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Die Erfindung betrifft ein Verfahren
zur Aufreinigung einer wässrigen
Lösung
rohen Albumins.
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Die Lösung kann jede beliebige wässrige Lösung rohen
Albumins sein. Insbesondere ist sie eine Lösung von Albumin, das ausgehend
von Blutplasma eines Säugers,
beispielsweise eines Rinds, Pferds, Schweins, Schafs oder Kaninchens,
erhalten wird, und vorzugsweise eine Lösung, die ausgehend von menschlichem
Plasma erhalten wird.
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Es ist hinlänglich bekannt, ausgehend von Blut
durch Zentrifugation die globulären
Bestandteile einerseits und das Blutplasma andererseits abzutrennen.
Seit vielen Jahren weiß man,
dass Plasma neben Albumin, welches den größten Anteil gelöster Substanzen
ausmacht, eine ganze Serie weiterer Moleküle, insbesondere Proteine,
enthält,
deren Extraktion angesichts ihrer therapeutischen Verwendungen besonders
interessant ist. Es wurden daher Verfahren zur fraktionierten Fällung mit
einem Fällungsmittel
durch pH-, Ionenstärke-
und Temperaturvariation vorgeschlagen. Heutzutage am häufigsten werden
die Methode von Cohn, siehe COHN. J. et al., J. Am. Chem. Soc. 72,
465-474/1950) oder Variationen dieser Methode verwendet, wobei das
verwendete Fällungsmittel
Ethanol ist. Nach der Methode von Cohn wird das Plasma auf –30°C abgekühlt und dann
auf +2°C
erwärmt,
was zu einem Kryopräzipitat führt, das
den Blutgerinnungsfaktor VIII, Fibronogen und Fibronektin enthält. Man
trennt den Überstand, "Überstand I" genannt, von dem oben erwähnten Präzipitat
ab, senkt seinen pH-Wert auf 5,85 ± 0,05 und gibt Ethanol zu,
bis die Ethanolkonzentration 19 Vol.-% beträgt, wobei die Temperatur allmählich mit der
Zugabe von Ethanol bis auf –5°C abgesenkt
wird. Auf diese Art und Weise erhält man ein Präzipitat, "Präzipitat
(II + III)" genannt,
das insbesondere die Gammaglobuline und einen Albumin und Verunreinigungen
enthaltenden Überstand, "Überstand (II + III)" genannt, enthält. Man
nimmt den auf diese Art und Weise erhaltenen Überstand auf und erhöht den Alkoholanteil
bis auf eine Ethanolkonzentration von 40 Vol.-%, wobei die Temperatur
bis auf etwa –8°C abgesenkt
wird. Auf diese Art und Weise erhält man ein Präzipitat, "Präzipitat
IV" genannt, und
einen Überstand, "Überstand IV" genannt, der das Albumin mit einem
Reinheitsgrad von etwa 94 bis 97% bezogen auf das Proteingewicht,
enthält.
Der Überstand
IV kann als Ausgangsmaterial für
die gewünschten
Albuminlösungen dienen,
jedoch enthält
er eine große Menge
Ethanol; einer ersten Technik folgend kann man den Überstand
IV direkt gegen physiologisches Serum dialysieren, jedoch muss man
eine sehr große Menge
Wasser verwenden und das Verfahren ist daher langsam und teuer;
einer weiteren Technik folgend senkt man den pH-Wert des Überstands
IV auf 4,80 ± 0,05
ab, wodurch das Albumin ausfällt:
man trennt das Präzipitat, "Präzipitat
V" genannt, ab und löst es wieder
in physiologischem Serum, wobei der Ethanolrest durch Dialyse extrahiert
wird.
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Um die Aufreinigung des Albumins
abzuschließen,
hat man bereits vorgeschlagen, chromatographische Techniken, insbesondere
auf Ionenaustausch-Basis, zu verwenden (siehe insbesondere Curling
J.M., Methods of Plasma Protein Fractionation, Herausgeber J. Curling,
Acad. Press, 77–91 (1980);
Tayot J. L. et al., Methods of Plasma Protein Fractionation, Herausgeber
J. Curling, Acad. Press, 149–160
(1980); Saint-Blancard J., Nouveaux échangeurs d'ions Trisacryl, Ann.
Pharm. Fr. 39, 403–409 (1981)).
Das Prinzip dieser Methoden ist es, das Albumin auf einem spezifischen
Träger
in Abhängigkeit vom
pH-Wert und der Ionenstärke
zu fixieren und auf diese Art und Weise bestimmte Verunreinigungen, die
sich in der Lösung
des chromatographierten Albumins befinden, im Eluat zu eliminieren.
Wenngleich sich die Qualität
der erhaltenen Albuminlösungen
mit diesen Techniken erheblich verbessern lässt, sind diese jedoch unglücklicherweise
schwer anwendbar und kostspielig. Tatsächlich enthalten die behandelten
Albuminlösungen
annähernd
4 diverse, extrahierbare Verunreinigungen. Da man das Albumin an
der Füllung
der Chromatographiesäule
fixiert, muss man 96% der behandelten Substanz fixieren; da die
Fixierung von Albumin auf eine Größenordnung von etwa 10 mg pro
Gramm Füllung
begrenzt ist, bedeutet dies den Einsatz eines sehr großen Füllbettvolumens
in den Säulen.
Da die Füllung
sehr voluminös
ist, bedarf es einer großen
Wassermenge, um einerseits die Voräquilibrierung der Säule und
andererseits die Passage des Produkts durch die Säule zu gewährleisten; außerdem ist
es im Allgemeinen erforderlich, wegen der Art der Füllungen
für die
Voräquilibrierung
spezielle Puffer zu verwenden. Wenn das Albumin auf dem Füllbett zurückgehalten
wurde, ist es ferner erforderlich, mit Hilfe geeigneter Lösungspuffer
das Albumin von der Säule
zu eluieren, um es zurückzugewinnen, so
dass sich das Albumin anschließend
mit diesen Puffern im Gemisch befindet und man daher gehalten ist, die
Albuminlösungen
erneut zu dialysieren, um die Salze der Lösungspuffer zu eliminieren
und letztendlich ein injizierbares Produkt zu erhalten.
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Beispielsweise aus der
EP-A 0 367 220 ist es gleichermaßen bekannt,
mit einer Passage durch eine DEAE-SEPHADEX-Säule oder eine SEPHAROSE-4B-Säule, die
mit Bromcyan aktiviert wurde und auf der spezifische Antikörper fixiert
sind, Verunreinigungen abzutrennen, wobei die Verunreinigungen wie
Haptoglobin und α
1-AGP auf der Säule binden und das Eluat aus
gereinigtem Albumin besteht. Diese Art von Chromatographie ist von
Vorteil, da erstens nur die Verunreinigungen auf der Chromatographiesäule zurückgehalten
werden müssen,
was die Verwendung von Füllbetten
geringeren Volumens erlaubt; zweitens ist das Albumin enthaltende
Eluatvolumen ebenfalls geringer, tatsächlich liegt es in der Größenordnung
des anfangs aufgetragenen Volumens; drittens werden für die Voräquilibrierung
der Säulen
lediglich geringere Flüssigkeitsmengen
benötigt;
viertens müssen
die Füllbetten
nicht behutsam und vollständig
gewaschen werden, um das Albumin zurückzugewinnen, und fünftens reicht
es, die Chromatographiesäulen
durch einfaches Waschen, ohne dass große Vorsichtsmaßnahmen
für die
Waschmethoden notwendig wären,
zu regenerieren. Jedoch kann das erhaltene Albumin in der Wärme noch
in zu großen
Mengen Polymere bilden.
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung
ist ein Reinigungsverfahren, wobei man die Verunreinigungen chromatographisch
fixiert und das Eluat aus einer Albuminlösung besteht, aus der sich
sehr reines Albumin erhalten lässt,
das in der Wärme
praktisch keine Polymere bildet.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
ein Verfahren zur Aufreinigung einer wässrigen Lösung rohen Albumins, wobei
man kontaminierende Proteine mittels Chromatographie auf einer festen
stationären Phase
zurückhält und die
Lösung
aufgereinigten Albumins als Eluat gewinnt, das dadurch gekennzeichnet
ist, dass man als stationäre
Phase eine neutrale oder nahezu neutrale Phase wählt, die mit wenigstens einer
Verbindung beladen ist, welche unter Verbindungen, die C3-C8-Alkylreste aufweisen,
und Verbindungen, die Sulfatgruppen aufweisen, ausgewählt ist.
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Die feste stationäre Phase kann als Fasern oder
Membranen vorliegen; sie besteht vorzugsweise aus einem neutralen
partikulären
Material, d.h. einem, das üblicherweise
in der Chromatographie als neutral angesehen wird, dessen Partikel
eine mittlere Abmessung unterhalb von 2 mm, vorzugsweise von 1 μm bis 2 mm,
aufweisen. In diesem Fall wird die Chromatographie auf wenigstens
einer Säule
durchgeführt.
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Die wässrige rohe Albuminlösung ist
vorzugsweise eine Lösung,
die ausgehend von Blutplasma, insbesondere menschlichem Blutplasma,
mit einer bekannten Methode vom COHN-Typ erhalten wird, d.h., man
fraktioniert das Plasma sukzessive durch Änderung der Temperatur und
durch Einwirkung eines Fällungsmittels,
um im Anschluss an eine wenigstens partielle Abtrennung der Faktoren
VIII und IX und von γ-Globulinen
zu Albuminlösungen
zu gelangen, extrahiert das Fällungsmittel
und gewinnt die Lösung
rohen Albumins.
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Die rohe wässrige Albuminlösung weist
vorteilhafterweise eine Konzentration rohen Albumins von 1 g bis
300 g pro Liter und einen pH-Wert von 6 bis 8, vorzugsweise von
6,9 bis 7,1, auf.
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Die C3-C8-Alkylreste aufweisende Verbindung, mit
der die stationäre
Phase beladen ist, ist vorzugsweise ein Butylrest. Das Füllbett der
Chromatographiesäule(n)
besteht also insbesondere aus dem Produkt, das von der Firma "MERCK" unter der Handelsbezeichnung "FRACTOGEL TSK-BUTYL-650" vertrieben wird.
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Die Sulfatgruppen aufweisende Verbindung, mit
der die stationäre
Phase beladen ist, ist vorzugsweise ein Dextransulfat. Das Füllbett der
Chromatographiesäule(n)
besteht insbesondere aus dem Produkt, das unter der Bezeichnung "DEXTRAN BEADS SULFATED" von der Firma "SIGMA" vertrieben wird.
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Erfindungsgemäß unterwirft man die wässrige rohe
Albuminlösung
wenigstens zwei Chromatographien, d.h. wenigstens einer Chromatographie
auf einer stationären
Phase, die mit einer C3-C8-Alkylreste
aufweisenden Verbindung beladen ist, und wenigstens einer weiteren
Chromatographie auf einer stationären Phase, die mit einer Sulfatgruppen
aufweisenden Verbindung beladen ist.
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Vorteilhafterweise unterwirft man
die wässrige
rohe Albuminlösung
einer Chromatographie auf einer stationären Phase, die mit Sulfatgruppen
aufweisenden Verbindungen beladen ist, vor und nach einer Chromatographie
auf einer stationären
Phase, die mit einer C3-C8-Alkylreste
aufweisenden Verbindung beladen ist, oder umgekehrt einer Chromatographie
auf einer stationären
Phase, die mit einer C3-C8-Alkylreste aufweisenden
Verbindung beladen ist, vor und nach einer Chromatographie auf einer stationären Phase,
die mit Sulfatgruppen beladen ist.
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Vorteilhafterweise kann man die Eluate
einer ersten Chromatographie direkt verwenden, um die sich anschließende Chromatographie
zu speisen. Die Chromatographietemperatur beträgt 1 bis 30°C. Der Chromatographiefluss
auf den Säulen
liegt im Allgemeinen zwischen 1 bis 30 cm/Stunde.
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Falls erforderlich, stellt man den
pH-Wert der als abschließendes
Chromatographieeluat erhaltenen, wässrigen Albuminlösung auf
6,9 bis 7,1 ein und unterwirft diese dann einer Sterilfiltration,
um den Reglementierungserfordernissen der europäischen Pharmacopöe zu genügen.
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Bevor man die wässrige Albuminlösung einer
Chromatographie auf einer stationären Phase, die mit C3-C8-Alkylresten
aufweisenden Verbindung beladen ist, unterwirft, äquilibriert
man die betreffende(n) Säule(n)
mit einer wässrigen
Salzlösung,
welche höchstens
die 10-fache Ionenstärke
der wässrigen
Albuminlösung
aufweist. In gleicher Weise äquilibriert
man die betreffende(n) Säule(n)
mit einer zu der Albuminlösung
höchstens
isotonischen Salzlösung,
bevor man die wässrige
Albuminlösung
einer Chromatographie auf einer stationären Phase, die mit einer Sulfatgruppen
aufweisenden Verbindung beladen ist, unterwirft. Vorzugsweise verwendet
man zur Äquilibrierung
der Säule(n)
eine Natriumchloridlösung
oder einen Phosphatpuffer (PBS).
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Gemäß der bevorzugten Ausführungsform, die
2 oder 3 Chromatographien in Serie beinhaltet, erfordert das erfindungsgemäße Verfahren
während der
Durchführung
keinen Pufferwechsel und auch keinen pH-Wechsel, da die verschiedenen
Chromatographien in Serie durchgeführt werden.
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Ist die behandelte Albuminlösung eine
Lösung
aus humanem Plasmaalbumin, das mit dem Cohn-Verfahren oder einem
verwandten Verfahren präpariert
wurde, ist die erhaltene Albuminlösung stabil, bildet in der
Wärme praktisch
keine Polymere und weist lediglich eine schwache Färbung auf,
was dem Verschwinden von Hämoglobin- und Häm-Spuren
entspricht. Behandelt man eine Lösung
von Rinderalbumin beispielsweise ausgehend von dem Produkt "FLUKA Nr. 05480", ist das erhaltene
Albumin sehr viel stabiler als das Ausgangsalbumin. Des weiteren
ist es möglich,
Lösungen
injizierbaren Albumins, die aussortiert wurden (beispielsweise wegen Trübungen oder
Partikeln), zu behandeln, um ihnen wieder eine gute Stabilität zu verleihen.
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Um den erfindungsgemäßen Gegenstand besser
zu verstehen, wird nun beispielhaft, rein veranschaulichend und
nicht beschränkend
eine Ausführungsform
beschrieben, wobei die Eigenschaften des erhaltenen Produkts in
den anhängenden
Zeichnungen dargestellt sind. In den Zeichnungen zeigt:
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– die 1 die Farbprofile nach Elektrophorese
auf Celluloseacetat für
ein erfindungsgemäß erhaltenes
Albumin und ein Albumin nach Stand der Technik (gemäß dem Verfahren
von Cohn);
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– die 2 die nach Gelfiltration
erhaltenen Extinktionskurven (optische Dichte) für ein erfindungsgemäß erhaltenes
Albumin und ein Albumin nach Stand der Technik (gemäß dem Verfahren
von Cohn);
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– die 3 die für ein erfindungsgemäß erhaltenes
Albumin und ein Albumin nach Stand der Technik (gemäß dem Verfahren
von Cohn) erhaltenen Extinktionsspektren;
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– die 4 die Variation der Turbidität in Abhängigkeit
von der Erwärmungszeit
bei 60°C
für ein erfindungsgemäß erhaltenes
Albumin und ein Albumin nach Stand der Technik (gemäß dem Verfahren von
Cohn).
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Als Ausgangssubstanz verwendet man
Humanplasma, das mit dem von Kistler und Nitschman (Vox Sang. 7,
414–424
(1962)) beschriebenen Verfahren fraktioniert wurde; das Verfahren
basiert im Wesentlichen auf der zuvor beschriebenen Methode von
Cohn: die Albumin enthaltenden Ausgangsfraktionen sind entweder
der Überstand
IV oder das Präzipitat
V.
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Geht man vom Überstand IV aus, der 40% (Volumen)
Ethanol beinhaltet und einen pH-Wert von 5,85 ± 0,05 aufweist, verdünnt man
den Überstand zur
Hälfte
mit einer NaCl-Lösung
(7 g/l). Der pH-Wert wird mit 1 N Natronlauge auf 7,45 ± 0,05
eingestellt. Man konzentriert das Albumin bis auf 90 g/l in einer Ultrafiltrationskassette
vom Typ "Omega" (Filtron), welche
in einem Ultrafiltrationssystem "Omega" (Filtron) "Minisette SS Cell
NPT Cell" (Filtron
Tech. Corp.) betrieben wird, vor. Diese Kassette besitzt eine Filtrationsoberfläche von
0,07 m2 und eine Ausschlussgrenze von 30
KDa. Die Zirkulation wird durch eine peristaltische Pumpe gewährleistet,
deren Druck sich von 2 × 105 Pa zu Beginn der Maßnahme bis auf 5 × 105 Pa gegen Ende ändert. Wird die Konzentration
von 90 g/l Albumin erreicht, setzt man der Albuminlösung eine
NaCl-Lösung
(9 g/l) zu und dialysiert bei konstantem Volumen weiter, bis man
einen Alkoholanteil von weniger als 0,1 Vol.-% erhält. Ist das
Ethanol auf diese Weise eliminiert, setzt man die Dialyse fort,
um die Lösung
bis auf 200 g Albumin pro Liter zu konzentrieren. Man stellt den
pH-Wert mit 1 N Salzsäure
auf 7,10 ± 0,05
ein.
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Geht man vom Präzipitat V aus, suspendiert man
das Präzipitat
in physiologischem Serum (NaCl-Lösung
mit 9 g pro Liter), wobei man 4 Liter physiologisches Serum pro
kg Präzipitat
verwendet. Man filtriert, um Präzipitatklümpchen zu
entfernen, die während
des Rührens
nicht suspendiert wurden; man stellt den pH-Wert mit 1 N Natronlauge
auf 7,45 ± 0,05
ein und konzentriert die so erhaltene Lösung auf 90 g Proteine pro
Liter, wobei man dasselbe Dialysesystem verwendet, das zuvor für den Überstand IV
beschrieben wurde. Die Dialyse wird fortgeführt, indem man physiologisches
Serum nachgibt und bei konstantem Volumen arbeitet, bis ein endgültiger Ethanolanteil
von weniger als 0,1 Vol.-% erreicht ist. Ist das Ethanol auf diese
Weise eliminiert worden, führt
man die Dialyse fort, um die Lösung
bis auf 200 g Proteine pro Liter zu konzentrieren. Man stellt den pH-Wert
mit 1 N Salzsäure
auf 7,1 ± 0,05
ein.
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Die auf diese Weise ausgehend vom Überstand
IV oder vom Präzipitat
V hergestellte Albuminlösung
wird dann steril filtriert (Filter "Millex-GS", 0,2 Micron (Millipore)). Die auf diese
Weise erhaltene rohe wässrige
Albuminlösung
wird dann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
behandelt.
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Die rohe wässrige Albuminlösung wird
zunächst
auf einer stationären
Phase chromatographiert, die mit einer Sulfatgruppen aufweisenden
Verbindung beladen ist, die sogenannte Chromatographie auf polysulfatiertem
Gel. Diese Chromatographie wird in einer 50-ml-Säule (2,5 cm × 10 cm)
(Biorad) durchgeführt,
die mit einem von der Firma "SIGMA" unter der Handelsbezeichnung "DEXTRAN BEADS SULFATED" vertriebenen partikulären Material beladen
ist. Die Säule
wird zunächst äquilibriert,
indem man 3 Säulenvolumina
physiologisches Serum über
das Bett laufen lässt.
Dann wird die Albuminlösung über die
Säule geschickt,
und das Eluat wird direkt über
eine zweite Chromatographiesäule
auf einer stationären
Phase, die mit C3-C8-Resten
beladen ist, geschickt, die sogenannte hydrophobe Chromatographie.
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Die hydrophobe Chromatographie wird
in einer Säule
durchgeführt,
die mit der vorhergehenden identisch ist, wobei das Chromatographiebett
aus einem partikulären
Material besteht, das von der Firma MERCK unter der Handelsbezeichnung "FRACTOGEL TSK BUTYL-650" vertrieben wird.
Vor Gebrauch wird diese Säule äquilibriert,
indem man 3 Säulenvolumina
physiologisches Serum über
das Chromatographiebett laufen lässt.
Ist sie äquilibriert,
wird die Säule
für die
hydrophobe Chromatographie direkt in Serie an den Ausgang der Säule für die Chromatographie
auf polysulfatiertem Gel angeschlossen. Die Äquilibrierung der beiden Säulen kann
auch in Serie geschehen.
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Der Fortgang der Chromatographie
wird verfolgt, indem man die Extinktion der Fraktionen bei 280 nm
am Ausgang der Säule
misst. Das Eluat der beiden in Serie geschalteten Chromatographiesäulen wird
gewonnen und dann durch Dialyse bis auf 200 g Albumin pro Liter
konzentriert oder in physiologischem Serum bis auf 40 g Albumin
verdünnt,
je nachdem, wozu es verwendet werden soll; man stellt den pH-Wert auf 7,00 ± 0,5 ein
und filtriert das Eluat steril auf "Millex-GS"-Filtern (0,2 Micron, Millipore). Der
Durchfluss in den beiden in Serie geschalteten Säulen beträgt 16 cm/Stunde; Die Chromatographien werden
bei 20 °C
durchgeführt.
Verfolgt man den Fortgang der Chromatographie, stellt man fest,
dass man bis zu 400 g Albumin pro Liter Chromatographiebett in der
ersten und in der zweiten Säule
aufgetragen werden können,
ohne die Effektivität
der Trennung wesentlich zu verringern.
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Das Säulenbett der Chromatographie
auf polysulfatiertem Gel wird regeneriert, indem man mit zwei Säulenvolumina
einer Natriumchloridlösung
(2 mol pro Liter) und anschließend
mit zwei Säulenvolumina
einer Natriumchloridlösung
(1 mol pro Liter) bei einem pH-Wert von 9 wäscht. Man regeneriert die Säulenfüllung der
hydrophoben Chromatographie, indem man mit 2 Säulenvolumina 0,1 N Natronlauge wäscht.
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Man hat festgestellt, dass die Fixierkapazität der Chromatographiebetten
nach 40 aufeinanderfolgenden Zyklen aus Chromatographie und Regeneration
nicht beeinträchtigt
war.
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Es wurden bestimmte Eigenschaften
des mit dem oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Albumins
bewertet; die entsprechenden experimentellen Resultate werden nachfolgend
beschrieben. Man hat die Eigenschaften der wässrigen Albuminlösung vor
der Passage durch die beiden Säulen,
d.h. der Chromatographie auf polysulfatiertem Gel und der hydrophoben
Chromatographie, mit den Eigenschaften nach der Passage durch die
beiden Säulen
verglichen. Die Lösung
vor der Passage stellt somit ein Albumin des Standes der Technik
dar, die Lösung
nach der Passage ein erfindungsgemäß chromatographiertes Albumin.
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Man nimmt eine Probe vom Albumin
des Standes der Technik und eine Probe vom erfindungsgemäß präparierten
Albumin. Man setzt diesen Proben 10 mg Natriumcaprylat pro Gramm
Albumin zu und erwärmt
die Proben 10 Minuten auf 60°C.
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1 – Immunelektrophorese:
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Man verwendet die Methode von GRABAR (Grabar
P. et al., Biochem. Biophys. Acta, 17, 67–75 (1955)). Das Gesamt-Antiserum
stellte man her, indem man ein Pferd mit komplettem Humanplasma immunisierte.
Für das
Albumin des Standes der Technik stellte man fest, dass es rund um
das Depotreservoir eine Präzipitationslinie
gibt, was dafür spricht,
dass aus denaturierten Proteinen bestehende "Neoantigene" zugegen sind; im Gegensatz dazu gibt
es diese Präzipitationslinie
für das
erfindungsgemäß chromatographierte
Albumin nicht, was zeigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren das Albumin von
Verunreinigungen bildenden kontaminierenden Proteinen abzutrennen
vermag.
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2 – Elektrophorese auf einer
Celluloseacetatmembran:
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Es wurden 5%ige Proteinlösungen wie
in dem Artikel ROELANDS J.F. et al., Vox Sang., 26, 415–424 (1974)
beschrieben getestet. Die Proben wurden 35 Minuten mit einem Puffer "TRIS-VERONAL" bei einem pH-Wert
von 9,2 und einer Ionenstärke
von 0,05 unter 220 Volt getestet. Die Membranen wurden mit dem Farbstoff "PONCEAU S" behandelt, und die
quantitative Bestimmung mit Densitometrie durchgeführt. Die
resultierenden Kurven sind in der 1 dargestellt:
in der mit A bezeichneten Graphik erkennt man neben dem für Albumin
stehenden Hauptpeak P1 einen für Verunreinigungen
stehenden Sekundärpeak
P2, während
in der für
erfindungsgemäßes Albumin
stehenden Graphik B sich zwar der Peak P1 identisch
wiederfindet, der Peak P2 aber verschwunden
ist, was die Effektivität
des erfindungsgemäßen Reinigungsverfahrens
zeigt.
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3 – Gelfiltration:
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Man verwendet eine Säure "Biorad" (1,5 × 50 cm)
mit einer von der Firma "PHARMACIA
LKB BIOTECHNOLOGY" vertriebenen
Füllung "SEPHACRYL S 400 HR". Diese Säule wird
zuvor mit einem Phosphatpuffer, pH 7, äquilibriert. Anschließend lässt man 20
mg Albumin von jeder Probe über
die präparierte Säule laufen;
der Durchfluss beträgt
1 ml pro Minute. Man verfolgt die Extinktion der Chromatographiefraktionen
(1,2 ml pro Fraktion) mit Hilfe eines Spektrophotometers "UVICON 810" bei 280 nm.
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Die erhaltenen experimentellen Kurven
sind in der 2 dargestellt.
Die durchgezogene Kurve entspricht dem Albumin des Standes der Technik
und zeigt neben dem für
Albumin stehenden Peak P3 einen für kontaminierende Verunreinigungen,
u.a. Polymere, stehenden Peak P4. Im Gegensatz
dazu steht die gestrichelte Kurve für erfindungsgemäß erhaltenes
Albumin; in dieser Kurve steht der Peak P'3, sehr nah
an P3, für
Albumin; es gibt aber keinen benachbarten Peak, was das Fehlen kontaminierender
Verunreinigungen zeigt.
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4 – Extinktionsspektren:
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Man hat das Extinktionsspektrum zwischen 350
und 500 nm für
eine Albuminprobe des Standes der Technik und eine Probe von erfindungsgemäß erhaltenem
Albumin untersucht (Kurve 1 bzw. 2 der 3). Man stellt fest, dass für das erfindungsgemäß erhaltene
Albumin im Gegensatz zur anderen Probe eine Absorption bei 403 nm
fehlt. Es ist bekannt, dass Hämoglobin
bei einer Wellenlänge λ von 403
nm absorbiert. Man stellt daher fest, dass das Albumin des Standes
der Technik Hämoglobinspuren
enthält,
die sich im erfindungsgemäß erhaltenen
Albumin nicht wiederfinden; letzteres hat in der Tat eine weniger
intensive Farbe, selbst wenn man 10 Stunden bei 60°C mit einem
stabilisierenden Additiv erwärmt.
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5 – Veränderung der Turbidität:
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Man hat die Veränderung der Turbidität in Abhängigkeit
von der Erwärmungszeit
bei 60°C
für das
Albumin des Standes der Technik und das erfindungsgemäß erhaltene
Albumin untersucht. Den beiden Proben wurde 1 Gew.-% Natriumcaprylat
bezogen auf das Albumingewicht zugesetzt.
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Die 4 zeigt,
dass die Albuminprobe des Standes der Technik (Kurve C1)
eine Turbitität
aufweist, die im Gegensatz zur verfahrensgemäßen Albuminprobe (Kurve C2) mit der Zeit rasch zunimmt. Die Veränderung
der Turbidität
entspricht der Polymerbildung. Man stellt daher fest, dass die Eliminierung
von Verunreinigungen des Albumins zu einer verminderten Polymerbildung
führt,
die nach 10-stündigem
Erwärmen
bei 60°C
und während
einer längeren
Lagerung der Albuminlösungen
trotz des Zusatzes von Stabilisatoren wie Natriumcaprylat auftreten. Der
erfindungsgemäße Herstellungsprozess
führt zu einer
Albuminlösung,
die sehr viel weniger Polymere bildet, was vom kommerziellen Standpunkt
aus gesehen besonders interessant ist.