DE69728656T2

DE69728656T2 - Methode zur herstellung einer flüssigen mischung

Info

Publication number: DE69728656T2
Application number: DE69728656T
Authority: DE
Inventors: Nils STAFSTRÖM
Original assignee: Amersham Bioscience AB
Current assignee: Cytiva Sweden AB
Priority date: 1996-02-29
Filing date: 1997-02-24
Publication date: 2005-04-28
Anticipated expiration: 2017-02-25
Also published as: WO1997031692A1; SE9600796D0; JP2000506968A; DK0883428T3; EP0883428A1; DE69728656D1; US6221250B1; EP0883428B1; ATE264129T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer flüssigen Mischung mit kontrolliertem pH – Wert, ebenso wie ein Gerät, das in einem solchen Verfahren angewendet werden kann.
Genauer gesagt, betrifft die Erfindung ein Verfahren der Flüssigkeitschromatographie, das eine solche oben erwähnte Flüssigkeitsmischung verwendet, und ebenso ein Gerät das in einem solchen Verfahren angewendet werden kann.
Die Erfindung ist von besonderem Interesse bei der Durchführung von ionenaustauschchromatographischen Gradientenelutionen, genauer gesagt für die Trennung und Reinigung von Biomolekülen wie Proteinen.
HINTERGRUND UND STAND DER TECHNIK
In vielen Fällen, wie z.B. auf dem Gebiet der Flüssigkeitschromatographie ist es wichtig, flüssige Medien mit einer genau bekannten Zusammensetzung zu erhalten. Bei vielen chromatographischen Trennungen sollten nicht nur die Zusammensetzungen des flüssigen Mediums genau bekannt sein und kontrolliert werden, sondern auch auf genaue und kontrollierte Weise mit der Zeit variieren, wie z.B. bei der Gradientenelution.
Es existieren verschiedene Flüssigkeitschromatographieverfahren, die auf den verschiedenen Interaktionen der zu trennenden Moleküle basieren, mit der stationären Phase auf der sie zurückgehalten werden und der mobilen Phase, d.h. dem Eluent. Weitgehend wird das Gradientenelutionsverfahren besonders im Ionenaustauschchromatographieverfahren benutzt, bei dem die stationäre Phase aus Ionenaustauschharzen besteht; das Eluens enthält ein inertes Salz und der Gradient wird erzeugt, indem die Konzentration dieses Salzes verändert wird. Dies ist ein sehr wichtiges Verfahren für die Trennung und Reinigung von Biomolekülen wie z.B. Proteinen. Siehe z.B. „Warren, W. et al. „ Eine neue Strategie für eine schnelle Op timierung zur Trennung von Proteinen", American Biotechnology Laboratory, 0749–3223, 34–40, (1989).
Die Möglichkeit der Trennung von Proteinen auf Ionenaustauschharzen beruht auf der Tatsache, dass das Proteinmolekül im allgemeinen an verschiedenen Stellen geladen ist. Die Anwesenheit dieser Ladungen macht die Proteine für eine Trennung durch eine Retention auf den Ionenaustauschersäulen zugänglich.
Diese Ladungen des Proteinmoleküls rühren vom sauren / basischen Charakter der Aminosäurenreste her aufgrund der Neigung zur Protonierung und Deprotonierung. Es ist offenkundig, dass die Ladungen an den verschiedenen Stellen der Moleküle und also die Nettoladung der Moleküle deutlich von dem pH – Wert der umgebenden Flüssigkeitsmedien beeinflusst werden und so die Proteintrennung durch die Ionenchromatographie sehr empfindlich gegenüber dem pH – Wert des flüssigen Mediums, d.h. dem Eluenten reagiert. Siehe z.B. Diamond , P.F. Carberry R., „Systematische Verfahren zur Entwicklung der Chromatographie von Biomolekülen : pH- Wert – Kartographie", Bioconcepts, Technical Newsletter of PerSeptive Biosystems, Sept – Oct 1–3 (1990).
In Übereinstimmung mit dem oben gesagten ist gut dokumentiert, dass der pH – Wert und die Ionenstärke des Eluenten die zwei wichtigsten Parameter sind, die die Selektivität der Proteintrennung auf Ionenaustauschharzen kontrollieren.
Der traditionelle Weg zur Gradientenbildung hat die sorgfältige Herstellung von Eluenten einbezogen, die inerte Salze ebenso wie Puffer mit einem vorbestimmten pH – Wert umfassen, um den Ionenstärkengradienten auf einem konstanten pH – Wert zu halten.
Die Optimierung der Trennung der Proteine ist dadurch erreicht worden, dass die Neigung des Gradienten des inerten Salzes geändert wird und / oder indem das Puffersystem durch ein System mit einem anderen pH – Wert ersetzt wird.
Im Stand der Technik hat die Optimierung so die Herstellung verschiedener Pufferlösungen mit vorbestimmten pH Werten – und Salzkonzentrationen umfasst, welche sorgfältig titriert werden müssen, damit die Trennungen reproduzierbar sind.
Da die oben beschriebenen Verfahren, die im folgenden als „traditionelle" Verfahren bezeichnet werden, sehr zeitaufwendig und schwierig sind, schlugen Waren et al. (ibid.) eine neue Prozedur vor , die sie das „Waters Auto-Blend ^TM" nannten, bei dem der pH – Wert, die Ionenstärke und die Gradientenprofile automatisch erzeugt werden, indem ein einziger Satz von Stammlösungen benutzt wird. Diese Stammlösungen sind: ein saurer Puffer, ein basischer Puffer, eine Salzlösung und entionisiertes Wasser (Milli – Q – Wasser). Durch eine genaue Mischung dieser vier Lösungen erzeugten Warren et al. verschiedene Gradienten sowohl von der Ionenstärke als auch vom pH – Wert. Und zwar mischten Waren et al. getrennt zwei Pufferlösungen, d.h. die saure und die basische, um einen gewissen vorselektionierten pH – Wert zu erhalten und kombinierten dann diese Mischung mit einer ähnlichen Mischung der Salzlösung und dem entionisierten Wasser mit einer auf gleiche Weise vorbestimmten Ionenstärke. Indem man entweder das Verhältnis der Salzlösung zum Wasser oder vom sauren Puffer zum basischen Puffer verändert hat, erzeugen sie etwas, was sie unabhängige Gradienten entweder vom pH – Wert oder der Ionenstärke nennen, oder indem alternativ der pH – Wert von einem Durchlauf zum anderen geändert wird, ohne ein völlig neues Puffersystem wählen zu müssen.
(Eine automatisierte Abänderung dieses Verfahrens ist das so genannte BioCAD^TM Verfahren, welches trotzdem nach dem sehr ähnlichen Prinzip funktioniert und auch derselben Firma gehört, nämlich der PerSeptive Biosystem Inc., Massachusetts, US.). Warren et al. reduzieren so die große Anzahl von komplexen Pufferlösungen die bei den herkömmlichen Verfahren für die Optimierung einer gegebenen Proteintrennung in Bezug auf den pH – Wert hergestellt werden mussten, auf nur zwei verschiedene Pufferlösungen und eine Salzlösung, wobei letztere sehr viel einfacher herzustellen ist.
Ein großer Nachteil bei dem Verfahren von Warren et al. ist, dass es in der Tat keinen Eluenten mit genau kontrolliertem pH – Wert und Ionenstärke liefert. Das liegt an der Tatsache, dass sie nicht die Wechselbeziehung zwischen der Ionenstärke und dem pH- Wert berücksichtigen. Indem man jedoch die Debye – Hückel – Gleichung in Anbetracht zieht, die aus vielen Fachbüchern der physikalischen und anorganischen Chemie bekannt ist, so wie z.B. „Physikalische Chemie" von P.W. Atkins (Oxford University Press ISBN 0198551487) und „Puffer für die pH – und Metallionenkontrolle von D.D. Perrin, Boyd Dempsey (Chap man und Hall Laboratory Manuals ISBN 0 412 11700 2) wird klar, dass sich der pH – Wert ändert sobald sich die Ionenstärke über einen bestimmten Salzgradienten ändert. In Anbetracht der vorhergehenden Diskussion bezüglich der Wichtigkeit des pH – Wertes für das Bindungsverhalten von Proteinen, stellt das Fehlen einer sehr genauen Kontrolle des pH-Wertes des Eluenten einen bedeutenden Nachteil bei einer wirksamen Optimierung der Proteintrennung dar: eine kleine Variation des pH- Wertes kann eine Variation beim Retentionsverhalten eines Proteinmoleküls in unvorhersehbarer Weise nach sich ziehen.
Es wird klar, dass die Optimierung der Proteintrennung stark dadurch beeinträchtigt wird, dass es nicht möglich ist, einen Eluenten mit einem sehr genau bekannten pH – Wert auf einfache und bequeme Weise zur Verfügung zu stellen. Einerseits waren die herkömmlichen Verfahren sehr umständlich, wodurch eine sorgfältige Optimierung der Proteintrennung wegen Zeit- und / oder Geldmangel unmöglich gemacht wurde. Das Verfahren von Waters et al., das die Optimierung an sich vereinfachen sollte, ist andererseits in der Tat auf inhärente Weise ungenau , was den reelen pH – Wert des Eluenten in dem System bei einem beliebigen Salzgradienten anbetrifft.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung einer flüssigen Mischung mit variierender Ionenstärke zur Verfügung zu stellen, bei dem der pH- Wert auf genaue und reproduzierbare Weise kontrolliert werden kann.
Dieses Ziel wird durch ein Verfahren erreicht, wie es im Anspruch 1 zur Herstellung einer flüssigen Mischung definiert ist, umfassend die folgenden Komponenten:

(i) eine oder mehrere Pufferspezies;
(ii) eine Säure oder alternativ eine Base;
(ii) wahlweise ein Salz; und
(iv) ein Lösungsmittel

Das erfinderische Verfahren wie es anderweitig im Anspruch 1 definiert worden ist, basiert auf der Verwendung einer modifizierten Debye-Hückel – Gleichung. Es umfasst die folgenden Schritte:

(a) Berechnung durch die Verwendung der Debye – Hückel – Gleichung der Verhältnisse der verschiedenen protolytischen Komponenten einer Mischung, wie oben definiert, mit einer gegeben Salzkonzentration und aus den Verhältnissen, welche die Konzentrationen der verschiedenen puffernden Spezies herleiten, worin die Ionenstärke der Mischung derartig genommen wird, dass sie nur von der Anwesenheit des Salzes herrührt, so dass ein vorgewählter pH erhalten wird;
(b) Berechnung der resultierenden Ionenstärke der Mischung auf der Basis der in dem vorangehenden schritt berechneten Verhältnisse;
(c) Berechnung durch die Verwendung der Debye – Hückel – Gleichung und unter Berücksichtigung der in (b) berechneten Ionenstärke eines neuen Satzes von Verhältnissen der protolytischen Komponenten der Mischung bei dem vorgewählten pH der Mischung, so dass ein neuer Satz von Konzentrationen für die Pufferspezies berechnet wird; und
(d) Wiederholen der Schritte (b) und (c), bis die Abweichung zwischen dem letzen Satz der für die Verhältnisse der protolytischen Komponenten gefundenen Werte und dem in dem unmittelbar vorausgehenden Schritt gefundenen Satz ein vordefiniertes maximales Niveau nicht überschreitet, wobei das Niveau eine Funktion der Ausgangskonzentration des Puffers ist, wobei dieser letzte Satz der Verhältnisse anschließend als Ergebnis der Mischung des ausgewählten pH bei einer gegebenen Salzkonzentration beibehalten wird.

Es ist ein anderes Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Erzeugung eines Flüssigkeitsstroms mit kontrolliertem pH – Wert zur Verfügung zu stellen, bei dem der Flüssigkeitsstrom erhalten wird durch Einspeisen der Komponenten (i) bis (iv) mittels einer Dosiervorrichtung , die nach dem oben definierten iterativen Verfahren gesteuert wird. Dieser Flüssigkeitsstrom ist besonders gut als Eluent in der Ionenaustauschchromatographie geeignet.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Gerät für die Flüssigchromatographie zur Verfügung, bei dem die oben erwähnte Messvorrichtung benutzt wird, um eine flüssige Eluentenmischung der Erfindung zu erhalten.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Die Erfindung wird jetzt unter Bezugnahme auf die Figuren beschrieben, von denen:
Die 1 eine schematische Ansicht des erfindungsgemäßen Flusssystems ist.
Die 2 die Chromatogramme darstellt, die mit einer Mischung von drei verschiedenen Proteinen erhalten werden, wobei eine Trennung durch Anionenaustauschchromatographie mit einem Salzgradienten bei verschiedenen vorgewählten pH – Werten durchgeführt wird, wobei eine flüssige Eluentenmischung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wird.
Die 3 eine Variation des pH über einen Salzgradienten in einer flüssigen Eluentenmischung für die Anionenaustauschchromatographie, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wird, darstellt.
Die 4 die Chromatogramme darstellt, die mit einer Mischung von drei verschiedenen Proteinen durch Auftrennungen mittels Anionenaustauschchromatographie mit einem Salzgradienten bei einem konstanten pH – Wert erhalten wurden, und zwar mit einer flüssigen Eluentenmischung, die jeweils durch das erfindungsgemäße Verfahren und ein traditionelles Verfahren aus dem Stand der Technik erhalten wurden.
Die 5 die Chromatogramme darstellt, die mit einer Mischung von drei verschiedenen Proteinen durch Auftrennungen mittels Kationenaustauschchromatographie mit einem Salzgradienten bei verschieden gewählten pH – Werten erhalten wurde, und zwar mit einer flüssigen Eluentenmischung die jeweils durch das erfindungsgemäße Verfahren und ein traditionelles Verfahren aus dem Stand der Technik erhalten wurden.
Die 6 die Variation des pH – Werts der flüssigen Eluentenmischung darstellt, gemessen auf der Ausgangsseite der chromatographischen Säule über einen Salzgradienten der auf der 5 dargestellten Proteintrennungen dargestellt ist.
Die 7 die Chromatogramme darstellt, die mit einer Mischung von drei verschiedenen Proteinen durch Auftrennungen mittels Kationenaustauschchromatographie mit einem Salzgradienten bei einem konstanten pH – Wert erhalten wurde, und zwar mit einer flüssigen Eluentenmischung die jeweils durch das erfindungsgemäße Verfahren und ein traditionelles Verfahren aus dem Stand der Technik erhalten wurden.
Die 8 die Variation des pH – Werts über den Salzgradienten in einer flüssigen Eluentenmischung für die Anionenaustauschchromatographie darstellt, die mit dem Bio CAD^TM-Verfahren aus dem Stand der Technik erhalten worden ist.
Die 9 die Variation des Eluenten – pH – Wertes über den Salzgradienten in einer flüssigen Eluentenmischung für die Anionenaustauschchromatographie darstellt, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten worden ist.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSGESTALTUNG DER ERFINDUNG
Die Komponenten (i) bis (iv)
In der vorliegenden Erfindung kann die Komponente (i) eine Mischung verschiedener Pufferspezies sein, z.B. bis zu fünf Spezies, wobei jede Spezies bis zu drei verschiedene pK_a's aufweist , wodurch ein weiter pH – Bereich abgedeckt werden kann.
In den unteren Tabellen 1 und 2 werden einige Beispiele bevorzugter Puffer zusammen mit den Daten für die jeweiligen Puffer gegeben. Die AIEX (Anionenaustauschchromatographie und CIEX (Kationenaustauschchromatographie) genannten Puffer gegeben, die jeweils umfassen:

AIEX : 0,05M 1 – Methyl – Piperazin, 0,05M Bis – Tris, 0,025M Tris;
CIEX : 0,03M Na₂HPO₄, 0,03M Na Formiat, 0,06M Na – Azetat

Tabelle 1
Tabelle 2
Wie es aus der Tabelle ersichtlich ist, wird ein pH – Bereich von 5,0 – 9,5 durch den AIEX genannten Puffer abgedeckt, während ein pH – Bereich von 3,0 – 7,5 von dem CIEX genannten Puffer abgedeckt wird. Andere Pufferzusammensetzungen können ebenfalls in Anhängigkeit davon, welchen pH – Bereich man abdecken will, benutzt werden.
In den obigen Tabellen werden Korrekturfaktoren „0%B" und „100%B" angegeben. Diese Korrekturfaktoren werden in diesem Text weiter unten in der Beschreibung des iterativen Verfahrens erklärt.
In der Beschreibung des iterativen Verfahrens wird außerdem auf protolytische Systeme Bezug genommen, d.h. von Gleichgewichtskonstanten der protolytischen Reaktionen beherrschte Säure – Base – Systeme . Eine Pufferspezies stellt so ein protolytisches System dar. Dabei sei angemerkt, dass z.B. die weiter oben definierten AIEX und CIEX – Puffer jeweils drei protolytische Systeme , d.h. drei Pufferspezies enthalten.
Die Säure der Komponente (ii) kann theoretisch irgendeine Säure sein, ist jedoch bevorzugt eine starke Säure, wie z.B. Salzsäure (HCl), welche in Lösung völlig dissoziiert ist. Ähnlich wird bevorzugt, dass die Base eine starke Base ist, wie z.B. NaOH, obwohl andere Basen gleichermaßen möglich sind. Wie es in der Tabelle angegeben ist, ist eine angemessene Konzentration der sauren oder basischen Stammlösung jeweils 0,1M, obwohl andere Konzentrationen ebenfalls möglich sind.
Das Salz der Komponente (iii) ist bevorzugt irgendein Salz dass inert gegenüber dem flüssigen System reagiert, d.h. in dem System nicht auf andere Weise als durch ionische Dissoziierung reagiert. Bevorzugte Beispiele sind NaCl oder KCl. Die Erfindung kann jedoch leicht auf die Verwendung pH – aktiver Salze erweitert werden, z.B. Ammoniumsulfat, und es wird in Betracht gezogen, dass ein Fachmann die entsprechenden Veränderungen an dem System vornehmen kann.
Es wird ebenfalls in Betracht gezogen, dass der Fachmann den geeigneten Salzgradienten in Abhängigkeit von den anderen chromatographischen Bedingungen, wie z.B. der Säule , auswählen kann. Ein bevorzugtes Beispiel ist jedoch ein Gradient von inertem Salz zwischen 0 und 1,0 M.
Das Lösungsmittel der Komponente (iv) kann jedes beliebige Lösungsmittel bzw. jede beliebige Lösungsmittelkombination sein in dem bzw. in der die anderen Komponenten der flüssigen Mischung löslich sind, es ist jedoch in Beimischung mit Wasser vorzuziehen, wobei als pH – Wert des wässrigen Lösungsmittels der der Wasserphase genommen werden kann.
Die iterative Prozedur
Die Debye-Hückel-Gleichung, die die Basis für das Verfahren darstellt, ist folgende:
wobei f_i der Aktivitätsfaktor des Ions i, das eine negative oder positive Ladung mit dem absoluten Wer zi trägt, ist; I ist die Ionenstärke der ionischen Lösung die n verschiedene Ionenspezies umfasst, wobei i durch die folgende Summengleichung erhalten wird:
wobei ci für jeden Ionentyp gleich deren Ionenstärke ist.
Die Konstante A in der Gleichung ändert sich mit der Temperatur ungefähr nach der Beziehung dA/dT = 0,01°C. Bei der Temperatur 25°C ist A=0,512. Es wird angenommen, dass ein Fachmann in der Lage ist, nötigenfalls die Korrekturen für die Temperaturabhängigkeit von A vorzunehmen.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine iterative Prozedur wie sie weiter oben beschrieben worden ist benutzt, um die Proportionen der verschiedenen Komponenten ((i) bis (iv), supra) zu bestimmen. Diese iterative Prozedur wird jetzt weiter beschrieben.
In einem ersten Schritt dieser iterativen Prozedur wird die Ionenstärke der Komponenten (i) bis (iv) so eingestellt, dass sie nur von der Anwesenheit von Salz in der Mischung abhängt, und mit Hilfe dieser hypothetischen Ionenstärke werden die Verhältnisse der verschiedenen protolytischen Bestandteile des Systems in Abhängigkeit des ausgewählten ph – Wertes unter Benutzung der Debye – Hückel – Gleichung berechnet. Von diesem ersten Schritt werden die Konzentrationen der verschiedenen Spezies des Puffersystems abgeleitet.
Im zweiten Schritt wird ein genauerer Wert der Ionenstärke der flüssigen Mischung der Komponenten (i) bis (iv) berechnet, wobei auch der Beitrag der verschiedenen Ionenspezies des Puffersystems bei der Ionenstärke unter Benutzung der im vorhergehenden Schritt berechneten Konzentrationen berücksichtigt wird.
Im dritten Schritt wird der ausgewählte pH – Wert der flüssigen Mischung kombiniert mit der im dritten Schritt erhaltenen Ionenstärke zusammen mit der Debye – Hückel – Gleichung benutzt, um einen neuen Satz von Konzentrationen für die Pufferspezies in der flüssigen Mischung zu berechnen.
Die Schritte zwei und drei werden dann mehrere Male wiederholt bis der Unterschied zwischen den für die Konzentrationen der Pufferspezies erhaltenen Werte von einem zum unmittelbar folgenden Schritt nicht eine gewisse vorgewählte Grenze überschreitet; diese Konzentrationen entsprechen dann dem geforderten Verhältnis der Pufferkomponente in der Endmischung mit kontrolliertem pH – Wert und Ionenstärke. Die vorgewählte Grenze kann z.B. eine Funktion der Ausgangskonzentration des Puffers sein, z.B. 0,1% der Anfangskonzentration des Puffers. Der Grenzwert sollte vorzugsweise so sein, dass er die Genauigkeit des Messsystems , d.h. des Pumpen- und Ventilsystems aufweist.
Für jeden Wert der Salzkonzentration und des pH- Wertes in der Mischung wird diese iterative Prozedur wiederholt.
In einer bevorzugten Ausgestaltung wird ein Korrekturfaktor in die Berechnungen eingeschlossen (Faktoren, die 0%B und 100%B in den oberen Tabellen 1 und 2 genannt werden). Dieser Korrekturfaktor wird auf empirischer Basis bestimmt, indem die Abweichung des aktuellen gemessenen pH der flüssigen Mischung in Bezug auf den ausgewählten Wert bei geringster Salzkonzentration, d.h. 0% Salz und bei maximaler Salzkonzentration, d.h. bei der die kombinierten Komponenten (iii) und (iv) der Mischung nur aus der Salzlösung d.h. 100% von (iii) bestehen, gemessen wird. Wenn eine gewisse Abweichung bei 0% Salz gefunden wird, wird der pH – Einstellpunkt korrigiert, indem diese Abweichung vom Anfangswert des pH – Einstellpunktes abgezogen wird; diese Korrektur wird einen neuen Wert erzeugen für das Verhältnis der Pufferspezies in der Mischung bei 0% Salz. Die entsprechende Korrektur wird auch bei 100% Salz vorgenommen und die Korrektur des Pufferverhältnisses bei jedem Wert der Salzkonzentration zwischen dem Maximum und dem Minimum wird durch ein einfaches Verhältnis zwischen diesen zwei Extremen erhalten.
In einer bevorzugten Ausgestaltung, die z.B. in einem Flüssigchromatographiesystem anwendbar ist, werden die Berechnungen durch ein Datenverarbeitungsprogramm vorgenommen, bei dem die unter Gleichungen implementiert sind und das direkt eine Messvorrichtung wie z.B. ein Pumpen- und Ventilsystem oder jede beliebigen Mittel zur Einführung der Komponenten steuert. Dieses Programm umfasst auch die Korrekturfaktoren für die Variationen der pK_a mit der Temperatur.
Es sei vermerkt, dass der Fachmann auf dem Gebiet dieser Technik in der Lage ist, die oben erwähnten Implementierungen auf der Basis der weiter unten angegeben Gleichungen durchzuführen.
In dem implementierten Datenverarbeitungsprogramm ist der berechnete Parameter das Verhältnis der Pufferlösung. Es werden jetzt in einer detaillierten Beschreibung die durchgeführten Berechnungen wiedergegeben. Das Verständnis des Systems wird durch die 1 erleichtert, in der ein Flusssystem schematisch wiedergeben ist und auf das sich die Beschreibung jetzt bezieht.
Die Bezeichnungen in den Figuren sind folgende:

F _buff= der Einspeisungsfluss der Pufferlösung;
F _add = der Einspeisungsfluss der sauren Lösung (in dem dargestellten Fall wo ein saurer pH - Wert gesucht wird, im Falle eines basischen pH wird vorgezogen, dass die Säure durch eine Base ersetzt wird);
F _salt = der Einspeisungsfluss der Salzlösung;
F _aq = der Einspeisungsfluss des Wassers.

Die sauren und basischen Lösungen werden zusammen mit einem Ventil – und Pumpensystem eingespeist, wobei die beiden Komponenten sehr genau in den Verhältnissen in denen sie durch das Programm berechnet worden sind gemessen werden, es ist also: F pH = F buff + F acid.
Ein anderes Ventil- und Pumpensystem misst die Salzlösung und das Wasser gemäß einem ausgewählten Salzgradienten in einem kombinierten Fluss: F grad = F salt + F aq.
Und der endgültige Eluentenfluss ist: F = F pH + F grad, wobei dieser Fluss als konstant angenommen wird.
Außerdem werden F_pH und F_grad beide als konstant angenommen, so dass
F_pH / F = α = konstant ist.
In der vorliegenden Ausgestaltung wird der Salzgradient linear ausgewählt, was durch folgende Gleichung ausgedrückt werden kann: S(t) = S(0) + k*t wobei S(t) die Salzkonzentration bei einem Zeitintervall t nach dem Beginn des Gradienten ist;
S(0) die Salzkonzentration beim Anfang des Gradienten ist; k die Neigung der Gradientenkurve, d.h. die Zuwachsrate der Salzkonzentration des Eluenten mit der Zeit, ist.
Für jedes beliebige protolytische System kann die Gleichgewichtskonstante β definiert werden auf der Basis der protolytischen Reaktionen:
Das dem Schritt i in dem protolytischen System entsprechende βi wird gegeben durch:
Es sei angemerkt, dass die oben definierte Gleichgewichtskonstante reziprok zu der Dissoziierungskonstante K_a ist, so dass β = 1/K_a = 10^pka.
In der obigen Gleichung, in der βi gegeben wird, kann die Protonenaktivität ausgedrückt werden durch: (H+) = h = 10 –pH
Für jede gelöste Substanz kann die Aktivität ausgedrückt werden als das Produkt aus der Aktivitätskonstante und der Konzentration der gelösten Substanz. Die dem Schritt i entsprechende Gleichgewichtskonstante kann konsequenterweise folgendermaßen ausgedrückt werden:
Durch die oben angegebene Beziehung zwischen β und pK_a, kann erstere leicht für jedes beliebige Puffersystem aus den entsprechenden Werten von pK_a die z.B. aus einem Handbuch wie sie in der Fußnote 2 der Tabelle 2 angeben ist, erhalten werden kann, berechnet werden.
Es wird die konditionelle Konstante βi' eingeführt:
die auch so geschrieben werden kann:
Die Pufferlösung umfasst n protolytische Systeme, und wenn die Konzentration des j-ten protolytischen Systems in der Pufferlösung mit Coj geschrieben wird, kann die entsprechende Konzentration in der Endlösung folgendermaßen geschrieben werden:
Cj ist die Summe der Konzentrationen aller verschiedenen protolytischen Spezies des Puffersystems: Cj = [Aj]+[HAj]+[H2Aj]+... das auch so geschrieben werden kann:
wobei Nj die Anzahl protolytischer Schritte des Systems j ist. Die Einführung von βo = βo' = 1 erlaubt es zu schreiben:
Die Konzentration der titrierbaren Protonen in dem j-ten protolytischen System ist: Cj(H+) = [HA]+2[H2A]+... was auch folgendermaßen geschrieben werden kann:
Die Gesamtkonzentration der titrierbaren Protonen in dem j-ten protolytischen System im Gleichgewicht ist:
Diese Konzentration ist gleich der Konzentration der beigemengten titrierbaren Protonen, d.h. einer starken Säure:
wobei C_s = die Anfangskonzentration der starken Säure ist; ebenso wie von dem j-ten protolytischen System:
wobei q ein Faktor in Beziehung zum protolytischen System ist, d.h. der Anzahl der titrierbaren Protonen der anfangs beigemengten Pufferverbindung entspricht.
Bei einem n protolytische Systeme enthalten System wird die Gesamtkonzentration der beigemengten titrierbaren Protonen folgende sein:
Das Protonengleichgewicht des Systems kann nun folgendermaßen geschrieben werden:
Bei Einführung von f₁ = Aktivitätsfaktor eines einwertigen Ions und
kann man folgendes schreiben:
woraus der gesuchte Parameter abgeleitet werden kann:
Der Parameter φ muss iterativ aus dieser letzten Gleichung berechnet werden, da β'_ij und f₁ wegen der Variation der Ionenstärke von φ abhängen. Die Debye – Hückel – Gleichung wird dann folgendermaßen benutzt:
In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung wird auch ein Korrekturfaktor benutzt, um die aktuelle Abweichung des aktuellen pH – Wertes der flüssigen Mischung vom Einstellpunkt zu kompensieren. Die Kompensationskorrektur ist basiert auf der Abweichung des pH - Werts des Einstellpunktes vom pH- Wert der im Fluss der flüssigen Mischung gemessen wurde, wenn der kombinierte Fluss F_grad der Salzlösungskomponenten (iii) und der Wasserkomponenten (iv) einerseits nur aus der Salzlösungskomponenten F_salt (Korrekturfaktor 100%B) und andererseits nur der Wasserkomponenten F_aq (Korrekturfaktor 0%B) besteht. In beiden Fällen ist der Korrekturfaktor ganz einfach gleich dem Unterschied zwischen den Mess- und Einstellpunktswerten. Als Beispiel wird der Korrekturfaktor (0%B)= 0,1 benutzt, wenn der pH- Einstellpunkt = 7 ist, während bei 0% für die Salzlösungskomponente (d.h. F_grad = F_aq) ein pH = 6,9 in der flüssigen Mischlösung F gemessen wird, so dass der pH - Einstellpunkt pH = 7,1 gewählt wird. Dieser korrigierte Wert wird dann bei jeder beliebigen Salzkonzentration benutzt (da h=10^–pH), um φ zu berechneten.
Der aus dem Unterschied zwischen dem gemessenen pH – Wert und dem pH-Einstellpunkt der Salzlösungskomponenten (F_grad = F_salt) erhaltene Korrekturfaktor (100%B) wird dann auf leicht unterschiedliche Weise benutzt. Zuerst wird φ bei 100 % der Salzlösungskomponenten mit dem pH – Wert der sowohl unter Benutzung des Korrekturfaktors 0%B (φ0%) als auch unter Benutzung des Korrekturfaktors 100%B (φ100%) korrigiert worden ist, berechnet. Dann wird der Unterschied zwischen den beiden Werten folgendermaßen berechnet: Δφ100%= φ0%– φ100%.
Dieser Unterschied wird schließlich als Korrekturfaktor für das φ bei jeder beliebigen Salzkonzentration benutzt. Dieser Vorgang kann z.B. als lineare Korrektur nach folgender Gleichung ausgeführt werden: φkorr = φ – Δφ100% · Fsalt /Fgrad.
Andere Beziehungen als die oben angegebene lineare Gleichung können auch benutzt werden, um einen korrigierten Wert von φ auf der Basis des berechneten, unkorrigierten Wertes und dem Inkrement Δφ 10–0% zu etablieren. Als Beispiel kann eine nicht lineare Beziehung empirisch wie z.B. die folgende Gleichung etabliert werden:
wobei g und r jeweils Zahlen darstellen, die empirisch bestimmt werden müssen, z.B. g = 2 und r=1.
In einer bevorzugten Ausgestaltung wird der Bereich von 0% bis 100 % von F_salt/F_grad in mehrere Intervalle unterteilt und für die Anfangs- und Endpunkte jedes Intervalls wird die obige nicht lineare Gleichung angewendet, um einen entsprechenden Wert φ_korr zu berechnen. Dann wird eine lineare Interpolation zwischen diesen Werten ausgeführt.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann der pH des Eluenten mit einer Genauigkeit von +/– 0,3, bevorzugterweise +/– 0,1 bei einer sich ändernden Ionenstärke eingestellt werden.
Wie oben festgestellt wurde, werden in einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens zur Erhaltung eines flüssigen Stroms die Komponenten (i) bis (ii), d.h. die Pufferlösung und die saure / basische Lösung zusammen mit Hilfe eines Ventils eingespeist das an eine Pumpe angeschlossen ist, wobei die beiden anderen Komponenten , d.h. (ii) und (iv) auf ähnliche Weise durch ein anderes Ventil- und Pumpensystem eingespeist werden. Die Messvorrichtung der Erfindung umfasst so zwei Sätze von Ventil und Pumpe, welche in einem chromatographischen System der Erfindung bevorzugterweise in Serie mit der Trennvorrichtung (z.B. eine chromatographische Säule) geschaltet sind.
Die anderen in dem chromatographischen Gerät der Erfindung enthaltenen Teile können beliebige Teile aus dem Stand der Technik sein, wie sie z.B. in Poole,C.F, und Poole S.K. „Chromtographie heute", erste Ausgabe, Elsevier Science B.V., Amsterdam, Niederlande (1991), welche in diesen Text durch Bezugnahme integriert werden.
Das Verfahren der Erfindung kann vorteilhafterweise für die Optimierung von Trennungen und Reinigungen von Biomolekülen wie den Proteinen sowie auch für das Studium der Solidität dieser Trennungen / Reinigungen angewendet werden.
Als ein Beispiel muss man zur Optimierung einer Proteintrennung zuerst eine Salzgradientenelution bei verschiedenen pH mit ziemlich großen Intervallen, z.B. pH 4, pH 5, pH 6.., pH vornehmen; diese Optimierung wird pH – screening genannt. Man kann dann zu einer feineren Optimierung des pH übergehen, indem man z.B. Elutionen mit engeren pH – Intervallen um den optimalen durch das erste pH – screening erhaltenen Wert herum gelegenen Wert herstellt.
Eine Untersuchung der Solidität der Trennung in Bezug auf die pH – Variationen kann ebenfalls durchgeführt werden, indem der pH mit kleinen Inkrementen um den für den Eluenten herum ausgewählten pH variiert wird.
Die Erfindung wird außerdem mit Hilfe der vorliegenden Beispiele illustriert.
BEISPIELE
In den Beispielen 1 und 2 wird die Optimierung der Proteintrennungen mit dem erfindungsgemäßen Verfahren beschrieben. Da der Parameter, der geändert wird, der pH ist, wird die Optimierung pH – screening genannt. Bei dem endgültig gewählten pH wird die erhaltene Trennung mit der Trennung verglichen, die auf traditionelle Weise erhalten wird, indem ein Ionenstärkegradient bei einem ausgewählten pH bestimmt wird, d.h. durch Mischen von zwei Puffern, die beide den gewählten pH – Wert haben, sich jedoch durch die Ionenstärke unterscheiden. Es wird festgestellt, dass eine äquivalente Trennung erhalten wird.
Außerdem wird der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene pH der flüssigen Eluentenmischung bei den Salzgradienten der obigen Art gemessen.
Experimente
Die zu trennenden Proteine waren Transferin (Sigma T-4515), Ovalbumin (Sigma A-5503), Beta-Lactoglobulin (Sigma L-6879), Chymotrypsinogen A (Pharmacia 17-0442B LOT 2100442011), Cytochrom C (Pferdeherz) (Sigma C-2506) und Lysozym (Sigma L-6876).
Das benutzte Gerät war eine chromatographische Vorrichtung, die einen UV – Sensor mit einer 2mm Zelle und einem 1,6 ml Mischer aufweist. Die Datenverarbeitungssoftware war Unicom 2.000.09 mit der oben beschriebenen Funktion die aufgeteilt war um die die genauen Verhältnisse der Eluentenkomponenten zu berechnen. Dieses System wird „ÄKTA^TM-Explorer" genannt.
Die Säulen waren Mono Q und Mono S HR 10/10.
Die für das erfindungsgemäße Verfahren benutzten Pufferlösungen waren:

AIEX1: 0,05M 1-Methylpiperazin + 0,05M Bis – Tris – + 0,02M Triethanolamin;
AIEX2: 0,05M 1-Methylpiperazin + 0,05M Bis – Tris – + 0,025M Tris;
CIEX: 0,03M Na₂HPO₄ + 0,03M Na-Formiat + 0,06M Na-Azetat.

Die für das „ traditionelle Verfahren" benutzten Pufferlösungen waren:

AEIX : 20mM Piperazin pH 6,0, 0 – 0,5M NaCl
CIEX: 50mM MES pH 6,6, 0 – 1,0M NaCl.

Die zur Änderung des pH in der Eluentenmischung der Erfindung benutzte Säure war wässrige 0,1M HCl.
Das zum Erhalten des Salzgradienten benutzte Salz war wässrige NACl, 1,0M AIEX – Puffer und 2,0M für die CIEX – Puffer. In dem Anionenaustauschmodus variiert die Salzkonzentration zwischen 0M und 0,5M während des Salzgradienten; beim Kationenaustauschmodus variiert sie zwischen 0M und 1,0M.
Beispiel 1
pH – screening, Anionenaustauschmodus
Proben von 500 Microliter, die 2mg/ml Transferin, 4mg/ml Ovalbumin und 4mg/ml Betalaktoglobulin enthalten, wurden auf eine Mono Q HR 10/10 – Säule injiziert. Die chroma tographischen Durchläufe wurden dann bei pH 5,0; 5,5;6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0 und 9,0 unter Benutzung einer erfindungsgemäß erhaltenen flüssigen, den AIEX – Puffer aufweisende Eluentenmischung durchgeführt. In der 2 werden die bei entsprechenden pH – Werten erhaltenen Chromatogramme gezeigt.
Als nächstes wurde die pH – Variation in der flüssigen erfindungsgemäßen Eluentenmischung bei dem Salzgradienten bei verschiedenen oben angegebenen pH untersucht. Die pH - Elektrode wurde mit einem stationären Referenzpuffer kalibriert. In der 3 werden die pH gegenüber dem Salzgradienten gezeigt.
Außerdem wurden chromatographische Durchläufe bei pH = 6 durchgeführt , was als Optimum aus dem oben beschriebenen pH – screening beibehalten wurde, und zwar jeweils mit einer flüssigen Eluentenmischung, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung zweier unterschiedlicher AIEX – Puffer der Erfindung und mit einem traditionellen Verfahren unter Verwendung von „traditionellem" AIEX – Puffer erhalten wurde. Die erhaltenen Chromatogramme werden in der 4 gezeigt.
Beispiel 2
pH – screening, Kationenaustauschmodus
Proben von 500 Microliter, die 1,25mg/ml Chymotrypsinogen A, 1,3mg/ml Cytochrom C und 1,9 mg/ml Lysozym enthalten, wurden auf eine Mono Q HR 10/10 – Säule injiziert. Die chromatographischen Durchläufe wurden dann bei pH 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 6,0; 7,0 und 7,5 unter Benutzung einer nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen flüssigen, den CIEX – Puffer aufweisenden Eluentenmischung durchgeführt. In der 5 werden die bei entsprechenden pH – Werten erhaltenen Chromatogramme gezeigt.
Während der obigen Kationenaustauschchromatographie – Durchläufe wurde der Eluenten -pH – Wert auf der Auslassseite der chromatographischen Säule gemessen. Die pH – Elektrode wurde mit einem Referenzpuffer in einem Flusssystem kalibriert. Die Ergebnisse werden in der 6 gezeigt.
Außerdem wurden chromatographisehe Durchläufe bei pH = 6 durchgeführt , was als Optimum aus dem oben beschriebenen pH – screening beibehalten wurde, und zwar jeweils mit einer flüssigen Eluentenmischung, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung zweier unterschiedlicher CIEX – Puffer der Erfindung und mit einem traditionellen Verfahren unter Verwendung von „traditionellem" CIEX – Puffer erhalten wurde. Die erhaltenen Chromatogramme werden in der 7 gezeigt.
Ergebnisse
Bei einer ersten Bezugnahme auf die durch das pH – screening der im Beispiel 1 beschriebenen Anionenaustauschchromatographie erhaltenen, in der 2 gezeigten Chromatogramme kann man erkennen, dass bei zunehmendem pH die den Proteinen entsprechenden Spitzen später im Gradienten eluieren. Die Reihenfolge der Elution ist Transferin, gefolgt von Ovalbumin und Betalaktoglobulin als der letzten eluierten Komponente, diese Elutionsreihenfolge wird für alle gescreenten pH – Werte beibehalten. Die beste Trennung wird bei einem pH zwischen 6,0 und 6,5 erhalten.
Aus der 4 kann man ersehen, dass bei diesem optimalen pH die Trennung der äquivalent ist, die mit dem „traditionellen" Verfahren erhalten worden ist.
Der große Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens verglichen mit den „traditionellen" Verfahren ist so im wesentlichen die viel einfachere Optimierung: mit nur einer Pufferlösung kann ein weiter pH – Bereich abgedeckt werden.
Aus der 3 kann ersehen werden, dass der Eluenten – pH ziemlich stabil über den ganzen Gradienten ist. Die maximale Drift wurde bei pH = 8 erhalten, wo sie sich auf 0,1 pH -Einheiten belief.
Außerdem ist der reelle Unterschied zwischen dem eingestellten pH und dem gemessenen pH des Eluenten in der Tat viel kleiner als es aus der 3 erscheint: Bei Benutzung eines externen pH – Messgeräts (bei pH 5, 7 und 8) konnte gezeigt werden, das sich der tatsächlich erhaltenen Unterschied zwischen dem eingestellten und dem erhaltenen pH auf weniger als - 0,1 pH-Einheiten belief. Der offensichtliche Unterschied im pH ist auf das Kalibrierungsverfahren des pH – Messgeräts zurückzuführen, wobei eine stationäre Flüssigkeit anstatt eines bei der Eluenten – pH – Messung benutzten Flusses benutzt wird.
Mit dem pH – screening der Ionenaustauschchromatographie, mit den auf der 5 gezeigten Chromatogrammen, gibt es eine Umkehrung in der Ordnung der Elution des Cytochroms C und des Lysozyms bei zunehmendem pH (zwischen ph 4,5 und pH 5,0). Die beste Trennung wird bei pH = 6 erhalten.
Wie bei dem vorangehenden Fall wird aufs Neue gezeigt, dass die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Trennung mit der äquivalent ist, die mit dem „traditionellen" Verfahren der 7 erhalten wird.
Die pH 6 – Kurven auf der 6 zeigen, dass der pH während eines Salzgradienten sehr stabil ist. Die Spitzen am Anfang der Zeichnung und die Spitzen bei pH = 3 sind zurückzuführen auf das Probenlösungsmedium selbst, das über die Säule und die Elektrode geht.
Beispiel 3
In diesem Beispiel wurde die Drift des Eluenten pH während eines Salzgradienten wie er mit einem System in Übereinstimmung mit der Erfindung und einem System nach dem Stand der Technik erhalten worden ist, besonders das BioCAD ^TM – Verfahren, verglichen.
Experimente
In dem BioCAD ^TM – Verfahren werden zwei Puffer benutzt, um den pH – Wert zwischen jedem Durchlauf zu variieren. Diese zwei Puffer wurden von einem AIEX – Puffer, der 0,05M Bis -tris-Propan und 0,5M Tris aufweist erhalten, welche Puffer jeweils bei pH = 6 und pH = 9 titriert worden sind. Folglich konnten deren pH indem die Mischungsverhältnisse der zwei Puffer in der Pufferlösung variiert worden sind, zwischen 6 und 9 variieren. Dies wurde automatisch durch eine Funktion im Bio CAD ^TM – Programm durchgeführt.
Bei jedem Durchlauf wurde der Salzgradient unter Benutzung einer wässrigen NaCl – Lösung die zwischen 0M und 1,0M bei einer Rate von 0,05M/Minute variierten, erhalten.
Der pH wurde auf der Ausgangsseite der Säule gemessen.
Ergebnisse
Auf der 9 werden die pH – Kurven die mit dem BioCAD ^TM – Verfahren erhalten worden sind, gezeigt. Es gibt einen großen Unterschied zwischen dem pH – Wert des Einstellpunkts und dem gemessenen pH – Wert ebenso wie eine große pH – Drift während des Gradienten: z.B. überschreitet die Drift bei einem pH – Wert des Einstellpunkts von 7 0,5 pH - Einheiten (von über pH 6,5 bis unter pH 6,0).
Im Gegensatz dazu ist auf der 9 unter Benutzung des vorliegenden Verfahrens der erhaltene pH – Wert während des ganzen Gradienten sehr stabil.
SCHLUSSFOLGERUNGEN
Durch Benutzung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird so eine flüssige Mischung mit kontrolliertem pH – Wert und kontrollierter Ionenstärke erhalten, und außerdem kann der pH - Wert über einen großen Bereich variiert werden, ohne neue Puffer herstellen zu müssen.
Die Anwendung der Erfindung auf die Trennung und Reinigung von Biomelekülen wie z.B. Proteine erlaubt eine größere Genauigkeit der Eluentenparameter, die von Interesse sind, und gleichzeitig dazu wird die ziemlich umständliche Optimierung solcher Trennungen / Reinigungen sehr vereinfacht.
Die Erfindung ist beschrieben worden als ein Mittel zum Konstanthalten des pH einer flüssigen Mischung bei verschiedenen Ionenstärken.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer flüssigen Mischung, umfassend die folgenden Komponenten: (i) eine oder mehrere Pufferspezies; (ii) eine Säure oder alternativ eine Base; (iii) ein Salz; und (iv) ein Lösungsmittel, worin die Verhältnisse der Komponenten (i) zu (iv) in einer solchen Weise begleitend variiert werden, dass auf die Wechselbeziehung des pH und der lonenstärke in der flüssigen Mischung geachtet wird, so dass jederzeit ein vorbestimmter pH der Mischung erhalten wird, und worin ein iteratives Verfahren auf der Basis einer modifizierten Debye-Hückel-Gleichung verwendet wird, um die variablen Verhältnisse von (i) zu (iv) zu bestimmen, dadurch gekennzeichnet, dass das iterative Verfahren besteht aus der (a) Berechnung durch die Verwendung der Debye-Hückel-Gleichung der Verhältnisse der verschiedenen protolytischen Komponenten einer Mischung, wie oben definiert, mit einer gegebenen Salzkonzentration und aus den Verhältnissen, welche die Konzentrationen der verschiedenen puffernden Spezies herleiten, worin die lonenstärke der Mischung derartig genommen wird, dass sie nur von der Anwesenheit des Salzes herrührt, so dass ein vorgewählter pH der Mischung erhalten wird; (b) Berechnung der resultierenden Ionenstärke der Mischung auf der Basis der in dem vorangehenden Schritt berechneten Verhältnisse; (c) Berechnung durch die Verwendung der Debye-Hückel-Gleichung und unter Berücksichtigung der in (b) berechneten lonenstärke eines neuen Satzes von Verhältnissen der protolytischen Komponenten der Mischung bei dem vorgewählten pH der Mischung, so dass ein neuer Satz von Konzentrationen für die Pufferspezies berechnet wird; und (d) Wiederholen der Schritte (b) und (c), bis die Abweichung zwischen dem letzten Satz der für die Verhältnisse der protolytischen Komponenten gefundenen Werte und dem in dem unmittelbar vorausgehenden Schritt gefundenen Satz ein vordefiniertes maximales Niveau nicht überschreitet, wobei das Niveau eine Funktion der Ausgangskonzentration des Puffers ist, wobei dieser letzte Satz der Verhältnisse anschließend als Ergebnis der Mischung des ausgewählten pH bei einer gegebenen Salzkonzentration beibehalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponenten (i) bis (iv) der flüssigen Mischung als separate Flüssigkeiten vorgesehen werden.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel destilliertes und/oder entionisiertes Wasser ist.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Salz gegenüber dem flüssigen System dahingehend inert ist, dass es in dem System nicht in einer anderen Weise als durch ionische Dissoziation reagiert.
Verfahren zur Bildung eines Flüssigkeitsstroms mit konstantem pH und variabler lonenstärke nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Flüssigkeitsstrom erhalten wird durch Ausgeben der Lösungen von (i) bis (iv) mittels einer Abmessvorrichtung, umfassend zwei Sätze eines Ventils und einer Pumpe, und durch Betreiben gemäß des Verfahrens nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche.
Flüssigchromatographieverfahren unter Verwendung des Flüssigkeitsstroms, welcher nach Anspruch 5 gebildet wird, als einen Eluentenstrom.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Ionensäulenchromatographie ist.
Apparat für die Flüssigchromatographie, umfassend eine Online-Abmessvorrichtung, welche zum Ausgeben eines Eluenten einer oder mehrerer Pufferspezies, einer Säure oder einer Base, eines Salzes und eines Lösungsmittels in eine Chromatographietrennvorrichtung in der Lage ist, worin die Verhältnisse des Eluenten in einer solchen Weise begleitend variiert werden, dass die Wechselbeziehung des pH und der lonenstärke in dem Eluenten berücksichtigt wird, so dass zu jedem Zeitpunkt ein vorbestimmter pH des Eluenten erhalten wird; worin die Abmessvorrichtung Mittel umfassen kann zur (a) Berechnung durch Verwendung der Debye-Hückel-Gleichung der Verhältnisse der unterschiedlichen protolytischen Komponenten des Eluenten mit einer gegebenen, Salzkonzentration und aus den Verhältnissen, welche die Konzentrationen der unterschiedlichen Pufferspezies herleiten, worin die lonenstärke des Eluenten derartig genommen wird, dass sie nur von der Anwesenheit des Salzes herrührt, wobei ein vorbestimmter pH des Eluenten erhalten wird; (b) Berechnung der resultierenden lonenstärke des Eluenten auf der Basis der in Schritt (a) berechneten Verhältnisse; (c) Berechnung eines neuen Satzes von Verhältnissen der protolytischen Komponenten des Eluenten bei einem vorbestimmten pH des Eluenten, um einen neuen Satz von Konzentrationen für die Pufferspezies zu berechnen; und (d) Wiederholen der Schritte (b) und (c), bis die Abweichung zwischen dem letzten Satz von Werten, welcher für die Verhältnisse der protolytischen Komponenten gefunden wurde, und dem in dem unmittelbar vorangehenden Schritt gefundenen Satz ein vordefiniertes maximales Niveau nicht überschreitet, wobei das Niveau eine Funktion der Ausgangskonzentration des Puffers ist, wobei dieser letzte Satz von Verhältnissen anschließend als Ergebnis des Eluenten mit dem ausgewählten pH bei gegebenen Salzkonzentrationen beibehalten wird.
Apparat nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Abmessvorrichtung zwei Pumpen umfasst, eine zum Ausgeben der Pufferspezies-Lösung und der Säure- oder Basen-) Lösung angeordnet, und die andere angeordnet zum Ausgeben des Lösungsmittels und der Salzlösung.