorr(1.33〜10.0Pa)の真空度に保ち、120から160℃に徐々に加熱すると、蒸着材料が気化してダイマーガスとなり、原料ガスが生成した。次いで、原料ガスを600℃に加熱してある分解部に導入した。この分解部では、前記のスキームに示されるように、導入された原料ガスは熱分解によりモノマーガスとなる。次に、得られたモノマーガスを蒸着部に導入した。蒸着部内は、最大63.7mTorr (8.5Pa)の真空度に保持されている。そして導入されたモノマーガスは蒸着部内に設置されたポリスチレン基体の表面で重合し、前記のスキームに示されるような重合体の膜を形成した。この時、形成された重合体膜の平均膜厚は0.8μmであった。また、重合体の膜形成における一連の作業は、蒸着材料中や重合体の膜中におけるホルミル基の酸化を防ぐために窒素雰囲気下で行った。このため、蒸着後のチャンバー内には速やかに窒素ガスが満たされた。
20%(質量百分率)ポリアリルアミン水溶液(日東紡製Polyallylamine-L(20%))を真空度約40〜60mmHg(5.32〜7.98kPa)、温度100℃で加熱し、水分を留去した。次いで、これにエタノールを加え、加熱還流させ溶解し、0.1%のポリアリルアミンエタノール溶液を得た。この溶液を上記のようにして製造した重合膜を有するポリスチレン製シャーレ内部に満たし、シャーレ内部表面の重合膜とポリアリルアミンとを接触させ、室温下で2時間放置した。その後、シャーレ内部の溶液をデカントし、温度約70℃で減圧乾燥を一晩行った。このようにしてポリスチレン製シャーレ内部表面上に式(II)で示される重合体のポリアリルアミンシッフ塩を生成した(前記スキーム参照)。その後、シャーレ内部は未反応のポリアリルアミンを除去するために十分に蒸留水にて洗浄を行った。
実施例1で得られた各サンプル基材No.1〜4、およびNo.5を用いてRat正常肝臓細胞の培養試験を行った。
エトキシレゾルフィン(ER)の代謝物であるレゾルフィン(R)の生成濃度を、吸光度、蛍光強度から算出することで、代謝酵素(CYP1A1/2)の酵素活性の指標とした。また、あらかじめ3-メチルコラントレン(3MC)等を培地に溶かして細胞に曝露しておくことで、酵素誘導能があるかどうかも調べた。CYP1A は、ethoxyresorufin ( ER ) のO -脱アルキル化反応 ( EROD )を触媒し、蛍光物質であるresorufin を生成させる。培地に蛍光性基質エトキシレゾルフィン溶液を入れ、一定時間期間暴露後。培地の一部を採ってエタノールで希釈し、残存するエトキシレゾルフィンの吸光と生成したレゾルフィンに基づく蛍光の強度を測定した。
実施例1と同様にして、ポリアリルアミン濃度を0.1%としたサンプルNo.11、0.01%としたNo.12、0.001%としたNo.13、1%としたNo.14、コラーゲンをコートした比較サンプルNo.15を用意した。
実施例1と同様にして、ポリアリルアミン濃度を0.1%としたサンプルNo.21、0.01%としたNo.22、0.001%としたNo.23、1%としたNo.24、コラーゲンをコートした比較サンプルNo.25を用意した。
12 分解部
13 蒸着部
14 トラップ
15 真空ポンプ
Claims (11)
- 前記式(III)または式(IV)におけるX中の重合体主鎖がポリエチレン、ポリエチレンイミン、またはポリメチレンアミドである請求項2または3の細胞培養用基材。
- 前記式(III)または式(IV)において、Xが−CH2に対して炭素または窒素により結合する請求項2〜4のいずれかの細胞培養用基材。
- クロロ置換[2.2]パラシクロファンの化学蒸着物を下地として、式(I)で表されるホルミル[2.2]パラシクロファンの化学蒸着により式(II)で表される重合体を形成した請求項1〜5のいずれかの細胞培養用基材。
- 前記基体が、3次元構造物である請求項1〜6のいずれかの細胞培養用基材
- 基体上に、式(I)で表されるホルミル[2.2]パラシクロファンを化学蒸着して式(II)で表される重合体の膜を得、この式(II)で表される重合体の膜に、モノマー単位に少なくとも1個のシッフ塩基を形成する能力のあるアミノ基(−NH2)を含む重合体を反応させて式(III)で表される重合体の膜を得、この重合体膜を表面改質層とした細胞培養用基材の製造方法。
式(II)中、nおよびmはそれぞれ重合度を表す正の整数であり、n=0であってもよいが、m=0となることはない。
式(III)中、nおよびmはそれぞれ重合度を表し、nは0以上の整数であり、mは1以上の整数であり、m+nは2以上である。Xは、重合体主鎖の炭素に直接、または炭素もしくは窒素に炭素数1〜4のアルキレン基を介してアミノ基が結合した第1級アミンを有する基を表す。] - 前記アミノ基(−NH2)を含む重合体を含有する溶液に前記重合体を浸漬して反応させる請求項8の細胞培養用基材の製造方法。
- 前記溶液中のアミノ基(−NH2)を含む重合体の濃度が、0.1〜0.00001%である請求項9の細胞培養用基材の製造方法。
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