TW390887B - A method for chromatographic removal of prions - Google Patents
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Description
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 _ B7 _ 五、發明說明(丨) 發明背景 海棉狀腦炎乃是一種哺乳動物中樞神經系統疾病, 其會導致早老性痴呆且一般爲致命性的。這些早老性 痴呆疾病包括人類庫司非-傑柯式病(Creutzfeldt-Jackob disease),庫魯病(Kuru)和葛士曼-史卓士勒-許 1每:根症候群(Gerstmann-Straussler-Scheinken),羊騷癢 症,和牛海棉狀腦炎。雖然有強列的證據顯示這些疾 病乃是由相同或非常相近的病原菌所引起的,但此病 原菌的.性質至今仍然不是十分淸楚(Prusiner, Science 252·· 1 5 1 5- 1 522 ( 1 99 1 ))。目前累積的證據顯示宿主細 胞內的一種經轉譯後修飾且能抗蛋白酶之蛋白質在此 扮演了一個很重要的角色,但目前並不淸楚單單此種 改變的蛋白質即是誘因物或者是此蛋白質乃是誘因物 上不可或缺的一部分。一般稱此種蛋白質爲病原性蛋 白顆粒蛋白質(prion protein)(在此係簡稱"PrP”),而海 棉狀腦炎的感染原則稱爲病原性蛋白顆粒。 雖然它們不一定都具感染性,但有證據顯示在某些 狀況下至少有某些海棉狀腦炎可由一種動物傳染至另 一種動物,且在某些情況下,也可跨越不同品種的動 物造成感染。例如,在1 970年代有報告指出有一系列 的庫司非-傑柯式.病(Creut.zfeldt-Jackob disease)患者 乃是發生在曾接受由不同腦下垂體純化之人類生長荷 爾蒙治療的患者身上(Brownetal.,:N.Eng.J.Med· 313” 72 8-73 1 ( 1 98 5))。一般相信第一樁牛海棉狀腦炎 3 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ' 裝--------訂---------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明(>) 乃是經由已感染羊騷癢症之飼料傳染至牛隻所產生 的。同時,也已藉著在老鼠顱內注射受污染的羊組織 而硏發出一種騷癢症的老鼠模式。 目前在組織及其它生物產物中測定病原性蛋白顆粒 必須依賴在老鼠或田鼠體內以所懷疑之生物物質萃出 物進行感染後來偵測。由於這類疾病之潛伏期通常須 一年或更長的時間以上,因此此類硏究通常非常昂貴 且耗時。 與病原性蛋白顆粒相關之疾病的廣布發生以及其跨 種族間傳染的可能性對由哺乳動物組織製造其產品的 生物科技產業會造成嚴重的影響(Di Martino, Biologicals 21:61-66 (1993))。有關這些產品安全性上 的顧慮導致許多將病原性蛋白顆粒去活化之硏究。這 些硏究顯示病原性蛋白顆粒較傳統病原菌如病毒或細 菌對去活化更具抗性。因此,須以較激烈的方法來去 除被病原性蛋白顆粒污染之生物物質。目前唯一能降 低生物物質製備物中病原性蛋白顆粒量的方法乃是以 氫氧化鈉在130 °C或更高的溫度下作延長殺菌。這些方 法乃是建議用來將病原性蛋白顆粒蛋白質去活化的例 行方法(Department of Health and Social Security Circular 84:1 6( 1 9 89))。同時也有報導指出可以在分子 量10 0KD下所進行的超過濾和6M尿素來對含有病原性 蛋白顆粒的生物物質製備物進行去污染(Pocchiari et al·, Arch. Virol. 9 8:131-135 (1988))。其它能降低病原 4 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) -----------©裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ___B7__ 五、發明說明(々) 性蛋白顆粒活性的方法包括以有機溶劑,淸潔劑,蛋 白質變性劑,親混亂性鹽(C h a 〇 t r 〇 p i c s a 11)和苯酣來作 處理(Millsorvet al., in Prus iner and Hadlow,eds.Slow Transmissible Diseases of the Nervous System, vol. II. New York:Academic Press 409-424(1 979); Prusiner et al·, PNAS 7 8:4606-46 1 0( 1 98 1 ); Kimberlin et al., J. Neurol. Sci. 59:390-392 ( 1 98 3 ); Walker et al., Am. J. Public Health 73:661-665 (1983); Brown et al., J . Dzi 1 5 3:1 1 45.1 1 48 ( 1 986))。 去除病原性蛋白顆粒時所須的極端環境與一般保留 生物分子中有用活性的方法並不相容,因此會導致許 多生物分子變性且因而幾乎完全破壞了其活性。因 此,須要一種能在不破壞所須生物分子活性情況下由 生物質中去除病原性蛋白顆粒的方法。 發明槪沭 本發明係關於一種由含有病原性蛋白顆粒及至少一 種其它生物分子之溶液中去除病原性蛋白顆粒的方法。 此法包括在濃度梯度下將溶液直接通過陰離子交換 色層層析管柱的步驟,在此步驟中可將病原性蛋白顆粒 與至少一種其它生物分子加以分離,並可在與含有病原 性蛋白顆粒之濾出液不同的濾出液中來收集這些生物分 子。 5 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格m〇 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -1^ 裝--------訂---------0> A7 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 B7 五、發明說明(t) 在另一實施例中,本發明提供了一種由含有病原性蛋 白顆粒及血紅素之溶液中去除病原性蛋白顆粒的方法。 此法包括在濃度梯度下將溶液直接通過陰離子交換色層 層析管柱的步驟。在此步驟中可將病原性蛋白顆粒與血 紅素加以分離,病原性蛋白顆粒會留在濾出液中而此濾 出液又與含有血紅素之濾出液不同。 本發明之方法可在較溫和的情況下進行,無須加熱, 或使用強鹼或氧化劑來進行。因此,本發明能在不會對 . 其它生物分子造成顯著影響的情況下對含有病原性蛋白 顆粒及許多其它生物分子之溶液來進行去污染。 發明詳沭 以下將詳述本發明方法之特性及其它細節並明列於 申請專利範圍中。應了解以下範例僅作爲說明之用,本 發明之範疇並不因此而受到限制。在不悖離本發明精神 範疇的情況下可將本發明之主要特點應用於各種實施 例。 本發明主要乃基於可以陰離子交換色層層析管柱有 效的來去除牛血紅素溶液中污染的病原性蛋白顆粒蛋白 質。將病原性蛋白顆粒由含有病原性蛋白顆粒及至少一 種其它生物分子之溶液中除去的方法包括在pH濃度梯 度下將溶液直接通過陰離子交換色層層析管柱的步驟。 在此步驟中可將病原性蛋白顆粒與至少一種其它生物分 6 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) -----------0裝--------訂 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
A7 B7 五、發明說明(<) 子加以分離,亦即,所濾出之至少一種其它生物分子的 濾出液與含有病原性蛋白顆粒之濾出液不同。 基於本發明之目的,"病原性蛋白顆粒"一詞在此係指 一種蛋白質,此蛋白質乃是造成中樞神經系統病變的誘 因物。”誘因物”一詞在此係指一種能引發所懷疑疾病之 物質並或是造成此疾病之物質因素中不可或缺的一部 分。與病原性蛋白顆粒相關的疾病包括各種海棉狀腦 炎,例如人類庫司非-傑柯式病(Creutz.feldt-Jac.kob ..disease),庫魯病,(Kuru)和葛士曼-史卓士勒-許海根 症候群(Gerstmann-Straussler-Scheinken),羊騷癢症, 牛海棉狀腦炎和傳染性貂海棉狀腦炎。病原性蛋白顆 粒可以是,例如,一種蛋白質,好比經過轉譯後修飾 之PrP蛋白質,或是與一種訊息分子形成複合物的蛋白 質,好比多核苷酸,例如,與經過轉譯後修飾之PrP蛋 白質形成複合物的多去氧-核糖核苷酸。 基於本發明之目的,’'生物分子"一詞在此係指任何起 源於生物體之分子’包括蛋白質,例如酵素,抗體,結 構性蛋白質和傳送蛋白質,多肽,荷爾蒙,例如生長荷 爾蒙,胰島素和類固醇荷爾蒙,多核苷酸,糖和脂類。 基於本發明之目的’較適合的生物分子爲蛋白質,多肽 和有實際或潛在用途之多核苷核酸。 可用來淸洗陰離子交換色層層析管柱之適當pH梯度 包括,例如,一種連續的pH梯度,其中濾出液中的pH f直 隨著時間而有所改變。此種pH連續梯度的範例之一乃是 7 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ------.—_------------©裝--------訂---------说. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明(k) 一種線性pH梯度,其中pH的變化與時間互成線性關係。 可以二或多種不同pH之緩衝液混合所形成之液體作爲 pH連續梯度中的過濾液。過濾液中緩衝液的比例,和’ 因此,過濾液中的pH,可隨時間作連續性的改變。以典 型被設定能產生所粟pH梯度之流量控制器來控制緩衝 液的混合過程。 在另一實施例中,pH的梯度也可以是階段性的,其中 pH的變化與時間的關係並不是連續的,pH在一或多個步 驟,或時間點上有突然的改變。只要將第一 過濾液以 不同pH的第二種過濾液取代即.可達到此目的。在一較佳 實施例中,所用之pH的梯度乃是不連續的。 在進行階段性pH梯度的方法中,將一系列緩衝液中不 同pH値的緩衝液連續的導入色層層析^管柱中。緩衝液較 好是經過過滤’例如通過10,000 Dalton之去熱原效應 膜。所用緩衝液應爲離子強度很低的單價緩衝液,因此 使瀘出液中的溶質乃是與pH相關而非與離子強度相 關。一般來說,適合之緩衝液其離子強度應在50mM或更 少。 適於本發明方法之陰離子交換介質的例子包括二氧 化矽,二氧化鋁,二氧化鈦,交聯葡聚糖,瓊脂,或聚 合物衍生物或共聚物,如聚丙烯醯胺,聚羥基乙基甲基 丙烯酯或苯乙烯二乙烯苯,這些物質本身即具有陽離子 的特性,如二乙基胺基乙基或四級胺基乙基基團。
S 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ----------------------CJ}裝·"-------訂--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明(q) 在一較佳實施例中,陰離子交換介質乃屬於矽膠類。 此介質乃是以熱水處理矽膠以增加孔隙大小,之後將其 曝露於(r-環氧丙醇-丙基)三甲氧基矽烷下以形成表面 具活性的環氧基團。之後以三級氨,例如 HOCH2CH2N(CH3)2,來處理矽衍生物以形成表面的季銨 .基團。 陰離子交換色層層析管柱可以是,例如,一種重力式 管柱,亦即移動相之流動乃是藉重力來完成。也可藉管 柱入口與出口間的壓力差來使移動相流動,例如在樣品 被放入管柱後將受壓的液體導入管柱入口。在一較佳實 施例中,陰離子交換色層層析管柱乃是高效率液體色層 層析管柱。 在一實施例中,第一種緩衝液是三羥甲基氨基甲烷 (Tris)(濃度約20mM,pH在8.4與9.4之間)。第二種緩衝液 乃是第一種緩衝液與第三種緩衝液的混合液,第二種緩 衝液之pH在8.2與8.6之間。第三種緩衝液乃是Tris溶液 (濃度約50mM,pH在6.5與7.5之間)。第四種緩衝液則是 NaCl/Tris 溶液(濃度約爲 l.OM NaCl 及20mM Tris; pH 在 8.9與9.1之間)。第二種緩衝液之pH較好是在8.2與8.4之 間。 .所用緩衝液之溫度一般在0°C至50°C之間。使用期間緩 衝液之溫度較好是在約1 2.4 1. 〇 °C。此外,將緩衝液儲 存於約9°C至1 1 °C之間的溫度下。 9 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) -----------©裝--------訂---------城,. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 B7____五、發明說明(2 ) 在另一實施例中’此法進一步包含將溶液通過一超過 濾膜。此步驟可在進行陰離子交換色層層析步驟之前或 之後進行。在一較佳實施例中,在進行陰離子交換色層 層析步驟之前先將溶液加壓通過一 l〇〇,〇〇〇Dalton之超 過濾膜。適合本法之超過濾膜的範例包括米里普企業 (Millipore Coroporation; Bedford, MA, catalog No. CDUF 050H1)和 A/G 科技(Needham,MA, model no. 1^?100£5 5)所出產的100,0000&^〇11之超過濾膜。 在一實施例中,此溶液包含會造成牛海棉狀腦炎之病 原性蛋白顆粒及第二種牛蛋白質。這第二種牛蛋白質可 以是,例如,牛血紅素,牛生長荷爾蒙,牛免疫球蛋白, 牛血淸白蛋白,牛抑胰肽酶(bovine, aprotini.n),牛鐵傳 遞蛋白,牛血淸,牛凝血酶或牛血纖維蛋白原》在一較 佳實施例中,此第二種牛蛋白質乃是牛血紅素。 在另一實施例中,此溶液包含會造成海棉狀腦炎,例 如騷癢症,人類庫司非-傑柯式病(Creutzfeldt-Jackob disease),庫魯病(Kuril),葛士曼-史卓士勒-許海根症 候群(Gerstmann-Straussler-Scheinken)之病原性蛋白顆 粒和一或多種衍生自人類或其它哺乳動物組織之生物 分子,如蛋白質或荷爾蒙。適合之其它生物分子包括 血紅素,胰島素,生長荷爾蒙,性腺激素,髓鞘質, 膠原蛋白,彈性蛋白,血淸,血淸白蛋白,乳蛋白素, 抗體和抗血淸,第八因子,第九因子,凝血酶前驅物和 凝血酶’紅喋呤,組織血纖維蛋白溶酶原活化物,血小 ------.---;------------©裝--- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------_ ____ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) A7 B7 五、發明說明(1 ) 板活化因子,蛋白酶,蛋白酶抑制劑,干擾素,白介素, 和細胞素。 本發明可藉以下實施例作更詳盡的闡述。 實施例 實施例1以陰離子交換色層層析法純化牛血紅素溶液 .製備牛血紅素溶液 依美國專利申請案號08/473,497所述之方法來製備牛 血紅素溶液。收集牛全血樣品,與檸檬酸鈉抗凝結劑混 合形成檸檬酸血液溶液,之後分析其中內毒素含量。將 收集之血液樣品保存在約2°C之溫度,之後以600網目的 篩子過濾除去大的集結物及粒子。 之後將檸檬酸血液溶液通過一系列800 /z m至50 y m之 聚丙烯濾器以除去大的血液殘渣。 淸洗紅血球細胞以便將細胞膜外的蛋白質,例如BSA 或IgG,與紅血球細胞分離。爲淸洗紅血球細胞,將血液 溶液置於一過濾桶中並以等量已通過1 0KD超過濾膜(構 自 Millipore Coroporation,cat· no. CDUF 050 G1)之等張 溶液來稀釋。此等張溶液含6.0g/L之檸檬酸鈉和 8.0g/L 之氯化鈉在適於用來注射之水中(WFI)。 將稀釋過的血液溶液通過0.2 // m空心纖維濾器 (Microgon Krosflo II microfiltration cartidge, Spectrum/Microgon,Laguna Hills,CA)以濃縮回到其原 來體積。同時,不斷加入已過濾過的等張溶液作爲補充, π 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ©裝---- 訂---------_ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 _______B7____ 五、發明說明(C 〇) 加入速率爲須等於過濾損失之速率。在過濾時,血液組 成遠小於紅血球細胞或留在溶液中的組成,如血漿溶 質,會與濾液一起通過濾器壁。紅血球細胞,血小板和 稀釋之血液溶液中大的物質,如白血球細胞,會留在加 入之等張溶液中以形成經過透析之血液溶液。 在清洗紅血球細胞時,將稀釋之血液溶液溫度維持在 10°C到25°c之間且濾器入口處之流體壓力約在25psi和 3 0psi之間以促進過濾效率。 當濾液體積約爲以等張溶液稀釋前之血液溶液體積 之600%時,紅血球細胞的淸洗過程便算完成。 之後將透析後的血液溶液不斷的以約每分鐘4升的速 率泵至配備有28 ringdam之夏普超離心機中(Model no. AS -16, Sharpies Division of Alfa-Laval Seperation, Inc)。離心的同時不斷的加入經透析的血液溶液,以便 將紅血球細胞與白血球細胞和血小板加以分離。操作期 間,離心機以足以將血液分爲較重之紅血球細胞相和一 較輕之白血球細胞相之轉速,一般在1 5,000rpm,下作運 轉。在離心過程中不斷的分離並釋出紅血球細胞相及白 血球細胞相之部分。 分離後,將紅血球細胞溶解以形成含有血紅素的溶 液。在由離心機釋出的過程中,由於須使紅血球細胞相 動線與離心機壁成一角度運動始能造成紅血球細胞相的 流動_,因此由於與離心機壁碰撞的結果造成有一大部分 12 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) I----------CSI裝-------—訂---------产 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 __B7____ 五、發明說明(ll ) 的紅血球細胞在釋出後已被機械性的溶解,因而使血紅 素由紅血球細胞中釋出進入紅血球細胞相中。 之後將已溶解之紅血球細胞相通過紅血球細胞相釋 出動線進入靜電混合器中(kenics 1/2 inch with 6 elements,Chemineer,Inc·)。傳送紅血球細胞相至靜電 混合器的同時,也注入等量之WFI溶液到混合器中,其 中WFI溶液會與紅血球細胞相混合。紅血球細胞相和WFI 進入靜電混合器之速率爲每分鐘約0.25升。 在靜電混合器中將WFI溶液與紅血球細胞相混合以形 成溶解之紅血球細胞膠體。之後將其轉移至適合用來將 紅血球細胞中血紅素與非血紅素成分分開之夏普超離心 機中(Model no, AS-16)。離心機以足以將溶解之紅血球 細胞膠體分爲較重和較輕之血紅素相之轉速下作運轉。 較輕的相主要由血紅素構成同時也含有密度約等於或小 於血紅素之非血紅素組成。 通過0.4 5 //m之派立康匣式微濾器(Pellicon Cassette microfilter; Millipore Coroporation, cat. no. H VLP 0 00C5)將血紅素相由離心機中連續釋出進入用來純化血 紅素之保存桶中。之後將細胞基質與留在微濾器中的物 質一起放回保存桶中。在微過濾進行期間,將原來保存 桶之溫度維持在10°c或更低之溫度。爲增進效率,當微 濾器入口之流體壓力由開始時的lOpsi增加至25pis時微 過濾過程便算完成了。將血紅素微過濾液由微濾器中轉 13 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) -----------^0}裝--------訂---------r_ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 B7 五、發明說明(丨〆) 移至微濾^桶中。此時將微瀘液分成兩分樣品,樣品A 及B。此時不將樣品A進一步作純化。 接著將樣品B通過100KD之超過濾器(Millipore Coropration,cat. no. CDUF 05 0 HI)。微濾液中所含的大 部分爲血紅素與水,能通過超過爐器形成血紅素之超過 濾液,而大型之微濾液組成,例如分子量大於100KD之 蛋白質,將會被留下並回流至微過濾液桶中。同時,將 WFI連續不斷的加入微過濾桶中以補償在微抄超過濾過 程中所損失的水分。持續進行超過濾過程直到微過濾液 桶中血紅素的濃度低於8g/L。在超過濾過程中,將微過 濾液桶中之溫度維持在約10°C左右。 將血紅素超過濾:液轉移至超過濾桶中,並回流通過 30KD之超過濾器(Millipore Coropration,cat. no. CDUF 050 Tl)以去除較小的細胞組成物,例如電解質,代謝中 間物,水和分子量低於30KD1之蛋白質。此舉導致在濃 縮血紅素溶液中每升約含l〇〇g之血紅素。樣品Β的初步 純化工作到此告一段落。 陰離子交換色層層析介質之製備 以溶於水之(r -環氧丙醇-丙基)三甲氧基矽烷在7〇°c 下來處理矽膠,以形成表面具活性衍生自矽的環氧基 團。之後以N,N-二甲基乙醇胺(HOCH2CH2)N(CH3)2來處 理此矽膠衍生物,以產生表面具有四級氨基團的矽膠衍 生物。 14 本紙張尺度適用中國國家標準〈CNS)A4規格(210 X 297公釐〉 ------------©裝—— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) . 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明(\3) 以騷癢劑來處理樣品 用於本硏究之騷癢劑乃是蘇格蘭愛丁堡動物健康硏 究院所核准之老鼠ME-7株。此藥劑起源於桑福羊的一種 天然騷癢症感染。將這些羊之腦部萃出物以莫里登隨機 繁殖鼠(Moredun random bred mice)經兩代繁殖, C57BL/6N九代繁殖,C3H老鼠一次及C57BL/6N老鼠一次 額外繁殖。用於本硏究之騷癢劑乃是第十三代之產物。 以20ml之騷癢劑來處理樣品A(180 ml)以獲得樣品 A'。留下一體積之樣品A’以便用於"騷癢症証明(prove spike)”之分析中,剩下的則以上述對樣品B之操作方法 使其通過100KD之超過濾器。所得超過濾液,現稱樣品 A”,以實施例2之步驟分析其騷癢症的感染力。 比2ml之騷癢劑來處理20ml之樣品B以獲得樣品B1。將 一部分之樣品B'留下作爲控制組”騷癢症証明"之分析 中。剩下的樣品則使其通過陰離子交換色層層析管柱。 將騷癢樣品B’導入色層層析管柱中的介質內,以陰離子 交換高效率液體色層層析管柱來純化血紅素。管柱之內 徑爲8英吋長度爲24英吋。管柱中的陰離子交換色介質乃 是上述以矽膠爲底之介質。 事先以一種能促進血紅素與介質結合之緩衝液來處 理色層層析管柱。之後將樣品B'以1.78L/miri的速率注入 管柱中。之後以連續三種不同的緩衝液淸洗管柱以在管 柱中產生pH梯度的方式得到血紅素濾出液。操作期間每 15 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝--------訂---------# 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明(ifr) —種緩衝液均維持在1 2.4 °C的溫度下。在將緩衝液注入 管柱前事先讓緩衝液通過10KD之超過濾膜(Millipore Coroporation, eat. no . C D UF 0 5 0 G l)。每一*種緩衝液流 入管柱的速率爲3.56L/min。 第一種緩衝液,20 mM之三羥甲基氨基甲烷(Tris,pH 在8.4與9.4之間),能將血紅素濃縮液傳送至管柱中的陰 離子交換介質中。第二種緩衝液,乃是第一種緩衝液與 第三種緩衝液之pH 8.3的混合液,調整管柱之pH以便使 污染物流出管柱同時並使血紅素留在管柱中。持續以第 二種緩衝液來達到平衡約30分鐘。將第二種緩衝液之濾 出液丟棄。第三種緩衝液,乃是50 mM的Tris溶液(pH在 6.5與7.5之間),可將血紅素由管柱中洗出。將第一及最 後3 %至4%之血紅素濾出液丟棄,剩下的血紅素濾出液, 現稱爲樣品B”,以實施例2之步驟分析其騷癢症的感染 力。 眚施例2 在牛血紅素製備物中去除病原件蛋白顆粒之 方法的驗証 在一有註冊登記之設施中,依美國食品藥物管理局之 良好實驗室操作準則(21 CFR 58)之規定,大英國協GLP 計劊,日本GLP標準及OECD之良好實驗室操作準則之規 定來進行方法的驗証。 16 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) —-------裝·-------訂-----——r (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 B7 i'發明說明(v<) 用於體內分析來查驗騷癢感染性之溶液爲 1 . 用來 處理血紅素溶液之騷癢劑溶液。2. 樣品A',3 . 樣品 A”,4. 樣品B'和5. 樣品B"。 . 體內分析 騷癢感染性之體內分析乃是由微生物協會 (Microbiological Association, Rockville,MD),依已發 表 之 方 法 來 進 行 (Chesebro, Spongiform Encephalopathies: The Transmissible Agents, in Virology, Fields, Knipe, et al., eds. Raven Press LTD: New York, Chapter 81,pp. 2325-23 36 (1 990))。此法牽涉到以所感 興趣之溶液在老鼠顱內進行接種,監測老鼠是否有騷癢 感染的臨床症狀並測定一年內殘存之老鼠的數目。 以下列溶液來分析騷癢感染性:引起騷癢之物質,樣 品A'(分級和未分級),樣品A”,樣品B1,和樣品B”。製 備這些溶液之一系列的稀釋液:引起騷癢之物質,稀釋 因子 1(未稀釋),1〇-3,1〇-4,1〇_5,1〇-6,ΙΟ·7,和 10-8 ;樣品未分級:稀釋因子1,分級:稀釋因子1,1 0· 1 ; 樣品 A",稀釋因子 1,ΙΟ·1,10-2,10-3,1〇-4,和 10-5 ; 樣品B’,稀釋因子1,10-1 ;樣品B",稀釋因子1,ΙΟ·1, 10-2, 1〇-3, 1〇-4,和 10-5。 將C57BL/6雌鼠分成各10或15隻老鼠一組。一組15隻 控制組老鼠不進行接種,另一組15隻載體控制組老鼠則 17 本紙張足度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .©裝 丨訂---------#、 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明(+) 各接種0.02ml之載體。剩下組別中的老鼠則分別接種 0.02ml本硏究之各溶液之稀釋液。 連續監測老鼠365天觀察其是否有騷癢症的臨床現象 出現。騷癢症之末期症狀包括對噪音敏感,小便失禁, 毛色粗糙,步調失常及目光遲滯。由死亡或犧牲老鼠腦 部組織的病理檢驗來確認騷癢症感染,其中腦組織液泡 的出現可支持並證實騷癢症的存在。 結果 整個牛血紅素之純化方法詳見美國專利申請案號 08/473,479所揭露之部分,其內容在此僅以參考文獻方 式列出。依此方法之部分製備兩種牛血紅素溶液,如實 施例1所述,但每一個案中純化.步驟並不停在同一點上。 樣品A乃是以微過濾的步驟加以純化(孔隙大小爲0.45 # m ),而樣品B則是以過濾步驟純化(在正常分子量爲 100KD處作切除)。 驗證方法可檢視100KD超過濾步驟及陰離子交換色層 層析步驟對受老鼠ME-7株騷癢劑感染老鼠之腦部均質 液的影響。以騷癢劑作爲引發牛海棉狀腦炎之誘因物模 式。所用方法乃是老鼠之體內分析法,也是目前唯一能 用來分析病原性蛋白顆粒感染性的方法。以兩種受騷癢 劑感染之樣品在進行純化過程前的感染力作爲控制組, 其在兩組老鼠365天的觀察期內致死率均爲100%,受感 染老鼠之腦組織形象有明顯的變化,此與騷氧症感染相 符。相反的,相對於經過100KD超過濾或陰離子交換色 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .Θ裝 訂---------銬 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7____ 五、發明說明(Λ) 層層析步驟加以純化之樣品,其在體內分析試驗中並未 顯出任何騷氧症感染之症狀。 下表總結了體內分析試驗之結果,其中顯示每一測試 組之老鼠,在365天後仍然存活之老鼠數目,在測試期間 發展出騷氧症之臨床症狀的老鼠數目,在硏究期間死亡 或被犧牲之老鼠數目和死亡老鼠之病理檢驗顯示有騷氧 症感染之老鼠數目。 數據顯示在20隻接種了會引發騷氧症物質其1(Γ4或更 高倍稀釋液之老鼠,有19隻有明顯的騷氧症臨床症狀, 且經病理切片檢驗證實。此組中唯一存活的老鼠很可能 是因接種時發生錯誤所致。 所有以未分級,未稀釋之樣品Α’處理過的老鼠最後都 死亡,但並未顯示出騷氧症感染的臨床症狀,而是經病 理切片檢驗加以證實的。死亡的原因可能是由於不均質 .混合物中之固體物質的毒性所致。1 〇隻以未分級之樣品 Α1處理過之老鼠中的每一隻在發展出騷氧症感染的臨床 症狀後也都死亡,其中的9隻並經病理切片檢驗證實的確 感染騷氧症。在此組中的一隻老鼠,由於組織大部分都 已自我溶解,因此無法由病理切片檢驗加以證實。相反 的,接種了樣品Α"稀釋液的90隻老鼠中,有86隻存活’ 且都沒有表現出騷氧症感染的臨床症狀,而死亡的4隻老 鼠其病理切片也都很正常。 接種了樣品Β1的5隻老鼠中,沒有一隻存活,其中4隻 其臨床症狀與病理切片均呈正反應。將樣品Β”的稀釋液 19 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) -----------ο 裝--------訂----------¾ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 B7 五、發明說明(0) 施用在90隻老鼠身上。在這些老鼠中,有84隻存活’且 沒有任何一隻死亡的老鼠顯示出騷氧症感染的臨床症狀 且其病理切片也都很正常。 這些結果淸楚的顯示經過會引發騷氧症感染之物質 處理過的血紅素溶液可在溫和的條件下將污染物去除。 以100KD超過濾或有pH梯度的陰離子交換色層層析管柱 來進行純化可降低溶液的感染力到低於體內分析可偵測 的範圍以下。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --^裝---丨丨!丨訂·----- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) A7 B7 五 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 “明月除(皆'引發騷氧症感染物質之方法其有效程度硏究 樣品 ----— 稀釋 殘存/接 種 有臨床症 狀之數目 /死亡或 犧牲之數 巨 病理確定 有騷氧.症 感染之數 目/檢驗 總數 ---- 引 發 1 0-8 9/10 0/1 0/1 騷 氧 之 物 質 引 發 1〇-7 9/10 0/1 0/1 騷 氧 之 物 質 引 發 10_6 9/10 1/1 1/1 騷 氧 之 物 質 21 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Η/ ...—// _ I — — — — — — ^---------梦------------------------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 390887 A7 _B7 五、發明說明(β) 引發 騷氧 之物 質. 10-5 8/10 2/2 2/2 引發 騷氧 之物 質 ΙΟ'4 0/10 10/10 10/10 引發 騷氧 之物 質 10-3 1/10 9/9 ' 9/9 控制 組 te 12/15 0/3 0/3 載體 控制 組 姐 15/15 0/0 0/0 A, 未稀釋 0/5 1/5 1/1 ------------户、-裝---------訂---------^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) 390BB?五' 發明說明(r| ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A' 未分級 未稀釋 0/5 5/5 5/5 A' 分級 1:10 0/5 5/5 4/5 A" 10-5 14/15 0/1 0/1 A" 10-4 14/15 0/1 0/1 A" 10-3 14/15 0/1 0/1 A" 10-2 14/15 0/1 0/1 A" 1 0-1 15/15 0/0 0/0 A" 未稀釋 15/15 0/0 0/0 B' 未稀釋 0/5 4/5 4/5 B" ΙΟ'5 13/15 0/2 0/2 B" 10-4 13/15 0/2 0/2 B" 1 0_3 15/15 0/0 0/0 B" 10-2 14/15 0/1 0/1 B" 10-1 14/15 0/1 0/1 B " 未稀釋 15/15 0/0 0/0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐)
Claims (1)
- •Λ 告本I?88 S90BB7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 · 一種由含有病原性蛋白顆粒〜..(|31:1〇11.)〜及一攆額外 蛋白質之溶液中去除病原性蛋白顆粒之方法,包括導引 溶液在能造成· pH梯、度洗提的情況_下—通過陰離子交換色 層層析管柱,藉-此-該蛋白質在pH値約_方_ 5至8 · 3之間由該 陰離子交換色層屢―析管柱选J1出來的洗提液部分中取 集,’藉以使病原性蛋白顆粒與.收集的蛋白質中分離。 2. 如申請專利範圍第1項之方法,其丰之PH梯度乃 是一.建續.式.梯度。 -〆 3; 如申請專利範圍第1項之方法,其中之p Η梯度乃 最二階段性的梯度。 4..如申請專利範圍第1項之方法,其中之陰離子交--· ........ 換色層層析管柱之介質含有至少一種組成物乃選自由二 氧化矽,二氧化鋁,二氧化鈦,交鏈葡聚糖,瓊脂,或 具有陽離子基團之聚合物击組成之物質族群。 5. 如申請專利範圍第4項之方法,其中之聚合物乃 是藥丙烯醯胺,聚_ (羥基乙基早基既烯U二或聚JC苯乙烯 -共-二乙烯苯)。 6. 如申請專利範圍第4項之方法·,其中之陽離子基_ 團乃是季銨基團。 7 . 如申請專利範圍第1項之方法,進一步〜包含將溶 液以超過濾膜過濾之步驟》 8. 如申請專利範圍第7項之方法,其中之超過濾膜 可過^濾分子量約lOOKd左右之物質。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 請 先 閲 背 面 之 注 I 頁 •Λ 告本I?88 S90BB7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 · 一種由含有病原性蛋白顆粒〜..(|31:1〇11.)〜及一攆額外 蛋白質之溶液中去除病原性蛋白顆粒之方法,包括導引 溶液在能造成· pH梯、度洗提的情況_下—通過陰離子交換色 層層析管柱,藉-此-該蛋白質在pH値約_方_ 5至8 · 3之間由該 陰離子交換色層屢―析管柱选J1出來的洗提液部分中取 集,’藉以使病原性蛋白顆粒與.收集的蛋白質中分離。 2. 如申請專利範圍第1項之方法,其丰之PH梯度乃 是一.建續.式.梯度。 -〆 3; 如申請專利範圍第1項之方法,其中之p Η梯度乃 最二階段性的梯度。 4..如申請專利範圍第1項之方法,其中之陰離子交--· ........ 換色層層析管柱之介質含有至少一種組成物乃選自由二 氧化矽,二氧化鋁,二氧化鈦,交鏈葡聚糖,瓊脂,或 具有陽離子基團之聚合物击組成之物質族群。 5. 如申請專利範圍第4項之方法,其中之聚合物乃 是藥丙烯醯胺,聚_ (羥基乙基早基既烯U二或聚JC苯乙烯 -共-二乙烯苯)。 6. 如申請專利範圍第4項之方法·,其中之陽離子基_ 團乃是季銨基團。 7 . 如申請專利範圍第1項之方法,進一步〜包含將溶 液以超過濾膜過濾之步驟》 8. 如申請專利範圍第7項之方法,其中之超過濾膜 可過^濾分子量約lOOKd左右之物質。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 請 先 閲 背 面 之 注 I 頁 A8 B8 C8 D8 390887 申請專利範園 9. 如申請專利範圍第1項之方法,其中之蛋白質乃 衍生自哺乳動物。. 1 0 .如申請專利範圍第9項之方法,其中之哺乳動物 乃是乂類!或牛隻。藉隻._,羊或鼠...科動物。 1 1.如申請專利範圍第L0.項之方法,其中之蛋白質乃 是血紅素。 1 2 ·如申請專利圍差10項之方法,其中—之病原性蛋 白顆粒乃是造成海棉狀腦炎的誘因物。 13. 如申請專利範圍第I2項之方法,其中之海棉狀腦 炎是騷癢症,庫司非傑柯式.病..(Cr.eji_tzfel.dt-Ja.ckob disease),庫魯病(Kuru),葛士曼-史卓士勒-許海根症 蝾群(Ge.rst.mann-StiaUssler-Scheinken),或牛海棉狀腦1 炎。 14. —種由含有病原性蛋且顆粒及血紅素之溶液中去 除病原性蛋白顆粒之方法,包括導引溶液在能造成pH梯 度洗提的情況下通過陰離子交換色層層析管柱,藉此該. 血紅素在pH値約6.5至8.3之間由.該陰離子交換色層層析 管柱洗提出來的洗提液部分中收集,藉以使病原性蛋白 顆粒與收集的血紅素分離。 1 5 .如申請專利範圍第1 4項之方法,其中之血紅素乃 是—血紅素。 1 6.如申請專利範圍第1 5項之方法,其中之病原性蛋 白顆粒乃是造成牛海棉狀腦炎的誘因物。 本紙張又度逋用中國國家標準(CNS > A4規格(210X297公釐) 請 先 閱 之 注 意 事 項 再 頁 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 SSSS8? 1 _____ D8 六、申請專利範圍 17. 如申請專利範圍第.14項之方法.,其中之陰離子交 換色層層析管柱之介質包括二氧化砂。 18. 如申請專利範圍第1 4項之方法,其中之二氧化较: .爲具有陽離子之官能基團。, 1 9.如申請專利範圍第1 8項之方法,其中之陽離王棊 .. · .................. ... .團乃是_季銨基.團》 〜 厂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 一張 -紙 本 CN /IV 準 標 家 國 國 中 用 適 釐一祕 9 2
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