JP3998713B2 - チロシナーゼ関連タンパク質1及び2のヒト癌抗原並びにこれをコードする遺伝子 - Google Patents
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Description
本発明は、癌ワクチンを含む癌の診断薬および治療薬の領域に関する。より具体的には、本発明は、新規な癌ペプチド並びにその癌ペプチドをコードする代替(alternative)オープンリーディングフレームDNA配列の単離と精製に関する。本発明はさらに、癌を治療および防止する際の道具として作用し得る新規な腫瘍抗原並びにその癌抗原をコードするDNAの単離と精製に関する。本発明はさらに、チロシナーゼ関連タンパク質1(TRP1)遺伝子内に由来する代替オープンリーディングフレームDNA配列によってコードされる新規な癌ペプチドに関する。本発明はまた、TRP2遺伝子内に由来する新規な癌ペプチドに関する。本発明はさらに、個人における癌と前癌を検出および診断および治療するための方法に関する。
発明の背景
腫瘍浸透リンパ球(TIL)の養子免疫伝達は、転移性メラノーマを伴う患者で腫瘍の退行を仲介することができ、T細胞によって認識される腫瘍拒絶抗原がこれらの腫瘍細胞上に存在することが示唆される。そのようなT細胞が入手可能なことにより、ヒトメラノーマ抗原をコードする遺伝子をクローン化し配列決定することが可能になっている。ヒトメラノーマからこれまでに同定された抗原は、その発現パターンに基づいて2つのクラスに分類することができる。第1のクラスの抗原は、腫瘍および精巣でのみ発現し、他の正常ヒト組織で発現しない遺伝子によってコードされる。MAGE1、MAGE3、GAGEおよびBAGEはこのクラスの例である。第2のクラスの抗原は、メラノサイト、メラノーマおよび正常網膜でのみ発現する遺伝子によってコードされる分化抗原を表す。MART−1/Melan−A、gp100およびチロシンはこのクラスの例である。これらの抗原は全て未変異自己タンパク質である。しかしながら、CDK4、B−カテニンおよびMum−1を含む幾つかの変異抗原もまた、T細胞によって認識されることが同定された。対応する遺伝子産物に由来するT細胞によって認識される抗原性エピトープの同定は、自己抗原に対する免疫応答の機構を理解するためのみならず、癌を伴う患者の治療のためのこれらの抗原または合成ペプチドによる新規で有効な免疫治療戦略を開発するためにも、重要である。
以前の研究により、メラノーマを伴う自己由来患者内にTIL586+IL−2を注入すると転移の客観的な退行が生じることが示された。より最近に、HLA−A31と関連してTIL586によって認識される腫瘍抗原をコードする遺伝子、チロシナーゼ関連タンパク質1(TRP−1またはgp75)がクローン化された。興味深いことに、遺伝子産物gp75は、転移性メラノーマを伴う患者からの血清中のIgG抗体によって認識される抗原として最初に同定された。その遺伝子は、メラノーマ、正常メラノサイト細胞株および網膜でのみ発現し、試験した他の正常組織では発現しないことが判明した。従って、この遺伝子は、MART−1/Melan−A、gp100およびチロシナーゼを含む第2のクラスの抗原の一員である。
本分野では、癌の発達から個人を保護するための免疫原またはワクチンとして有用である癌細胞上のエピトープを同定することは困難であった。本発明は、T細胞によって特異的に認識されるTRP−1遺伝子内の代替オープンリーディングフレーム配列からコードされるペプチド内の癌ペプチドおよび抗原性癌エピトープの同定である。本発明は、TRP−2遺伝子によってコードされる癌ペプチドを包含する。本発明の癌ペプチドは哺乳類で癌を阻害または防止するための免疫原およびワクチンとして有用である。
発明の要旨
本発明の一つの目的は、Tリンパ球によって癌抗原として認識される新規なペプチドおよびその一部を提供することである。
本発明の癌ペプチドおよびその癌ペプチドの抗原性癌エピトープ部分は、同一の遺伝子由来の正常のタンパク質またはペプチドをコードするために使用されるオープンリーディングフレームDNA配列以外の遺伝子の代替オープンリーディングフレームDNA配列によってコードされる。この範囲内に入る遺伝子はTRP−1遺伝子である。
本発明の別の側面は、同一の遺伝子由来の正常のタンパク質またはペプチドをコードするオープンリーディングフレームDNA配列以外の遺伝子の代替オープンリーディングフレームDNA配列によってコードされる腫瘍抗原である。この範囲内に入る遺伝子はTRP−1遺伝子である。
本発明の別の目的は、癌ペプチドとして作用する、TRP−1、TRP−2およびその変異体のペプチドフラグメントである。
本発明の腫瘍抗原およびその腫瘍抗原の抗原性癌ペプチドは、TRP−2遺伝子(配列番号46)の全部または一部によってコードされる。TRP−2は、チロシナーゼ関連遺伝子ファミリーの一員である。TRP−2はT細胞に免疫応答を引き出させることができる新規で潜在的な腫瘍抗原として現在同定されている。
本発明の一つの側面は、癌の発達から被験者を保護できる癌ワクチンとして有用である、TRP−1遺伝子、TRP−2遺伝子またはその変異体によってコードされる癌ペプチドである。本発明はまた、癌を防止するのに有効な量の癌ワクチンを投与する方法に関する。
本発明の別の側面は、癌ペプチドまたはその抗原性癌エピトープを単独または1以上の免疫刺激分子と組み合わせて含む医薬組成物である。本発明の別の側面は、TRP−1癌抗原を単独、TRP−2腫瘍抗原を単独、または1以上の同時免疫刺激分子と組み合わせて含む医薬組成物である。本発明の別の目的は、T細胞を刺激して腫瘍および癌に対して免疫原性応答を引き出す、TRP−1、TRP−2ペプチドまたはその組み合わせを含む、医薬組成物である。癌ペプチドまたはその抗原性癌エピトープは、癌の防止または治療のための免疫原としてまたはワクチンとして提供することができる。医薬組成物は、哺乳類において癌を治療または防止する方法で有用である。治療方法では、医薬組成物は、哺乳類における癌を防止または阻害するのに有効な量で哺乳類に投与される。
本発明の別の目的は、同一の遺伝子由来の正常のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームDNA配列以外の遺伝子由来の代替オープンリーディングフレームDNA配列の翻訳によって癌ペプチドおよびそのペプチド内の抗原性癌エピトープを生成する方法である。
本発明のさらに別の目的は、正常のタンパク質またはペプチドをコードするオープンリーディングフレームDNA配から翻訳される遺伝子産物以外の遺伝子由来の代替オープンリーディングフレームDNA配列から翻訳される癌ペプチド遺伝子産物またはその一部を検出および同定する方法である。
本発明のさらに別の側面は、癌ペプチドまたはその一部をコードする代替オープンリーディングフレームDNAまたはRNA配列、並びに癌ペプチドまたはその一部を産生する方法におけるそのDNAまたはRNA配列の使用である。本発明はさらに、プローブまたはプライマーとして使用するための代替オープンリーディングフレームDNAまたはRNA配列のオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明のさらに別の目的は、細胞で発現させた場合に腫瘍抗原を産生する、TRP−2またはそのフラグメントをコードする核酸配列である。
本発明はさらに、癌ペプチドまたはその一部をコードする代替オープンリーディングフレームDNA配列を単独または少なくとも1つの免疫刺激分子をコードする第2のDNA配列と組み合わせて含むベクターを提供する。代替オープンリーディングフレームDNA配列は、TRP−1遺伝子またはその変異体からのものでもよい。
本発明はまた、癌ペプチドまたはその一部をコードする代替オープンリーディングフレームDNA配列を単独または少なくとも1つの免疫刺激分子をコードする第2のDNA配列と組み合わせて含むベクターでトランスフェクトまたは形質導入した宿主細胞を提供する。
本発明はさらに、腫瘍抗原をコードするTRP−2遺伝子またはその一部を単独または少なくとも1つの同時免疫刺激分子をコードする第2のDNA配列と組み合わせて含むベクターを提供する。ベクターおよび宿主細胞はワクチンとして作用することができ、腫瘍抗原または癌ペプチドの発現は、ワクチンで免疫化した哺乳類における腫瘍抗原特異的Tリンパ球の刺激を生じさせる。
本発明はまた、TRP−2腫瘍抗原またはその変異体をコードするDNAを単独または少なくとも1つの同時免疫刺激分子をコードする第2のDNA配列と組み合わせて含むベクターでトランスフェクトまたは形質導入した宿主細胞を提供する。
ベクターおよび宿主細胞はワクチンとして作用することができ、TRP−2腫瘍抗原の発現は、ワクチンで免疫化した哺乳類における抗原特異的Tリンパ球の刺激を生じさせる。
ベクターおよび宿主細胞はワクチンとして作用することができ、癌ペプチドまたはその一部の発現は、ワクチンで免疫化した哺乳類における癌ペプチド特異的Tリンパ球の刺激を生じさせる。
本発明のさらに別の目的は、ヒトの前新生物性および新生物性の細胞および組織を診断する方法を提供することである。
本発明は、同一の遺伝子由来の正常のタンパク質をコードするために使用されるオープンリーディングフレーム核酸配列以外の遺伝子の代替リーディングフレーム核酸配列によってコードされる癌ペプチドまたはその一部を検出することによって哺乳類における癌または前癌を診断する方法であって、その癌ペプチドまたはその一部がTリンパ球によって認識される方法を提供する。代替リーディングフレーム核酸配列は、TRP−1遺伝子またはその変異体からのものでもよい。
本発明のさらに別の目的は、ヒトの前新生物性および新生物性の細胞および組織を診断する方法を提供することである。本発明によれば、その方法は、ヒトから細胞、組織またはその抽出物を単離し、癌ペプチドをコードする代替オープンリーディングフレームDNA配列、RNA配列またはその一部を検出するか、代替オープンリーディングフレームDNA配列またはRNA配列によって発現される癌ペプチドまたはその一部を検出することを含み、代替オープンリーディングフレームDNA配列、RNA配列または発現産物の検出またはその増加は、前新生物または新生物の指標である。
本発明は、TRP−2腫瘍抗原の検出による哺乳類の癌または前癌の診断方法であって、腫瘍抗原、癌ペプチドまたはその変異体がTリンパ球によって認識される方法を提供する。
本発明は、TRP−2遺伝子またはそのフラグメントによってコードされる腫瘍抗原の検出による哺乳類の癌または前癌の診断方法であって、腫瘍抗原がTリンパ球によって認識される方法を提供する。
本発明のさらに別の目的は、癌ペプチドまたはその一部をコードする代替オープンリーディングフレームDNA配列の1以上のコピーをそのゲノム中に取り込んでいるトランスジェニック動物を提供することである。代替リーディングフレーム核酸配列はTRP−1遺伝子またはその変異体からのものでもよい。代替オープンリーディングフレームDNA配列の取り込みにより、多重型または変異型の癌ペプチドの過剰発現または発現が生じる。そのようなトランスジェニック動物は癌の治療に有用な治療剤のスクリーニングのために有用である。
本発明のさらに別の目的は、本発明の腫瘍抗原の1以上のコピーをそのゲノム中に取り込んでいるトランスジェニック動物を提供することである。TRP−2DNA配列またはそのフラグメントの取り込みにより腫瘍抗原の過剰発現または発現が生じる。そのようなトランスジェニック動物は、癌の治療に有用な治療剤のスクリーニングのために有用である。
本発明はまた、代替オープンリーディングフレーム核酸配列またはTRP−2腫瘍抗原核酸配列に特異的にターゲッティングして結合し、同一の遺伝子に由来する正常タンパク質の発現に悪影響を及ぼすことなく癌ペプチドまたは腫瘍抗原の発現を阻害する、アンチセンスオリゴヌクレオチドを包含する。
本発明のさらに別の側面は、診断および検出アッセイで使用するためのTRP−1癌ペプチドおよびTRP−2腫瘍抗原を含む癌ペプチドおよびその抗原性癌エピトープと反応性を有するモノクローナルおよびポリクローナル抗体である。モノクローナルおよびポリクローナル抗体は、単独または診断および検出アッセイで通常使用される他の試薬と一緒のキットの形態で提供することができる。
【図面の簡単な説明】
本発明のこれら及び他の目的、特徴、および随伴する利点の多くは、添付する図面を一緒に考慮して、以下の詳細な説明を読むことでより良く理解されるであろう。図面中、
図1Aおよび1Bは、TIL586によって認識される抗原性ペプチドをコードするgp75ヌクレオチド配列の位置を示す。
図1Aは、gp75の1584bpのオープンリーディングフレームを含む全長cDNAを示す。ヌクレオチドは、リーダー配列と成熟gp75から成るタンパク質へと翻訳される開始コドンから番号付けされている。pcDNA776は最初の246ヌクレオチドコード領域を欠くgp75の部分cDNAであり、HLA−A31遺伝子と一緒にCOS−7をコトランスフェクションした際に、TIL586によるGM−CSF分泌を刺激する能力に基づくアッセイを使用してcDNAライブラリーから単離された。一連の欠失構築物およびPCR DNAフラグメントを作製した。pD776AはApaI制限酵素での消化後のpcDNA776の誘導体である。
図1Bは、TIL586によるGM−CSFの放出を示す。TIL586によるGM−CSF分泌は、図1Aに示すDNAフラグメントとHLA−A31遺伝子でコトランスフェクションしたCOS−7で同時培養した後に測定した。対照刺激物質細胞は、586mel、397mel/A31+、COS−7単独、およびHLA−A31またはpcDNA776cDNAでトランスフェクトしたCOS−7を含む。
図2は、gp75遺伝子のヌクレオチド、アミノ酸配列およびオープンリーディングフレームを示す。最初の157アミノ酸の部分ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、ORF1(gp75)の翻訳の開始コドンから示した。TIL586からのGM−CSF放出を刺激する能力を付与したDNAフラグメントを下線で示す。2個の推定開始コドン、ATG(254−256)およびATG(294−296)を太字で示し、各々ORF2およびORF3の翻訳を生じさせることができる。ORF3からTIL586によって認識されるペプチド配列は太字と下線で示す。
図3Aと3Bは、抗原性ペプチドと代替オープンリーディングフレームの翻訳を示す。
図3Aは、PCRによって増幅されたPCRフラグメントの位置と長さを示す。DNAフラグメントはPCR増幅によって得られ、pCR3発現ベクター中にクローン化された。位置294−296のATGのATCによる置換は、材料および方法に記載される通りに行った。
図3Bは、TIL586からのサイトカイン放出を刺激するDNAフラグメントおよび変異構築物の試験を示す。GM−CSF放出アッセイは図1の場合と同様に行った。
図4A−4Cは、TIL586によって認識される抗原性ペプチドの特徴を示す。
図4Aは、種々の刺激物質とともに同時インキュベートした場合の、HLA−A31制限TIL586によるGM−CSFの放出を示す。トランスフェクションおよびサイトカインアッセイは図1AおよびBと同様に行った。586melおよび397melをTIL586の反応性に関して陽性および陰性対照として含めた。ORF3Pペプチドを1μg/mlの濃度で90分間586EBV(A31+)およびT2(非−A31)細胞とともにインキュベートした。TIL586によるGM−CSF分泌の刺激は、ペプチドORF3Pでパルスした自己由来586EBVおよび異質遺伝子型の1510EBV(A31+)細胞で同時インキュベートした場合は有意に増加したが、586EBV単独またはORF3Pペプチドで充填したT2(非−A31)細胞で同時インキュベートした場合は増加しなかった。
図4Bは、TIL586による標的細胞の細胞毒性溶解を示す。586mel(−■−)および397mel(−□−)を各々陽性および陰性対照として使用した。586EBV B細胞を、マークした通り、ORF3P(pep)と(−▲−)、無関係なペプチドと(ipep)(−●−)、ペプチドなしに(−△−)インキュベートし、そしてT2細胞をORF3Pでパルスした(−○−)。インキュベーション後、TIL586を添加し標的細胞と混合した。TIL586の細胞溶解活性を4時間のクロム放出アッセイで測定した。
図4Cは、TIL586による溶解のために標的細胞を感作するためのペプチド濃度の滴定を示す。586EBV細胞を、ORF3P(pep)(−▲−)または無関係なペプチド(ipep)(−●−)の連続希釈で、そしてT2細胞をORF3Pペプチドで(−○−)90分間別々にインキュベートした。TIL586の細胞溶解活性は、エフェクター:標的(E:T)の比率40:1で4時間の51Cr放出アッセイで評価した。
図5Aおよび図5Bは、ORF3Pペプチドでロードした未標識586EBV細胞による51Cr標識した標的細胞の溶解の阻害を示す。
図5Aは、586mel細胞をクロムで90分間「ホット」標的として標識したことを示す。ORF3P(−▲−)、無関係なペプチド(−△−)でパルスした586EBV細胞並びにORF3PペプチドでロードしたT2細胞(−□−)を「コールド」標的細胞として使用した。洗浄後、「ホット」および「コールド」標的細胞を再度計数し、1:1、5:1、10:1および20:1の「コールド」/「ホット」比で混合した。TIL586をエフェクター:「ホット」標的(E:T)比率20:1で添加した。クロムの放出を4時間のインキュベーション後に測定した。
図5Bは、gp100を認識したTIL1200による51Cr標識した624mel(「ホット」標識)の溶解が、無関係なペプチド(−△−)でパルスした586EBV細胞と比較して、ORF3P(−▲−)でパルスした586EBV細胞によって阻害されなかったことを示す。「コールド」および「ホット」標的細胞を示した比率で混合した。TIL1200をエフェクター:ホット標的(E:T)比率30:1で添加した。TIL1200の細胞溶解活性を4時間の51Cr放出活性で評価した。
図6A−6Dは、TIL586細胞株からの抗原性ペプチドT細胞クローンの認識を示す。T細胞クローンをTIL586細胞株から生成した。586EBV B細胞をORF3Pペプチドまたは無関係なペプチドでパルスした。T細胞クローンまたはTIL586細胞を添加して同時インキュベートした。586mel、397mel/A31+腫瘍およびメラノサイトNHEM680細胞について、1×105細胞/ウエルを、各々T細胞クローン、TIL586−C1(図6A)、TIL586−C4(図6B)およびTIL586−C6(図6C)またはTIL586(図6D)に18〜24時間1×105細胞でインキュベートした。GM−CSFアッセイを図1Bに記載した通り行った。
図7.TIL586に由来するCTLクローンによる種々の標的細胞および抗原性ペプチドの認識。T細胞クローンをTIL586細胞株由来の限界希釈(1細胞/ウエル)によって生成し、6000IU/mlのIL−2を含むAIM−V培地中でさらに膨張させた。CTLクローン586TIL−C1およびクローン4によるGM−CSF分泌を、正常メラノサイト細胞株(HLA−A31+)、ORF3Pペプチドまたは無関係なペプチドでパルスした586EBV B細胞、397melまたは586mel細胞と同時培養した後に測定した。
図8.CTLクローン4により認識された新規な腫瘍抗原としてのTRP−2の同定。CTLクローン4によるGM−CSF放出を、MART−1、gp75/TRP−1、gp100、チロシナーゼ、p15およびTRP−2をコードする遺伝子と一緒にHLA−A31cDNAでコトランスフェクションしたCOS−7と同時培養後に測定した。対照刺激物質細胞には、586mel、397mel、COS−7単独、およびHLA−A31cDNAでトランスフェクションしたCOS−7が含まれた。
図9.TRP−2遺伝子の欠失およびサブクローンの構築およびT細胞認識。1557bpオープンリーディングフレームを含むTRP−2の全長cDNAを示す。ヌクレオチドをTRP−2cDNAの5’未翻訳領域からf〜rstヌクレオチドから番号を付けた。一連の欠失構築体およびDNAフラグメントのスブクローニングを作製した。各構築物のT細胞認識を、上記したDNAフラグメントおよびHLA−A31遺伝子でコトランスフェクションしたCOS−7でCTLクローン4を同時培養した後に測定した。
図10.TRP−2の抗原性ペプチドおよび部分コード配列.TRP−2遺伝子の部分ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。pTD4、pTA、pTD3およびpTK中のDNAフラグメントの長さおよび3’末端を矢印で示し、ApaI、PstIおよびKpnIの制限部位に印を付ける。CTLクローン4で認識される抗原性ペプチド配列を太字および下線で示す。
図11Aから図11C. CTLクローン4で認識される抗原性ペプチドの特徴。
図11(A).異なるペプチド濃度でのT細胞によるGM−CSF放出。586EBV(A31+)を、TRP197-205ペプチド(−−▲−−)でパルスし、T2(非−A31)細胞をTRP197-205ペプチド(−−●−−)で異なるペプチド濃度で90分間パルスした。対照ペプチドとしてのORF3Pを、586EBV B細胞(−−△−−)上にパルスした。CTLクローン4によるGM−CSF放出を、TRP197-205およびORF3Pでパルスした586EBV B細胞、そしてTRP197-205でパルスしたT2細胞と同時インキュベートした後に測定した。
図11(B).異なるペプチド濃度でのCTLクローン4による溶解のための標的細胞の感作。586EBV B細胞を、TRP197-205(−−▲−−)、無関係なペプチドORF3P(−−△−−)とインキュベートし、そしてT2細胞を種々のペプチド濃度でTRP197-205でパルスした(−−●−−)。ペプチドインキュベーション後に、標的細胞を30分間標識した。洗浄後、E:T比率40:1でのCTLクローン4の細胞溶解活性をT細胞と標的細胞との4時間のインキュベーション後に測定した。図11(C).異なるE:T比率でのCTLクローン4による標的細胞の溶解。標的586EBV細胞を、TRP197-205(−−▲−−)または無関係なペプチドORF3P(−−△−−)と別々にインキュベートし、標的T2細胞をTRP197-205ペプチド(−−●−−)と90分間インキュベートした。586mel(−−□−−)および397mel(−−■−−)を各々陽性および陰性対照として使用した。
発明の詳細な説明
本発明は、免疫系のTリンパ球によって免疫学的に認識される、癌ペプチド、腫瘍抗原並びにそれらの一部、誘導体または変異体を包含する。本発明はさらに、癌ペプチドまたは腫瘍抗原中に含まれる抗原性癌エピトープを包含する。抗原性癌エピトープは免疫系のT細胞との相互作用により細胞仲介免疫応答を特異的に生じさせる。抗原性癌エピトープとT細胞との相互作用により、T細胞はヒトを含む哺乳類中の癌に対して反応し、それを防止、排除または減少させる。
一つの態様において、本発明の癌ペプチドの中に含まれる癌ペプチドおよび抗原性癌エピトープは、癌ペプチドが遺伝子内の正常のタンパク質またはペプチドをコードするオープンリーディングフレーム以外の遺伝子の代替オープンリーディングフレームによってコードされるという点で、正常のタンパク質またはペプチドと区別される。癌ペプチドおよびその一部は、特徴的なことに、正常な細胞では不在であるか非常に低いレベルで存在し、前癌および癌細胞では高いレベルで存在する。高いレベルでの癌ペプチドの発現は、正常細胞から前癌または癌細胞への形質転換と相関している。
本発明の癌ペプチドは、原発性または転移性のメラノーマ、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、非ホドキンの(non-Hodgkin's)リンパ腫、ホドキンのリンパ腫、白血病、子宮癌、頸部癌、膀胱癌、腎臓癌、およびアデノカルチノーマ、例えば乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌等を含むがこれらに限定されない癌の一部を形成するか、それらから誘導される。
メラノーマという用語には、メラノーマ類、転移性メラノーマ、メラノサイトまたはメラノサイト関連母斑細胞の何れか由来のメラノーマ、黒色癌、黒色上皮腫、黒色肉腫、in situメラノーマ、表在拡散性メラノーマ、結節性メラノーマ、ほくろ悪性メラノーマ、末端性ほくろ性メラノーマ、侵食性メラノーマまたは家族性非定型性母斑及びメラノーマ(FAM−M)症候群が含まれるが、これらに限定されない。
特に興味深いのは、癌、特にメラノーマを有する患者中の自己由来CTLによって認識される癌ペプチド、そのフラグメントまたは誘導体である。さらに興味深いのは、MHC制限CTL、特にMHCクラスI制限CTLによって認識される癌ペプチド、そのフラグメントまたは誘導体である。
本発明の「腫瘍抗原」は、哺乳類での抗腫瘍応答を引き出すことができる癌または腫瘍タンパク質およびその癌または腫瘍タンパク質の任意の部分を包含する。一つの態様では、腫瘍抗原には、全長TRP−2タンパク質が含まれる。
「癌ペプチド」という用語は本明細書で使用する場合、腫瘍抗原として作用する、癌または腫瘍タンパク質の任意のエピトープまたはフラグメントを包含する。
「フラグメント」という用語は本明細書で使用する場合、タンパク質フラグメントの場合で少なくとも5または6アミノ酸そして遺伝子の場合で少なくとも15から18ヌクレオチドを有するタンパク質または遺伝子の任意のセグメントを意味する。
一つの態様では、本発明の癌ペプチドは、正常遺伝子由来の代替オープンリーディングフレームDNA配列の発現から生じる。正常の遺伝子産物が発現されるよりむしろ、MHC制限様式でTリンパ球によって免疫学的に認識されることができる癌ペプチドが発現する。MHC制限Tリンパ球は癌または前癌に関連する代替オープンリーディングフレーム遺伝子産物を同定するのに有用である。
特に興味深いのは、TRP−1(gp75);マウス腫瘍サプレッサーINK4a遺伝子の代替リーディングフレームから生じるタンパク質p19ARF(Quelle, D.E.他、Cell Vol.83, pp993-1000, 1995);抗原性オクタペプチドSVVEFSSL、即ち、JAL8、bm1抗B6同種異系反応性bm1BZ19.4T細胞によって認識される異質遺伝子型ペプチド(Malarkannan, S他、J.Exp.Med. Vol.182, pp.1739-1750, 1995)など:に関連する癌ペプチドである。
一つの態様では、本発明の癌ペプチド、そのフラグメントまたは誘導体は、哺乳類の癌腫瘍由来の腫瘍浸透性リンパ球(TIL)によって免疫学的に認識される抗原性癌エピトープを含む。特に興味深いのは、癌抗原特異的細胞傷害性T細胞によって認識される抗原性癌エピトープである(CD8+)。
本発明の一つの態様では、癌ペプチドは約24アミノ酸を含み、図2に記載したチロシナーゼ関連タンパク質1をコードする同一の遺伝子由来またはそれらのホモログまたは変異体由来の代替オープンリーディングフレーム3DNA配列によって発現される。
一つの態様では、本発明の癌ペプチドはアミノ酸配列:
MXaaLQRQFLRTQLWDVPSWLERSCL(配列番号7)およびそのフラグメントまたは誘導体を含む(式中、XaaはSerまたはAlaである)。配列番号6と部分的配列相同性を共有する癌ペプチドまたはその一部も本発明の範囲内に含まれる。部分的アミノ酸配列相同性とは、配列番号6と少なくとも85%の配列相同性、好ましくは少なくとも95%の配列相同性またはそれ以上を有するペプチドを意味し、癌抗原特異的Tリンパ球を刺激する生物学的作用を有する。
本発明の一つの態様では、癌ペプチドは式:
MetXaaLeuGlnArgGlnPheLeuArg(配列番号8)およびそのフラグメントおよび誘導体によって表すことができる(式Xaa=SerまたはAla)。
本発明の癌ペプチドの別の態様では、アミノ酸配列:
MSLQRQFLR(配列番号9)およぴそのフラグメントおよび誘導体を含む。
別の態様では、本発明の腫瘍抗原の中に含まれる癌ペプチドおよび抗原性癌エピトープは、メラノーマ、正常メラノサイト細胞株および網膜で主として発現するTRP−2タンパク質に由来する。本発明の腫瘍抗原は、前癌および癌細胞で見られる上昇したレベルよりも大部分の正常細胞では有意に低いレベルで存在する。腫瘍抗原の上昇した発現は正常細胞の前癌または癌細胞への形質転換と相関する。TRP−2はヒト染色体13に位置し、チロシナーゼ関連遺伝子ファミリーの一員であることが示され、チロシナーゼおよびgp75/TRP−1に対して40−45%のアミノ酸配列同一性を共有する(Yokoyama他(1994);Bouchard他(1994))。TRP−2は519アミノ酸を有するタンパク質をコードし、メラニン合成に関与するDOPAクロム互変異性化酵素(tautomerase)活性を有することが実証されている(Bouchard他(1994))。
特に興味深いのは、癌、特にメラノーマを有する患者における自己由来CTLによって認識されるTRP−2の癌ペプチドまたはその変異体である。さらに興味深いのは、MHC制限CTL、特にMHCクラスI制限CTLによって認識される癌ペプチド、そのフラグメントまたは誘導体である。癌ペプチドによって認識される好ましいHLAサブタイプはHLA−A31サブタイプである。本発明は、HLA−A31制限T細胞によって認識される潜在的な腫瘍抗原としての、TRP−2、チロシナーゼタンパク質ファミリーのメラノーマ/メラノサイト分化抗原の同定に関する。TRP−2遺伝子産物はTIL586から単離されたCTLクローンによって認識される第2の腫瘍抗原である。
本発明の別の態様では、腫瘍抗原は約9アミノ酸を含む癌ペプチドであり、チロシナーゼ関連タンパク質−2(配列番号46)をコードする遺伝子または図10に示すそのホモログまたは変異体から発現される。
さらに別の態様では、TRP−2タンパク質のフラグメントまたはその機能的に均等な変異体は癌ペプチドとして使用される。好ましくは、本発明の腫瘍抗原はアミノ酸197−205の少なくとも一部分を含むTRP−2タンパク質のフラグメントを含む。最も好ましくは、本発明の癌ペプチドはアミノ酸配列:LLGPGRPYRおよびそのフラグメントまたは誘導体を含む。アミノ酸197−205を含むTRP−2の領域と部分的配列相同性を共有する癌ペプチドまたはその一部も本発明の範囲内に含まれる。部分的アミノ酸配列相同性とは、LLGPGRPYRと少なくとも85%の配列相同性、好ましくは少なくとも95%の配列相同性またはそれ以上を有するペプチドを意味し、癌抗原特異的Tリンパ球を刺激する生物学的作用を有する。
本発明の別の態様は、癌ペプチドとして有効に作用するのに十分な相同性をLLGPGRPYRに対して有する癌ペプチドを包含する。そのようなペプチドは1以上の位置で保存的アミノ酸変化を有していてもよい。保存的アミノ酸変化とは、特定の位置での本来存在するのと同一の型のアミノ酸変化を意味し、即ち、疎水性アミノ酸が疎水性アミノ酸に変化し、塩基性アミノ酸が塩基性アミノ酸に変化すること等である。そのようなアミノ酸変化はペプチドの全体の荷電および配置を有意には変更せず、従ってそのような変異体は癌ペプチドの抗癌活性を維持する。そのような保存的変化の例は当業者に周知であり、本発明の範囲内である。
本発明のさらに別の態様は、LLGPGRPYRペプチドに由来するが、1以上の位置で非保存的アミノ酸変化を含む数種の癌ペプチドに関する。そのようなペプチドが本発明で同定され、LSGPGRPYR、KLGPGRPYR、LLGPGFPYRおよびそのフラグメントおよび誘導体を含むが、これらに限定されない。
本発明はTRP−1またはTRP−2癌ペプチドの機能的に均等な変異体に関する。「機能的に均等な変異体」には、部分的配列相同性を有するペプチド、1以上の特定の保存的および/または非保存的アミノ酸変化を有するペプチド、ペプチド結合体、キメラタンパク質、融合タンパク質およびペプチド核酸が含まれる。
癌ペプチド、腫瘍抗原およびそれらの抗原性癌エピトープは、一次臨床単離物、細胞株などからなどのように天然源から精製および単離することができる。癌ペプチドおよびその一部は少なくとも90%の純度、好ましくは少なくとも95%の純度、そして100%の純度である。癌ペプチドおよびそれらの抗原性エピトープはまた、化学合成によってまたは当分野で公知の組み換えDNA技術によって得ることもできる。化学合成の技術はJ.M. StewardおよびJ.D.Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1969; M. Bodansky他"Peptide Synthesis", John Wiley & Sons, 第2編、1976、およびJ.Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptidea", Vol.2, p.46, Academic Press, New York, 1983およびE.SchroderおよびK.Kubke "The Peptides" Vol.1, Academic Press, New York, 1965に記載されている。
癌ペプチドおよびそれらの抗原性癌エピトープは、当分野で公知の方法によって薬学的に許容可能な担体とともに医薬組成物に調剤化することができる。本組成物は癌を防止または治療するためのワクチンとして有用である。本組成物はさらに少なくとも1つの免疫刺激分子を含む。抗原特異的T細胞応答を刺激するために癌ペプチドまたはその一部分と組み合わせて使用するための免疫刺激分子には、1以上の主要組織適合性複合体(MHC)分子、例えばクラスIおよびクラスII分子、好ましくはクラスI分子が含まれるが、これらに限定されない。本組成物はさらに、B7.1、B7.2、ICAM−1、ICAM−2、LFA−1、LFA−3、CD72等を含む他の刺激剤分子、並びに、IL−1からIL−15、TNFα、IFNγ、RANTES、G−CSF、M−CSF、IFNα、CTAPIII、ENA−78、GRO、I−309、PF−4、IP−10、LD−78、MGSA、MIP−1α、MIP−1βを含むがこれらに限定されないサイトカイン類、またはそれらの組み合わせ等を、免疫強化のために含んでもよい。
刺激分子は物理的に別個の形態として提供してもよいし、B細胞、マクロファージまたは樹枝状細胞などの抗原提示細胞の膜中に、リポソームの膜中に提供してもよいし、形質導入またはトランスフェクションした細胞の表面上に発現してもよい。MHC免疫刺激分子のDNA配列はGenBank等から入手可能である。
癌ペプチド、腫瘍抗原およびそれらの抗原性癌エピトープは、癌を防止または治療するための方法で有用であり、ヒトを含む哺乳類中の癌または前癌を検出するための診断アッセイで有用である。癌ペプチドまたはその一部は、放射標識、ビオチン、フルオレセインなどの他の構成成分がそれに付着している、誘導体の形態でもよい。特定の器官、腫瘍または細胞型への特異的ターゲッティングを可能にするターゲッティング物質もまた腫瘍抗原、癌ペプチドまたはその一部に付着させてもよい。そのようなターゲッティング物質は、ホルモン、サイトカイン、細胞受容体などでもよい。癌ペプチド、腫瘍抗原およびそれらの一部は、単独または他の試薬と組み合わせてキットの形態で用意することができる。
本発明の別の側面は、癌に対する腫瘍特異的細胞仲介免疫性を誘導するのに有用なワクチンである。
癌の免疫療法に対するアプローチは能動または受動のカテゴリーに分類することができる。能動免疫療法には、腫瘍に対する免疫応答を増進するための試みにおいて癌抗原を有する癌患者を直接免疫感作することが含まれる。受動免疫治療は、抗腫瘍応答を直接的に仲介することを目標にして、抗腫瘍反応性を有する免疫細胞または抗体などの免疫試薬を投与することを言う。
能動免疫療法の最初の試みは、無傷な癌細胞または癌細胞抽出物のいずれかを、これらの物質が免疫応答を刺激できる量および形態で腫瘍抗原を含んでいるという期待をもって、利用した。しかしながら、癌抗原の分子の同定により、ヒト癌の治療のための免疫療法を開発する新たな可能性が開けた。これらの試みの幾つかの要約を表1に示す。
表1 癌抗原の分子同定に基づく癌治療
1. 以下のものによる能動免疫治療:
a.免疫優性ペプチド
1)単独
2)アジュバンドとの組み合わせ
3)ヘルパーペプチド、脂質またはリポソームに結合
4)抗原提示細胞上にパルス
b.MHC分子への結合を増大させるアミノ酸置換による免疫優性ペプチド
c.単独またはアジュバンドと組み合わせたタンパク質
d.癌抗原をコードする「裸の」DNA
1)皮膚内注入のための「遺伝子銃」
2)筋肉内注入
3)脂質に結合
e.次をコードするワクシニア、鶏痘又はアデノウイルス等の組み換えウイルス
1)癌抗原単独
2)癌抗原+サイトカインをコードする遺伝子、同時刺激分子、または免疫疫応答を増強する他の遺伝子
f.単独または免疫刺激分子と組み合わせて癌抗原をコードするBCG、サルモネラまたはリステリア等の組み換え細菌
2. 免疫刺激サイトカインの投与を伴う(上記の)能動免疫治療
1. IL−2
2. IL−6
3. IL−10
4. IL−12
5. IL−15など
3.TIL又はPBLの次へのインビトロ感作で生じた抗腫瘍リンパ球による受動免疫治療
1.抗原提示細胞上にパルスした免疫優性ペプチド(CD8細胞を生じる)
2.抗原提示細胞と同時インキュベートした抗原性タンパク質(CD4細胞を生じる外生抗原提示経路)
E.coli、酵母またはバキュロウイルスなどの高効率発現系への癌抗原をコードする遺伝子の挿入は、免疫化で使用するための大量の精製された腫瘍抗原を得る機会を提供する。あるいは、これらの腫瘍抗原からの免疫優性ペプチドはインビトロで容易に合成でき、単独にあるいはアジュバンド、脂質/リポソームまたはヘルパーペプチドへの結合との組み合わせなどのそれらの免疫原性を改善することを意図した形態で免疫化のために大量に精製することができ、または抗原提示細胞上へパルスすることができる。MHC抗原への結合効率を改善するための免疫優性ペプチドの個々のアミノ酸の修飾により、天然のペプチドと比較して免疫原性を潜在的に増加させることができる。
筋肉中または皮膚中に直接注入した「裸の」DNAを使用する最近の技術は、コードされた抗原に対する細胞性とホルモン性の両方の免疫応答を高めることを示した(Cooney, E.L., A.C. Collier, P.D. Greenberg, R.W. Coombs, J.Zarling, D.E. Arditti, M.C. Hoffman, S.L. HuおよびL. Correy, 1991, Lancet 337:567; Wolff, J.A., R.W. Malone, P.Williams, W. Chong, G. Acsadi, A. Jani,およびP.L.Felgner, 1990, Science 247:1465; Davis, H.L., R.G. Whalen,およびB.A. Demeniex, 1993, Hum. Gene Ther.4:151; Yang, N.S., J.Burkholder, B. Roberts, B Martinelli,およびD. McCabe, 1990, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87:9568; Williams, R,S., S.A. Johnston, M.Riedy, M.J. Devit, S.G. McElligott,およびJ.C. Sanford, 1991, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88:2726; Fynan, E,R., Webster, D.H. Fuller, J.R. Haynes, J.C. Santoro,およびH.L.Robinson, 1995, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:11478; Eisembraum, M.D., D.H.Fuller,およびJ.R. Haynes, 1993, DNA and Cell Bio. 12:791; Fuller, D.H.およびJ.R. Haynes, 1994, AIDS Res. Hum. Retrovir. 10(11):1433; Acsadi, G., G. Dickson, D.R.Love, A. Jani, F.S. Walsh, A. Gurusinghe, J.A. Wolff, およびK.E. Davies, 1991, Nature 352:815)。生活力のないDNAベクターを使用する技術は準備の容易性と投与の安全性の利点を有している。本発明の代替核酸配列は癌に対する免疫原としてまたはDNAワクチンとして有用である。TRP−1の本発明の代替オープンリーディングフレーム核酸配列あるいは本発明のTRP−2タンパク質またはペプチドをコードするDNA配列は、癌細胞に対する細胞応答を引き出す量で遺伝子銃を使用して投与することができる。ナノグラムの量がそのような目的にとって有用である。
免疫化の有効な形態は、BCG、サルモネラまたはリステリア等の組み換え細菌中にあるいはワクシニア、鶏痘またはアデノウイルス等の組み換えウイルス等中に免疫原性分子をコードする遺伝子を取り込むことを含む。癌抗原をコードする遺伝子は、単独で、あるいは免疫刺激分子をコードする遺伝子または感染後に免疫応答を増大させることができる他の遺伝子と一緒に発現させることができる。マウスモデル中のモデル腫瘍抗原による研究は、インターロイキン−2(IL−2)またはB7.1の遺伝子の取り込みによりモデル腫瘍抗原の免疫原性を増大することができ、これらの抗原を有する確立した肺転移巣の減退を仲介さえでき、そしてこれらの抗原を有する確立した肺転移巣の減退を仲介さえできることを示した。IL−2、IL−6、IL−10、IL−12またはIL−15等の免疫刺激サイトカインの外来投与を伴う能動免疫治療を使用して免疫応答を改善することもできる。
ヒト腫瘍抗原を認識できる遺伝的に改変した免疫細胞(通常は養子免疫治療と称される)による受動免疫は転移性メラノーマを有する選択患者における癌の退行を仲介するのに有効である。ヒトリンパ球が抗原提示細胞上に提示された腫瘍抗原免疫優性ペプチドにインビトロで感作されるインビトロ技術が開発されている。反復したインビトロ刺激によって、ヒト腫瘍抗原をコードする遺伝子をクローン化するために使用したTILよりもはるかに大きなヒト腫瘍抗原を認識する能力を有する細胞を誘導することができる。即ち、癌ペプチドによる反復したインビトロ感作によって、TILの50〜100倍以上の効力を有するリンパ球を誘導することができた。これらの細胞の養子移入は、通常通り生育したTILよりもインビトロでの腫瘍退行を仲介するのにより有効であるかもしれない。
癌を防止または阻害する方法において、癌ペプチドまたはその一部を、静脈内、筋肉内、皮下、皮膚内、腹腔内、くも膜内、胸膜内、子宮内、直腸、膣、局所、腫瘍内などを含むがこれらに限定されない複数の経路の一つを通じて投与することができる。
投与は、粘膜通過または皮膚通過手段で行うことができる。粘膜通過または皮膚通過投与のためには、透過すべき障壁に適した浸透剤を調剤中に使用する。そのような浸透剤は当分野で一般的に既知であり、例えば、粘膜通過投与のためには胆汁塩およびフシジン酸(fusidic acid)誘導体が含まれる。さらに、洗浄剤を使用して浸透を容易化することができる。粘膜通過投与は、例えば、鼻腔スプレー、または座薬によるものでもよい。経口投与のためには、癌ペプチド、腫瘍抗原、その一部または変異体は、カプセル剤、錠剤および毒物(toxics)などの通常の経口投与形態に調剤化される。
一般に、被験者の体重1Kg当たり少なくとも約1pg、好ましくは体重1Kg当たり少なくとも約1ng、より好ましくは体重1Kg当たり少なくとも約1μg以上の投与量の癌ペプチドまたはその一部を被験者に供給することが望ましい。体重1Kg当たり約1ngから体重1Kg当たり約100mgの範囲が好ましいが、より低い投与量またはより高い投与量を投与することもできる。投与により、癌抗原特異的Tリンパ球、好ましくは細胞毒性Tリンパ球のクローン性膨張を開始、刺激および/または生じさせるのに有効であり、これらは次いで被験者中で癌を防止または阻害することができる。
投薬量は少なくとも1回投与され、巨丸薬(bolus)としてまたは連続投与として供給してもよい。数週間から数カ月間にわたる投薬量の多数回投与が好ましいかもしれない。次の投与は指示された通りに投与することができる。
治療方法においては、癌ペプチドまたはその一部を含むワクチンを有効量で哺乳類に投与し、哺乳類における癌を防止する。特に興味深いのは、メラノーマの防止のためのTRP−1遺伝子のORF3によってコードされる癌ペプチドまたはその一部を含むワクチンである。また特に興味深いのはメラノーマの防止のためのTRP−2遺伝子のフラグメントによってコードされる1以上のペプチドを含むワクチンである。
腫瘍を有する動物における腫瘍の負荷を減少する方法においては、当該方法は腫瘍の負荷の部位に有効量の抗原性癌エピトープを投与することを含み、その量はその部位の腫瘍の大きさを減少するのに有効である。
治療の別の方法では、自己由来の細胞毒性リンパ球または腫瘍浸透リンパ球を癌を有する患者から得ることができる。リンパ球を培養液中で生育させ、特異的癌ペプチドまたは抗原性癌エピトープの単独での、またはサイトカインを有する少なくとも1つの免疫刺激分子と一緒での存在下において培養することによって癌抗原特異的リンパ球を膨張させる。抗原特異的リンパ球を次いで、患者の腫瘍を減少または排除するのに有効な量で患者中に注入して戻す。
免疫化の後に、ワクチンの効率を、特異的溶解活性、特異的サイトカイン産生、腫瘍退行またはこれらの組み合わせによって評価される通り、癌抗原を認識する免疫細胞の産生によって評価することができる。免疫化すべき哺乳類が癌または転移性癌に既に罹患している場合には、ワクチンを、免疫調節剤、例えば、IL−2、IL−6、IL−10、IL−12、IL−15、インターフェロン、腫瘍壊死因子などの他の治療処置、シスプラチナムなどの化学治療剤、ガンシクロビルなどの抗ウイルス剤、アムホテリシンB、抗生物質などと組み合わせて投与することができる。
本発明の別の側面は、正常のタンパク質またはペプチドをコードするオープンリーディングフレームDNA配列以外の遺伝子の代替オープンリーディングフレームDNA配列であって、代替オープンリーディングフレームDNA配列が免疫系のT細胞によって免疫学的に認識される癌ペプチドおよびその一部をコードする、上記DNA配列である。
代替オープンリーディングフレームDNA配列は、TRP−1遺伝子、TRP−2遺伝子、INK4a遺伝子などからのDNA配列を含むが、これらに限定されない。
興味深いのは、メラノーマ形成遺伝子由来の代替オープンリーディングフレームDNA配列である。メラノーマ形成遺伝子は、MART−1/MelanA、チロシナーゼ、gp100、gp75(TRP−1)、TRP−2(Helahan, R他、1993 J. Invest. Dermatol. 100(Suppl.): 176S-185S)などをコードする遺伝子を含むが、これらに限定されない。
本発明の一つの態様は、チロシナーゼ関連タンパク質をコードする遺伝子配列内からの癌ペプチドをコードする代替オープンリーディングフレームDNA配列またはその一部である。TRP−1の遺伝子配列は、Vijayasaradhi, S. 他(1990, J.Exp.Med.171:1375-80)に記載されている通り、アクセッション番号X51455により、そしてCohen, T. 他1990 Nucleic Acids Research, VOL.18:2807に記載されている通り、EMBLアクセッション番号X51420により、EMBLデータバンクに開示されている。
一つの態様において、代替オープンリーディングフレームDNA配列は、腫瘍浸透リンパ球を含む癌抗原特異的Tリンパ球によって認識される癌ペプチドまたはその一部をコードする、配列番号5を有する図2に記載のORF3、その一部および機能的に均等なその配列変異体を含む。図2に記載したORF3に相補的並びに抗相補的な核酸配列も本発明に含まれる。
別の態様において、代替オープンリーディングフレームDNA配列は、
を含む。
本発明の一つの態様は1以上の癌ペプチドをコードするTRP−2の一部である。TRP−2の遺伝子配列は、Yokoyama他(1994)に記載されている通りアクセッション番号D17547そしてBouchard他(1994)に記載されている通りジーンバンクアクッション番号S69231によりジーンバンクに開示されている。
一つの態様において、TRP−2遺伝子フラグメントは、LLGPGRPYRおよび、腫瘍浸透リンパ球を含む癌抗原特異的Tリンパ球によって認識される癌ペプチドについての機能的に均等なその配列変異体をコードする。LLGPGRPYRをコードする配列およびその均等な配列変異体に相補的並びに抗相補的な核酸配列も本発明に含まれる。
別の態様において、TRP−2タンパク質をコードするDNA配列は全てまたはその一部以上を発現する。TRP−2遺伝子の好ましいフラグメントは、ヌクレオチド位置947のPstI部位とヌクレオチド位置1080のKpnI部位の間の領域を含む。
TRP−2遺伝子の別の好ましいフラグメントは、
を含む。
遺伝コードの縮重のため、DNA配列の変形が均等な癌ペプチドの翻訳を生じるであろう。その結果、置換が癌抗原MHC制限T細胞によって認識される癌ペプチドの発現を生じる限り、そのような置換も本発明の範囲内に含まれる。本発明に包含される一つの置換は、SerをコードするTCAのAlaをコードするGCT、GCC、GCAまたはGCGの代わりの置換である。他の哺乳類種からのホモログが本発明の範囲内に含まれる。
TRP−1遺伝子などからのような代替オープンリーディングフレームDNA配列の全部または一部をプローブとして使用して他の哺乳類種の癌ペプチドのホモログを同定および単離することができる。同様に、TRP−2遺伝子の全部または一部をプローブとして使用して他の哺乳類種の癌ペプチドのホモログを同定および単離することができる。一つの態様においては、マウスcDNA配列を使用してヒトホモログ核酸配列の哺乳類cDNAライブラリーをスクリーニングする。陽性クローンを選択して配列決定する。cDNAライブラリーを合成できる組織種類の例としては、真皮、表皮、固体腫瘍、メラノーマ、メラノサイトなどが含まれるがこれらに限定されない。当業者ならばホモログを検出するために使用する好適なハイブリダイゼーション条件を理解するであろう。核酸ハイブリダイゼーション、ライブラリーの構築およびクローニング技術の慣用的方法はSambrook他(eds)(1989)「Molecular Cloning. A Laboratory Manual」Cold Spring Harbor Press, Plainview, New YorkおよびAusubel他(eds)「Current Protocols in Molecular Biology」(1987)、John WileyおよびSons, New York, New Yorkに記載されている。
本発明の別の側面は、癌を有する哺乳類から単離された生物試料中のTRP−1、TRP−2癌ペプチドなどのような癌ペプチドを転写するRNAの検出および定量のための核酸プローブである。対照RNA試料に対するRNAのレベルの変化は哺乳類の疾患の診断および予後において有用である。
一つの態様において、mRNAを癌または前癌を有することが疑われる患者の組織から誘導し、健常な対照被験者由来のmRNAと比較する。対照と比較して、患者中の癌ペプチドをコードする代替オープンリーディングフレームmRNAの定量的および/または定性的増加は患者中の癌または前癌の指標である。mRNAはmRNAにハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドプローブを使用して検出できる。一つの態様において、プローブはTRP−1のORF3の転写産物とハイブリダイズできる。
本発明の別の側面は、癌を有する哺乳類から単離された生物試料中のTRP−2腫瘍抗原を転写するRNAの検出および定量のための核酸プローブである。対照RNA試料に対するRNAのレベルの変化は哺乳類の疾患の診断および予後において有用である。
一つの態様において、TRP−2mRNAを癌または前癌を有することが疑われる患者の組織から誘導し、健常な対照被験者由来のTRP−2mRNAと比較する。対照と比較して、患者中のTRP−2mRNAの定量的および/または定性的増加は患者中の癌または前癌の指標である。mRNAはオリゴヌクレオチドプローブを使用して検出できる。
癌ペプチドまたはその一部をコードする配列に基づくオリゴヌクレオチド対の組み合わせをPCRプライマーとして使用して、選択されたRNA配列を増幅するための逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)法を使用して生物試料中のmRNAを検出することができる。本発明はまた癌ペプチドまたはその一部をコードするDNAおよびRNAの検出のためのin situPCRおよびin situRT−PCRをも包含する。その技術は、標的核酸のコピー数が非常に低い場合、または異なる型の核酸を区別しなければならない場合に好ましい。その方法は正常細胞由来の前癌および癌を検出および識別する際に特に有用である。
本発明は、遺伝子由来の核酸欠失フラグメントの生成を含む抗原特異的T細胞と反応性を有する抗原性癌エピトープを同定する方法を含む。欠失フラグメントを好適なベクター中に置き、これを次いで核酸産物の発現のために宿主細胞中にトランスフェクトまたは形質導入する。場合により、宿主細胞は免疫刺激分子をも発現する場合もある。癌抗原特異的T細胞応答は欠失産物を発現する宿主細胞の存在下で測定される。
宿主細胞が欠失産物のみを発現する場合、免疫刺激分子を、B細胞、マクロファージ、樹枝状細胞などの抗原提示細胞によってあるいは刺激分子でトランスフェクションした細胞によって供給することができる。一つの態様において、免疫刺激分子はMHCクラスI分子である。
このアプローチを使用するマッピングによって、癌ペプチドまたは抗原性癌エピトープをコードする代替オープンリーディングフレームDNA配列を決定する。
癌抗原および抗原性癌エピトープを同定する代替法は、合成ペプチドを作製し、その合成ペプチドで抗原提示細胞をパルスし、そしてペプチドでパルスした抗原提示細胞を抗原特異的T細胞と一緒に添加し、そしてペプチドでパルスした抗原提示細胞の存在下でT細胞の抗原特異的応答を測定することによる。抗原特異的T細胞応答を生じる合成ペプチドは本発明の抗原性癌エピトープを含む。
本発明はまた、癌ペプチドまたは抗原性癌エピトープをコードする代替オープンリーディングフレームDNA配列を含むベクターを包含する。場合により、ベクターは少なくとも1つの免疫刺激分子をコードするDNA配列をも含むことができる。一つの態様において、ベクターはTRP−1遺伝子のORF−3を含む。
本発明はまた、本発明の腫瘍抗原をコードするTRP−2遺伝子およびそのフラグメントを含むベクターを包含する。場合により、ベクターは少なくとも1つの同時免疫刺激分子をコードするDNA配列をも含むことができる。
真核発現ベクターには、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、鶏痘ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヒトパピローマウイルスベクター、馬脳炎ベクター、インフルエンザウイルスベクターなどが含まれるがこれらに限定されない。
本発明は、同一の遺伝子からの正常のタンパク質またはペプチドをコードするために使用されるオープンリーディングフレーム核酸配列以外の遺伝子の代替オープンリーディングフレーム核酸配列によってコードされる癌ペプチドまたはその一部を発現する新規な組み換えウイルスを包含する。別の態様において、本発明は、TRP−2遺伝子またはそのフラグメントまたは変異体の核酸配列によってコードされるTRP−2腫瘍抗原を発現する新規な組み換えウイルスを包含する。組み換えウイルスは少なくとも1つの免疫刺激分子を発現してもよい。組み換えウイルスは、哺乳類、特にヒトの癌を防止または治療する目的のために、哺乳類において細胞仲介免疫応答を引き出すかアップ調節することができる。
組み換えウイルスは、単独または免疫刺激分子をコードする1以上の遺伝子と一緒に、癌ペプチド、その一部、または抗原性癌エピトープをコードする核酸配列をそのゲノムまたはその一部中に取り込んでいる。一つの態様において、組み換えウイルスは、TRP−1癌ペプチドまたはその一部をコードする核酸配列をそのゲノム中に取り込んでいる。別の態様において、組み換えウイルスは、単独または同時免疫刺激分子をコードする1以上の遺伝子と一緒に、TRP−2腫瘍抗原またはその変異体をコードする核酸配列をそのゲノムまたはその一部中に取り込んでいる。組み換えウイルスで感染した宿主細胞は、癌ペプチド、その一部、または抗原性癌エピトープを単独または少なくとも1つの免疫刺激分子と一緒に発現する。
組み換えワクシニアウイルスベクターからの外来遺伝子産物を構築および発現させる方法は、Perkus他Science 229:981-984, 1985、Kaufman他Int.J.Cancer 48:900-907, 1991、Moss Science 252:1662, 1991、SmithおよびMoss BioTechniques Nov/Dec, p.306-312,1984、および米国特許4,738,846号に開示されている。SutterおよびMoss(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:10847-10851, 1992)およびSutter他(Virology 1994)は、本発明でウイルスベクターとして使用できる非複製性組み換えアンカラウイルス(MVA、改変したワクシニアアンカラ)のベクターとしての構築および使用を開示している。BaxbyおよびPaoletti(Vaccine 10:8-9, 1992)は、本発明でウイルスベクターとして使用するための、カナリア痘ウイルス、鶏痘ウイルスおよび他の鳥類種を含む非複製性プロキシウイルス(proxvirus)のベクターとしての構築および使用を開示する。
本発明のベクターは、癌ペプチドまたは抗原性癌エピトープの発現のために好適な宿主細胞中に置くことができる。真核宿主細胞株には、COS細胞、CHO細胞、HeLa細胞、NIH/3T3細胞、昆虫細胞、樹枝状細胞などの抗原提示細胞などが含まれるがこれらに限定されない。場合により、宿主細胞は刺激分子を発現することもできる。宿主細胞が癌ペプチドまたは抗原性癌エピトープを少なくとも1つのMHC分子と一緒に両方発現する場合、真核発現系を使用して適当なグリコシル化を行うことが好ましい。宿主細胞による癌抗原および免疫刺激分子の両方の発現により、特異的T細胞に対して必要なMHC制限ペプチドとT細胞に対する好適なシグナルが供給され、抗原認識と増殖が助けられ、または抗原特異的T細胞のクローン性膨張が助けられる。全体的な結果は免疫系のアップ調節である。免疫応答のアップ調節は、癌または前癌の増殖を殺傷または阻害することができる癌抗原特異的細胞毒性リンパ球の増加によって明白である。
DNAは、当分野で既知の方法によってトランスフェクション、形質導入、リポソームなどによって宿主細胞中に挿入される(Sambrook他、1989、「Molecular Cloning A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor press, Plainview, New York)。リポソームのためには、例えば、ポリカチオン性脂質である、中性リン脂質ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミン(DOPE)と複合化したジミリスチルオキシプロピル−3−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウム(DMRIE)などのカチオン性脂質が好ましく、Nabel, E.G 他, 1992, Hum.Gene.Ther. 3:367-275; Nabel, G.J.他,1992, Hum.Gene Ther.3:649-656; Stewart,M.J. 他, 1992, Hum.Gene Ther.3:399-410; Nabel, G.J. 他 1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:l1307-l1311;およびHarrison, G.S.他 1995 BioTechniques 19:816-823に開示されている通りである。
宿主細胞によって発現された組み換え癌タンパク質、腫瘍抗原または抗原性癌エピトープは、当分野で既知の標準的タンパク質精製法によって細胞ライセートまたは細胞上清から精製することができる。これらには、モレキュラーシーブクロマトグラフイー、イオン交換クロマトグラフィー、等電点フォーカシング、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、HPLC、逆相HPLCなどが含まれるがこれらに限定されない(Ausubel他、1987, Current Protocols in Molecular Biology, John WileyおよびSons, New York, NY)。免疫アフィニティークロマトグラフィーを、免疫アフィニティー試薬として、本明細書に記載した抗癌タンパク質抗体またはその抗原結合フラグメントを使用して精製のために使用することもできる。
組み換えウイルスは治療剤またはワクチンとしても使用できる。そのような使用では、被験者に約105から約1010プラーク形成単位/哺乳類mgの範囲内の組み換えウイルスの投与量を供給することが望ましいが、より低いまたはより高い投与量を投与することもできる。
組み換えウイルスベクターは、メラノーマなどの癌の証拠の前に、またはメラノーマなどの癌に罹患した哺乳類の疾患の退行を仲介するために、哺乳類に導入することができる。ウイルスベクターを哺乳類に投与するための方法の例としては、ex vivoで組み換えウイルスに細胞を露出すること、あるいは罹患した組織中の組み換えウイルスの注入または静脈内、皮下、皮膚内、筋肉内などのウイルス投与が挙げられるがこれらに限定されない。あるいは、組み換えウイルスベクターまたは組み換えウイルスベクターの組み合わせを好適な薬学的に許容可能な担体中で癌性損傷への直接注入または局所投与によって局所的に投与することができる。問題の核酸配列を有する組み換えウイルスベクターの量はウイルス粒子の力価に基づく。免疫化の好ましい範囲は、哺乳類1頭、好ましくはヒト1人当たり約105から1010ウイルス粒子である。
腫瘍拒絶に関与する本発明の癌抗原エピトープは本明細書に具体的に開示されたものに限定されない。本発明で開示した方法を使用して、代替オープンリーディングフレーム産物に含まれる他の癌抗原エピトープを他の腫瘍関連抗原から同定することができ(Van der Bruggen, P. 他1991 Science 254:1643-47; Gaugler, B 他1994 J.Exp.Med. 179:921-30; Boel, P. 他1995 Immunity. 2:167-75; Brichard, V他1993, J.Exp.Med. 178:489-95; Robbins, P.F. 他、1994、Cancer Research 54; 3124-26; Kawakami, Y.他1994, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 91:3515-19; Coulie, P.G.他1994 J.Exp.Med. 180:35-42; Bakker, A.他1994, J. Exp.Med.179:1005-09)、例えばMART−1/MelanA(Kawakami, 他J. Exp.Med.180:347-352, 1994)、MAGE−3(Gaugler他、J. Exp.Med.179:921-930, 1994)、gp100(Kawakami, 他Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 91:6458-6462, 1994)、チロシナーゼ(Brichard他J. Exp.Med.178:489, 1993)、TRP−2、CEA、CA−19−A、CA−125、PSA、erb−2(Boon他、Ann.Rev.Immunol.12:337, 1994)などから同定することができる。
腫瘍保有患者由来の腫瘍浸透リンパ球(TILs)は主要組織適合性複合体(MHC)クラスI分子によって提示される腫瘍関連抗原を認識する。インターロイキン−2(IL−2)と一緒にTIL586を転移性メラノーマを有する自己由来患者に注入すると、主要の客観的退行が生じた。TIL586によって認識された腫瘍抗原をコードする遺伝子は最近単離され、gp75をコードすることが示された。本発明は、正常のgp75タンパク質に由来しない、TIL586によって認識された、抗原ペプチド、MSLQRQFLR(配列番号9)の同定と単離である。代わりに、この9量体ペプチドが同一遺伝子の代替オープンリーディングフレームの翻訳から生じた。即ち、gp75遺伝子は2種の完全に異なるポリペプチド、即ち、癌を有する患者からの血清中のIgG抗体によって認識される抗原としてのgp75と、T細胞によって認識される腫瘍拒絶抗原としての24アミノ酸産物とをコードする。これは、ヒト腫瘍拒絶抗原が正常のタンパク質をコードするために使用されるもの以外のオープンリーディングフレームを使用して正常の細胞遺伝子から生成できることの最初の実証を意味する。これらの知見は、癌に対する腫瘍特異的細胞仲介免疫を誘導するためのワクチンとして有用である、腫瘍抗原を生成するための新規な機構を明らかにした。
ExoIII/S1欠失分析の方法は癌エピトープをgp75遺伝子の小さいDNAフラグメントに位置付けた。癌エピトープは正常のgp75タンパク質に不在であった。TIL586によって認識された本発明の癌ペプチドは、正常のgp75タンパク質をコードする同一の遺伝子の代替オープンリーディングフレームから翻訳された遺伝子産物から誘導された。ヌクレオチド294−296のATGをATCで置換するとTIL586からのサイトカイン放出を刺激する能力の完全な損失が生じた。コールド標的阻害実験は、同定された癌エピトープが腫瘍細胞上に存在する天然でプロセスされたペプチドによってT細胞認識を競合できることを示した。TIL586細胞株から作製した6個のT細胞クローンは、586mel腫瘍細胞、このペプチドでパルスした586EBV B細胞、および正常メラノサイトをHLA−A31制限様式で認識することができ、また代替オープンリーディングフレームによってコードされた遺伝子産物が腫瘍細胞並びに正常メラノサイト中に存在するかもしれないことも示唆される。
本発明はまた、TIL586によって認識される腫瘍抗原をコードしTRP−2をコードすることを示した遺伝子に関する。本発明はまた、TRP−2に由来し、癌ワクチンとして活性である抗原性ペプチドLLGPGRPYRの同定および単離に関する。
本発明は、癌ペプチドまたはその一部をコードする代替オープンリーディングフレームDNA配列の1以上のコピーをそのゲノム中に取り込んでいるトランスジェニック動物を提供する。本発明はまた、TRP−2腫瘍抗原またはその一部をコードするDNA配列の1以上のコピーをそのゲノム中に取り込んでいるトランスジェニック動物を提供する。トランスジェニック動物の一般的な作製方法は、Krimpenfort他、米国特許5,175,384、Leder他、米国特許5,175,383、Wagner他、米国特許5,175,385、Evans他、米国特許4,870,009およびBerns米国特許5,174,986に記載されている。遺伝子の取り込みは、癌ペプチドの多重形態または変異体の過剰発現、変化した発現または発現を生じる。得られたトランスジェニック動物は本発明の癌または腫瘍抗原の発達の研究で有用である。動物モデルは癌治療のためのワクチンおよび化学療法剤のスクリーニングで有用である。トランスジェニック動物はまた癌の発達の研究でも有用である。
本発明はさらに、本発明の癌ペプチドまたは抗原性癌エピトープの免疫化によって引き出された抗体またはその抗原結合部分を含む。癌ペプチドまたは抗原性癌エピトープが数個のアミノ酸のみから成る場合、癌ペプチドまたは抗原性癌エピトープは、抗体反応を引き出すために担体タンパク質と結合させることができる。KLHまたは破傷風毒素などの担体タンパク質および結合の方法は当分野で公知である。抗体は本発明の癌ペプチドおよび抗原性癌エピトープに対する特異性を有し、それと反応または結合する。
例示的な抗体分子は、完全な免疫グロブリン分子、実質的に完全な免疫グロブリン分子または抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子のこれらの一部分であり、F(ab)、F(ab’)、F(ab’)2、ヒト化キメラ抗体、およびF(v)として当分野で公知の免疫グロブリン分子の一部が含まれる。ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は当分野で既知の方法によって作製できる(KohlerおよびMilstein(1975)Nature 256, 495-497; Campbell「Monoclonal Antibody Technology, the Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas」in Burdon他(eds.)(1985)、「Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology」第13巻、Elsevier Science Publishers, アムステルダム)。抗体または抗原結合フラグメントは遺伝子工学によって作製することもできる。重鎖および軽鎖の両方の発現のための技術はPCT特許出願、公開番号WO901443、WO9014424、Huse他(1989)Science 246:1275-1281、及び米国特許4,946,778の主題である。
一つの態様において、本発明の抗体を免疫分析で使用して、生物試料中のTRP−1ペプチドおよびTRP−2腫瘍抗原またはその一部を含む癌ペプチドを検出する。抗体またはその抗原結合フラグメントを使用して癌に罹患した哺乳類からの組織バイオプシー試料中の癌ペプチドを検出できる。疾患組織中の癌抗原の評価を使用して哺乳類における疾患の進行を予測したり、治療の効果を診断できる場合がある。免疫分析は放射免疫分析、ウエスタンブロット分析、免疫蛍光分析、酵素免疫分析、ケミルミネッセント分析、免疫組織化学分析などが可能であり、インビトロ、インビボまたはin situで行うことができる。ELISAに関する当分野で公知の標準技術は、「Methods in Immunodiagnosis」第2版、RoseおよびBigazzi eds. John Wiley & Sons, 1980; Campbell他「Methods and Immunology」、W.A. Benjamin,社、1964; およびOellerich, M.1984, J.Clin.Chem.Clin.Biochem. 22:895-904に記載されている。免疫組織化学のための慣用法はHarlowおよびLane(eds)(1988)、「Antibodies A Laboratory Manual」Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York; Ausbel他(eds)1987「Current Protocols in Molecular Biology」、John WileyおよびSons(New York, NY)に記載されている。そのような検出分析のために適当な生物試料は、細胞、組織バイオプシー、全血、血漿、血清、たん、脳髄液、胸膜液、尿などが含まれるがこれらに限定されない。
本発明の抗体および抗原結合フラグメントは免疫治療でも使用できる。抗体またはその抗原結合フラグメントは、癌の症状の度合い、範囲または持続期間を防止、減少または減衰させるのに十分な量で哺乳類に提供される。
引用された全ての文献および特許は引用により本明細書中に取り込まれる。
本発明を一定の特定の態様に関して上記で説明してきたが、多くの変形が可能であること、並びに代替の物質および試薬を本発明から離れることなく使用できることが理解される。ある場合には、そのような変形および置き換えは若干の実験を必要とするかもしれないが、通常の試験を含むだけである。
特定の態様の上記の記載は本発明の一般的性質を十分に明らかにし、他者は、現在の知識を適用することによって、一般的概念から離れることなくそのような特定の態様を各種の応用のために容易に改良および/または採択でき、従ってそのような採択および改良は開示した態様の意味および均等の範囲の中に含まれることが意図される。
実施例1
材料と方法
化学薬品と試薬
下記化学薬品と試薬は表示供給源から購入した:RPMI 1640,AIM−V培地,Lipofectamine,G418(GIBCO BRL,Garithersberg,MD);真核細胞発現ベクターpCR3(Invitrogen,San Diego,CA);抗−HLA−A31モノクローナル抗体(One lamda,Canoga Park,CA);フルオレセインイソチオシアネートとコンジュゲートした抗−免疫グロブリン M抗体(Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,CA)。
細胞傷害性Tリンパ球(CTL)と細胞系統
TIL586を、転移性メラノーマを有する患者の腫瘍標本から単離し、IL−2(6000IU/ml)(Chiron)を含有する培地中で32〜60日間、既述されたように増殖させた(Topalian,S.,D.Solomon,F.P.Avis,A.E.Chang,D.L.Freeksen,W.M.Linehan,M.T.lotze,C.N.Robertson,C.A.Seipp,P.Simon,C.G.Simpson及びS.A.Rosenberg,1988,J.Clin.Oncol.6:839〜53)。TIL586は主としてCD8+T細胞であった。TIL1200はTIL586に関して述べた条件と同じ条件下で増殖させた。T細胞クローンはTIL586細胞系統から限界希釈法によって得て、次に、6000IU/mlのIL−2を含有するAIM−V培地中で膨張させた(expanded)。
メラノーマ細胞系統397mel,397mel/A31,586mel,624mel及びEBV形質転換B細胞系統586EBVと1510EBVをこの実験室で確立して、10%ウシ胎児血清(FCS)を含有するRPMI 1640培地中で培養した。幼児***(infant foreskin)に由来する正常培養メラノサイト(Clonetics,CAから購入したNHEM680)はメラノサイト増殖培地(MGM;Clonetics,CA)中で培養した。COS7細胞系統はW.Leonard博士(NIH)から提供された。
GM−CSF分泌アッセイ
DNAトランスフェクションとGM−CSF分析は既述されたようにおこなった(Wang,R.F.,P.F.Robbins,Y.Kawakami,X.Q.Kang及びS.A.Rosenberg,1995,J.Exp.Med.181:799〜804)。簡単には、異なるフラグメントを含有するDNA 200μgとHLA−A31 DNA 50ngとを100μlのDMEM中の200μlのリポフェクタミンと15〜45分間混合した。DNA/リポフェクタミン混合物を次にCOS−7(5x104)細胞に加えて、一晩インキュベートした。翌日、細胞をDMEM培地によって2回洗浄した。TIL586を120 IU/mlのIL−2を含有するAIM−V培地中に1x105細胞/穴の濃度で加えた。18〜24時間のインキュベーション後に、100μlの上澄み液を回収し、GM−CSFを標準ELISAアッセイ(R+D Systems,Minneapolis,MN)で測定した。ペプチドに関しては、586EBV、1510EBV及びT2細胞を37℃においてペプチドと共に90分間インキュベートしてから、120 IU/mlのIL−2を含有するAIM−V培地によって3回洗浄した。TIL586を加え、さらに18〜24時間インキュベートし、100μlの上澄み液をGM−CSFアッセイのために回収した。
ExoIII/SI欠失構築とPCRフラグメント
一連の欠失を作製するために、poDNA776プラスミドDNAをXbaIによって消化させ、α−ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチド三リン酸によって充填し、ExoIIIヌクレアーゼ消化をブロックした。pcDNA776プラスミドは2.4kb DNAフラグメントと、転写を導くためのCMVプロモーターとを含有するpcDNA3ベクターの誘導体である。直鎖状(linearized)DNAを第2の制限酵素XhoI消化にさらして、ExoIIIに感受性の1末端を形成した。ExoIIIヌクレアーゼ/Mung Beanヌクレアーゼ欠失は製造者の指示(Stratagene,CA)に従っておこなった。詳細なプロトコールは次の通りである:
1.10μgのDNAをXbaIによって消化させて、αホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチドによって充填した。
2.DNAを第2酵素XhoIによって消化させた後に、フェノール抽出及びエタノール沈降をおこなった。
3.DNAペレットを乾燥させ、125μlの2X Exo緩衝剤、25μlの100mM β−メルカプトエタノール、100μlの水中に懸濁させた。
4.全てのアリコートが取り出されて、ドライアイス上に置かれた時点で、チューブを68℃で15分間加熱してから、氷上に置いた。
5.15UのMung Beanヌクレアーゼを各時点のチューブに(1X Mung Bean希釈緩衝剤によって予め希釈して)加えて、30℃において30分間インキュベートした。
6.下記を加えた:
4μlの20%SDS
10μlの1M Tris−HCl,pH9.5
20μlの8M LiCl
250μlの緩衝剤平衡化フェノール:クロロホルム
7.サンプルをボルテックスし、マイクロフュージ中で1分間回転させ、上部水層を取り出して、クロロホルムで抽出して、Mung Beanタンパク質をDNAから抽出した。
8.25μlの3M NaOAc(pH7.0)を水相に加えた。10ng/μlの最終濃度までのtRNAを沈降のためのキャリヤーとして用いた。
9.650μlの冷エタノールを加えた。サンプルをドライアイス上で10分間急冷して、マイクロフュージ中で20分間回転させた。
10.上澄み液を排出して、ペレットを80%エタノールによって洗浄した。
11.ペレットを乾燥させた。
12.DNAペレットを15μlの10mMTris−Cl(pH7.5)、0.1mM EDTA中に再溶解した。
B.ライゲーション
13.DNA欠失を下記条件を用いてライゲートした。
1.0μlのExo/Mung処理DNA
2.0μlの10Xライゲーション緩衝剤
500mM Tris−Cl,pH7.5
70mM MgCl2
10mM DTT
2.0μlの5mM ATP,pH7.0〜7.5
2.0μlのT4 DNAリガーゼ(Cat#600011;キットとして提供)
13.0μlのH2O
20.0μlの総反応容量
室温においてインキュベート
インサートをベクターにライゲートするためのDNAライゲーションキット(Cat#203003)をStratageneが提供。
14.残留する14.0μlのExo/Mung処理DNAのうちの7μlをゲル電気泳動分析に用いた。
15.1μlのライゲーション反応を用いて、100μlのEpicurian coli RecA−JM109又はXLI−Blue細胞を形質転換させ、LB/AMPプレート上にプレートした。
C.低融点アガロース方法
欠失体のスクリーニングを最少にするために、欠失の一部を低融点アガロース中で泳動し、問題のバンドを切り取り、ライゲーションを続けた。ライゲーション反応において、アガロース濃度は0.5%未満に維持した。
PCR反応を94℃において2分間おこなった後に、94℃で1分間、55℃で45秒間そして72℃で1分間の25サイクルを続けた。プライマーgpN(5’AGAATGAGTGCTCCTAAACTCCTCTCTCTGGG)(配列番号:42)とgp11B(5’CATGTGAGAAAAGCTGGTCCCTCA)(配列番号:43)とを用いて、DNAフラグメント(1〜667)を生成し、次にpCR3発現ベクター中にクローン化して、pPCR110を作製した。プラスミドpPCR210とpPCR220とは、それぞれ、プライマーgp−1(5’TGGATATGGCAAAGCGC ACAACTC)(配列番号:44)とgp11B,gp−1及びgp22(5’TAAATGGAA ATGTTCTCAAATTGT GGCGTG)(配列番号:45)とを用いて増幅させたDNA挿入フラグメントを含有するpCR3ベクターであった。
細胞傷害性溶菌アッセイ
溶菌アッセイを既述されたようにおこなった(Kawakami,Y等,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:6458〜62)。簡単には、ターゲット細胞をクロムによって90分間標識した。3回洗浄した後に、細胞を1μg/mlの濃度のペプチドと共に90分間インキュベートした。細胞を再び洗浄し、カウントし、次にTIL586とエフェクター:ターゲット(E:T)の指定比率で混合した。4時間のインキュベーション後に、クロム放出を測定した。ペプチドはペプチドシンセサイザー(Model AMS422,Gilson Co.社,Worthington,OH)を用いて固相法によって合成した。一部のペプチドはHPLCによって精製され、98%を越える純度を有した。TIL586によって認識されるORF3Pペプチドの滴定のために、586EBV B細胞を種々な濃度の精製ORF3Pペプチドと共にインキュベートした。特異的溶菌(specific lysis)の%を式:(A−B)/(C−B)x100[式中、Aはペプチドの存在下でのTIL586による586EBV B細胞の溶菌であり、Bは同じペプチドの存在下、但し、エフェクター細胞の不存在下での586EBV B細胞からの自然放出(spontaneous release)であり、Cは最大クロム放出である]から算出した。細胞溶解のコールドターゲット阻害は“ホット”ターゲットとして51Cr標識586mel又は624melを、“コールド”ターゲットとして、ペプチドをパルスされた(pulsed)586EBV B及びT2細胞を用いておこなった。
部位特異的突然変異誘発
部位特異的突然変異を構築するために、変異したプライマーGPMUTI、(5’GCCATGGGCAGAGATGATCGGGAGGTCTGGCCCTTGCGCTTCTTCAATAGGACATCTCACTGCAAC)(配列番号:11)とGPA1とを用いて、ヌクレオチド296に変異(GからCへ)を含有するPCRフラグメントを生成した。野生型DNAフラグメントをプライマーGPF1(5’GAAGATCTGCCATGGGCAGAGATGATCGGGAGG TCTG)(配列番号:12)、GPE1(5’GAATTCGTTG TGT CCTGAGAAATTGCCGTTG)(配列番号:13)、GPE2(5’GA ATTCGACTATGAGAACCCTCTGGTCACAGGC)(配列番号:14)及びGPA1(5’AAGATCTGGGCC CGGACAAAGTGGTTCTTTTC)(配列番号:15)を図3Aにおける矢印頭によって指示されるように用いることによって増幅させた。精製PCR生成物を次にpCR3発現ベクター中にクローン化した。PCRフラグメントを含有する全てのプラスミドを配列決定して、方向とヌクレオチド配列とを確認した。
実施例2
TIL586によって認識される抗原ペプチドの局在化
gp75から抗原性エピトープを同定するために、ExoIII/S1ヌクレアーゼを用いて3’末端からgp75遺伝子の一連のネストされた欠失(nested deletions)を生成し、さらに、PCR増幅によってgp75から付加的なDNAフラグメントを生成した(図1A)。欠失研究のための出発物質としてpcDNA776を選択した理由は、このクローンが最初にライブラリースクリーニングによって同定され、TIL586からのサイトカイン放出を刺激する能力を与えたからである。プラスミドpcDNA776はAmerican Type Culture Collection(12301 Parklawn Drive,Rockville,MD)にBudapest Treatyに従って1996年1月19日に寄託され、受託番号ATCC97423を与えられた。この研究の目的はTIL586によって認識されるエピトープを同定することであるので、比較的小さいDNAフラグメント中のエピトープを迅速に局在化することができるように、できるかぎり短いフラグメント(全長cDNAの代わりの、切頭型のgp75)が用いられた。次に、これらの欠失構築体をHLA−A31遺伝子を含有するpBK−CMVプラスミドと共にCOS−7細胞中にトランスフェクトした(transfected)(Wang,R.F.等,J.Exp.Med.181:799〜804)。24時間後に、トランスフェクトされたCOS−7細胞を検査して、どの構築体がTIL586によるサイトカイン放出を刺激することができるのかを判定した。正常gp75開始コドンを欠いた、ヌクレオチド247から771までの範囲の小さい切頭DNAフラグメントはTIL586によるGM−CSF放出を刺激する能力を有し、このことはTIL586によって認識されるエピトープが247から771までのヌクレオチドを含有するDNAフラグメント中に位置付けされることを示唆する。ヌクレオチド445〜447に位置付けされたKozak配列(GATATGG)(配列番号:16)に比較的良好に関係して、gp75オープンリーディングフレームと同じフレーム内にATG開始コドンが存在するので、TIL586によって認識されるエピトープがヌクレオチド445から771までの範囲内に位置付けされると推理された。それ故、pPCR210とpPCR220とを構築したが、これらはpCR3発現ベクターの誘導体であり、切頭正常gp75タンパク質の翻訳のための開始コドンとして445bpに位置付けされたgp75(GATATGG)(配列番号:16)を有するフレーム中に内部ATGコドンを含有した。しかし、pPCR210又はpPCR220のいずれも、HLA−A31遺伝子とのCOS−7の同時トランスフェクション後に(図1B)TIL586からのサイトカイン分泌を刺激する能力を与えず、このことはこのエピトープがこれらのフラグメントの上流に局在することを示唆した。それ故、さらに別のプラスミドpD776Aを構築したが、これは247から442までのヌクレオチド配列を含有し、gp75と同じフレーム中にATGコドンを有さなかったが、gp75とは異なるオープンリーディングフレーム中に2個のATGコドンを含有した。このプラスミドは、A31cDNAと共にCOS−7細胞中に同時トランスフェクトしたときにTIL586からのサイトカイン放出を強度に刺激した。gp75の真正の開始コドンを含有するプラスミドpPCR110は、HLA−A31遺伝子と共に同時トランスフェクトしたときに(図1B)、pDel5又はpD776Aよりも数倍低いサイトカイン放出を刺激した。これらの結果は、TIL586によって認識されるエピトープ(単数又は複数)がヌクレオチド247〜442の領域に位置付けされることを示唆した。
この領域(ヌクレオチド247〜442)は正常gp75オープンリーディングフレーム中にATG開始コドンを有さなかったが、例えばACG、CTG及びGTGのような非ATGコドンからの翻訳開始が幾つかの場合に報告されている(Hann,S.R.,1994,Biochimie 76:880〜86;Muralidhar,S.等,J.Virol.1994,68:170〜76)。この領域のエピトープを同定するために、HLA−A31のペプチド結合モチーフ(binding motif)(位置2における疎水性残基とC末端における正に荷電した残基)に基づいて合成ペプチドを作製した(図2)(Falk,K等,Immunogenetics 1994,40:238〜41)。この研究のために選択されたペプチドの大部分はノナマー(nonamer)であったが、一部は10マー及び11マーであった。これらのペプチドを586EBV B細胞上にパルスさせて、TIL586によるサイトカイン放出を刺激するこれらの細胞の能力を調べた(表1)。1つのペプチド、AACDQRVLIVRR(配列番号:25)はTIL586からのGM−CSF放出を非常に弱く誘導した。しかし、このペプチドはTIL586による溶菌に関してペプチド負荷586EBV Bを感作させることができなかった(表1)。
586EBV細胞は1μg/mlの濃度の個々のペプチドと共に90分間インキュベートした。GM−CSF放出はTIL586とのペプチド負荷586EBV細胞の同時インキュベーション後に測定した。刺激物質なしのTIL586のみによるGM−CSF分泌を控除した。586EBVはHLA−A−31を発現するEBV形質転換済みB細胞系統であった。TIL586による、ペプチドパルスされた586EBVの細胞傷害性溶菌を4時間クロム放出アッセイにおいておこなった。
このペプチドは、高濃度(>1μg/ml)で586EBV B細胞をインキュベートしたときにのみTIL586からのサイトカイン放出を弱く刺激し、10μg/mlのペプチド濃度においてもターゲット細胞をTIL586による溶菌に関して感作しなかった(データ示さず)ので、このペプチドはTIL586によって認識される主要なT細胞エピトープに相当する可能性はなかった。
この主要なT細胞エピトープを含有する領域をさらに定義するために、それぞれ、プライマーGPF1と、GPE1及びGPE2とによって増幅されたPCRフラグメントを含有する、さらに2種類のプラスミドを構築した(図3A)。図3Bに示すように、小さいPCRフラグメントの始点にATG開始コドンを含有する両プラスミドは、HLA−A31に関連したTIL586によるサイトカイン放出を刺激する能力を与え、このことはT細胞によって認識されるエピトープがgp75cDNAの塩基247から329までの82ヌクレオチド配列内でコードされることを示唆した。ORF1中の28のオーバーラップペプチド(overlapping peptides)(9マー又は10マー)をこの領域中のgp75のアミノ酸配列に基づいて合成したが、いずれもGM−CSF放出を刺激しないか、又は586EBV B細胞をTIL586による溶菌に関して感作しないことが判明した(データ示さず)。
実施例3
gp75遺伝子の代替オープンリーディングフレームの翻訳から生じる抗原性ペプチド
この小領域においてTIL586によって認識されるエピトープを同定できないことは、代替オープンリーディングフレームが翻訳されうることを示唆した。比較的良好に関連した2種類のATGコドンが、gp75オープンリーディングフレーム(ORF1)とは異なるオープンリーディングフレーム中のこの領域(ヌクレオチド247〜442)に存在した(図2)。最初のATG(251GAGATGA257)(配列番号:29)からの翻訳は45アミノ酸をコードするオープンリーディングフレーム(ORF2)を生じたが、ヌクレオチド294〜296間に位置付けられたATG(GACATGT)(配列番号:30)から出発した翻訳は24アミノ酸遺伝子産物(ORF3)を生成した(図2)。ORF2に由来する3ペプチドとORF3に由来する2ペプチドを選択して、HLA−A31結合モチーフに基づいて合成した(表2と図2)。意外にも、ORF3に由来する1つのペプチドMSLQRQFLR(配列番号:9)(ORF3Pと表示)は、586EBV B細胞にパルスされたときに、TIL586によって強度に認識された(表2)。TIL586によるORF3ペプチド(MSLQRQFLR)(配列番号:9)の認識は、このペプチドが自己由来586EBV B細胞及び1510EBV B(A31+)細胞上にパルスされたときにのみ観察されたが、ペプチドがT2(非HLA−A31)細胞上に負荷したときには観察されず、このことはTIL586によるこのペプチドの認識がHLA−A31制限されることを示唆した。ORF3Pのペプチド質量(peptide mass)は質量分光測定分析によって確認された。図4Bに示すように、TIL586はORF3Pペプチドをパルスされた586EBV B細胞を溶菌したが、HLA−A31のペプチド結合モチーフの基準を満たすがTIL586によって認識されない関連のないペプチドをパルスされた586EBV B細胞、又はORF3PペプチドをパルスされたT2細胞を溶菌することができなかった。ペプチドによる溶菌に関する感作は100nMにおいて最大効果を示したが、1nMのペプチド濃度においても溶菌活性は検出された(図4C)。TIL586はペプチドMSLQRQFLRT(配列番号:33)若しくはSLQRQFLRT(配列番号:34)のいずれも認識せず、MSLQRQFLR(配列番号:9)に由来する修飾ペプチド(位置2、6及び9におけるアンカー残基の置換)MLLQRQFLR(配列番号:36)、MRLQRQFLR(配列番号:37)、MSLQRLFLR(配列番号:38)、MSLQRQFLE(配列番号:39)、MSLQRQFLK(配列番号:40)も認識しなかった(表2)。TIL586は、ペプチドMSLQRQFLR(配列番号:9)に比べて位置2におけるAlaによるSer置換を有するペプチドMALQRQFLR(配列番号:35)のみを認識した(表2)。
586EBV B細胞によるペプチドインキュベーションとGM−CSF放出アッセイとの条件は、表1に述べた条件と同じであった。刺激物質なしのTIL586のみによるGM−CSF分泌を控除した。修飾ペプチドはMSLQRQFLR(配列番号:9)に対する位置2、6及び9におけるアミノ酸置換によって作製した。TIL586による、ペプチドパルスされた586EBVの細胞傷害性溶菌を4時間クロム放出アッセイにおいておこなった。
実施例3
自然プロセス抗原性ペプチド生成のために翻訳が必要である
ORF3のATG開始コドン(294〜296)の上流の6ヌクレオチド中に位置付けられた停止コドンTAG(288〜296)が存在した(図2)ので、ORF3Pペプチドがフレームシフト(frameshift)から生じたとは思われなかった。DNA配列分析も、この上流領域に欠失又は挿入が存在しないことを確認した。ヌクレオチド294〜296に位置付けられたATGが24アミノ酸産物の翻訳に重要な役割りを果たすかどうかを調べるために、ATGT(294〜297)からATCTへ変異させて(294〜297)、ORF1(gp75)におけるCys(UGU)からSer(UCU)への変化を生じると考えられる、ORF3の翻訳を排除した(図3A)。変異した遺伝子を含有するプラスミド(pGFMUT1)を、COS−7中にHLA−A31cDNAと共に同時トランスフェクトしたときにTIL586による認識を生じるその能力に関して試験した。図3Bは、変異した遺伝子が、野生型遺伝子を含有する構築体に比べて、TIL586によるGM−CSF放出を刺激する能力を完全に失ったことを実証した。この観察は、ヌクレオチド位置294〜296におけるORF3中のATGが24アミノ酸産物の翻訳のために必要であるので、TIL586によって認識されるT細胞エピトープの生成のために重要であることを意味した。
Met(ATG)はペプチドエピトープの位置1に存在し、ヌクレオチド294〜296におけるATGからATCへの変異はペプチドの位置1におけるMetからIleへの変化を生じたので、TIL586が変異した遺伝子を認識しないことは変異したペプチドがMHCクラスI分子に結合する能力を失ったことによると考えられる可能性を研究した。変異した遺伝子によってコードされる配列と同じアミノ酸配列を有する合成ペプチド(ISLQRQFLR)(配列番号:41)を作製して、TIL586による認識に関して検査した。合成変異ペプチドが野生型ペプチドに匹敵する濃度においてTIL586によってまだ認識されることが判明した。さらに、同じ変異を全長cDNA中に導入した場合には、TIL586に対する反応性が観察されなかったが、野生型cDNAはpPCR110と同様なレベルにおいてTIL586からのサイトカイン放出を刺激することができた。このことは欠失データと一致し、TIL586が遺伝子の他の領域におけるペプチド(単数又は複数)を認識しなかったことを意味した。これらの結果は、T細胞が変異遺伝子(ヌクレオチド294〜296におけるATGからATCへ)を認識しないことはORF3の翻訳開始の不活化によるものであると示唆した。
実施例4
腫瘍細胞並びにメラノサイト上の抗原性ペプチドの認識
腫瘍細胞上のORF3Pペプチドと同様な又は同じである自然プロセス(naturally processed)ペプチドをTIL586が認識するかどうかという問題に対処するために、ORF3Pペプチドをパルスされた586EBV B細胞がコールドターゲット阻害アッセイにおいて51Cr標識586melの溶菌を阻害する能力を検査した。51Cr標識586melの溶菌の顕著な阻害が、ORF3Pペプチドをパルスされた586EBV B細胞によって観察されたが、関連のないペプチドをパルスされた586EBV B細胞又はORF3PペプチドをパルスされたT2細胞によっては観察されず(図5A)、このことは、このペプチドエピトープがT細胞認識に関して腫瘍細胞上の自然プロセスペプチドと競合しうることを意味した。予想されたように、ORF3P負荷586EBV B細胞はTIL1200によるターゲット624melの溶菌を阻害せず、TIL1200は、586EBV B単独に比べて、HLA−A2に関連してgp100抗原を認識する(図5B)。T細胞クローンがORF3Pペプチドをパルスされた586EBV B細胞と腫瘍細胞系統の両方を認識することができるかどうかをさらに試験するために、T細胞クローンを限界希釈(96穴丸底マイクロプレートにおいて1細胞/穴)によってTIL586細胞系統から生成し、培養においてさらに膨張させた。T細胞クローンは限界希釈(1細胞/穴)によってTIL586細胞系統から生成した。T細胞クローンを6000IU/mlのIL−2を含有するAIM−V培地においてさらに膨張させた。培養においてさらに膨張させた。586EBV B細胞をORF3Pペプチド又は関連のないペプチドによって37℃において90分間パルスした。3回洗浄した後に、T細胞クローン又はTIL586細胞を加えて、さらに18〜24時間同時インキュベートした。586melと、397mel/A31+腫瘍と、メラノサイトNHEM680細胞とに関しては、1x105細胞/穴を、それぞれ、T細胞クローン、TIL586−C1(図6A)、TIL586−C4(図6B)及びTIL586−C6(図6C)又はTIL586(図6D)に対して1x105細胞で18〜24時間インキュベートした。GM−CSFアッセイを図1Bに示すようにおこなった。6種類のT細胞クローンは586mel腫瘍細胞と、ORF3Pペプチドをパルスされた586EBV B細胞と、HLA−A31陽性(positive)メラノサイトとを認識することができたが、397mel/A31又は586EBV B細胞単独を認識することができなかった。典型的なデータを図6A〜6Dに示す。これらの結果は、T細胞クローンが恐らく腫瘍細胞及び正常メラノサイト上のORF3Pペプチドと同様な又は同じの自然プロセスペプチドを認識することを示唆した。
チロシナーゼ、gp100及びTRP−2に対するgp75の40〜45%アミノ酸配列同一性が存在するので、T細胞クローンによって認識されるペプチドがgp75に由来するのではなく、これらの他のタンパク質のいずれかに由来する可能性を試験した。COS−7細胞をHLA−A31に加えたチロシナーゼ、gp100又はTRP−2cDNAsによって、それぞれトランスフェクトして、いずれも6種類のTクローンによって認識されることができないが、HLA−A31とgp75cDNAとによってトランスフェクトされたCOS−7は、これらのクローンからのGM−CSF放出を刺激することを発見した(データ示さず)。コンピューターのデータベースサーチも、データベース中のチロシナーゼ、gp100及びTRP−2を含めた既知タンパク質がHLA−A31のペプチド結合モチーフを有するアミノ酸配列と、TIL586によって認識されるペプチドエピトープとの顕著な類似性とを含有しないことを示した。
実施例5
In vivo保護アッセイ
in vivo保護試験のために、MHL−A31+トランスジェニックマウスを、104Trp−1+B16マウスメラノーマ細胞による皮下チャレンジ又は5x105Trp−2+B16マウスメラノーマ細胞による静脈内チャレンジの前に、0日目と14日目に0、1pg、1ng、1μg、1mg又は100mgの癌ペプチド(配列番号:9)によって静脈内で免疫感作させる。腫瘍細胞を皮下に受容したマウスを腫瘍発生に関して週2回観察して、サイズを測定する。腫瘍細胞を静脈内に受容したマウスを12日目に安楽死させ、肺転移の数をHoughton,A.N.1994,J.Exp.Med.180:1〜40によって述べられているように測定する。
実施例6
In vivo処置アッセイ
in vivo処置に関しては、肺転移を確立するために、MHL−A31+トランスジェニックマウスを、1x105又は5x105Trp−1+B16マウスメラノーマ細胞によって静脈内チャレンジする。続いて、マウスに105PFU/mg体重で癌ペプチド(配列番号:9)を発現する組換えウイルスを予防接種する。マウスを12日目に安楽死させ、予防接種したマウス対非予防接種マウスの肺転移の数を測定する。
実施例7
癌抗原特異的Tリンパ球
免疫療法
メラノーマ抗原に対して予感作されたTリンパ球は、メラノーマに罹患した哺乳動物の治療処置に有効であると考えられる。Tリンパ球を末梢血又はメラノーマ懸濁液から単離して、in vitro培養した(Kawakami,Y.等,1988,J.Exp.Med.168:2183〜2191)。
Tリンパ球を癌ペプチド(配列番号:9)に1μg/mlの濃度において単独で又はIL−2の存在下で暴露させ、再感作させ、培養で膨張させる。癌ペプチドに暴露させたTリンパ球を哺乳動物に約109〜1012リンパ球/動物で投与する。これらのリンパ球は静脈内、腹腔内又は病巣内に投与する。この処置は例えばサイトカイン、メラノーマの手術切除及び化学治療薬のような、他の治療処置と同時に投与することができる。
実施例8
転移性メラノーマを有する患者の処置
このプロトコールでは、進行したメラノーマを有する患者を抗原性癌エピトープによって免疫感作させる。
このトライアルに適した患者は、標準的な有効療法を失敗した、測定可能な又は評価可能な転移性メラノーマの徴候を有さなければならない。患者は、腫瘍細胞RNAのPCR又はノーザンブロット分析によって実証されるような、TPI−1抗原を発現する腫瘍を有さなければならない。
患者は1ng、1μg、1mg又は500mg/kg体重の癌ペプチド(配列番号:6)を0日目、7日目及び14日目に単独で又はIL−2及び/又は免疫刺激性分子と組合せて受容する。患者を毒性、免疫学的効果及び治療効力に関して評価する。
処置した患者から採取したリンパ球をアミノ酸配列MSLQRQFLR(配列番号:6)を含む癌抗原に対する特異的反応に関して検査する。
完全な反応は、少なくとも4週間持続する、疾患のあらゆる臨床徴候の完全な消失として定義される。部分的反応(partial response)は、新たな病巣の出現がないか又は病巣の増大のない、全ての測定可能な病巣の垂直直径の積(product)の全体として、少なくとも4週間にわたる50%以上の減少である。軽度反応は、新たな病巣の出現がない又は病巣の増大のない、全ての測定可能な病巣の垂直直径の積の全体として25〜49%の減少として定義される。部分的反応未満を有する患者は不反応者と見なされる。部分的反応又は完全反応後の、新しい病巣の出現又は先行病巣の垂直直径の積の25%を越える増加は再発と見なされる。
実施例9
TRP−2のための材料と方法
化学薬品と試薬
下記化学薬品と試薬は指定供給源から購入した:RPMI 1640,AIM−V培地,Lipofectamine,G418(GIBCO BRL,Gaithersberg,MD);真核細胞発現ベクターpCR3(Invitrogen,San Diego,CA);抗−HLA−A31モノクローナル抗体(One lamda,Canoga Park,CA);フルオレセインイソチオシアネートとコンジュゲートした抗−免疫グロブリン M抗体(Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,CA)。
T細胞クローンと系統
T細胞クローンは、TIL586細胞系統から限界希釈法(1細胞/穴)によって、10%ヒトAB血清と500IU IL−2とを含有するRPMI 1640中で支持細胞として同種PBL(1x103細胞/穴)を用いて生成させた。12日間後に、T細胞クローンを6000IU/ml IL−2を含有するAIM−V培地中で膨張させた。最適な膨張(expansion)を得るために、S.Riddell(Walter等,1995,N.Engl.J.Med.333:1038〜1044)が述べているOKT3膨張方法を用いた。簡単には、0日目に5x104〜5x105T細胞をHLA−A31 PBL(500:1、PBL:T細胞比率)及び586EBV B細胞(100:1、EBV:T細胞比率)と共に、11%ヒト血清と30ng/mlのOKT3抗体と抗生物質とを含有するRPMI 1640(25ml)中で同時培養した。1日目に、IL−2を180IU/mlの最終濃度で加えた。5日目に、この培地を、11%ヒト血清と、IL−2 180IU/mlとを含有する新しい培地と交換した。次に、培地を3日間毎に交換した。12〜14日目に、T細胞を回収して、計数し、冷凍保存した。TIL586を転移性メラノーマを有する患者の標本から単離し、IL−2(6000IU/ml)(Chiron)を含有する培地中で既述されたように32〜60日間増殖させた(Topalian等,1988,J.Clin.Oncol.6:839〜853)。TIL586は主としてCD8+T細胞であった。
メラノーマ細胞系統397mel、397mel/A31、586mel、624mel、624mel/A31、及びEBV形質転換B細胞系統、586EBVと1510EBVを我々の実験室で確立して、10%ウシ胎児血清(FCS)を含有するRPMI 1640培地中で培養した。幼児***に由来する正常培養メラノサイト(NHEM680、Clonetics、CAから購入)をメラノサイト増殖培地(MOM;Clonetics、CA)中で培養した。COS−7細胞系統はDr.W.Leonard(NIH)によって提供された。
GM−CSF分泌アッセイ
DNAトランスフェクションとGM−CSFアッセイとは既述されたようにおこなった(Wang等,1995,J.EXP.Med.181:799〜804)。簡単には、抗原をコードするDNA 200ngと、HLA−A31 DNA 50ngとを、100mlのDMEM中の2μlのリポフェクタミンと15〜45分間混合した。DNA/リポフェクタミン混合物を次にCOS−7(5x104)細胞に加えて、一晩インキュベートした。翌日、細胞をDMEM培地によって2回洗浄した。TIL586を120 IU/mlのIL−2を含有するAIM−V培地中で1x105細胞/穴の濃度で加えた。T細胞クローンに関しては、1〜2x104細胞/穴のみを加えた。18〜24時間インキュベートした後に、100μlの上澄み液を回収し、GM−CSFを標準ELISAアッセイ(R+D Systems,Minneapolis,MN)で測定した。ペプチド認識を試験するために、586EBV又はT2細胞を37℃においてペプチドと共に90分間インキュベートしてから、120 IU/mlのIL−2を含有するAIM−V培地によって3回洗浄した。T細胞を加え、さらに18〜24時間インキュベートし、100μlの上澄み液をGM−CSFアッセイのために回収した。
ExoIII/SI欠失構築とサブクローニング
TRP−2cDNAはDr.Shibaharaの贈り物(Yokoyama等,1994,Biochim.Biophys.Acta,1217:317〜321)であり、これを発現のためのCMVプロモーターと共にpCR3ベクター中にサブクローニングした。一連の欠失を作製するために、TRP−2cDNAを含有するプラスミドpCR3をXbaIによって消化させ、α−ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチド三リン酸によって充填し、ExoIIIヌクレアーゼ消化をブロックした。直鎖状DNAを第2の制限酵素消化にさらして、ExoIIIに感受性の1端部を生成した。ExoIIIヌクレアーゼ/Mung Beanヌクレアーゼ欠失は製造者の指示(Stratagene,CA)に従っておこなった。全ての欠失構築体を配列決定して、取り出されるDNA配列の位置を決定した。pTAプラスミドは、TRP−2遺伝子の3’末端からApa I DNAフラグメントが欠失した、pCR3−TRP−2の誘導体であった。TRP−2遺伝子の3’末端からKpnI DNAフラグメントを除去した後に、pTKが作製された。pTPは内部PstIフラグメントの欠失と再ライゲーションとによって生成された。
ノーザンブロット分析
グアニジンイソチオシアネート/塩化セシウム遠心分離法によって、総RNAを単離した。ヒト正常組織からの総RNAはClontech、CAから購入した。20μgの総RNAに1.2%アガロースホルムアルデヒドゲル中での電気泳動をおこなって、これをナイロン膜上に移した。TRP−2遺伝子の2.0kb DNAフラグメントをランダムプライミング法によって32P−α−CTPで標識した。プレハイブリダイゼーションとハイブリダイゼーションとをQuickHybプロトコール(Stratagene)に従っておこなった。膜を室温での15分間の2XSSC/0.1%SDSによって2回、60℃での30分間の0.1XSSC/0.1%SDSによって2回洗浄した。オートラジオグラフィーを−70℃においておこなった。
細胞傷害性アッセイ
溶菌をCalcein AM(Molecular Probes,Eugene,OR)を用いておこなった。簡単には、T2細胞又は586EBV B細胞をRPMI1640/5%FCS中でペプチドで90分間パルスした。腫瘍細胞と、ペプチドパルスされたEBV B細胞とをCalcein AM(1x106細胞毎に15μlの1mg/ml Calcein AM)によって37℃において30分間標識した。インキュベーション後に、細胞をAIM V/120IU IL−2によって3回洗浄した。1x103ターゲット細胞にT細胞を種々なE:T比率で混合した。37℃における4時間のインキュベーション後に、5μlの臭化エチジウム含有ウシヘモグロビンクエンチ溶液(bovine hemoglobin quench solution)を加えた。プレートをLambdaスキャンによって読み取った。溶菌の%は下記式:[1−(A−B)/(C−B)]x100[式中、AはT細胞の存在下での非溶菌細胞の読取り値であり、Bはバックグラウンドシグナル値であり、Cはターゲット細胞からの最大シグナル値である]から算出した。
ペプチドはペプチドシンセサイザー(Model AMS 422,Gilson Co.社,Worthington,OH)を用いて固相法によって合成した。数種類のペプチドをHPLCによって精製し、これらは98%を越える純度を有した。数種類のペプチドのペプチド質量を質量分光測定分析によって確認した。
実施例10
CTLクローンによる腫瘍細胞上の新しい抗原の認識
以前の研究において、我々は限界希釈法によってTIL586細胞系統から多くのT細胞クローンを単離している(Wang等,1996b,J.Exp.Med.183:1131〜1140)。ごれらの中で、6種類のクローンが、TRP−1/gp75遺伝子の代替オープンリーディングから翻訳された遺伝子産物に由来するORF3Pペプチドをパルスされた586EBV B細胞と、自己由来586mel腫瘍細胞とを認識したが、関連のないペプチドをパルスされた586EBV B細胞を認識しなかった。図7に示すような、これらのT細胞クローンの1つの代表としてTIL586−C1を選択した。しかし、同じTIL586細胞系統から単離された幾つかのT細胞クローンは、TRP−1ペプチドORF3Pをパルスされた586EBV B細胞も、TRP−1とHLA−A31cDNAとによってトランスフェクトされたCOS細胞も認識しなかったが、586mel並びにHLA−A31+メラノサイトを認識することができた(図7)。これらの結果は、これらのT細胞クローンが586mel腫瘍細胞上の付加的な腫瘍抗原を認識することを示唆した。次に、これらのT細胞クローンを膨張させて、材料と方法の項(実施例9)に述べた方法による認識に関して、cDNAライブラリーをスクリーニングするために又は他のcDNAを試験するために充分な細胞を得た。1種類のクローン、CTLクローン4を以下に述べるような他の研究のために上首尾に膨張させて、用いた。
実施例11
T細胞クローンによって認識される腫瘍抗原をコードするcDNAの同定
CTLクローン4に抗原を提示する役割を担うHLA分子を決定するために、例えば397mel及び624melのようなA31陰性腫瘍系統中にHLA−A31cDNAをトランスフェクトして、CTLクローンによる認識に関して試験した。HLA−A31を発現する397mel及び624melのトランスフェクション体(transfectant)はCTLクローン4によって顕著に認識された(表3)。さらに、これらのT細胞はHLA−A31陽性同種腫瘍系統1353melをも認識することができ、このことは、CTLクローン4による腫瘍抗原の認識がHLA−A31制限される(HLA-A31 restricted)ことを意味した。
2x104CTLクローン4細胞をメラノーマ細胞系統又は、HLA−A31cDNAによってトランスフェクトされたCOS−7と共に24時間インキュベーションした後に、上澄み液中のGM−CSFを測定した。
限られた数のT細胞のみが利用可能であったので、これらのT細胞が予め同定された腫瘍抗原又はメラノサイト系統分化タンパク質(melanocyte-lineage differentiation protein)を認識するか否かを最初に試験した。HLA−A31cDNAと、MART−1(Kawakami等,1994a,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:3515〜3519)、gp75(Wang等,1995,J.Exp.Med.181:799〜804)、gp100(Kawakami等,1994b,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:6458〜6462)、チロシナーゼ(Brichard等,1993,J.Exp.Med.178:489〜495)、p1S(Robbins等,1995,J.Immunol.154:5944〜5950)及びTRP−2(Yokoyama等,1994,Biochim.Biophys.Acta,1217:317〜321;Bouchard等,1994,Eur.J.Biochem.219:127〜134)を包含する、既知腫瘍抗原又は推定される抗原をコードする遺伝子とによってトランスフェクトされたCOS−7細胞の、CTLクローン4による認識を試験した。HLA−A31のみ又はTRP−2のみによってトランスフェクトされたCOS細胞はT細胞クローンによる認識を生じなかった。しかし、HLA−A31とTRP−2cDNAとによってトランスフェクトされたCOS細胞はT細胞からのGM−CSF放出を刺激したが、HLA−A31と他の遺伝子とによってトランスフェクトされたCOS細胞は刺激せず、このことは、T細胞クローン4がHLA−A31制限様式でTRP−2を腫瘍抗原として認識したことを示す。
HLA−A3、A11、A31、A33及びA68とそれらのペプチド結合モチーフとにおける構造類似性の分析は、A3様スーパーモチーフ(A3-1ike supermotif)の存在を示唆している(Sidney等,1996,Human Immunol.45:79〜93)。単一エピトープペプチドは、総集団(general population)の約40〜50%に累積的に発現されるHLA−A3、A11、A31、A33及びA68分子と交差反応することができた。B型肝炎ウイルス ヌクレオキャプシドタンパク質に由来する同じペプチドエピトープがHLA−A31と−A68分子によって提示され、対応するHLA−A31又は−A68制限CTRによって認識されることが報告されている(Missale等,1993,J.EXP.Med.177:751〜762)。HLA−A31制限T細胞が、HLA−A3陽性EBV B細胞上にパルスされた場合のTRP−1及びTRP−2エピトープを認識するかどうかを試験した。興味深いことには、T細胞からのGM−CSF放出に基づいて弱い認識が検出された。しかし、HLA−A3陽性腫瘍細胞の認識は検出されなかった。
実施例12
TRP−2遺伝子の発現
種々な組織におけるTRP−2の発現パターンを評価するためのプローブとしてTRP−2cDNAを用いて、ノーザンブロット分析をおこなった。正常な網膜組織は試験した正常なヒト組織のうちでTRP−2発現において唯一の陽性であることが判明した。メラノーマ細胞系統と他の細胞系統とにおけるTRP−2の発現パターンを以下の表4に列挙する。30のメラノーマ細胞系統のうちの25の細胞系統がTRP−2を発現することが判明した。BurkittのB細胞系統Daudiと胸部癌細胞系統MDA23 1とは、以前の結果と一致して、陰性であった(Bouchard等,1994,Eur.J.Biochem.219:127〜134)。したがって、チロシナーゼ、TRP−1、gp100及びMART−1と同様に、この遺伝子の発現パターンはメラノーマ、正常メラノサイト細胞系統及び網膜に限定されるように思われる。
TRP−2の発現をノーザンブロット分析によって10−20〜gの総RNAを用いて試験して、TRP−2cDNAフラグメントによってプローブした。DaudiはBerkittのB細胞系統であり、MDA231は乳癌細胞系統である。
実施例13
T細胞によって認識されるペプチドエピトープ
TRP−2からの抗原性エピトープを判定するために、ExoIII/S1ヌクレアーゼと、TRP−2の切頭形をコードするDNAフラグメントとを用いて3’末端からTRP−2遺伝子の一連の組重ね欠失体を生成した。これらの欠失体とサブクローン化構築体とを、HLA−A31cDNAを含有するpBK−CMVプラスミドと共に、COS−7細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクトされたCOS細胞の認識をCTLクローンによって、CTLクローンからのGM−CSFサイトカイン放出を測定することによって試験した。図9は、pTD1、2及び3構築体がCTLクローン4からのサイトカイン放出を刺激する能力を保有するが、pTD4とpTD5はCTLクローン4に対する刺激活性を失ったことを示し、このことはCTLクローン4によって認識されるエピトープ(単数又は複数)がヌクレオチド836〜1045の領域に位置付けられたことを意味した。このことはサブクローニング実験によって得られた結果と一致した。pTAとpTPとはCTLクローン4からのサイトカイン放出を刺激する能力を失ったが、pTKはサイトカイン放出アッセイにおいてまだ陽性のままである。それ故、これらのエピトープは、図10に示すように、第1のPstIとKpnI部位によって隣接されたDNAフラグメント中に存在した。
この小さいDNAフラグメントのコーディング領域からエピトープを同定するために、5種類の合成ペプチドはHLA−A31の合成ペプチド結合モチーフ(位置2における疎水性残基と位置9における正に荷電した残基)に基づくものであった(Rammensee等,1995,Immunogenetics,41:178〜228)。これらのペプチドを586EBV B細胞上にパルスし、CTLクローン4によるサイトカイン放出を刺激するそれらの能力に関して試験した。表5に示すように、ペプチドTRP197〜205は、586EBV B細胞上にパルスされたときに、CTLクローン4によって強度に認識された。CTLクローン4によるこのペプチドの認識は、このペプチドを、例えば586EBVと1510EBVのような、HLA−A31+EBV B細胞上にパルスしたときにのみ観察され、HLA−A31陰性T2細胞上にパルスしたときには観察されなかった。CTLクローン4はTRP−1遺伝子の代替オープンリーディングフレームに由来するORF3Pペプチドを認識しなかった。これらの結果は、TIL586−ClがTRP−1由来ORF3Pペプチドを特異的に認識し、CTLクローン4がTRP2由来ペプチドを特異的に認識することを実証した。ORF3PとTRP2−p197の両方がHLA−A31分子によってT細胞に提示されたときに、交差反応性は観察されなかった。
586EBV細胞を1〜g/mlの濃度の個々のペプチドと共に90分間インキュベートした。ペプチド負荷586EBV細胞を、TRP−1又はTRP−2のいずれかを認識するT細胞クローンと共に同時インキュベーションした後にGM−CSF放出を測定した。刺激因子なしのT細胞のみによるGM−CSF分泌を控除した。586EBVと1510EBVはHLA−A31を発現するEBV形質転換B細胞系統であった。
実施例14
TRP197-205ペプチドの特徴付け
滴定実験は、1nMのペプチドがT細胞クローン4からのGM−CSF放出を刺激するために充分であり、この刺激が500nMにおいてプラトーに達したことをことを実証した(図10A)。TRP197-205をパルスされた586EBV B細胞のCTLクローン4による溶菌も種々なペプチド濃度において測定し(図10B)、サイトカイン放出アッセイと同様に、CTLクローン4によるターゲット細胞の溶菌は1nMペプチド濃度において検出された。最大溶菌は100nMのペプチド濃度において見られた。CTLクローン4はTRP2−p197をパルスされた586EBVと586mel腫瘍細胞とを低いE:T比率においても溶菌することができたが、単独若しくは対照ペプチドORF3Pをパルスされた586EBV B細胞も、HLA−A31陰性397mel系統も溶菌することができなかった(図10)。
現在までに同定されたヒトメラノーマ抗原の大部分は非変異自己抗原であり、対応するMHC分子に対するこれらの自己ペプチドのT細胞認識及び結合アフィニティは、幾つかの場合に、アンカー残基におけるアミノ酸の置換によって改良されている。8マー又は10マーを包含する多くの合成ペプチドと、表6に表示する修飾ペプチドとを作製し、586EBV B細胞にパルスされた場合のCTLクローン4による認識に関して試験した。TRP197-205のN末端において1アミノ酸が伸長された、10マーTLLGPGRPYRは、586EBV B細胞にパルスされた場合に、CTLクローン4によってまだ認識されたが、反応性は重複9マーLLGPGRPYRの約60%であった。HLA−A31の結合モチーフに基づいて、アンカー残基位置2と9並びに他の位置におけるアミノ酸置換によって若干の修飾ペプチドを生成した。C末端の位置9におけるArg残基は、Lys残基によって置換されることができ、この修飾ペプチドは親ペプチドの活性の少なくとも60%を保有した。位置2におけるLeu残基の、Ser、Ile又はVal残基による置換は、同じ活性を維持したか、又は親ペプチドの60%に活性を低下させたが、この位置におけるAla又はPheによる置換はT細胞からのサイトカイン放出を刺激する能力を低下させた(表6)。他の修飾はT細胞認識における可変な癌ペプチド活性を生じた。
586EBV細胞を0.5〜g/mlの濃度の個々のペプチドと共に90分間インキュベートした。ペプチド負荷586EBV細胞を、CTLクローン4細胞と共に同時インキュベーションした後にGM−CSF放出を測定した。刺激因子なしのT細胞のみによるGM−CSF分泌を控除した。586EBVはHLA−A31を発現するEBV形質転換B細胞系統であった。
TRP−2タンパク質は2つの推定の銅結合部位と、システイン富化領域と、膜通過ドメインとを含有する。ヒトTRP−2は染色体13にマッピングされており、マウスの対応物は染色体14のコートカラー変異(coat color mutation)、スレーティ(slaty)の領域にマッピングされている。TRP−2とチロシナーゼ又はTRP−1/gp75との間には約40%のアミノ酸配列同一性が存在するが、チロシナーゼタンパク質ファミリー間の共通ペプチドエピトープを認識するCTL系統又はクローンは現在までに見つかっていない。
CTLクローン4によって認識された9マーTRP197-205ペプチドはTRP−2のコーディング領域における銅結合部位の1つに位置付けられる。このペプチドは、この研究で試験した修飾ペプチドを含めた他のペプチドに比べて、T細胞からのサイトカイン放出を最も効果的に刺激した。このことは、位置2におけるLeuと位置9におけるArgとが好ましい残基であることを示す、予測されたHLA−A31結合モチーフと一致した。位置2におけるLeuと位置9におけるArgとはそれぞれ位置2におけるIleとSer及び位置9におけるLysと、T細胞認識に対する反応性の損失が殆ど無く若しくは微々たる損失で、置換されることができるが、位置1、3又は6におけるアミノ酸置換は反応性の若干の損失を生じた。
実施例15
In vivo処置アッセイ
in vivo処置に関しては、肺転移を確立するために、MHL−A31+トランスジェニックマウスを、1x105又は5x105Trp−1+B16マウスメラノーマ細胞によって静脈内チャレンジする。続いて、マウスに105PFU/mg体重で癌ペプチド、LLGPGRPYRを発現する組換えウイルスを予防接種する。マウスを12日目に安楽死させ、予防接種したマウス対非予防接種マウスの肺転移の数を測定する。
実施例16
癌抗原特異的Tリンパ球
免疫療法
メラノーマ抗原に対して予感作されたTリンパ球は、メラノーマに罹患した哺乳動物の治療処置に有効であると考えられる。Tリンパ球を末梢血又はメラノーマ懸濁液から単離して、in vitro培養する(Kawakami,等,1988,J.Exp.Med.168:2183〜2191)。
Tリンパ球を癌ペプチド、LLGPGRPYRに1μg/mlの濃度において単独で又はIL−2の存在下で暴露させ、再感作させ、培養で膨張させる。癌ペプチドに暴露させたTリンパ球を哺乳動物に約109〜1012リンパ球/哺乳動物で投与する。これらのリンパ球は静脈内、腹腔内又は病巣内に投与する。この処置は例えばサイトカイン、メラノーマ損傷の手術切除及び化学治療薬のような、他の治療処置と同時に投与することができる。
実施例17
転移性メラノーマを有する患者の処置
このプロトコールでは、進行したメラノーマを有する患者を抗原癌エピトープによって免疫感作させる。
このトライアルに適した患者は、標準の有効療法に失敗した、測定可能な又は評価可能な転移性黒色腫の徴候を有さなければならない。患者は、腫瘍細胞RNAのPCR又はノーザンブロット分析によって実証されるようなTPI−2抗原を発現する腫瘍を有さなければならない。
患者は1ng、1μg、1mg又は500mg/kg体重の癌ペプチド、LLGPGRPYRを0日目、7日目及び14日目に単独で又はIL−2及び/又は同時免疫刺激性分子(co-immunostimulatory molecule)と組合せて静脈内で受容する。患者を毒性、免疫学的効果及び治療効力に関して評価する。
処置した患者から採取したリンパ球をアミノ酸配列、LLGPGRPYRを含む癌抗原に対する特異的反応に関して検査する。
完全な反応は、少なくとも4週間持続する、疾患のあらゆる臨床徴候の消失として定義される。部分的反応は、新たな病巣の出現がないか又は病巣の増大のない、全ての測定可能な病巣の垂直直径の積の全体として、少なくとも4週間にわたる50%以上の減少である。軽度反応は、新たな病巣の出現がないか又は病巣の増大のない、全ての測定可能な病巣の垂直直径の積の全体として25〜49%の減少として定義される。部分的反応未満を有する患者は不反応者と見なされる。部分的反応又は完全反応後の、新しい病巣の出現又は先行病巣の垂直直径の積の25%を越える増加は再発と見なされる。
考察
例えばチロシナーゼ、MART−1/Melan−A及びgp100のような対応する非変異性共有(non-mutated shared)メラノーマ抗原の正常オープンリーディングフレームに由来する幾つかの抗原性T細胞エピトープが同定されている。この研究では、TIL586によって認識される抗原性ペプチドがgp75遺伝子の第2遺伝子産物に由来することを実証した。我々の知るかぎりでは、これは、T細胞が同じ遺伝子の重複オープンリーディングフレームの翻訳から生じる抗原性ペプチドを認識する最初の例であり、かつ2種類の完全に異なるタンパク質及び/又はペプチドが単一細胞遺伝子の重複オープンリーディングフレームから翻訳されることができるという真核細胞における唯一つの例である。gp75遺伝子のORF3は24アミノ酸の短いタンパク質をコードする。TIL586によって認識される抗原性ペプチドは、代替オープンリーディングフレームのATG(294〜296)開始コドンの直後に位置付けられた配列によってコードされる。gp75はチロシナーゼ、gp100及びTRP−2に対して40〜45%の配列相同性を有するが、COS−7細胞中へのHLA−A31とチロシナーゼ、gp100又はTRP−2cDNA、それぞれとの同時トランスフェクションはTIL586由来T細胞クローンからのGM−CSF放出を刺激することができなかった。データベースサーチは、HLA−A31ペプチド結合モチーフと、TIL586とそれに由来するT細胞クローンによって認識されるペプチドエピトープに対して顕著な配列相同性とを有するタンパク質を明らかにしなかった。さらに、以前の研究は、メラノーマトランスフェクション体(gp75+/A31+)がTIL586からのGM−CSF放出を刺激する能力を与えたが、gp75メラノーマトランスフェクション体(gp75-/A31+)は与えなかったことを示した(Wang,R.F.等,1995,J.Exp.Med.181:799〜804)。他のメラノーマ細胞系統(gp75-/A31+)によっても同様な結果が得られた。ORF3Pペプチドはgp75遺伝子から同定された唯一のエピトープであり、TIL586由来の6種類のT細胞クローンによって認識されたので、このペプチドは腫瘍細胞又はメラノサイト上の自然プロセスペプチドと同じ又は類似すると考えられる。このことは、このペプチドは腫瘍細胞上の自然ペプチドとT細胞認識に関して競合することができたので、コールドターゲット阻害実験によってさらに支持された。
結腸癌における変異した腺腫症結腸ポリポーシス(APC)遺伝子のフレームシフトに由来するT細胞エピトープペプチドが予防接種したBALB/cマウスから得られたCTLによって認識されることが報告された(Townsend,A.等,1994,Nature,371:662)。図3の結果は、ヌクレオチド294〜296におけるATGが24アミノ酸産物の翻訳のために必要であり、24アミノ酸産物は次にTIL586によって認識される抗原性ペプチドにプロセシングされることを示した。TIL586は586EBV B細胞にパルスされた変異合成ペプチドをも認識したが、COS−7細胞中にHLA−A31cDNAと共に同時トランスフェクトされた場合は、変異遺伝子を認識せず、このことは、TIL586による変異(ATGからATCへ)遺伝子の認識喪失がORF3産物の翻訳の無いことに起因することを示した。DNA配列分析に加えてこれらの結果は、TIL586によって認識される抗原性ペプチドがgp75のフレームシフト産物に由来するという可能性を除外した。それ故、多重のペプチド又はタンパク質がしばしば単一真核遺伝子の重複オープンリーディングフレームから翻訳されるが、これらの代替産物を検出するための手段が利用可能でなかったことが考えられる。自然プロセスペプチドを検出するためのT細胞の鋭敏な感受性は、この現象の多くの他の例を明らかにすることができる。
重複オープンリーディングフレーム3(ORF3)がin vivoで翻訳される機構は、現在不明である。1つより多いAUGコドンにおいて開始し、幾つかの稀な場合にはAUGコドンと、例えばCUGのような非AUGコドンの両方において開始してN−末端伸長した同じ配列を形成する細胞mRNAの幾つかの例が報告されているが、単一真核細胞mRNAからの重複オープンリーディングフレーム(即ち、2種類の全く異なるペプチドを翻訳する)の利用は、我々の知る限りまだ述べられていない。単一mRNAからの重複リーディングフレームの翻訳の幾つかの例は述べられているが、ウイルス遺伝子に排他的に限定されている。ウイルス遺伝子における重複オープンリーディングフレームの産物の検出は、ウイルス感染宿主の血清中の反応性抗体の存在のために可能であった。本発明では、T細胞アッセイを用いて、T細胞によって認識されるエピトープペプチドを同定した。このアプローチは慣用的なウェスタンブロット又は免疫沈降分析とは全く異なり、これらの分析よりも高感度である。真正開始コドンと、ORF3の開始コドンとの間には5個のATGコドンが存在するが、ORF1(gp75)のN末端部分と、完全なORF2及びORF3をカバーする構築体pPCR110(ヌクレオチド1〜667)はTIL586からのサイトカイン放出を刺激する能力をまだ保有する。しかし、刺激のレベルはgp75の5’切頭形(最初の246ヌクレオチドが欠失)による刺激レベルよりも数倍低く(図1Aと1B)、このことは上流のATGコドンがORF3発現を部分的に阻害したと考えられることを示唆した。幾つかのファクターがこの系におけるORF3産物の発現を検出することを可能にしている。第一に、ORF3のATG開始コドンに先行する上流のATGコドンは最適に関係しないように思われ、このことがリーキースキャンニングモデル(leaky scanning model)による開始コドンとしての下流ATGの使用を可能にすると考えられる。第二に、COS−7細胞中のトランスフェクトされた遺伝子の比較的高い発現と、極度に敏感な手段としてのT細胞アッセイの有効性とが非常に低レベルの翻訳産物の検出を可能にすると考えられる。
興味深いことには、ORF3産物は腫瘍細胞中並びに正常メラノサイト中でT細胞によって検出され(図6A〜6D)、このことはORF3タンパク質が腫瘍細胞における遺伝的変化(genetic alteration)に起因する遺伝子産物でないことを強く示唆した。以前の研究では、TIL586が試験された多重の腫瘍細胞系統(gp75+/A31+)を認識したことが示され、これは、TIL586が非変異共有腫瘍抗原を認識することを示唆した(Wang R.F.等上記文献)。gp75遺伝子はノーザンブロットとPCR分析とに基づくとメラノーマ中に高度に発現され(Wang R.F.等上記文献)、その遺伝子産物gp75タンパク質はメラノーマ細胞とメラノサイトに発現された最も豊富な細胞内糖タンパク質であるので(Tai,T.,Eisinger,M.,Ogata,S.及びLloyd,K.O.,1983,Cancer Res.43:2773〜2779;Thomson,T.N.,Mattes,J.M.,Roux,L.,Old,L.J.及びLloyed,K.O.1985,J.Invest.Dermat.85:169〜174;Thomson,T.N.,real,F.X.,Mutakami,S.,Cordon−cardo,C.,Old,L.J.及びHoughton,A.N.1988,J.Invest.Dermat.90,459〜466),T細胞クローンが586EBV B細胞(A31+),メラノーマ(gp75+/A31+)並びにA31+メラノサイト上にパルスされた場合のORF3Pペプチドを認識したが、gp75+/A31+メラノーマ細胞上にパルスされた場合、又は非A31 T2細胞にパルスされたORF3Pを認識しなかったことは意外ではない。腫瘍細胞とメラノサイトとにおけるペプチド発現を説明する他の可能性は、ORF3がgp75mRNA又は異なるプロモーターの選択的スプライシング(alternative splicing)によって生成された別のmRNA転写体(transcript)(単数又は複数)から翻訳されうることである。我々の知る限りでは、選択的スプライシングによって生成されたmRNA転写体は、同じオープンリーディングフレームを用いてアイソフォームタンパク質に翻訳される。しかし、本発明の場合には、別の転写体が生成されて、翻訳の鋳型として用いられたとしても、gp75とは全く異なるオープンリーディングフレームがORF3産物の翻訳に用いられた。in vivoでのORF3タンパク質の翻訳の機構を解明するには、さらなる実験が必要である。それにも拘わらず、上述したこれらの可能性は相互に排他的ではない。
配列表
(1)一般情報:
(i)出願人:ヘルス・アンド・ヒューマンサービス省長官により代表されるアメリカ合衆国政府
(ii)発明の名称:チロシナーゼ関連タンパク質1及び2の新規ヒト癌抗原並びにこれをコードする遺伝子
(iii)配列の数:60
(iv)通信先:
(A)宛て名:モルガン&フィンネガン、L.L.P.
(B)通り:345パークアベニュー
(C)都市:ニューヨーク
(D)州:ニューヨーク
(E)国:USA
(F)ZIP:10154
(V)コンピューター読み取り形式:
(A)媒体型:3.5インチ、1.44MB記憶装置
(B)コンピューター:IBM PCコンパチブル
(C)オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS
(D)ソフトウエア:ワードパーフェクト5.1
(vi)現出願のデータ:
(A)出願日:1997年2月6日
(vii)先の出願のデータ:
(A)出願番号:08/599,602
(A)出願日:1996年2月9日
(vii)先の出願のデータ:
(A)出願番号:08/725,736
(B)出願日:1996年10月4日
(viii)弁護士/代理人情報:
(A)氏名:キャサリンM、ブラウン
(B)登録番号:34,556
(C)参照/ドケット番号:2026−4209PC
(ix)電信情報:
(A)電話:(212)758−4800
(B)テレファックス:(212)751−6849
(C)テレックス:421792
(2)配列番号1の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:471塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:cDNA
(ii)仮定:あり
(iv)アンチセンス:なし
(X)公開情報:
(A)著者:COHEN,T.;MULLER, R.M.;TOMITA, Y.:SHIBAHARA, S.
(B)名称:ヒトチロシナーゼ関連タンパク質をコードするcDNAのヌクレオチド配列
(C)雑誌:NUCLEIC ACIDS RESEARCH
(D)巻:18
(E)号:9
(F)頁:2807−2808
(G)日付:1990年5月11日
(H)配列番号1中の関連残基:1から471
(xi)配列の記載:配列番号1
(2)配列番号2の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:157アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:タンパク質
(xi)配列の記載:配列番号2
(2)配列番号3の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:129塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:cDNA
(iii)仮定:あり
(iv)アンチセンス:なし
(xi)配列の記載:配列番号3
(2)配列番号4の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:43アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:タンパク質
(xi)配列の記載:配列番号4
(2)配列番号5の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:72塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:cDNA
(iii)仮定:あり
(iv)アンチセンス:なし
(xi)配列の記載:配列番号5
(2)配列番号6の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:24アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号6
(2)配列番号7の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:24アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:ペプチド
(ix)特徴:
(A)名称/キー:XAA
(B)位置:1から2
(C)同定方法:実験による
(D)他の情報:XAA=SERまたはALA
(xi)配列の記載:配列番号7
(2)配列番号8の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:9アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:ペプチド
(ix)特徴:
(A)名称/キー:XAA
(B)位置:1から2
(C)同定方法:実験による
(D)他の情報:XAA=SERまたはALA
(xi)配列の記載:配列番号8
(2)配列番号9の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:9アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号9
(2)配列番号10の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:27塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:cDNA
(iii)仮定:あり
(iv)アンチセンス:なし
(xi)配列の記載:配列番号10
(2)配列番号11の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:66塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:cDNA
(iii)仮定:あり
(iv)アンチセンス:なし
(xi)配列の記載、配列番号11
(2)配列番号12の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:cDNA
(iii)仮定:あり
(iv)アンチセンス:なし
(xi)配列の記載:配列番号12
(2)配列番号13の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:31塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:cDNA
(iii)仮定:あり
(iv)アンチセンス:なし
(xi)配列の記載:配列番号13
(2)配列番号14の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:33塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:cDNA
(iii)仮定:あり
(iv)アンチセンス:なし
(xi)配列の記載:配列番号14
(2)配列番号15の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:32塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:cDNA
(iii)仮定:あり
(iv)アンチセンス:なし
(xi)配列の記載:配列番号15
(2)配列番号16の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:7塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:cDNA
(iii)仮定:あり
(iv)アンチセンス:なし
(xi)配列の記載:配列番号16
(2)配列番号17の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:9アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号17
(2)配列番号18の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:9アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号18
(2)配列番号19の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:9アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号19
(2)配列番号20の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:9アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号20
(2)配列番号21の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:10アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号21
(2)配列番号22の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:11アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号22
(2)配列番号23の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:10アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号23
(2)配列番号24の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:10アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号24
(2)配列番号25の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:11アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号25
(2)配列番号26の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:9アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖
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(xi)配列の記載:配列番号26
(2)配列番号27の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:11アミノ酸
(B)型:アミノ酸
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(xi)配列の記載:配列番号27
(2)配列番号28の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:11アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号28
(2)配列番号29の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:7塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:cDNA
(iii)仮定:あり
(iv)アンチセンス:なし
(xi) 配列の記載:配列番号29
(2)配列番号30の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:7塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:cDNA
(iii)仮定:あり
(iv)アンチセンス:なし
(xi)配列の記載:配列番号30
(2)配列番号31の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:9アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号31
(2)配列番号32の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:9アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号32
(2)配列番号33の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ.:10アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号33
(2)配列番号34の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:9アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号34
(2)配列番号35の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:9アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号35
(2)配列番号36の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:9アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号36
(2)配列番号37の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:9アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号37
(2)配列番号38の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:9アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号38
(2)配列番号39の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:9アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号39
(2)配列番号40の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:9アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号40
(2)配列番号41の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:9アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号41
(2)配列番号42の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:32塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:cDNA
(iii)仮定:あり
(iv)アンチセンス:なし
(xi)配列の記載:配列番号42
(2)配列番号43の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:24塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:cDNA
(iii)仮定:あり
(iv)アンチセンス:なし
(xi)配列の記載:配列番号43
(2)配列番号44の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:24塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:cDNA
(iii)仮定:あり
(iv)アンチセンス:なし
(xi)配列の記載:配列番号44
(2)配列番号45の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:30塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖
(ii)分子の型:cDNA
(iii)仮定:あり
(iv)アンチセンス:なし
(xi)配列の記載:配列番号45
(2)配列番号46の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:2291塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖:二本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:
(A)説明:cDNA
(x)公開情報:
(A)著者:YOKOYAMA他
(B)名称:ヒトドーパクロム互変異性化酵素/チロシナーゼ関連タンパク質−2をコードするcDNAの分子クローニングと機能分析
(C)雑誌: BIOCHIM.BIOPHSY.ACTA.
(D)巻:1217
(E)号:
(F)頁:317−321
(G)日付:1994年
(xi)配列の記載:配列番号46
(2)配列番号47の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:519
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:
(A)説明:タンパク質
(x)公開情報:
(A)著者:YOKOYAMA他
(B)名称:ヒトドーパクロム互変異性化酵素/チロシナーゼ関連タンパク質−2をコードするcDNAの分子クローニングと機能分析
(C)雑誌: BIOCHIM.BIOPHSY.ACTA.
(D)巻:1217
(E)号:
(F)頁:317−321
(G)日付:1994年
(xi)配列の記載:配列番号47
(2)配列番号48の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:11
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:
(A)説明:ペプチド
(ix)特徴:
(A)名称/キー:TRP−2ペプチド
(B)位置:1から11
(C)同定方法:実験による
(D)他の情報:Xaaは同一または異なり、1以上のアミノ酸である。
(xi)配列の記載:配列番号48
(2)配列番号49の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:9
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:
(A)説明:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号49
(2)配列番号50の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:10
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:
(A)説明:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号50
(2)配列番号51の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:10
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:
(A)説明:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号51
(2)配列番号52の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:9
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:
(A)説明:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号52
(2)配列番号53の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:9
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:
(A)説明:ペプチド:
(xi)配列の記載:配列番号53
(2)配列番号54の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:9
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:
(A)説明:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号54
(2)配列番号55の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:9
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:
(A)説明:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号55
(2)配列番号56の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:9
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:
(A)説明:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号56
(2)配列番号57の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:9
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:
(A)説明:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号57
(2)配列番号58の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:9
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:
(A)説明:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号58
(2)配列番号59の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:9
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:
(A)説明:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号59
(2)配列番号60の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:27
(B)型:核酸
(C)鎖:未知
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:
(A)説明:オリゴヌクレオチド
(xi)配列の記載:配列番号60
Claims (38)
- MALQRQFLR(SEQ ID NO:35)の癌ペプチド。
- MSLQRQFLR(SEQ ID NO:9)の癌ペプチド。
- 請求項1または2に記載の癌ペプチド、および医薬的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
- 医薬組成物がさらに、MHCクラスI分子、MHCクラスII分子、B7.1、B7.2、ICAM−1、ICAM−2、LFA−1、LFA−3、CD72、インターロイキン、TNFα、IFNγ、RANTES、G−CSF、M−CSF、IFNα、CTAPIII、ENA−78、GRO、I−309、PF−4、IP−10、LD−78、MGSA、MIP−1α、MIP−1β、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される免疫刺激分子を含む、請求項3に記載の医薬組成物。
- 請求項1または請求項2に記載の癌ペプチドを単独で、または少なくとも1つの免疫刺激分子とともに含む、抗原。
- 免疫刺激分子が、MHCクラスI分子、MHCクラスII分子、B7.1、B7.2、ICAM−1、ICAM−2、LFA−1、LFA−3、CD72、インターロイキン、TNFα、IFNγ、RANTES、G−CSF、M−CSF、IFNα、CTAPIII、ENA−78、GRO、I−309、PF−4、IP−10、LD−78、MGSA、MIP−1α、MIP−1β、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項5に記載の抗原。
- MALQRQFLR(SEQ ID NO:35)の癌ペプチドをコードする単離された核酸配列。
- MSLQRQFLR(SEQ ID NO:9)の癌ペプチドをコードする単離された核酸配列。
- 核酸配列がATGTCACTGCAACGGCAATTTCTCAGG(SEQ ID NO:10)を含む、請求項8に記載の単離された核酸配列。
- 請求項7〜9のいずれか1項に記載の核酸配列を含む、組換え発現ベクター。
- 請求項10に記載の組換え発現ベクターにより形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞または非ヒト宿主生物。
- 請求項7〜9のいずれか1項に記載の核酸配列に対して相補的な核酸配列を含む、オリゴヌクレオチド。
- 請求項7〜9のいずれか1項に記載の核酸配列が組み込まれたウイルスゲノムを含む、組換えウィルス。
- 免疫刺激分子をコードする少なくとも一つの遺伝子をさらに含む、請求項13に記載の組換えウイルス。
- 免疫刺激分子が、MHCクラスI分子、MHCクラスII分子、B7.1、B7.2、ICAM−1、ICAM−2、LFA−1、LFA−3、CD72、インターロイキン、TNFα、IFNγ、RANTES、G−CSF、M−CSF、IFNα、CTAPIII、ENA−78、GRO、I−309、PF−4、IP−10、LD−78、MGSA、MIP−1α、MIP−1β、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項14に記載の組換えウイルス。
- ウイルスがレトロウイルス、バキュロウイルス、アンカラウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス、およびワクシニアウイルスからなる群から選択される、請求項13に記載の組換えウイルス。
- MALQRQFLR(SEQ ID NO:35)の癌ペプチドに結合する、単離された抗体または、前記抗体の抗原結合部位を含むフラグメント。
- MSLQRQFLR(SEQ ID NO:9)の癌ペプチドに結合する、単離された抗体または、前記抗体の抗原結合部位を含むフラグメント。
- 組換え癌ペプチドの製造方法であって:
a. 単離されたヌクレオチド配列を発現ベクター中に挿入し、ここでヌクレオチド配列がMALQRQFLR(SEQ ID NO:35)またはMSLQRQFLR(SEQ ID NO:9)の癌ペプチドをコードし;
b. 発現ベクターを宿主細胞に導入し;
c. 癌ペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養し;そして
d. 組換え癌ペプチドを回収する;
ことを含む前記方法。 - 哺乳動物における癌または前癌の存在の検出方法であって:
a. MALQRQFLR(SEQ ID NO:35)またはMSLQRQFLR(SEQ ID NO:9)の癌ペプチドをコードする単離された核酸配列を、哺乳動物から採取したmRNAの試験生物学的試料と、該配列と該mRNAとの間に複合体を形成させる条件下で接触させ;
b. 複合体を検出し;
c. 試験試料中のmRNAの量を、既知の正常の生物学的試料中からのmRNAの量と比較し、試験試料からのmRNAの増加した量が癌または前癌の指標である、
ことを含む前記方法。 - 癌または前癌がメラノーマである、請求項20に記載の方法。
- 生物学的試料におけるTRP-1遺伝子からのORF3ゲノム核酸配列の検出方法であって:
a. ゲノム核酸配列を、MALQRQFLR(SEQ ID NO:35)またはMSLQRQFLR(SEQ ID NO:9)の癌ペプチドをコードする核酸配列と、該ゲノム核酸配列と該癌ペプチドをコードする核酸配列との間に複合体を形成させる条件下で接触させ;そして
b. 複合体を検出する;
ことを含む、前記方法。 - 生物学的試料における癌ペプチドの検出方法であって;
a. 試料を、請求項17または18の抗体と、免疫複合体を形成させる条件下で接触させ;そして
b. その存在が生物学的試料中の前記癌ペプチドの指標となる免疫複合体の存在を検出する;
ことを含む、前記方法。 - 哺乳動物における癌を防止または阻害するための医薬組成物であって、有効な量の請求項1または請求項2の癌ペプチドを、単独または免疫刺激分子と一緒に含む、前記医薬組成物。
- 哺乳動物におけるメラノーマを阻害し得る細胞を生産する方法であって、前記細胞は、in vitroで、請求項1または請求項2の癌ペプチドに、単独または免疫刺激分子と一緒に、癌ペプチド特異的Tリンパ球を誘導するのに十分な時間曝露されたTリンパ球である、前記方法。
- 哺乳動物における癌を防止または阻害するための医薬組成物であって、有効な量の請求項13〜16のいずれか1項に記載の組換えウイルスを、単独または外因性免疫刺激分子と一緒に含む、前記医薬組成物。
- 請求項13〜16のいずれか1項に記載の組換えウイルスを単独または外因性免疫刺激分子、化学療法薬、抗生物質、抗菌薬、抗ウイルス薬またはそれらの組み合わせと一緒に含み、そして薬学的に許容できる担体を含む、医薬組成物。
- 免疫刺激分子が、MHCクラスI分子、MHCクラスII分子、B7.1、B7.2、ICAM−1、ICAM−2、LFA−1、LFA−3、CD72、インターロイキン、TNFα、IFNγ、RANTES、G−CSF、M−CSF、IFNα、CTAPIII、ENA−78、GRO、I−309、PF−4、IP−10、LD−78、MGSA、MIP−1α、MIP−1β、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項24、26または27に記載の医薬組成物。
- 免疫刺激分子が、MHCクラスI分子、MHCクラスII分子、B7.1、B7.2、ICAM−1、ICAM−2、LFA−1、LFA−3、CD72、インターロイキン、TNFα、IFNγ、RANTES、G−CSF、M−CSF、IFNα、CTAPIII、ENA−78、GRO、I−309、PF−4、IP−10、LD−78、MGSA、MIP−1α、MIP−1β、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項25に記載の方法。
- 抗原特異的Tリンパ球と反応性を有する癌抗原の抗原性癌エピトープの同定方法であって:
a. SEQ ID NO:5として図2に記載したORF3またはSEQ ID NO:46の欠失変異体のセットを生成し;
b. 前記セットの各欠失変異体を発現ベクター中に置き;
c. 宿主細胞をベクターでトランスフェクションまたは形質導入し;
d. 前記セットの欠失変異体を発現する宿主の存在下で、癌抗原特異的Tリンパ球応答を測定する、
ことを含む前記方法。 - 癌抗原がメラノーマである抗原である、請求項30に記載の方法。
- TRP-1またはTRP-2癌抗原の抗原性癌エピトープの同定方法であって:
a. 多数の合成ペプチドを生成し;
b. 癌抗原提示細胞を合成ペプチドでパルスし;
c. ペプチドでパルスした細胞をTRP-1またはTRP-2癌抗原特異的Tリンパ球に添加し;そして
d. 癌抗原特異的Tリンパ球応答を測定する、
ことを含む前記方法。 - 請求項1または請求項2の癌ペプチドをコードする外因性遺伝子を保持する、非ヒトトランスジェニック動物。
- 請求項1または請求項2の癌ペプチドを発現する、非ヒトトランスジェニック動物。
- 哺乳動物の癌を防止または阻害するための医薬を製造するための、請求項1または2に記載の癌ペプチドの使用であって、製造において単独でまたは免疫刺激分子と組み合わせて使用される、前記使用。
- 哺乳動物のメラノーマを阻害し得る細胞を製造するための、請求項1または2に記載の癌ペプチドの、単独でまたは免疫刺激分子と組み合わせた使用であって、Tリンパ球をin vitroで、前記癌ペプチドを単独でまたは免疫刺激分子と組み合わせて、癌ペプチド特異的Tリンパ球を誘導するために十分な時間曝露する工程を含む、前記使用。
- 哺乳動物の癌を防止または阻害する方法において使用するための医薬の製造の際における、請求項13〜16のいずれか1項に記載の組換えウィルスの、単独でまたは外因性免疫刺激分子と組み合わせた使用。
- 免疫刺激分子が、MHCクラスI分子、MHCクラスII分子、B7.1、B7.2、ICAM−1、ICAM−2、LFA−1、LFA−3、CD72、インターロイキン、TNFα、IFNγ、RANTES、G−CSF、M−CSF、IFNα、CTAPIII、ENA−78、GRO、I−309、PF−4、IP−10、LD−78、MGSA、MIP−1α、MIP−1β、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項35−37のいずれか1項に記載の使用。
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