DE69108258T2

DE69108258T2 - Mit imidoester quer-vernetzte hämoglobinzusammensetzungen.

Info

Publication number: DE69108258T2
Application number: DE69108258T
Authority: DE
Inventors: Robert Garlick; Stephen Lyle; Joseph Martin
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1990-11-29
Filing date: 1991-10-03
Publication date: 1995-08-10
Anticipated expiration: 2011-10-04
Also published as: HU9301563D0; IL99785A; CZ281912B6; CZ85493A3; EP0559655A1; IE914144A1; IL99785A0; DK0559655T3; US5521154A; FI932461A; MX9102239A; EP0559655B1; SK54993A3; CA2093650A1; PT99666A; NO931956D0; AU8546691A; HUT64571A; WO1992009630A1; FI932461A0

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung eines gereinigten vernetzten Hämoglobinprodukts mit der Eignung als Blutersatz bei Blutübertragungen bei Mensch und Tier oder als Sauerstofftransportfluidum. Das vorliegende vernetzte Hämoglobinprodukt ist im wesentlichen frei von Verunreinigungen, indem es (nämlich) nur sehr geringe Mengen an bakterieliern Endotoxin und Phospholipid enthält.
Über die Struktur und Funktion von Hämoglobin wurde berichtet (H.F. Bunn und B.G. Forget in "Hemoglobin: Molecular, Genetic and Clinical Aspects", W.B. Saunders Company, Philadelphia, S. 690 (1986)). Säugetierhämoglobin ist ein Tetramer mit jeweils zwei von zwei unterschiedlichen Arten von Untereinheiten, Alpha und Beta. Jede Untereinheit besitzt ein Molekulargewicht von etwa 16 000 und enthält eine Häm-Gruppe mit einem zentralen Eisenatom. Der Proteinanteil bzw. das Globin wirkt dahingehend, das Häm-Eisen in reduziertem bzw. Eisen(II)-Zustand zu halten, damit das Hämoglobinmolekül reversibel Sauerstoff zu binden vermag.
Säugetierhämoglobin sollte nicht als statisches Tetramer, d.h. als einzige Porteinart mit einem Molekulargewicht von 64-68000 angesehen werden. Stattdessen besteht es aus durch nicht-kovalente Bindungen verknüpften Untereinheiten und existiert in dynamischen Gleichgewichten mit Monomer-Dimer- und Dimer-Tetramer-Wechselwirkungen. Zu jedem Zeitpunkt dürfte das Hämoglobin aus einem bestimmten Anteil von Monomeren mit einem Molekulargewicht von etwa 16 000, Dimeren eines Molekulargewichts von 32 000 und Tetrameren bestehen. Die Verteilung von Monomeren-, Dimeren- und Tetramerenarten in Lösung hängen von der Hämoglobinkonzentration, dem Ligandenzustand des Hämoglobins sowie dem pH-Wert und der Salzzusammensetzung der Lösung, in der es sich befindet, ab.
Säugetierhämoglobin ist in roten Blutkörperchen oder Erythrozyten enthalten. Bei den Säugetieren haben diese spezialisierten Zellen während der Reifung ihre Kerne verloren, es handelt sich bei ihnen um einfache Hämoglobinsäcke oder -beutel mit sehr geringen Konzentrationen an sonstigen Proteinen. Das Hämoglobin ist aus bestimmten Gründen in zirkulierenden Erythrozyten enthalten. Zunächst würde das Hämoglobin, falls es nicht in Zellen enthalten wäre, sondern frei in Lösung zirkulieren würde, ohne weiteres bei der Passage durch Kapillarwände, die Niere und sonstige Stellen aus dem Kreislauf entfernt. Bestimmte wirbellose Organismen haben dieses Problem gelöst, daß sie polymere Hämoglobine mit Molekulargewichten im Millionenbereich, die zu groß sind, um durch Kapillaren und das Nephron der Niere hindurchzutreten, entwickelt haben. Andere von dem roten Blutkörperchen zu erfüllende Funktionen bestehen in der Bereitstellung einer geschützten Umgebung zum Schutz des Hämoglobinmoleküls gegen proteolytische Serumproteine, in der Aufrechterhaltung eines für die Hämoglobinfunktion geeigneten Ionengleichgewichts, in der Bereitstellung eine das Häm-Eisen in reduziertem (funktionellem) Zustand haltenden Enzymsystems und in der Steuerung der Anwesenheit allosterischer Effektormoleküle.
Es gibt zahlreiche Versuche zur Herstellung geklärter stromafreier Hämoglobinlösungen als Blutersatz bei Blutübertragungen bei Menschen (R.B. Pennell und W.E. Smith "Preparation of stabilized solutions of hemoglobin" in "Blood" 4:380-385 (1949); S.F. Rabiner, J.R. Helbert, H. Lopas und L.H. Friedman, "Evaluation of a strom-free hemoglobin solution for use as a plasma expander" in "J. Exp. Med." 126: 1127-1142 (1967); S.M. Christensen, F. Medina, R.W. Winslow, S.M. Snell, A. Zegna und M.A. Marini, "Preparation of human hemoglobin Ao for possible use as a blood substitute" in "J. Biochem. Biophys. Meth." 17: 43-154 (1988) und M. Feola, H. Gonzalez, P.C. Canizaro, D. Bingham und P. Periman, "Development of a bovine stroma-free hemoglobin solution as a blood substitute" in "Surg. Gyn. Obst." 157: 399-408 (1983)). Diese Lösungen enthalten das Hämoglobin in nicht-modifiziertem Zustand. Das Hämoglobin kann frei in seine Untereinheiten dissoziieren. Eine Infusion von nicht-modifiziertem Hämoglobin führt zu einer raschen Beseitigung des Hämoglobins aus dem Kreislauf. Darüber hinaus gibt es Berichte, daß eine Infusion von nichtmodifiziertem Hämoglobin innerhalb des Körpers zu einem Wirt schädlicher Wirkungen einschließlich von Nephrotoxizität führt. Diese auf nicht-modifiziertes Hämoglobin zurückzuführende Nephrotoxizität hat das Center for Biologics Evaluation and Reseach of the U.S. Food and Drug Administration zu der Aussage veranlaßt, daß nicht-modifiziertes Hämoglobin nicht in einem Sauerstoffträger auf Hämoglobinbasis enthalten sein sollte.
Es gibt zahlreiche Berichte über die Stabilisierung von Hämoglobinlösungen durch Ausbildung kovalenter chemischer Vernetzungen zwischen den Hämoglobinpolypeptidketten (C.W. Rausch und M. Feola, "Extra pure semi-synthetic blood substitute", Internationale Patentanmeldung Nr. PCT/US87/02967, Internationale Veröffentlichung Nr. WO/88/03408, 19. Mai 1988; K. Bonhard und N. Kothe, "Cross-linked hemoglobin of extended shelf life and high oxygen transport capacity and process for preparing same", US-PS 4 777 244; E. Bucci, A. Razynska, D. Urbaitis und C. Fronticelli, "Pseudo cross-link of human hemoglobin with mono-(3,5-dibromosalicyl)fumarate" in "J. Biol. Chem." 264: 6191-6195 (1989) und US-PS 4 001 200).

INFORMATIONEN BEZÜGLICH EINSCHLÄGIGER VERÖFFENTLICHUNGEN

Vernetzte Hämoglobinzubereitungen sind aus den US-PS 4 001 200, 4 011 401, 4 053 590 und 4 061 736 bekannt. Kompliziertere Formen einer Vernetzung von Hämoglobin zur anschließenden Reinigung sind aus der US-PS 4 857 636 bekannt.
Die Herstellung und Vernetzung von Rinderhämoglobin wurde von M. Feola, H. Gonzalez, P.C. Canizaro, D. Bingham und P. Periman unter dem Titel "Developinent of a bovine stromafree hemoglobin solution as a blood substitute" in "Surg. Gyn. Obst.", 157: 399-408 (1983) und Internationale Patentanmeldung Nr. PCT/US87/02967, Internationale Veröffentlichung Nr. WO/88/03408 vom 19. Mai 1988 beschrieben.
Dimethyladipimidat-Reaktionen mit normalem Humanhämoglobin (HbA) und Sichelzellenhämoglobin (HbS) wurden von C.F. Pese und E.L. Amma unter dem Titel "Circular dichroism as a probe of the allosteric R-T transformation in hemoglobins and modified hemoglobins (1977) beschrieben. Aus der US-PS 3 925 344 (1975) ist ein mit Imidoestern vernetztes Hämoglobin zur Herstellung eines Plasmaproteinmaterials oder Plasmaexpanders bekannt. Dieses Material eignet sich jedoch nicht als Sauerstoffübertragungsfluidum. Wie von R. Pennathur-Das, R.H. Heath, W.C. Mentzer und B.H. Lubin unter dem Titel "Modification of hemoglobin S with dimethyl adipimidate Contribution of individual reacted subunits to changes in properties" in "Biochim. Biophys. Acta" 704: 389-397 (1982) berichtet, führte eine Vernetzung mit den Imidoestern (DMA) zu einer erhöhten Sauerstoffaffinität des Hämoglobins, das es zum Transport von Sauerstoff und zu seiner Freigabe ungeeignet macht (vgl. auch R. Pennathur-Das, L.E. Vickery, W. Mentzer und B.H. Lubin in der Veröffentlichung "Modification of hemoglobin A with dimethyl adipimidate. Contribution of individual reacted subunits to changes in oxygen affinity" in "Biochim. Biophys. Acta" 580: 356-365 (1979)).
Somit besteht ein Bedarf nach der Bereitstellung eines Verfahrens zum Vernetzen von Hämoglobin, welches es stabil und vornehmlich in tetramerer Form oder in Form tetramerer Multipler macht und ihm dabei eine p50 bzw. Sauerstoffaffinität läßt, die niedrig genug ist, um wirksam Sauerstoff zu transportieren und anschließend diesen an die Zellen eines lebenden Organismus abzugeben. Es ist ferner wichtig, daß das Molekulargewicht vornehmlich mindestens 64 000 (tetramere Form von Hämoglobin) bei weniger bis nichts unter 64 000 (d.h. dimere oder monomere Form) und wenig bis nichts weit über 64 000 (hierbei kann es sich um Moleküle handeln, die groß genug sind, um eine Komplimentaktivierung bei Säugetierorganismen hervorzurufen) beträgt. Es besteht folglich ein hoher Bedarf nach der Entwicklung eines solchen Polymerisationsverfahrens, um erfolgreich einen Sauerstofftransportersatz aufzufinden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gemäß einer Ausführungsform ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung eine stabile vernetzte Hämoglobinzubereitung mit der Fähigkeit zum Transport und zur Freigabe von Sauerstoff in lebenden Zellen. Das Hämoglobin ist im wesentlichen frei von Verunreinigungen und mit einem Imidoester vernetzt, wobei das Hämoglobin in vornehmlich tetrameren und größeren Formen vorhanden ist. Die bevorzugten Imidoester zum Vernetzen des Hämoglobins sind Dimethyladipimidat oder Dimethylsuberimidat. Ein vornehmlich in tetramerer oder größerer Form vorliegendes Hämoglobin kann als solches interpretiert werden, bei dem mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90 - 95%, des vernetzten Hämoglobins ein Molekulargewicht von mindestens 64 000 Dalton aufweisen. Darüber hinaus ist das imidoestervernetzte Hämoglobin im Vergleich zu üblichen Vernetzungsmaßnahmen gegenüber Methämoglobin sehr stabil und besitzt eine Sauerstoffaffinität p50 von mindestens 1,7 kPa (13 mm Hg).
Die vernetzte Hämoglobinzubereitung kann ferner ein pharmazeutisch akzeptables Trägermedium zur leichteren Blutübertragung oder -injektion an ein zu behandelndes Säugetier oder zur Verwendung als Sauerstoffträgerfluidum zum analytischen, Transplantations- oder Laborgebrauch enthalten. Ein typisches pharmazeutisch akzeptables Trägermedium ist beispielsweise gereinigtes Wasser oder physiologische Kochsalzlösung.
Gemäß einem weiteren Aspekt ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer vernetzten Hämoglobinzubereitung durch
a) Sammeln von Säugetierblut,
b) Abtrennen der roten Blutkörperchen aus dem gesammelten Blut und Waschen der roten Blutkörperchen,
c) Lysieren der gewaschenen roten Blutkörperchen,
d) Zentrifugieren der lysierten Blutkörperchen zur Gewinnung eines Hämoglobinlysats,
e) Reinigen des Lysats durch Anionen- oder Kationenaustauschchromatographie,
f) Durchführen einer Ultrafiltration oder Mikrofiltration des aus der Chromatographiestufe erhaltenen eluierten Lysats zur Gewinnung von gereinigtem Hämoglobin und
g) Vernetzen des gereinigten Hämoglobins mit einem Imidoester zur Gewinnung eines vornehmlich in tetramerer Form vorliegenden Hämoglobins.
Die Lyse der roten Blutkörperchen kann durch hypo-osmotischen Schock erfolgen. Die Ultrafiltration erfolgt in typischer Weise mit einer ein Molekulargewicht von 300 000 aufweisenden Membran. Die Mikrofiltration erfolgt in typischer Weise mit einem etwa 0,025 bis etwa 0,040 um Filter. Andererseits kann die Vernetzung mit dem Imidoester in Stufe (g) nach Erhait des Hämoglobinlysats in Stufe (d) durchgeführt werden. Hierbei beginnt Stufe (e) mit der Reinigung des vernetzten Hämoglobins. Das Verfahren kann zusätzlich eine Stufe (h) aufweisen, in der ein Größenausschluß des gereinigten vernetzten Hämoglobins zur Entfernung von niedrigmolekularem Hämoglobin (weniger als 64 000 Dalton) erfolgt. In typischer Weise erfolgt der Größenausschluß durch Niederdruckgrößenausschluß- Chromatographie.
Die vorliegende Erfindung beschreibt folglich eine imidoestervernetzte Hämoglobinzubereitung, die im wesentlichen von Verunreinigungen frei ist und in vornehmlich tetramerer oder größerer Form vorliegt und die eine gegenüber traditionelleren Formen von Hämoglobinvernetzung, z.B. mit Glutaraldehyd, verbesserte Oxidationsbeständigkeit des Hämoglobins aufweist. Die Hämoglobinzubereitung besitzt ein Hauptmolekulargewicht von mindestens 64 000 Dalton und eine verbesserte Vernetzungstabilität. Das Hämoglobin eignet sich zur Verwendung als Blutsauerstofftransportersatz für Säugetiere oder allgemein als Sauerstofftransportfluidum.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zum Reinigen und Vernetzen von Hämoglobin mit bestimmten Imidoestern, die bislang noch nicht zur Vernetzung von Hämoglobin zur Verwendung als Transfusionstherapeutikum verwendet wurden. Diese bifunktionellen Imidoester-Vernetzungsmittel umfassen u.a. Dimethyladipimidat und Dimethylsuberimidat. Bei Verwendung dieser Vernetzungsmittel sind gegenüber bislang verwendeten Vernetzungsmitteln für Hämoglobin Vorteile zu erzielen. Es wurden spezielle Reaktionsbedingungen entwickelt, die für eine enge Molekulargewichtsverteilung und einen geeigneten Sauerstoff transport sorgen.
Imidoester, wie Dimethyladipimidat und Dimethylsuberimidat sind bifunktionelle Vernetzungsmittel, die unter milden Bedingungen spezifisch und rasch mit Proteinen reagieren. Mit Epsilon-Aminogruppen von Lysinresten und dem aminoterminalen Amin von Polypeptidketten entstehen stabilie Amidinaddukte (F. Wold (1972), "Bifunctional reagents" in "Methods in Enz." 25: 623-651 und K. Peters und F.M. Richards (1977), "Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure" in "Ann. Rev. Biochem." 46: 523-551). Das Vernetzungsreagens reagiert in typischer Weise mit einer bis zwei Aminogruppe(n) pro Hämoglobinuntereinheit. Eine gewisse Vernetzung erfolgt auch zwischen den zwei Beta-Ketten-Lysinresten (Beta-82), die die tetramere Form von Humanhämoglobin stabilisieren. Dimethyladipimidat wurde als Antisichelmittel für Hämoglobin S untersucht (vgl. B.H. Lubin, V. Pena, W.C. Mentzer, E. Bymun, T.B. Bradley und L. Packer (1975), "Dimethyl adipimidate: a new antisickling agent" in "Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A." 72: 43-46). Eine Modifizierung der Beta-82-Lysine ändert die Konformation der desoxygenierten Form von HbS und verhindert auf diese Weise seine Kristallisation oder Gelierung. Eine Kristallisation ist die molekulare Basis für das Sichelbildungsphänomen, das bei befallenen roten Blutkörperchen feststellbar ist. Obwohl zur Verhinderung einer Sichelbildung eine Modifizierung des Beta-82-Lysins durch das Vernetzungsmittel erforderlich ist, ist es die aktuelle Vernetzung der beiden Beta-82-Lysine mit einem Hämoglobin-Tetrameren nicht. Die vorliegende Erfindung benutzt das Dimethyladipimidat bei Rinderhämoglobin mit der Absicht zur Bildung von sowohl stabilisierten Tetrameren durch Einführen von Vernetzungen zwischen Untereinheiten zwischen den Beta-82-Lysinen und von hochmolekularen Aggregaten stabilisierter Tetramerer durch Einführen intramolekularer Vernetzungen zwischen Epsilon-Aminogruppen getrennter stabilisierter Hämoglobintetramerer.
Die Vorteile einer Vernetzung von Hämoglobin mit Imidoestern und insbesondere Dimethyladipimidat, sind zweifach. Zunächst hemmt eine Vernetzung die Dissoziation von tetramerem Hämoglobin eines Molekulargewichts von 64 000 in Dimere mit Molekulargewichten von 32 000. Bei dem unmodifizierten Hämoglobin befinden sich tetramere und dimere Arten in einem dynamischen Gleichgewicht. Eine Stabilisierung des tetrameren Hämoglobins durch Vernetzung mit Imidoestern vermindert die Passage des Hämoglobins in die Nierentubuli durch Verhinderung einer Filtration durch die Membran der glomerulären Kapsel in erheblichem Maße.
Zum zweiten führt eine Vernetzung zur Bildung hochmoleku-Jarer Oligomerer des Hämoglobintetramers, die gegenüber einer Nierenfiltration extrem widerstandsfähig sind und gegenüber einer Oxidation bei physiologischer Temperatur weit stabiler sind als sowohl unmodifiziertes Hämoglobin oder mit dem Vernetzungsmittel Glutaraldehyd modifiziertes Hämoglobin.
Dimethyladipimidat ist ein relativ preisgünstiges Reagens und in großen Mengen verfügbar. Das Vernetzungsverfahren mit Dimethyladipimidat läßt sich gut in größerem Maßstab durchführen.
Es wurden die Sauerstoffbindeeigenschaften der verschiedensten Formen von Rinderhämoglobin bestimmt. Die Ergebnisse finden sich in Tabelle 1. P50 ist derjenige Sauerstoffpartialdruck, bei dem 50% der verfügbaren Stellen Sauerstoff gebunden enthalten. In Tabelle I ist der P50-Wert in mmHg-Säule angegeben. Der Hill-Koeffizient bzw. n-Wert ist ein Ausdruck für die Cooperationsfähigkeit unter den Sauerstoffbindungsstellen, wobei hohe n-Werte für eine hohe Cooperationsfähigkeit stehen. Die P50-Werte wurden sowohl während der Oxidation als auch während der Entoxidation der Hämoglobinlösung gemessen. Die mittleren P50-Werte waren 1,8 kPa (13,5 mm Hg) für mit Dimethyladipimidat vernetztes Hämoglobin, 1,9 kPa (14,25 mm Hg) für mit Glutaraldehyd vernetztes Hämoglobin und 3,16 kPa (23,75 mm Hg) für nicht-modifiziertes Rinderhämoglobin. Wurde mit Imidoestern oder Glutaraldehyd eine extreme Vernetzung durchgeführt, sanken die p50-Werte für diese Hämoglobine stark ab. Ferner verminderte eine Vernetzung des Hämoglobins sowohl mit den Imidoestern als auch mit dem Glutaraldehyd dessen cooperationsfähigkeit bei größerer Verminderung bei der mit Glutaraldehyd behandelten Probe. TABELLE I Hb-Probe P50-Oxidation P50-Entoxidation n-Wert Rinder Hb Glutaraldehyd-vernetzt DMA-vernetzt Überschüssiger Glutaraldehyd Uberschüssiges DMA
Ein Vergleich dem Stabilität der verschiedenen vernetzten Hämoglobine zeigte, daß die Imidoesterversion die bessere Stabilität aufwies. Folglich lieferte der Imidoester bei geeigneten Vernetzungsmaßnahmen - wie sie im folgenden beschrieben werden - unter Beachtung der Stabilität und Sauerstoffaffinität ein besseres Sauerstofftransporthämoglobin.
Bei der Inkubation bei 36 - 37ºC enthielten die Dimethyladipimidat-vernetzten, Glutaraldehyd-vernetzten bzw. unmodifizierten Hämoglobinproben 2,5%, 8,0% bzw. 3,5% Methämoglobin zu Beginn der Inkubation. Nach 5 h bei 36 - 37ºC betrugen die Prozentanteile an Methämoglobin 8,9%, 44,4% bzw. 8% für die Dimethyladipimidat-vernetzten, Glutaraldehyd-vernetzten bzw. unmodifizierten Rinderhämoglobinproben. Nach 24 h betrugen die Methämoglobinkonzentrationen 24,1, 87,9 bzw. 42% für die Dimethyladipimidat-vernetzten, Glutaraldehyd-vernetzten bzw. unmodifizierten Rinderhämoglobinproben. Nach 48 h betrugen die Methämoglobinkonzentrationen in den Dimethyladipimidat-vernetzten bzw. unvernetzten Rinderhämoglobinproben 46,5% bzw. 68%. Das Dimethyladipimidat-vernetzte Hämoglobin war gegenüber einer Methämoglobinbildung stabiler als das unmodifizierte Hämoglobin. Die Literatur berichtet darüber, daß Glutaraldehydvernetztes Humanhämoglobin mit einer 4mal schnelleren Geschwindigkeit autoxidiert als das unmodifizierte Humanhämoglobin. Folglich war es unerwartet, daß das DMA-vernetzte Hämoglobin stabiler ist als das nicht-modifizierte Hämoglobin.
Die Stabilität des nicht-modifizierten Rinderhämoglobins und eines Dimethyladipimidat-vernetzten bzw. Glutaraldehydvernetzten Rinderhämoglobins gegen Autoxidation wurde nach 52- tägiger Inkubation bei 4ºC in dem zuvor beschriebenen Phosphatpuffer ebenfalls bestimmt. Nach 28 Tagen erhöhte sich der Methämoglobingehalt des Dimethyladipimidat-vernetzten Rinderhämoglobins von 2,5% auf 9,6%. Innerhalb derselben Zeit erhöhte sich der Methämoglobingehalt des Glutaraldehyd-vernetzten Hämoglobins von 8,0% auf 23,5%. Bei einer Messung nach 52 Tagen enthielt das Dimethyladipimidat-vernetzte Hämoglobin 14,3% Methämoglobin, während nach 37 Tagen das nicht-modifizierte Rinderhämoglobin 16,3% Methämoglobin enthielt. Wie bei der Inkubation bei 37ºC war das Dimethyladipimidat-vernetzte Hämoglobin signifikant stabiler als das Glutaraldehyd-vernetzte Hämoglobin bzw. das nicht-modifizierte Rinderhämoglobin.
Gemäß einem Aspekt betrifft die Erfindung die Stabilitätsverbesserung von Säugetierhämoglobinen einschließlich von Rinderhämoglobin nach der Vernetzung mit Imidoestern, einschließlich Dimethyladipimidat. Es wird hierin beschrieben, daß sich die Stabilität von Säugetierhämoglobinen durch Umsetzung mit Imidoestern, insbesondere Dimethyladipimidat unter speziellen Reaktionsbedingungen verstärken läßt. Darüber hinaus wird auch ein Verfahren zur Herstellun von gereinigtem Säugetierhämoglobin, insbesondere Rinderhämoglobin, beschrieben. Das Hämoglobin ist im wesentlichen frei von Verunreinigungen, d.h. es enthält keine Materialien in einer solchen Menge, die für das behandelte Säugetier schädlich sind. Das Hämoglobin sollte vor der Vernetzung ausreichend frei von Endotoxin (beispielsweise weniger als 0,5 EU/ml bei einer Hämoglobinkonzentration von mindestens 40 mg/ml), Phospholipid, Viren und sonstigen Nicht-Hämoglobinproteinen sein. Es ist jedoch auch möglich, das Hämoglobin nach Sammlung des lysierten Hämoglobins zuerst zu vernetzten und dann das vernetzte Hämoglobin zu reinigen. In der Tat ist diese Verfahrenvariante für eine großtechnische Durchführung wirksamer. Das gereinigte und vernetzte Hämoglobin eignet sich als Sauerstofftransport-Blutstreckmittel für Infusionen bei Mensch und Tier.
In typischer Weise wird das erfindungsgemäße Hämoglobin durch Sammeln des Säugetierbluts unter aseptischen Bedingungen, Waschen der roten Blutkörperchen, Lysieren der roten Blutkörperchen, Zentrifugieren des Lysatsl entweder Ultrafiltrieren mit einer Membran eines Molekulargewichts von mindestens 300 000 oder Mikrofiltrieren mit einem 0,025 bis etwa 0,040 um-Filter, Reinigen durch Anionen- oder Kationenaustauschchromatographie zur Gewinnung eines gereinigten Hämoglobins, anschließendes Vernetzen mit dem Imidoester und gegebenenfalls Durchführen einer Größenausschlußchromatographie oder -ultrafiltration zur Entfernung irgendwelchen niedrigmolekularen Hämoglobins hergestellt. Andererseits kann das Hämoglobin auch nach dem Zentrifugieren und Sammeln des Lysats vernetzt worden sein. Danach können sich die Reinigungsstufen einschließlich der gegebenenfalls durchzuführenden Größenausschlußstufe anschließen.
Das erhaltene Hämoglobin dürfte im wesentlichen von Verunreinigungen frei sein und besteht vornehmlich aus einem stabilisierten Tetramer. Ein anderer Weg zur Charakterisierung des vernetzten Hämoglobins dürfte darin bestehen, seine Molekulargewichtsverteilung mit vornehmlich mindestens 64 000 festzulegen. "Vornehmlich" oder "vorherrschend" bedeutet hier und im folgenden mindestens 80% des vernetzten Hämoglobins, vorzugsweise 90 - 95% des vernetzten Hämoglobins.
Zur Herstellung des vorliegenden speziellen Sauerstofftransport-Hämoglobins werden (im folgenden) die verschiedensten Vernetzungsreaktionsparameter aufgeführt. Zunächst besitzt die Konzentration an Chloridionen und/oder Natriumchlorid einen tiefgründigen Einfluß auf das Ausmaß der Vernetzung von (Rinder)hämoglobin mit DMA über den Bereich von 1 mM Tris- HCl bis 50 mM Tris-HCl plus 2,0 M NaCl. In 1 und 10 mM Tris- HCl blieben nach 10 Zusätzen von DNA 90,3% bzw. 72,2% des Hämoglobins unpolymerisiert. Im Gegensatz dazu blieben in Gegenwart von 50 mN Tris-HCl plus 0,5, 1,0 bzw. 2,0 M NaCl lediglich 25,8, 24,4 bzw. 20,7% unvernetzt. Eine stetige Abnahme im unpolymerisierten Hämoglobin sowie eine Zunahme im hochmolekularen Bereich (> 400 000 Dalton) ließen sich mit zunehmender Salzkonzentration beobachten. Der höchste prozentuale Hämoglobinanteil im 64 - 400 000-Bereich wurde beobachtet, wenn die Vernetzung entweder in 50 mM Tris-HCl oder in 50 mM Tris-HCl plus 100 mM NaCl stattfand.
Zweitens hat es sich gezeigt, daß die Pufferart die Vernetzung stark beeinflußt. So lief beispielsweise die DMA-Vernetzungsreaktion in Glycin-HCl, Ethanolamin-HCl und in einer Lösung mit Natriumphosphat plus Lysin (recht) schlecht ab. Bei diesen Pufferarten hemmte vermutlich die primäre Aminofunktion die Vernetzungsreaktion, die offensichtlich vornehmlich an Aminogruppen am N-Terminus des Proteins und an seinen Lysinresten stattfindet. Die stärkste Vernetzung war in Gegenwart eines 2-Amino-2-methyl-1-propanolpuffers feststellbar. Hier blieben lediglich 23,4% des Hämoglobins unvernetzt. Dieser Puffer besitzt offensichtlich ebenfalls eine primäre Aminofunktionalität. Die nächsten vier Puffer, ausgewählt hinsichtlich ihrer DMA-Vernetzungswirksamkeit, waren Tris-(tris- [hydroxymethyl]-aminomethan), Natriumcarbonat, CHES (2-[N- Cyclohexylamino]-ethansulfonsäure) und CAPSO (3-[Cyclohexylamino]-2-hydroxy-1-propansulfonsäure); drei dieser Puffer besitzen primäre Aminofunktionalitäten. Im Gegensatz dazu war CAPS (3-[Cyclohexylamino]-1-propansulfonsäure) kein guter Puffer für die Vernetzungsreaktion. Das erhaltene Produkt war lediglich zu 27,2% vernetzt. Natriumphosphat war ebenfalls keine gute Wahl für die Vernetzungsreaktion.
Drittens spielte der pH-Wert eine wichtige Rolle bei einer wirksamen Polymerisation von Hämoglobin zu einem Imidoester. So waren beispielsweise Versuche zur Vernetzung von Hämoglobin mit DMA bei pH-Werten unter 8,0 im allgemeinen nicht erfolgreich. Bei einem pH-Wert von 8,0 waren nach 10 Zugaben von DMA und einem endgültigen stöchiometrischen Verhältnis DMA/Hämoglobin von 10 lediglich 12,2% vernetzt. Eine Erhöhung im Vernetzungsgrad war bei pH-Werten von 9,0, 10,0 bzw. 10,5 feststellbar, wobei am Ende der DMA-Zusätze lediglich 58%, 48% bzw. 50% unvernetzt geblieben waren. Aus den Ergebnissen geht jedoch hervor, daß die Reaktion von DMA mit Hämoglobin einen pH-Wert von 9 oder mehr erfordert, um erfolgreich zu sein.
Weiterhin hat es sich gezeigt, daß Hämoglobin, dem Sauerstoff entzogen worden war, rascher vernetzt wurde als oxidiertes Hämoglobin. Nachdem für die oben geschilderten Polymerisationsbedingungen für eine optimale Vernetzung gesorgt worden war, läßt sich das unvernetzte Hämoglobin abfiltrieren oder auschromatographieren, um das Molekulargewicht von 64 000 oder darüber zu gewinnen. Durch weiteres Filtrieren oder Chromatographieren erhält man dann vornehmlich das Molekulargewicht von 64 000. Folglich erleichtert eine Optimierung der Vernetzung des Hämoglobins in hohem Maße die wirtschaftliche und praktische Herstellung des vorliegenden Sauerstoffübertragungs-Materials, das vornehmlich ein Molekulargewicht von 64 000 - 300 000 aufweist.
Nachdem das vernetzte Hämoglobin hergestellt ist, wird es in typischer Weise in ein zur Injektion oder Infusion in ein zu behandelndes Säugetier geeignetes, pharmazeutisch akzeptables Trägermedium eingebracht. Zu typischen pharmazeutisch akzeptablen Trägermedien gehören beispielsweise physiologisch akzeptable Salzlösungen zur Injektion oder Infusion, z.B. handelsübliche physiologische Kochsalzlösungen. Ein pharmazeutisch akzeptabler Träger ist jede beliebige Flüssigkeit, die gegenüber dem vernetzten Hämoglobin relativ inert ist und keine schädlichen Einflüsse auf das Säugetier, dem sie infundiert oder injiziert wird, ausübt. Geeignete Fluide können auch andere Blutprodukte entweder natürlichen oder synthetischen Ursprungs oder Fluorkohlenstofffluide umfassen. Im allgemeinen wird das vorliegende vernetzte Hämoglobin in einen geeigneten pharmazeutischen Träger in einer solchen Menge eingemischt, daß die Hämoglobinkonzentration in adequater Menge von etwa 40 bis etwa 140 mg/ml verabreicht werden kann.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden hinsichtlich der verschiedenen Stufen und der zuvor beschriebenen molekularen Zusammensetzungen näher erläutert. Die beschriebenen Verfahren gelten für jedes Säugetierhämoglobin, auch wenn zu Belegzwecken die die Reinigung, die Vernetzung und die Modifizierung beschreibenden speziellen Beispiele mit Rinderhämoglobin befaßt sind. Rinderhämoglobin besitzt allerdings den Vorteil, einen zum Sauerstofftransport geeigneten sehr hohen p50- Wert aufzuweisen.

Beispiel 1

Sammeln von Blut und Herstellung eines roten Blutkörperchenhämolysats

Holstein-Stieren auf einer der The Upjohn Company Agricultural Division gehörenden Farm wurde auf aseptische Weise Blut entnommen. Zunächst wurden die einzelnen Stiere am Hals mit elektrischen Haarschneidemaschinen geschoren. Der geschorene Bereich wurde dann mit einem in eine Jodlösung getauchten Handtuch abgewischt und danach mit 95%igem Ethanol aus einer Spritzflasche gewaschen. Vor der Blutentnahme durfte das Ethanol an der Luft wegtrocknen. Das Blut wurde in sterile und keimfreie 0,5 - 1,0 l fassende Blutsammelflaschen aufgezogen. Vor der Blutentnahme wurde in jede Flasche eine geeignete Menge einer sterilen Natriumheparinlösung gefüllt. Unmittelbar nach dem Füllen wurden die Flaschen auf Eis gelegt und auf Eis ins Labor transportiert. Für anfängliche Untersuchungen wurden 2,5 - 5,0 l Blut entnommen.
Im Labor wurden sämtliche Maßnahmen entweder auf Eis oder bei 4ºC durchgeführt, um das Mikroorganismuswachstum und die gleichzeitige Keimbildung zu minimieren. Darüber hinaus sollten die Reinigungsstufen in einer sauberen Umgebung mit filtrierter Luft mit niedrigem Teilchengehalt durchgeführt werden. Die ersten Stufen bei der Reinigung des Hämoglobins umfassen die Abtrennung der roten Blutkörperchen aus dem Blutplasma und eine anschließende wiederholte Wäsche der roten Blutkörperchen mit einer Salzlösung sowie das Zentrifugieren zur Pelletisierung der roten Blutkörperchen. Das Vollblut wurde zunächst in keimfreie 0,5 l fassende Zentrifugenflaschen gegossen und 30 - 40 min bei 4 000 U/min und 4ºC zentrifugiert. Während des Zentrifugierens wurden die roten Blutkörperchen pelletisiert. Das Blutplasma im Überstand wurde durch Absaugen entfernt. Die roten Blutkörperchen bzw. Erythrozyten wurden in einer eiskalten Lösung mit 16 g Natriumchlorid (NaCl) pro Liter gereinigten Wassers resuspendiert. Diese Lösung wird als 1,6%ige physiologische Kochsalzlösung bezeichnet. Die roten Blutkörperchen wurden durch Verrühren mit einem sterilen und keimfreien Glasstab oder durch schwaches wiederholtes Wenden der Zentrifugenflasche resuspendiert. Nachdem die roten Blutkörperchen resuspendiert waren, wurden sie 30 - 40 min lang bei 4ºC mit 10 000 U/min rezentrifugiert. Die roten Blutkörperchen wurden in 1,6%iger physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert und erneut 30 - 40 min lang bei 4ºC mit 10 000 U/min zentrifugiert. Schließlich wurden die roten Blutkörperchen vor ihrem Aufbrechen bzw. ihrer Lyse insgesamt dreimal mit 1,6%iger physiologischer Kochsalzlösung gewaschen.
Nach dem Waschen der Zellen wurden die roten Blutkörperchen auffolgende Art und Weise durch hypo-osmotischen Schock lysiert. Ein Volumen gewaschener pelletisierter roter Blutkörperchen wurde mit 4 Volumina eiskalten 0,0025 M Natriumphosphatpuffer eines pH-Werts von 7,4 versetzt. Die roten Blutkörperchen wurden in diesem verdünnten Phosphatpuffer durch schwaches Wenden der Zentrifugenflaschen suspendiert. Nachdem die Zellen vollständig suspendiert waren, wurden die Suspensionen der roten Blutkörperchen 1 h lang bei 0 - 4ºC inkubiert und danach 30 - 90 min lang bei 4ºC und 10 000 U/min zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wurde das Hämoglobin im Überstand durch Absaugen entfernt. Bei bestimmten Versuchen wurde das Protokoll auf folgende Art und Weise modifiziert. Nach der 1-stündigen Inkubation mit dem 0,0025 M Natriumphosphatpuffer bei 0 - 4ºC wurde vor dem Zentrifugieren eine 2,0 M Lösung von Natriumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 0,2 M zugegeben. Der Zusatz des Natriumchlorids zu dem Lysat der roten Blutkörperchen lieferte nach dem Zentrifugieren einen klareren Überstand.
Nach dem Zentrifugieren zur Herstellung des Hämolysats kann eine Blankfiltrierstufe eingeschaltet werden. Dem zentrifugierten Hämolysat kann unter Rühren ein Filterhilfsmittel in Form entweder eines Cellulosederivats, einer Diatomeenerde oder eines Polymers oder eines Siliziumdioxidderivats zugegeben werden. Das Filterhilfsmittel wird dann durch Filtrieren oder Zentrifugieren entfernt. Die Einschaltung einer Blankfiltrierstufe mit einem Filterhilfsmittel entfernt weitere Stromafragmente und somit Phospholipid, die durch das Zentrifugieren nicht vollständig entfernt werden.
Als Alternative zu dem hypo-osmotischen Schock zum Lysieren der roten Blutkörperchen kann man diese mechanisch aufbrechen, z.B. mit einer French-Presse oder einem größer dimensionierten Zellenhomogenisator.
Der Keimgehalt der vier behandelten Hämolysate reichte von 0,05 - 0,2 Endotoxineinheiten (EU)/ml im Rahmen des Limulus-Amoebocytenlysat (LAL)-Keimtests. Eine Stromabwärtsbehandlung durch Anionenaustausch- oder Kationenaustauschchromatographie dürfte die letzten Spuren von Endotoxin und Phospholipid entfernen.

Beispiel 2

Verminderung des Virusgehalts

Wenn das Rinderblut mit Viren verunreinigt ist, wird eine bestimmte Menge viraler Belastung beim Waschen der roten Blutkörperchen unter Zentrifugieren mit niedriger Geschwindigkeit entfernt. Ein weiterer Prozentsatz wird beim Hochgeschwindigkeitszentrifugieren des Hämolysats entfernt und im Pellet bleiben. Ein weiterer aliguoter Teil läßt sich in einer Blankfiltrierstufe entfernen.
Eine weitere Verminderung der viralen Belastung erfolgt durch Mikrofiltration und/oder Ultrafiltration. Eine Mikrofiltration mit einem 0,025 - 0,040 um-Filter vermindert in hohem Maß den Titer der meisten Viren. Eine Ultipor-N66-Nylon 66-Mikrofiltrationspatrone der Pall Corporation besitzt eine Porosität von 0,04 um und eignet sich zum Filtrieren des Hämolysats vor einer weiteren Stromabwärtsbehandlung. Darüber hinaus steht eine Ultrafiltrationsmembran mit einem Rückhaltevermögen eines Molekulargewichts von 300 000 der Filtron Corporation zur Verfügung. Diese Wird in eine Pellicon-Produktionsmaßstab- Ultrafiltrationseinheit der Amicon Corporation eingefügt. Das Hämoglobin tritt frei durch sämtliche dieser Ultra- und Mikrofiltrationsmembranen hindurch, während ein Teil der Viren zurückgehalten wird. Folglich reduziert eine Kombination dieser beiden Filtrationsmembranen die virale Belastung in hohem Maße. Jede dieser Filterarten zeigt eine niedrige Proteinretention.
Neben der Filtration konnte der Virusgehalt des Hämolysats oder filtrierten Hämolysats auch durch Zusatz von geeigneten Detergentien von Ethylendinitrilotetraessigsäure, des von der FDA akzeptierten Reagens Trinitrobutylphosphat oder einer Kombination dieser Zusätze vermindert werden.

Beispiel 3

Ionenaustauschchromatographie des Hämoglobins

Zur Reinigung von Säugetierhämoglobinen bediente man sich in großem Umfang einer Anionenaustauschchromatographie (vgl. R.C. Williams und K. Tsay (1973) in "Anal. Biochem." 54: 137- 45). Unter geeigneten pH-Wert- und Ionenstärkebedingungen kann Hämoglobin zur Bindung an den Austauscher auf einen Anionenaustauscher appliziert werden. Während der Entwicklung der Säule können einweißartige und nicht-eiweißartige Verunreinigungen aus dem Hämoglobin entfernt werden. Man kann auch Bedingungen wählen, unter denen Hämoglobin nur eine geringe oder keine Affinität zu dem ausgewählten Anionenaustauscherharz besitzt. Unter den Bedingungen bleiben die Verunreinigungen auf der Säule. Die in frisch zubereitetem Hämolysat hauptsächlich vorhandenen Verunreinigungen bestehen aus Phospholipiden, möglicherweise restlichem Virus, der durch die stromaufwärts liegenden Behandlungsstufen nicht entfernt wurde, geringen Mengen an bakteriellem Endotoxin und anderen Proteinen als Hämoglobin. Endotoxin, Phospholipid und Plasmaproteine sind stärker negativ geladen als Hämoglobin und sollten unter den gewählten Bedingungen eine höhere Affinität für den Anionenaustauscher aufweisen. Unter geeigneten Aufgabe- und Eluierbedingungen dürfte sich die Anionenaustauschchromatographie zur Lösung des Hämoglobins von diesen Verunreinigungen eignen. Darüber hinäus sollte die Anionenaustauschchromatographie die virale Belastung weiter vermindern.
Wir bedienten uns dreier Anionenaustauschchromatographie- Protokolle zur Reinigung des Hämoglobins: Bindung bei erhöhtem pH-Wert und Eluieren mit einem absteigenden pH-Gradienten, Bindung bei erhöhtem pH-Wert und Eluieren mit einem Stufengradienten niedrigeren pH-Werts und Aufgabe unter pH-Wertbedingungen, bei denen das Hämoglobin keine Bindung an den Anionenaustauscher eingeht, sondern frei durch die Säule läuft. Sämtliche unserer Versuche wurden mittels einer Säule durchgeführt, erwartungsgemäß dürften sich jedoch unter chargenweiser Behandlung ähnliche Bedingungen entwickeln lassen, die nahezu Identische Ergebnisse liefern. Der bei diesen Versuchen benutzte Anionenaustauscher war Q-Sepharose Fast Flow von Pharmacia. Erwartungsgemäß dürften sich jedoch diese Maßnahmen mit einer Reihe von handelsüblichen Niedrig- bis Mitteldruckanionenaustauschern, die zur Proteinreinigung entwickelt wurden, einschließlich solcher mit quaternären Amin- und Diethylaminoethylfunktionalitäten, durchführen lassen.
Zur Reinigung von Säugetierhämoglobinen wurde auch bereits in großem Umfang eine Kationenaustauschchromatographie durchgeführt (vgl. E. Bucci (1981) "Preparation of isolated chains of human hemoglobin" in "Meth. in Enzymol." 76: 97- 106). Unter geeigneten pH-Wert- und Ionenstärkebedingungen kann Hämoglobin zur Bindung an den Austauscher auch auf einen Kationenaustauscher appliziert werden. Unter Bedingungen, unter denen Hämoglobin eine Bindung eingeht, dürften Phospholipid und Endotoxin sowie Plasmaproteine allenfalls eine geringfügige Affinität zum Kationenaustauscher zeigen. Unter geeigneten Aufgabe- und Eluierbedingungen sollte sich die Kationenaustauschchromatographie zum Lösen von Hämoglobin von diesen Verunreinigungen eignen. Darüber hinaus führt die Kationenaustauschchromatographie zu einer weiteren Verminderung der viralen Belastung.
Zur Reinigung des Hämoglobins wurden zwei Kationenaustauschchromatographie-Protokolle entwickelt. Beim ersten Protokoll wurde das Hämoglobin unter Bedingungen, unter denen es eine Bindung an den Kationenaustauscher eingeht, aufgegeben und danach mlt einem linearen pH-Wertgradienten eluiert. Beim zweiten Protokoll wurde das Hämoglobin unter Bedingungen, unter denen es eine Bindung an das Harz eingeht, aufgegeben und danach mit einem Stufen-pH-Wertgradienten eluiert. Bei beiden Protokollen passieren das Phospholipid und Endotoxin das Harz ungehemmt, so daß diese Verunreinigungen vom Hämoglobin gelöst werden. Es eignet sich eine Reihe von handelsüblichen Kationenaustauschern. Vorzugsweise wurde ein S-Sepharose Fast Flow von Pharmacia wegen seiner hervorragenden Proteinbindungs- und Fließeigenschaften verwendet. Eine Menge anderer Niedrig- bis Mitteldruckchromatographiemedien mit einer Sulfopropyl- oder Carboxymethylfunktionalität dürfte erwartungsgemäß die erforderliche Funktion ebenfalls erfüllen. Es ist wirtschaftlich, diese Harze abzuwiegen.

Beispielel 3A

Anionenaustauschchromatographie mit einem linearen pH-Wert- Gradienten

Dieser Versuch war eine Demonstration der Anionenaustauschchromatographiebedingungen, unter denen Rinderhämoglobin auf den Austauscher geladen und danach mit einem linearen pH- Wert-Gradienten eluiert wurde. Es wurde eine 2,5 x 5,5 cm Säule von Q-Sepharose Fast Flow vorbereitet und durch Einwirkenlassen von 0,5 M NaOH über Nacht gereinigt. Die Säule wurde mit 100 mM Tris eines pH-Werts von 8,5 gewaschen, bis der Säulenablauf einen pH-Wert von 8,5 aufwies. Danach wurde die Säule mit 50 mM Tris eines pH-Werts von 8,5 ins Gleichgewicht gesetzt. 5 ml einer Probe eines frisch zubereiteten Hämolysats roter Rinderblutkörperchen mit etwa 350 ml Hämoglobin wurden mit 10 ml 100 mM Tris eines pH-Werts von 8,5 verdünnt und mit einer Geschwindigkeit von 2,5 ml/min auf die Q-Sepharose-Säule geladen. Nach dem Laden wurde die Säule mit 50 mM Tris eines pH-Werts von 8,5 gewaschen, bis die Absorption des Säulenablaufs zur Grundlinie zurückkehrte. Danach wurde die Säule mit einem linearen Gradienten, bestehend aus dem Ausgangspuffer gegen 50 mM Tris eines pH-Werts von 6,5 über zehn Säulenvolumina eluiert. Das Hämoglobin eluierte im wesentlichen mit einem einzigen Hauptpeak mit mehreren schwächeren Peaks, die davor und danach eluierten. Der einzige Hauptpeak machte 95% des auf die Säule geladenenen Hämoglobins aus. Sämtliche chromatographischen Maßnahmen wurden bei 5ºC durchgeführt.

Beispiel 3B

Anionenaustauschchromatographie mit einem Stufen-pH-Wert- Gradienten

Dieses Experiment belegt die Anionenaustauschchromatographiebedingungen, unter denen Rinderhämoglobin auf den Austauscher geladen und danach mit einem einzigen pH-Wert-Stufengradienten eluiert wurde. Wie in Beispiel 3A wurde eine 2,5 x 5,5 cm Säule von Q-Sepharose Fast Flow vorbereitet und gereinigt. 8 ml einer Probe eines Hämolysats von roten Rinderblutkörperchen mit etwa 400 mg Hämoglobin wurden mit 50 mM Tris eines pH-Werts von 8,5 auf 16 ml verdünnt und mit einer Geschwindigkeit von 2,7 ml/min auf die Säule geladen. Nach dem Laden wurde die Säule mit 50 mM Tris eines pH-Werts von 8,5 gewaschen, bis die Absorption des Ablaufs zur Grundlinie zurückkehrte. Danach wurde die Säule mit 50 mM Tris eines pH-Werts von 7,4 entwickelt. Das Hämoglobin eluierte aus der Säule im wesentlichen als einzelner Peak. Die in der Q-Sepharosereichen Fraktion vorhandene Hämoglobinmenge war nahezu mit der auf die Säule geladenen Menge identisch. Dies zeigt eine nahezu quantitative Wiedergewinnung über diese Stufe hinweg.

Beispiel 3C

Anionenaustauschchromatographie, bei der das Hämoglobin nicht zurückgehalten wird.

Dieser Versuch zeigt Anionenaustauschchromatographiebedingungen, unter denen das Rinderhämoglobin keine Bindung an den Anionenaustauscher eingeht, sondern - ohne zurückgehalten zu werden - (frei) durch die Säule läuft. Es wurde eine 2,5 x 5,5 cm Säule von Q-Sepharose Fast Flow vorbereitet und durch Einwirkenlassen von 0,5 M NaOH über Nacht gereinigt. Die Säule wurde mit 100 mM Tris eines pH-Werts von 7,4 gewaschen, bis der Säulenablauf einen gemessenen pH-Wert von 7,4 aufwies. 10 ml eines frisch zubereiteten Hämolysats roter Rinderblutkörperchen mit 880 mg Hämoglobin wurden mit 50 mM Tris eines pH- Werts von 7,4 auf 40 ml verdünnt. 35 ml hiervon wurden mit einer Geschwindigkeit von 2,5 ml/min auf die Säule geladen. Nach dem Laden wurde die Säule mit 50 mM Tris eines pH-Werts von 7,4 gewaschen, bis der Hämoglobinaustritt aus der Säule beendet war. Das Hämoglobin lief durch die Säule ohne Bindung. Die Rückgewinnung betrug 88%.

Beispiel 3D

Kationenaustauschchromatographie von Hämoglobin

Dieses Experiment zeigt Kationenaustauschchromatographiebedingungen, unter denen Rinderhämoglobin auf den Austauscher geladen und danach mit einem linearen pH-Gradienten eluiert wurde. Es wurde eine 2,5 x 5,5 cm Säule von S-Sepharose Fast Flow vorbereitet und durch Einwirkenlassen von 0,5 M NaOH über Nacht gereinigt. Die Säule wurde mit 100 mM Bis-Tris eines pH- Werts von 6,0 gewaschen, bis der pH-Wert des Säulenablaufs 6,0 erreichte. Danach wurde die Säule mit 50 mM Bis-Tris eines pH- Werts von 6,0 ins Gleichgewicht gesetzt. 5 ml einer Probe von frisch zubereitetem Hämolysat roter Rinderblutkörperchen wurden mit 50 mM Bis-Tris eines pH-Werts von 6,0 auf 10 ml verdünnt und bei 2,5 ml/h auf die S-Sepharosesäule geladen. Nach dem Laden wurde die Säule mit 50 mM Bis-Tris eines pH-Werts von 6,0 gewaschen, bis die Absorption des Säulenablaufs die Grundlinie erreichte. Die Säule wurde dann mit einem linearen Gradienten zwischen dem Säulenpuffer und 50 mM Bis-Tris eines pH-Werts von 8,0 über zehn Säulenvolumina eluiert. Sämtliche chromatographischen Maßnahmen wurden bei 5ºC durchgeführt.

Beispiel 4

Vernetzung von Rinderhämoglobin mit Dimethyladipimidat

Eine Probe mit 170 mg/ml gereinigten Rinderhämoglobins wurde wie folgt behandelt: Die Vernetzungsreaktion erfolgte mit einer Hämoglobin-Tetramerkonzentration von 1,75 mM bzw. 112 mg/ml. Hohe Tetramer-Konzentrationen fördern die intermolekulare Vernetzung von Hämoglobin-Tetrameren. Das Hämoglobin wird in Gegenwart von 50 mM Tris-Puffer eines pH-Werts von 8,8 bei 4ºC modifiziert. Das Hämoglobin wird durch Zusatz von Dimethyladipimidat in äquimolaren Mengen (d.h. 1,75 mM Dimethyladipimidat und 1,75 mM Hämoglobin-Tetramer) modifiziert. Die Dimethyladipimidat-Behandlung wird achtmal in 30-minütigen Intervallen bei 4ºC wiederholt. Bei jeder Anwendung wird eine 50 mg/ml-Lösung von Dimethyladipimidat in 0,025 M Natriumcarbonat eines pH-Werts von 9,25 zu der Hämoglobinlösung bis zu einer Endkonzentration von 1,75 mM zugegeben. Die Hämoglobin-Lösung wird während der Zugabe des Vernetzungsreagens durchgewirbelt und dann 30 min lang auf Eis inkubiert. Nach 30 min wurde eine 0,4 ml-Probe entnommen und in 4 ml 0,25 M Natriumphosphat eines pH-Werts von 7,0 eingetragen. Der Phosphatpuffer beendet die Vernetzungsreaktion durch Hydrolyse des Imidoesters. Das Abstoppen erfolgt innerhalb von 2 h bei Raumtemperatur. Die restliche Hämoglobinlösung wird erneut mit einer frischen Lösung des Vernetzungsmittels umgesetzt. Innerhalb von 3,5 h werden acht Reaktionszyklen durcbgeführt. Bei diesem Versuch wurde als spezieller Imidoester Dimethyladipimidat verwendet. Es ließen sich auch andere Imidoester verwenden.

Beispiel 5

Größenausschluß-HPLC von Dimethyladipimidat-vernetztem Hämoglobin

Die Hämoglobinkonzentration wurde spektralphotometrisch unter Benutzung veröffentlichter Extinktionskoeffizienten (R.E. Benesch, R. Benesch und S. Yung (1973) "Equations for the spectrophotometric analysis of hemoglobin mixtures" in Analyt. Blochem. 55; 245-48) bestimmt. Die Reaktionsprodukte wurden nach jeder Zugabe von Vernetzungsmittel unter Benutzung einer Ausschluß-HPLC (SEC-HPLC) kontrolliert. Abgeschrecktes Reaktionsprodukt wurde auf 1 mg Hämoglobin-Tetramer pro ml in 0,2 N Natriumphosphat eines pH-Werts von 7,0 verdünnt. Das verdünnte Produkt wurde durch SEC-HPLC auf zwei getrennten Arten aralysiert. Die erste erfolgte mittels einer Zorbax GF-250 SEC-Säule (Dupont), die mit 0,2 M Natriumphosphats eines pH- Werts von 7,0 ins Gleichgewicht gesetzt worden war und mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min betrieben wurde. Die zweite erfolgte mit einer Superose 12 FPLC-Säule (Pharmacia), die mit 0,1 N Natriumphosphat eines pH-Werts von 7,0 ins Gleichtgewicht gesetzt worden war. Beide Säulen wurden mit Proteinen bekannten Molekulargewichts geeicht.
Aufeinanderfolgende Wiederholungen der Vernetzung mit Dimethyladipimidat führten zu einer progressiven Zunahme der Menge an polymerisiertem Tetramer-stabilisiertem Hämoglobin. Die Molekulargewichtsbereiche ließen sich auf Superose 12 SEC- HPLC wie folgt definieren: 1) % > 400 000 Dalton, 2) % > 64 000 Dalton und < 400 000 Dalton und 3) % < 64 000 Dalton. Nach vier Wiederholungen der Vernetzung betrugen die relativen Prozentwerte 1) 0%, 2) 40,64%, 3) 59,36%. Nach sieben Wiederholungen betrugen die Prozentwerte 1) 4,1%, 2) 50,4% und 3) 45,5%. Nach acht Wiederholungen betrugen die Prozentwerte 1) 7,5%, 2) 50,6% und 3) 41,9%. Der Klasse 3-Peak mit einem Molekulargewichtswert von weniger als 64 000 Dalton bestand aus einem einzigen symmetrischen Peak mit einem Molekulargewicht von 30 000 Dalton. Diese Fraktion eluierte gemeinsam mit nicht-modifiziertem Rinderhämoglobin und besteht vermutlich hauptsächlich aus Hämoglobin-Dimer. Der Methämoglobingehalt des Hämoglobins nach sieben Wiederholugen der Vernetzung betrug weniger als 2,5% Das sichtbare Spektrum des vernetzten Hämoglobins entsprach demjenigen von unmodifiziertem Rinderhämoglobin.

Beispiel 6

SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese von vernetztem Hämoglobin

Mit vernetzten und nicht-vernetzten Hämoglobinproben wurde eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) durchgeführt. Hämoglobinproben wurden in 0,005 M Natrimphosphat eines pH-Werts von 7,4 und 0,15 M NaCl auf 2 mg/ml verdünnt. Die verdünnten Proben wurden mit drei Teilen eines Standard-SDS-Gelpuffers gemischt und dann 3 h lang bei 37ºC inkubiert. Die Proben wurden auf 10 - 20% ISS-Minigelen in nicht-reduzierter Form laufengelassen. Die SDS-PAGE des vernetzten Hämoglobins nach sieben Wiederholungen der Vernetzung zeigte, daß 80% der Probe zwischen Untereinheiten vernetzt waren Mindestens acht Multimere des Untereinheit- Molekulargewichts waren vorhanden, und zwar sämtliche in etwa gleichem Anteil.

Beispiel 7

Sauerstoffgleichgewicht von vernetztem und nicht-vernetztem Rinderhämoglobin

Unter Verwendung eines Hämoxanalysegeräts von TCS Medical Industries wurde eine Sauerstoffgleichgewichtmessung für vernetztes und nicht-vernetztes Rinderhämoglobin durchgeführt. Nach sieben Wiederholungen der Reaktion mit Dimethyladipimidat wurde eine Probe des vernetzten Hämoglobins in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung eines pH-Werts von 7,4 auf 1,5 mg/ml verdünnt und analysiert. Weiterhin wurden unter identischen Bedingungen eine Probe von nicht-modifiziertem Rinderhämoglobin sowie eine Probe von Rinderhämoglobin, das in unserem Labor nach beschriebenen Verfahren (D. Guillochon und Mitarbeiter (1986) "Effect of glutaraldehyde on hemoglobin" in "Biochem. Pharm." 35:317-23) mit Glutaraldehyd vernetzt worden war, analysiert. Die P50-Werte (Sauerstoffpartialdruck bei Halbsättigung) für die Hämoglobinarten betrugen 1,8 kPa (13,5 mm Hg-Säule) für das Dimethyladipimidat-vernetzte Hämoglobin, 1,9 kPa (14,25 mm Hg-Säule) für das Glutaraldehyd-vernetzte Hämoglobin und 3,16 kPa (23,75 mm Hg-Säule) für das nicht-modifizierte Rinderhämoglobin.

Beispiel 8

Stabilitätsuntersuchungen an vernetztem und nicht-vernetztem Rinderhämoglobin

Rinderhämoglobin, das in sieben Wiederholungen mit Dimethyladipimidat vernetzt worden war, nicht-modifiziertes Rinderhämoglobin und mit Glutaraldehyd vernetztes Hämoglobin wurden in 0,125 M Natriumphosphat eines pH-Werts von 7,1 bei 36 - 37ºC inkubiert. Die Hämoglobinkonzentrationen betrugen 40 mg/ml für das Dimethyladipimidat-vernetzte Rinderhämoglobin und das nicht-modifizierte Rinderhämoglobin bzw. 28 mg/ml für das mit Glutaraldehyd vernetzte Rinderhämoglobin. Zu bestimmten Zeitintervallen wurden Proben jeder Hämoglobinart entfernt 1/100 in 0,25 M Natriumphosphatpuffer eines pH-Werts von 7,3 verdünnt und zwischen 680 nm und 420 nm in einem UV- sichtbares Licht-Abtastspektralphotometer Modell 160 von Shimadzu gescannt. Der Methämoglobingehalt wurde durch Analyse jeden Spektrums unter Verwendung veröffentlichter Gleichungen (R.E. Benesch und Mitarbeiter (1973) "Equations for the spectrophotometric analysis von hemoglobin mixtures" in "Anal. Biochem." 55: 245-48) ermittelt. Die Spektren wurden bei 22ºC aufgenommen.
Dimethyladipimidat-vernetztes Rinderhämoglobin und mit Glutaraldehyd vernetztes Hämoglobin wurden ferner über längere Zeit hinweg bei 4ºC inkubiert. Zu bestimmten Zeiten wurden Proben gezogen und in der geschilderten Weise auf ihren Methämoglobingehalt untersucht.
Bei der Inkubation bei 36 - 37ºC enthielten die Proben des Dimethyladipimidat-vernetzten, des Glutaraldehyd-vernetzten und des nicht-modifizierten Hämoglobins zu Beginn der Inkubation 2,5%, 8,0% bzw. 3,5% Methämoglobin. Nach 5 h bei 36 - 37ºC betrugen die prozentualen Mengen an Methämoglobin 8,9%, 44,4% bzw. 8% für die Proben des Dimethyladipimidatvernetzten, des Glutaraldehyd-vernetzten bzw. des nicht-modifizierten Rinderhämoglobins. Nach 24 h waren die Methämoglobinkonzentrationen 24,1, 87,9 bzw. 42% für die Proben des Dimethyladipimidat-vernetzten, Glutaraldehyd-vernetzten bzw. nicht-modifizierten Rinderhämoglobins. Nach 48 h betrugen die Methämoglobinkonzentrationen in den Proben des mit Dimethyladipimidat vernetzten bzw. nicht-vernetzten Rinderhämoglobins 46,5%- bzw. 68%. Das Dimethyladipimidat-vernetzte Hämoglobin war bei 36 - 37ºC gegen eine Methämoglobinbildung stabiler als das nicht-modifizierte Rinderhämoglobin. Die Literatur lehrt, daß das Glutaraldehyd-vernetzte Humanhämoglobin mit 4fach schnellerer Geschwindigkeit autoxidiert als das nicht-modifizierte Humanhämoglobin (D. Guillochon und Mitarbeiter (1986) "Effect of glutaraldehyde on hemoglobin" in "Biochem. Pharm." 35: 317-23). Es war nicht zu erwarten, daß das Dimethyladipimidat-vernetzte Rinderhämoglobin in bezug auf eine Autoxidation stabiler ist als das nicht-modifizierte Rinderhämoglobin.
Ferner wurde die Stabilität von Dimethyladipimidat-vernetztem bzw. Glutaraldehyd-vernetztem Rinderhämoglobin gegen Autoxidation nach 28-tägiger Inkubation bei 4ºC in dem zuvor beschriebenen Phosphatpuffer bestimmt. Nach 28 Tagen stieg der Methämoglobingehalt des Dimethyladipimidat-vernetzten Rinderhämoglobins von 2,5% auf 9,6%. Über dieselbe Dauer stieg der Methämoglobingehalt bei dem Glutaraldehyd-vernetzten Hämoglobin von 8,0% auf 23,5%.

Beispiel 9

Präparative Größenausschlußchromatographie bei Dimethyladipimidat-vernetztem Rinderhämoglobin

Zur Entfernung niedrigmolekularer Arten, d.h. < 64 000 Dalton, aus Dimethyladipimidat-vernetztem Rinderhämoglobin bediente man sich einer präparativen Größenausschlußchromatographie. Dimethyladipimidat-vernetztes Hämoglobin (40 mg/ml) wurde auf eine in 0,025 M Natriumphosphat, 0,15 M NaCl eines pH-Werts von 7,4 bei 4ºC ins Gleichgewicht gesetzte 2,5 x 90 cm Sephacryl 5-200 HR-Säule (Pharmacia) appliziert. Das Ladevolumen betrug 1% des Säulenbettvolumens. Die Strömungsgeschwindigkeit betrug 45 ml/min. Peaks aus der Chromatographie wurden gepoolt und die gepoolten Proben wurden durch SEC-HPLC auf einer Superose 12-Säule (vgl. oben) analysiert, um die Molekulargewichtsverteilung der darin befindlichen Hämoglobinarten zu ermitteln. Ferner wurden Proben vor Aufgabe auf die Säule bzw. der Ladung auf der Superose 12-Säule analysiert.
Die präparative Größenausschlußchromatographie trennte das DMA-vernetzte Hämoglobin in zwei Hauptfraktionen. Die Fraktion 1 enthielt die höhermolekulare vernetzte Hämoglobinart in einer Menge von 51,3% des gesamten aufgefangenen Hämoglobins. Die Fraktion 2 enthielt vernetztes Hämoglobin eines Molekulargewichts unter 64 000. Eine SEC-HPLC der vernetzten Hämoglobinfraktion vor Aufgabe auf die Säule zeigte, daß sie 2,6% als > 400 000 Dalton, 47,2% > 64 000 Dalton und 50,2% < 64 000 Dalton enthielt. Aus einer analytischen SEC-HPLC ergab sich, daß die gereinigte Fraktion 1 aus der präparativen Größenausschlußchromatographie 4,7% als > 400 000 Dalton, 92,7% als > 64 000 Dalton und 2,6% als < 64 000 Dalton enthielt. Dieses Verfahren eignete sich zur Entfernung der niedriger molekularen Hämoglobinarten.

Claims

1. Hämoglobin, das im wesentlichen von Verunreinigungen frei ist, mit einem bifunktionellen Imidoester vernetzt ist, gegen Methämoglobinbildung stabiler ist als das nicht-modifizierte Hämoglobin, vornehmlich in tetramerer Form vorliegt und einen P50, d.h. einen Sauerstoffpartialdruck bei Halbsättigung, von mindestens 1,7 kPa (13 mm Hg-Säule) bei einem pH-Wert von 7,4 aufweist.

2. Hämoglobin nach Anspruch 1, wobei der Imidoester aus Dimethyladipimidat oder Dimethylsuberimidat besteht.

3. Hämoglobin nach Anspruch 1 oder 2, wobei mindestens 80% ein Molekulargewicht von mindestens 64 000 aufweisen.

4. Hämoglobin nach Anspruch 3, wobei mindestens 95% ein Molekulargewicht von mindestens 64 000 aufweisen.

5. Zubereitung, enthaltend Hämoglobin nach einem der vorhergehenden Ansprüche und ein pharmazeutisch akzeptables Trägermedium.

6. Zubereitung nach Anspruch 5, wobei das Trägermedium aus gereinigtem Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung besteht.

7. Verfahren zur Zubereitung eines vernetzten Hämoglobins eines Molekulargewichts von vornehmlich 64 000 und eines P50-Werts von mindestens 1,7 kPa (13 mm Hg-Säule) bei einem pH-Wert von 7,4 durch Vernetzen eines gereinigten Hämoglobinlysats mit einem bifunktionellen Imidoester bei einem pH-Wert von mindestens 8,0 in einer Tris-HCl-Puffer enthaltenden Polymerisationslösung.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Polymerisationslösung NaCl enthält.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei der pH-Wert 8,0 bis 12,0 beträgt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei die Polymerisationslösung 50 mM Tris-HCl und 0,1 - 2,0 M NaCl enthält.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei dem gereinigten Hämoglobinlysat Sauerstoff entzogen ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, umfassend die Entfernung von niedrigmolekularem Hämoglobin durch Größenausschluß.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Größenausschluß auf chromatographischem Wege erfolgt.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 13, wobei der Imidoester aus Dimethyladipimidat oder Dimethylsuberimidat besteht.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 14, wobei die Polymerisation durch wiederholte Behandlung des gereinigten Hämoglobins mit äquimolaren Mengen des Imidoesters erfolgt.

16. Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung nach Anspruch 5 oder 6 durch Vereinigen des Hämoglobins mit dem Trägermedium.