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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Krebs-assoziiertes Antigen
und das Nucleinsäuremolekül, das für das Antigen
kodiert, sowie deren Verwendung.
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HINTERGRUND
UND STAND DER TECHNIK
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Es
wird weithin anerkannt, dass zahlreiche pathologische Leiden, wie
z.B. Infektionen, Krebs, Autoimmunerkrankungen etc., durch die unangemessene
Expression gewisser Moleküle
gekennzeichnet ist. Diese Moleküle
dienen somit als „Marker" für einen
bestimmten pathologischen oder abnormalen Zustand. Abgesehen von
ihrer Verwendung als Diagnose-„Ziele", d.h. als zu identifizierende
Materialien, um diese abnormalen Zustände zu diagnostizieren, dienen
die Moleküle
als Reagenzien, die zur Erzeugung diagnostischer und/oder therapeutischer
Wirkstoffe verwendet werden können.
Ein keineswegs als einschränkend
zu verstehendes Beispiel dafür
ist die Verwendung von Krebsmarkern, um für einen bestimmten Marker spezifische
Antikörper zu
produzieren. Ein anderes nicht einschränkendes Beispiel ist die Verwendung
eines Peptids, das mit einem MHC-Molekül komplexiert, um zytolytische
T-Zellen gegen abnormale Zellen zu bilden.
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Die
Herstellung solcher Materialien setzt natürlich eine Quelle von Reagenzien,
die zu deren Bildung verwendet werden, voraus. Die Reinigung von
Zellen ist ein anbeitsintensives Verfahren dafür, das weit davon entfernt
ist, sicher zu sein. Ein anderes bevorzugtes Verfahren ist die Isolierung
von Nucleinsäuremolekülen, die
für einen
bestimmten Marker kodieren, gefolgt von der Verwendung des isolierten
kodierenden Moleküls, um
das gewünschte
Molekül
zu exprimieren.
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Bis
heute sind zwei Strategien eingesetzt worden, um solche Antigene
z.B. in menschlichen Tumoren zu detektieren. Diese werden als der
genetische und der bio chemische Ansatz bezeichnet. Der genetische
Ansatz wird z.B. von dePlaen et al. in Proc. Natl. Sci. USA 85,
2275 (1988), dargestellt, was durch Verweis hierin aufgenommen ist.
Bei diesem Ansatz werden mehrere hundert Pools von Plasmiden einer
cDNA-Bank, die aus einem Tumor erhalten wurde, in Rezeptorzellen
wie COS-Zellen oder in Antigen-negative Varianten von Tumorzelllinien,
die auf die Expression des spezifischen Antigens untersucht wurden,
transfiziert. Der biochemische Ansatz wird z.B. von Kawakami et
al., Nature 369, 69 (1994), was hierin durch Verweis aufgenommen
ist, dargestellt und basiert auf einer sauren Elution von Peptiden,
die an MHC-Klasse-I-Moleküle
von Tumorzellen gebunden waren, gefolgt von Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
(HPLC). Antigenische Peptide werden identifiziert, nachdem sie an
leere MHC-Klasse-I-Moleküle
mutierter Zelllinien, die in der Antigen-Verarbeitung fehlerhaft
sind, gebunden waren, und ergeben spezifische Reaktionen mit zytotoxischen T-Lymphozyten.
Diese Reaktionen schließen
das Auslösen
von CTL-Proliferation, TNF-Freisetzung und Lyse von Zielzellen ein,
was in einem MTT-Test oder einem 51Cr-Freisetzungstest
gemessen werden kann.
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Diese
zwei Ansätze
zur molekularen Definition von Antigenen weisen folgende Nachteile
auf: Erstens sind sie sehr umständlich,
zeitintensiv und teuer, und zweitens hängen sie vom Vorhandensein
zytotoxischer T-Zelllinien (CTLs) mit vorbestimmter Spezifität ab.
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Die
diesen beiden bekannten Ansätze
zur Identifikation und molekularen Definition von Antigenen innewohnenden
Problemen werden am besten durch die Tatsache ersichtlich, dass
es den Verfahren bisher lediglich gelungen ist, eine geringe Anzahl
an neuen Antigenen in menschlichen Tumoren zu definieren. Siehe z.B.
van der Bruggen et al., Science 254, 1643–1647 (1991); Brichard et al.,
J. Exp. Med. 178, 489-495
(1993); Coulie et al., J. Exp. Med. 180, 35–42 (1994); Kawakami et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci USA 91, 3515–3519 (1994). Eine neue Familie
von Tumorabstoßungs-Antigenvorläufern ist
in der WO 96/21673 identifiziert worden.
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Die
beschriebenen Verfahren verlassen sich ferner auf die Verfügbarkeit
vorhandener permanenter Zelllinien der untersuchten Krebsart. Es
ist sehr schwierig, Zelllinien gewisser Krebsarten zu sichern, wie
z.B. von Oettgen et al., Immunol. Allerg. Clin. North. Am. 10, 607–637 (1990),
gezeigt wird. Zudem ist bekannt, dass einige Epithelzell-artige
Krebsarten in vitro nur wenig anfällig für CTLs sind, was Routineanalysen
ausschließt. Diese
Probleme haben auf dem Fachgebiet dazu geführt, dass zusätzliche
Verfahren zum Identifizieren von Krebs-assoziierten Antigenen entwickelt
wurden.
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Ein
wichtiges Verfahren wird von Sahin et al. in Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 92, 11810–11913
(1995), beschrieben. Zusammenfassend gesagt beinhaltet das Verfahren
das Exprimieren von cDNA-Banken in einem prokaryotischen Wirt. (Die
Banken sind aus einer Tumorprobe gesichert.) Die exprimierten Banken
werden mit absorbierten und verdünnten
Seren immungescreent, um diejenigen Antigene zu detektieren, die
Humoralreaktionen mit hohem Titer hervorrufen. Dieses Verfahren
ist als SEREX-Verfahren („Serological
identification of antigens by Recombinant Expression Cloning") bekannt. Das Verfahren
ist verwendet worden, um die Expression von vorhergehend identifizierten
Tumor-assoziierten Antigenen zu bestätigen sowie neue zu detektieren. Siehe
die Patentanmeldung, auf die oben verwiesen wurde, und Sahin et
al., s.o., sowie Crew et al., EMBO J 144, 2333–2340 (1995).
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Die
SEREX-Methode wurde bei Speiseröhrenkrebsproben
eingesetzt, und ein Antigen ist nun identifiziert und das dafür kodierende
Nucleinsäuremolekül isoliert
und kloniert worden. Das Antigen hat sich bei Krebs als weit verbreitet
erwiesen, ist jedoch in Nicht-Krebszellen nicht gefunden worden.
Dies ist u.a. Gegenstand der Erfindung, die in der folgenden Offenbarung
detaillierter beschrieben wird.
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KURZBESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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1 zeigt das Expressionsmuster
von RNA für
das NY-ESO-1-Antigen in verschiedenen Gewebearten.
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2 zeigt die Northern-Blot-Analyse
von NY-ESO-1-mRNA, die in Hoden und der Zelllinie SK-MEL-19, jedoch
nicht in zahlreichen anderen Zell- und Gewebeproben gefunden wurde.
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3 zeigt potentielle Modifikationsstellen
der abgeleiteten Aminosäuresequenz
von NY-ESO-1.
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4 ist ein Hydrophilieprofil
von NY-ESO-1, das hydrophile Domänen
im Aminoterminus und einen langen hydrophoben Abschnitt nahe dem
Carboxylende aufzeigt.
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5 zeigt die Ergebnisse von
CTL-Lyse-Untersuchungen, bei denen verschiedene Zellen verwendet wurden,
die HLA-A2-positiv, NY-ESO-1-positiv, positiv für beide oder positiv für keines
der beiden sind.
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6 veranschaulicht Daten,
die belegen, dass HLA-A2 das präsentierende
Molekül
für die
Präsentation
von von Seq.-ID-Nr. 1 abgeleiteten Peptiden ist.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Beispiel 1
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Die
gesamte RNA wurde mittels weithin bekannter Verfahren aus einer
schnell gefrorenen Probe von gut bis mäßig differenziertem Schuppenzellkrebs
der Speiseröhre
extrahiert. Siehe z.B. Chomzynski, J. Analyt. Biochem. 162, 156–159 (1987),
für ein derartiges
Verfahren. Diese RNA wurde dazu verwendet, eine cDNA-Bank herzustellen,
die dann gemäß den Angaben
des Herstellers in λZAP-Phagenvektoren
transfiziert wurde. Die λZAP-Bank
wurde dann in E. coli transfiziert, wodurch 1,6 × 106 primäre Isolate erhalten wurden.
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Anschließend wurde
die SEREX-Methode von Sahin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11810–11813 (1995),
hierin durch Verweis aufgenommen), angewandt. Kurz gesagt wurde
autologes Serum von Antikörpern
gegen Moleküle,
die für
E. coli endogen sind, gestrippt, indem das Serum mit Lysaten von
E. coli, die mit Phagen-λZAP, der
keine cDNA-Klone der Speiseröhrenkrebszellen
enthielt, transfiziert waren, kombiniert wurde.
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Das
entleerte Serum wurde dann verdünnt
und mit Nitrocellulosemembranen, die Phagenplaques enthielten, vermischt.
Die Plaques wurden über
Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen wurden die
Filter mit an alkalische Phosphatase konjugierten sekundären Ziegen-Anti-Human-FCγ-Antikörpern inkubiert,
und die reaktiven Phagenplaques wurden durch Inkubation mit 5-Brom-4-chlorindolylphosphat
und Nitroblau-Tetrazolium sichtbar gemacht. Insgesamt wurden 13
positive Klone gefunden.
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Beispiel 2
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Nach
der Identifikation wurden die reaktiven Klone durch Verdünnungsklonierung
und Testen mit menschlichem Serum zu Monoklonalität subkloniert.
Diese Klone wurden dann gereinigt, in vitro ausgeschnitten und gemäß den Angaben
des Herstellers in pBK-CMV-Plasmidformen umgewandelt. Die insertierte
DNA wurde dann mittels EcoRl-Xbal-Restriktionskartierung evaluiert,
um verschiedene Inserts zu bestimmen. Acht verschiedene Inserts
wurden identifiziert, deren Größe von etwa
500 bis etwa 1,3 Kilobasenpaaren reichte. Die Klone wurden mittels
eines automatisierten ABI-PRISM-Sequencers sequenziert.
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Tabelle
1 fasst die Ergebnisse zusammen. Ein Gen wurde durch vier überlappende
Klone repräsentiert,
ein zweites durch drei überlappende
Klone und die restlichen sechs durch lediglich einen Klon.
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Eine
Homologiesuche brachte hervor, dass die als NY-ESO-2, -3, -6 und
-7 bezeichneten Klone bereits bekannt waren. Siehe Elisei et al.,
J. Endocrin. Invest. 16. 533-540
(1993); Spritz et al., Nucl. Acids Res. 15, 10373–10391 (1987);
Rabbits et al., Nature Genetics 4, 175–180 (1993); Crozat et al.,
Nature 363, 640–644 (1993);
Gen-Bank H18368
und D25606. Von zwei der Klone (NY-ESO-3 und NY-ESO-6) wurde bereits
gezeigt, dass sie in verschiedenen normalen menschlichen Geweben
exprimiert werden. Es wurde kein Hinweis für eine Abstammungsbeschränkung gefunden.
NY-ESO-6 (cDNA) scheint der untranslatierte 3'-Abschnitt des FUS/TLS-Gens zu sein.
In hier nicht angeführten
Versuchen zeigten das Sequenzieren und die Southern-Blot-Analyse
von NY-ESO-6 keinen Hinweis auf Translokationen oder Punktmutationen
beim Krebs. Vier der Klone, d.h. NY-ESO-1, -4, -5 und -8, zeigten
keine starke Homologie mit Sequenzen der untersuchten Datenbanken
und wurden genauer untersucht.
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Tabelle
1. Aus Speiseröhrenkrebs-Bank
durch Immunscreening mit autologem Serum isolierte Gene
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Beispiel 3
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Untersuchungen
wurden durchgeführt,
um die mRNA-Expression der NY-ESO-1-, -4-, -5- und -8-Klone zu evaluieren.
Dafür wurden
spezifische Oligonucleotid-Primer für jede Sequenz entworfen, so
dass cDNA-Segmente aus 300 – 400
Basenpaaren amplifiziert werden konnten und die Primer-Schmelztemperatur
im Bereich von 65-70 °C liegt.
Reverse-Transkriptions-PCR wurde dann mittels im Handel erhältlicher Materialien und
Standardvorschriften durchgeführt.
Eine Vielzahl normaler Zelltypen sowie Tumorzelltypen wurden getestet.
Die Klone NY-ESO-4 und NY-ESO-8 waren ubiquitär und wurden nicht weiter untersucht.
NY-ESO-5 zeigte ein hohes Expressionsausmaß im Originaltumor und in normalem Ösophagusgewebe,
was nahe legt, dass es ein Differenzierungsmarker ist.
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Es
stellte sich heraus, dass NY-ESO-1 in Tumor-mRNA und in Hoden, jedoch
nicht in normalem Colon-, Nieren-, Leber- oder Hirngewebe exprimiert
wurde. Dieses Expressionsmuster stimmt mit anderen Tumorabstoßungs-Antigenvorläufern überein.
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Beispiel 4
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Der
obenstehend erläuterte
RT-PCR-Test wurde für
NY-ESO-1 bei einem umfassenderen Set an normalem Gewebe und Tumorgewebe
durchgeführt.
Die Tabellen 2, 3 und 4 zeigen diese Ergebnisse. Kurz gesagt stellte
sich heraus, dass NY-ESO-1 in normalen Hoden und Eierstockzellen
stark exprimiert wird. Geringe Mengen der RT-PCR-Produktion wurden in normaler Uterusmuskulatur
gefunden, jedoch nicht in der Gebärmutterschleimhaut, wobei das
positive Anzeichen nicht konsistent war. Das Schuppenepithel verschiedener Zelltypen,
einschließlich
normaler Speiseröhre
und Haut, war ebenfalls negativ.
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Als
Tumoren nicht verwandter Zelllinien getestet wurden, zeigten 2 von
11 Melanom-Zelllinien
sowie auch 16 von 67 Melanomproben, 6 von 33 Brustkrebsproben und
4 von 4 Blasenkrebesproben eine starke Expression. Bei anderen Tumorarten
lag sporadische Expression vor.
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Tabelle
4: NY-ESO-1-mRNA-Expression bei verschiedenen menschlichen Tumoren
durch RT-PCR
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Eine
weitere Reihe von Versuchen wurde durchgeführt, um festzustellen, ob das
Vorhandensein von Anit-NY-ESO-1-Antikörper in Krebspatientensera
mittels ELISA bestimmt werden konnte. Zusammenfassend gesagt wurde
rekombinantes NY-ESO-1-Protein,
das durch die untenstehend erläuterten
Verfahren hergestellt wurde, mittels Standardverfahren auf feste
Oberflächen
aufgetragen. Von normalen Patienten und Patienten mit verschiedenen
Krebsarten wurden Serumproben entnommen. Anti-NY-ESO-1-Antikörper sollten
an diese binden. Sie wurden dann mit Ziegen-Anti-Human-IgG kontaktiert, mit alkalischer
Peroxidase markiert und dann mit Substrat sichtbar gemacht. Die
Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angeführt:
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Beispiel 5
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Anschließend wurde
eine Northern-Blot-Analyse durchgeführt, um die Größe des NY-ESO-1-Transkripts
zu untersuchen und die Gewebeexpressionsmuster zu bestätigen. Die
Verfahrensweise von Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular
Biology (1995)) wurde verwendet. Genauer gesagt wurden 20 μg der gesamten
RNA pro Bahn in einem Formamid- und Formaldehyd-hältigen Puffer
gelöst,
auf 65 °C
erhitzt und dann auf einem 1,2%igen Agarosegel mit 3 % Formaldehyd
getrennt, gefolgt von einem Transfer auf Nitrocellulosepapier. Mittels
einer 32P-markierten Sonde wurde eine Hybridisierung
durchgeführt,
gefolgt von hoch-stringentem Waschen. Der letzte Waschvorgang wurde
15 min lang bei 0,1×SSC,
0,1 % SDS, 60 °C
durchgeführt.
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RNA
aus Hoden und eine Melanomzelllinie (SK-MEL-19), die in vorherigen
Tests positiv für
NY-ESO-1 gewesen waren, zeigten ein RNA-Transkript von etwa 0,8 – 0.9 kb.
Eine Ösophaguskarzinomprobe
zeigte ein Schleifen im 0,4- bis 0,9-Kilobasenbereich, was einen
partiellen Abbau wiederspiegelte. RNA zusätzlicher getesteter Gewebe
oder Zelllinien zeigte kein Transkript.
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Um
cDNA zu erhalten, die für
das volle Transkript kodiert, wurde die Ösophagus-cDNA-Bank mittels Plaque-Hybridisierung
erneut gescreent, und der ursprüngliche
cDNA-Klon wurde als Hybridisierungssonde verwendet. Beim Screenen
von 3×105 Klonen wurden sechs Positive gefunden.
Die drei längsten
Klone wurden sequenziert. Die Analyse der offenen Leseraster zeigte,
dass alle drei die gesamte Kodierungsregion sowie untranslatierte
5'-Regionen unterschiedlicher
Größe enthielten.
Der längste
Klon mit einer Länge
von 755 Basenpaaren (ohne polyA) enthält eine 543 Basenpaare lange
Kodierungsregion, zusammen mit 53 untranslatierten Basen am 5'-Ende und 151 untranslatierten
Basenpaare am 3'-Ende.
Siehe Seq.-ID-Nr. 1 (ebenso 3).
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Der
lange ORF deutete darauf hin, dass die abgeleitete Sequenz des NY-ESO-1-Proteins 180 Aminosäuren hat.
Der einzelne immunpositive Klon enthielt eine Sequenz, die für 173 davon
kodierte. Die abgeleitete Molekülmasse
beträgt
17.995 Dalton.
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Die
Analyse zeigt, dass ein Übermaß an Glycinresten
im N-Terminusabschnitt (30 der ersten 80, 4 in den restlichen 100)
vorliegt. Die Hydrophilie-Analyse zeigte, dass hydrophile Antigensequenzen
in der N-Terminushälfte
des Moleküls
gegeben waren, mit abwechselnd hydrophoben und hydrophilen Sequenzen,
die in einem langen hydrophoben Schwanz am C-Terminus endeten (Aminosäuren 152 – 172),
gefolgt von einem kurzen hydrophilen Schwanz. Dieses Muster legt
eine Transmembrandomäne
nahe. Es gibt mehrere potentielle N-Myristorylierungsstellen, 3
Phosphorylierungsstellen und keinen Hinweis auf N-Glykosylierungsstellen.
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Beispiel 6
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Eine
Melanomzelllinie „NW-MEL-38" wurde 1995 aus einem
Patienten, der an malignen Melanomen litt, gesichert. Serumproben,
Peripherblutlymphozyten und Tumorproben wurden vom Probanden entnommen und
eingefroren, bis die hierin beschriebenen Arbeiten durchgeführt wurde.
Unter Vorwegnahme der Evaluierung von Anti tumor-T-Zellenreaktion
bei diesem Patienten wurde der Patient als HLA-A1 und HLA-A2 typisiert.
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Um
zu bestimmen, ob die Melanome dieses Patienten NY-ESO-1 exprimierten,
wurde die gesamte RNA mittels Standardverfahren aus den Tumorproben
sowie der Zelllinie NW-MEL-38 isoliert. Dann wurden zwei Mikrogramm
der gesamten RNA von jeder der Proben einer cDNA-Synthese unterzogen,
wobei wiederum Standardverfahren angewandt wurden.
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Die
cDNA wurde dann in RT-PCR-Versuchen eingesetzt, wobei die folgenden
Primer herangezogen wurden:
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- 5' -CACACAGGAT
CCATGGATGC TGCAGATGCG G' – 3' (Seq.-ID-Nr. 2),
- und
- CACACAAAGC TTGGCTTAGC GCCTCTGCCC TG – 3' (Seq.-ID-Nr. 3)
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Diese
Primer sollten ein Segment der Seq.-ID-Nr. 1 amplifizieren, das
sich über
die Nucleotide 271 bis 599 erstreckt.
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Die
Amplifizierung wurde über
35 Zyklen bei einer Anellierungstemperatur von 60 °C durchgeführt. Die PCR-Produkte
wurden durch Ethidiumbromid-Färbung
auf 1,5%-igem Agarosegel
sichtbar gemacht.
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Die
Ergebnisse deuteten darauf hin, dass der Tumor sowie die Zelllinie
Seq.-ID-Nr. 1 exprimierten. Die Zelllinien- und Tumorproben wurden
in nachfolgenden Experimenten eingesetzt.
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Beispiel 7
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Das
oben erläuterte
isolierte cDNA-Molekül
wurde dann zur Herstellung eines rekombinanten Proteins verwendet.
Insbesondere wurde die cDNA durch Standardverfahren PCR-amplifiziert
und dann in einen im Handel erhältlichen
Plasmidvektor, d.h. pQE9, der His-Markierungen enthält, kloniert.
In Versuchen, die hierin nicht ausführlich erläutert werden, wurde auch ein
zweiter Vektor, pQE9K, verwendet. Dieser unterscheidet sich von
PQE9 dadurch, dass durch pQE9K Kanamycin-Resistenz anstelle von
Ampicillin-Resistenz verliehen wird.
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Der
Plasmid-Vektor wurde in den E.-coli-Stamm XL1-Blue transformiert,
und positive Transformanten wurden durch Restriktionskartierung
und DNA-Sequenzierung identifiziert. Die Herstellung eines rekombinanten
Proteins wurde durch Isopropyl-β-D-thiogalactosid angeregt,
und das Protein wurde auf einer Ni2+-Ionenchromatographiesäule nach
weithin bekannten Verfahren gereinigt. Das Protein wurde bei der
Analyse mittels 15 % SDS-PAGE und Silberfärbung als ein Protein mit einem
Molekulargewicht von etwa 22 Kilodalton identifiziert. Dies stimmt
mit der aus seiner Sequenz erwarteten Größe des Proteins überein.
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Nun
wurden eukaryotische Transfektanten hergestellt. Dazu wurde die
NY-ESO-1-Kodierungssequenz
aus dem oben beschriebenen pQE9-Vektor isoliert und dann in BamHI-HindIII-Stellen
des eukaryotischen Expressionsvektors pcDNA 3.1 kloniert. Als nächstes wurden
COS-7-Zellen mit diesem Vektor transfiziert, indem Zellproben mit
150 ng des oben erläuterten
Plasmids und 150 ng Plasmid pcDNA-1-Amp kontaktiert wurden, die
entweder cDNA für
HLA-A2.1 oder cDNA für
HLA-A1 enthielten. Das weithin bekannte DEAE-Dextran-Chloroquin-Verfahren
wurde verwendet. Die Zellen wurden dann bei 37 °C 48 h lang inkubiert und anschließend in
einem CTL-Stimulationstest
getestet. Der Test erfolgte gemäß Traversari
et al., Immunogenetics 35, 145–148
(1992), was hierin durch Verweis aufgenommen ist. Zusammenfassend
gesagt wurden 2500 CTLs (NW38-IVS-1, siehe Beispiel 9 unten) in
100 μl RPMI,
er gänzt
mit 100 % Humanserum und 25 U/ml rekombinantem IL-2 zu Mikrowells
mit COS-7-Transfektanten (20.000 Zellen/Well) zugesetzt. Nach 24
h wurden 50 μl Überstand
aus jedem Well entnommen, und die TNF-α-Mengen wurden in einem Standardtest,
d.h. einem Test, in dem die Zytotoxizität gegen WEHI-164-Klon-13-Zellen getestet wurde,
mittels MTT ermittelt. Die positiven Zellen wurden in der Western-Blot-Analyse,
die im folgenden Beispiel beschrieben wird, verwendet.
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Die
verwendeten CTLs waren CTL NW38-IVS-1, hergestellt gemäß Knuth
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3511–3515 (1984), was hierin durch
Verweis aufgenommen ist. Insbesondere wurden gemischte Lymphozyten-T-Zellen-Kulturen
hergestellt, indem 105 autologe NW38-MEL-1-Tumorzellen
und 106 Lymphozyten aus peripherem Blut
vom Probanden kombiniert wurden. Das Zytokin IL-2 wurde zugesetzt,
und die gemischte Kultur wurde bei 37 °C 1 Woche lang inkubiert. Tumorzellen
wurden entfernt, und eine neue Aliquote aus 5×104 Tumorzellen
wurde zusammen mit IL-2 zugesetzt. Dieser Vorgang wurde wöchentlich
wiederholt, bis beim Testen gegen 51Cr-markierte
NW-MEL-38-Zellen eine starke Reaktion ersichtlich war. Die Reaktions-T-Zellen
wurden gesammelt und eingefroren, bis sie in weiteren Versuchen
eingesetzt wurden.
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Beispiel 8
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Unter
Verwendung der oben beschriebenen Serumproben sowie der oben beschriebenen
Zelllysate aus der Zelllinie NW-MEL-38 und der oben beschriebenen
COS-7-Transfektanten
und dem ebenfalls oben beschriebenen gereinigten rekombinanten Protein
wurde eine Western-Blot-Analyse durchgeführt. Serumproben wurden zu
verschiedenen Zeitpunkten der Therapie des Patienten abgenommen.
Bei den Ergebnissen lag kein Unterschied vor.
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In
diesen Tests wurden 1 μg
rekombinantes NY-ESO-1-Protein oder 5 μl Zelllysate jeden Typs in SDS verdünnt und
5 min lang aufgekocht und anschließend auf einem 15 % SDS-Gel
Elektrophorese unterzogen. Nach dem Blotten über Nacht auf Nitrocellulose
(0,45 μm)
und Blockieren mit 3 % BSA wurden die Blots mit Serum, das 1:1000,
1:10.000 und 1:100.000 verdünnt
war, oder mit einem monoklonalem Antikörper gegen NY-ESO-1, verdünnt 1:50,
als positive Kontrolle inkubiert. Der monoklonale Antikörper wurde
wie folgt hergestellt. BALB/C-Mäuse
wurden durch 5 subkutane Injektionen mit rekombinantem NY-ESO-1-Protein
in Intervallen von 2 – 3
Wochen immunisiert. Die Immunisierungsformulierung schloss 50 μg rekombinantes
Protein in Adjuvans ein. Die erste Injektion verwendete komplettes
Freundsches Adjuvans, und danach wurde unvollständiges Freundsches Adjuvans
verwendet. Aus den immunisierten Mäusen wurden Milzzellen entnommen und
mit der Mausmyelom-Zelllinie
SP2/0 fusioniert, um Hybridome zu erzeugen.
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Sobald
Hybridome erzeugt worden waren, wurden sie kloniert und ihre Überstände mittels
Standard-Festphasen-ELISA auf Mikrotiterplatten gegen rekombinantes
Protein gescreent. Der Test erfolgte gemäß Dippold et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 77, 6114–6118
(1980), was hierin durch Verweis aufgenommen ist. Unter Verwendung
von rekombinantem NY-ESO-1 wurde auch eine Reihe negativer Kontrollen
durchgeführt.
Serumantikörper,
die an rekombinantes Protein banden, das wie oben beschrieben von
E. coli erzeugt wurde, wurden durch Ziegen-Anti-Human-IgG, markiert
mit alkalischer Phosphatase in einer Verdünnung von 1:10.000, visualisiert
und dann mit NBT-Phosphat sichtbar gemacht. Nicht transfizierte
COS-7-Zellen wurden ebenfalls als Kontrolle eingesetzt. Auch Serum
von gesunden Probanden wurde als Kontrolle verwendet.
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Bei
Serumverdünnungen
von 1:100.000 zeigte sich starke Reaktivität gegen das rekombinante Protein sowie
Reaktivität
gegen das Lysat von NW-MEL-38. Gegen die nicht transfizierten COS-7-Zellen
lag keine Reaktivität
vor, und auch das Serum eines gesunden Probanden wies keine Reaktivität auf.
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Beispiel 9
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Beim
Testen der COS-7-Transfektanten, siehe oben, und bei den in diesem
Beispiel erläuterten
Tests wurde eine zytolytische T-Zelllinie „NW38-IVS-1" verwendet. Diese „CTL" wurde durch In-vitro-Stimulation
der oben erwähnten
Lymphozyten aus peripherem Blut unter Verwendung der Tumorzelllinie
NW-MEL-38 erzeugt. Dies wurde durch Standardverfahren durchgeführt.
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Die
CTL wurde in einem Zytotoxizitätstest
mit NW-MEL-38 (das HLA-A1-, -A2-positiv und NY-ESO-1-positiv war)
zusammen mit zwei allogenischen Zelllinien, die NY-ESO-1-positiv und
HLA-A2-positiv waren (SK-MEL-37 und MZ-MEL-19), einer Zelllinie,
die MHC-Klasse-1-negativ ist (SK-MEL-19), einer Zelllinie, die HLA-A2-positiv
jedoch NY-ESO-1-negativ ist (NW-MEL-145) sowie mit Kontrollzelllinien
K562 und autologen, Phytohemagglutinin-stimulierten Blasten verwendet.
Verschiedene Effektor/Ziel-Verhältnisse
wurden verwendet, und die Lyse 51Cr-markierter
Zielzellen wurde als Parameter gemessen. 5 veranschaulicht dies.
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Die
Ergebnisse deuten darauf hin, dass die CTL NW38-IVS-1 sowohl die
autologe Zelllinie NW-MEL-38 als auch die allogenischen Zelllinien,
die HLA-A2- und ESO-1-positiv
waren, lysierte. Daher war die CTL mit allogenischen Materialien
reaktiv. Siehe 6.
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Beispiel 10
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Da
Patient NW38 HLA-A1- und HLA-A2-positiv war, wurden Versuche durchgeführt, um
herauszufinden, welches MHC-Molekül das präsentierende Molekül war.
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Derselbe
Versuch wie oben in Zusammenhang mit COS-7-Zellen beschrieben wurde
durchgeführt,
mit der Ausnahme, dass bei diesen Versuchen darauf geachtet wurde,
getrennte Gruppen an Cotransformanten, die entweder mit HLA-A1-cDNA
oder NLA- A2-cDNA,
jedoch nicht mit beiden transformiert worden waren, zu sichern.
Die Ergebnisse zeigen, dass die CTL NW38-IVS-1 COS-7-Transfektanten,
die ausschließlich
sowohl NY-ESO-1 als auch HLA-A2 enthielten, lysierte. Siehe 6. Die Versuche bestätigten auch
die Spezifität
der CTL, da die in Beispiel 9 beschriebenen NY-ESO-1-negativen, HLA-A2-positiven Zellen
für andere
Moleküle positiv
waren, von denen bekannt ist, dass sie zu durch HLA-A2-Moleküle repräsentierten
Peptiden verarbeitet werden.
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Beispiel 11
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Sobald
das repräsentierende
MHC-Molekül
als HLA-A2 identifiziert worden war, wurde Screening der Aminosäuresequenz
für NY-ESO-1
durchgeführt,
um sämtliche
Peptide zu identifizieren, die dieses Motiv erfüllen, und zwar unter Verwendung
des von D'Amaro
et al., Human Immunol. 43, 13–18
(1995), und Drijfhout et al., Human Immunol. 43, 1–12 (1995),
erläuterten
Modells, das hierin durch Verweis aufgenommen ist. Peptide, die
sämtlichen
dadurch abgeleiteten Aminosäuresequenzen
entsprachen, wurden mittels Standardverfahren synthetisiert und
dann in Zytotoxizitätstests
nach Knuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3511–3515 (1984),
was durch Verweis hierin aufgenommen ist, verwendet. Insbesondere
wurde die Zelllinie CEMX721.174.T2 („T2" hierin nachstehend) verwendet, da sie
keine Antigene auf MHC-komplexierte Peptide verarbeitet, wodurch
sie ideal für
Versuche der hierin beschriebenen Art ist. Proben von T2-Zellen
wurden durch Standardverfahren mit 100 μCi Na(51Cr)O4 markiert und dann drei Mal gewaschen, gefolgt
von einer Inkubation mit 10 μg/ml
Peptid und 2,5 μg/ml β2-Mikroglobulin.
Die Inkubation erfolgte 1 h lang bei Raumtemperatur. Anschließend wurden
Reaktionszellen (100 μl
einer CTL-NW-38-IVS-1-Suspension)
in einem Effektor/Ziel-Verhältnis
von 90:1 zugesetzt und 4 h lang in einer wassergesättigten
Atmosphäre
mit 5 % CO2 bei 37 °C inkubiert. Dann wurden die
Platten mit 200×g
5 min lang zentrifugiert, 100 μl Überstand
entfernt und die Radioaktivität
gemessen. Der Prozentsatz an 51Cr-Freisetzung
wurde gemäß bekannter
Strategien ermittelt. Es stellte sich heraus, dass die Peptide SLLMWITQCFL (Seq.-ID-Nr.
4), SLLMWITQC (Seq.-ID-Nr. 5) und QLSLLMWIT (Seq.-ID-Nr. 6) die
drei besten Stimulatoren der CTLs waren. Vergleichbare Ergebnisse
ergaben sich bei der Verwendung von NW-MEL-38 und Zelllinien SK-MEL-37
und MZ-MEL-19 als Ziele, wie obenstehend dargestellt ist.
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Die
vorhergehenden Beispiele beschreiben die Isolation eines Nucleinsäuremoleküls, das
für ein
Speiseröhrenkrebs-assoziiertes
Antigen kodiert. „Assoziiert" wird hierin verwendet,
da, obwohl klar ist, dass das relevante Molekül durch Speiseröhrenkrebs
exprimiert worden ist, andere Krebsarten wie Melanom, Brust-, Prostata- und Lungenkrebs
das Antigen ebenfalls exprimieren.
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Die
Erfindung bezieht sich auf die Nucleinsäuremoleküle, die wie beschrieben für Antigene
kodieren und unter stringenten Bedingungen zur Referenzsequenz Seq.-ID-Nr. 1 hybridisieren. „Stringente
Bedingungen" bezieht
sich hierin auf Bedingungen, wie sie in der US-A-5.342.774 spezifiziert
sind, d.h. 18 h Hybridisierung bei 65 °C gefolgt von vier einstündigen Waschschritten
bei 2×SSC,
0,1 % SDS und einer letzten Waschung bei 0,2×SSC, noch bevorzugter 0,1×SSC, 0,1
% SDS 30 min lang sowie wechselnde Bedingungen, die dasselbe Ausmaß an Stringenz
erfordern, und stringentere Bedingungen.
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Teil
der Erfindung sind auch Expressionsvektoren, die die Nucleinsäuremoleküle der Erfindung
in operabler Bindung (d.h. "operabel
gebunden") an einen
Promotor beinhalten. Die Konstruktion solcher Vektoren wie auch
die Transformation oder Transfektion von Zellen, um eukaryotische
Zelllinien oder prokaryotische Zellstämme, die für das Molekül von Interesse kodieren, herzustellen,
ist für
Fachleute auf dem Gebiet kein Problem. Beispiele für Wirtszellen,
die auf diese Art und Weise verwendet werden können, sind COS-Zellen, CHO-Zellen,
Hefezellen, Insektenzellen (z.B. Spodoptera frugiperda), NIH-3T3-Zellen
usw. Auch prokaryotische Zellen wie E. Coli und andere Bakterien
können
verwendet werden.
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Ebenfalls
Teil der Erfindung ist das hierin beschriebene Antigen, sowohl in
ursprünglicher
Peptidform als auch in posttranslational modifizierter Form. Das
Molekül
ist groß genug,
um ohne jegliche posttranslationale Modifikation antigenisch zu
sein, und ist daher als Immunogen nützlich, wenn es in Vorläuferformen
sowie posttranslational modifizierten Formen mit einem Adjuvans
(oder ohne dieses) kombiniert wird. Die durch dieses Antigen erzeugten
poly- sowie monoklonalen Antikörper
sind ebenso Teil der Erfindung wie das Hybridisieren, das den monoklonalen
Antikörper
ausbildet. Dieser kann therapeutisch als ganzes Protein oder in
Teilen, wie untenstehend erläutert,
eingesetzt werden. Teil der Erfindung sind zudem Antikörper gegen
dieses Antigen, wie polyklonale, monoklonale, reaktive Fragmente
wie Fab, F(ab)2' oder andere Fragmente, sowie Chimären, humanisierte
Antikörper,
rekombinant erzeugte Antikörper
usw.
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Aus
der Offenbarung geht hervor, dass die Proteine und Nucleinsäuremoleküle der Erfindung
diagnostisch verwendet werden können.
Das hierin erläuterte
SEREX-Verfahren wird bei einer Immunreaktion auf ein Pathologie-assoziiertes
Antigen angeführt.
Die jeweilige Pathologie kann daher durch z.B. Testen einer Körperflüssigkeitsprobe
eines Probanden wie Serum auf die Reaktivität mit dem Antigen an sich geprüft werden. Die
Reaktivität
würde als
Anzeichen für
das mögliche
Vorhandensein der Pathologie erachtet werden, so dass die Expression
des Antigens durch einen beliebigen Standard-Nucleinsäurehybridisierungstest,
wie sie auf dem Gebiet weithin bekannt sind und hierin nicht erläutert werden
müssen,
getestet werden könnte.
Anhand von Standardimmunoassays könnte auch auf Antikörper gegen
das jeweilige Molekül
getestet werden.
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Die
Analyse der Seq.-ID-Nr. 1 zeigt, dass darin nichtkodierende 5'- und 3'-Regionen vorhanden
sind. Die Erfindung bezieht sich auf die isolierten Nucleinsäuremoleküle, die
zumindest das kodierende Segment, d.h. Nucleotide 54 – 593, enthalten
und einen beliebigen oder alle der Nucleotide 1 – 53 und/oder 594 – 747 der
Seq.-ID-Nr. 1 umfassen können.
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Weitere
Untersuchungen, wie oben erläutert,
zeigen, dass das Molekül
zu Peptiden verarbeitet wird, die Lyse durch zytolytische T-Zellen
hervorrufen. Beispiel 7 veranschaulichte, dass diese Art der Motivanalyse für HLA-A2-Moleküle durchgeführt werden
kann. Viel Arbeit wurde in die Erforschung von Motiven für verschiedene
MHC- oder HLA-Moleküle investiert,
die hier anwendbar ist. Daher bezieht sich die Erfindung auf Zusammensetzungen,
die in einem therapeutischen Verfahren nützlich sind, worin ein oder
mehrere Peptide, die an ein HLA-Molekül auf der Oberfläche von
Tumorzellen eines Patienten binden, dem Patienten in einer Menge verabreicht
werden, die ausreicht, dass die Peptide an die MHC/HLA-Moleküle binden
und Lyse durch T-Zellen hervorrufen. Die oben angeführte Erläuterung
für HLA-A2-Moleküle ist keineswegs
die einzige Art der Verabreichung, die verwendet werden kann. Eine
beliebige Kombination von Peptiden kann herangezogen werden. Diese
Peptide, die alleine oder in Kombination verwendet werden können, sowie
das gesamte Protein oder immunreaktive Abschnitte davon können einem
Probanden, der sie benötigt,
durch eine beliebige Standardverabreichungsart, wie z.B. intravenös, intradermal,
subkutan, oral, rektal und transdermal, verabreicht werden. Es können auch
normale pharmazeutische Träger,
Adjuvantien wie Saponine, GM-CSF und Interleukine usw. verwendet
werden. Weiters können
diese Peptide und Proteine in Vakzinen mit dem angeführten Material, wie
auch dendritische Zellen oder andere Zellen, die die relevanten
MHC/Peptid-Komplexe repräsentieren,
formuliert werden.
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In ähnlicher
Weise bezieht sich die Erfindung auf Zusammensetzungen, die in Therapien
nützlich
sind, worin das Nucleinsäuremolekül, das für NY-ESO-1
kodiert, in einen Vektor, wie einen Vektor auf Adenovirus-Basis,
eingebaut ist, um dieses in eukaryotische Zellen, wie menschliche
Zellen, transfizierbar zu machen. Ähnlich können Nucleinsäuremoleküle, die
für ein
oder mehrere der Peptide kodieren, in diese Vektoren eingebaut sein,
die dann den Hauptbestandteil der Nucleinsäure-basierten Therapien darstellen.
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Jeder
dieser Tests kann auch in Progressions-/Regressionsuntersuchungen
verwendet werden. Der Verlauf einer Anomalie, die die Expression
von NY-ESO-1 beinhaltet, kann durch einfaches Überwachen der Mengen des Proteins,
dessen Expression usw. durch eine beliebige oder alle der oben erläuterten
Verfahren überwacht
werden.
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Es
sollte klar sein, dass diese Verfahren auch dazu verwendet werden
können,
die Wirksamkeit einer therapeutischen Behandlung zu bestimmen. Im
Wesentlichen kann ein Basiswert für das NY-ESO-1-Protein durch
einen beliebigen der obenstehend erläuterten Tests herangezogen,
ein gegebener therapeutischer Wirkstoff verabreicht und dann der
Proteinspiegel danach überwacht
werden, wobei Veränderungen
im ESO-1-Anteil als Anzeichen der Wirksamkeit der Behandlung dienen.
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Wie
obenstehend angedeutet wurde, beinhaltet die Erfindung u.a. das
Erkennen einer „integrierten" Immunreaktion auf
das NY-ESO-Molekül.
Eine Ramifikation dieses ist die Fähigkeit, den Verlauf der Krebstherapie
zu überwachen.
Bei diesem Verfahren erhält
ein Proband, der behandelt werden muss, eine Impfung, wie sie hierin
beschrieben wurde. Eine solche Impfung führt z.B. zu einer T-Zellen-Reaktion
gegen Zellen, die HLA/Peptid-Komplexe auf ihren Zellen aufweisen.
Die Reaktion kann auch eine Antikörperreaktion einschließen, die
möglicherweise
eine Folge der Freisetzung von Antikörper-provozierenden Proteinen
durch die Lyse von Zellen durch die T-Zellen ist. Die Wirkung einer
Vakzine kann daher durch Überwachen
einer Antikörperreaktion
kontrolliert werden. Wie oben angedeutet wurde, kann eine Erhöhung des
Antikörpertiters
als Anzeichen für
einen Fortschritt durch eine Vakzine betrachtet werden, und umgekehrt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist daher ein Verfahren zum Überwachen
der Wirksamkeit einer Vakzine nach deren Verabreichung, indem die
Antikörperspiegel
beim Probanden bestimmt werden, der für die Vakzine selbst oder ein
großes
Molekül,
das Teil der Vakzine ist, spezifisch ist.
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Die
Identifizierung von NY-ESO-1-Proteinen, wie sie bei pathologischen
Erkrankungen wie Krebs vorkommen, legt zusätzlich zu den oben erläuterten
auch eine Anzahl anderer therapeutischer Ansätze nahe. Die obenstehenden
dargestellten Versuche beweisen, dass Antikörper in Reaktion auf die Expression
des Proteins erzeugt werden. Die Erfindung stellt daher Zusammensetzungen
bereit, die sich auf die Behandlung von Erkrankungen, die durch
abartige oder abnormale Mengen an NY-ESO-1-Proteinen gekennzeichnet sind, durch die
Verabreichung von Antikörpern,
wie humanisierte Antikörper,
Antikörperfragmente
usw., beziehen. Diese können
durch geeignete zystostatische oder zytotoxische Reagenzien etikettiert
oder markiert sein.
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Die
Zusammensetzungen der Erfindung können bei Verfahren verwendet
werden, bei denen auch T-Zellen verabreicht werden. Es muss zudem
festgestellt werden, dass die T-Zellen in vitro durch reagierende Zellen
wie dendritische Zellen, Lymphozyten oder beliebige andere immunreagierende
Zellen hervorgebracht und dann in den behandelten Probanden zurückperfundiert
werden können.
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Es
ist festzustellen, dass die Erzeugung von T-Zellen und/oder Antikörpern auch
durch die Verabreichung von Zellen, die vorzugsweise so behandelt
wurden, dass sie nicht proliferativ sind, erreicht werden kann, die
die für
die Reaktion relevanten T-Zellen-
oder B-Zellen-Epitope repräsentieren,
wie z.B. die obenstehend erläuterten
Epitope.
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Die
therapeutischen Ansätze
können
auch Antisense-Therapien einschließen, worin ein Antisense-Molekül, vorzugsweise
mit einer Länge
von 10 bis 100 Nucleotiden, dem Probanden entweder „unverdünnt" oder in einem Träger wie
einem Liposom verabreicht wird, um die Einbindung in eine Zelle
zu erleichtern, worauf eine Hemmung der Expression des Proteins
folgt. Solche Antisense-Sequenzen können auch in geeignete Vakzinen,
wie virale Vektoren (z.B. Vaccinia), bakterielle Konstrukte, wie
Varianten der bekannten BCG-Vakzine, usw., integriert sein.
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Ebenfalls
Teil der Erfindungen sind Peptide, die Nonamere, Decamere oder Undecamere
sein können, die
als die folgende Kernsequenz aufweisend definiert sind:
LLMWIT
(Seq.-ID-Nr. 7)
wobei sie zumindest ein zusätzlicher Restterminus zum ersten
L-Rest, vorzugsweise Serin, aufweisen, wobei sie bis zu drei besitzen
können,
worin Serin an L gebunden ist, um -SL- auszubilden, sowie 0 bis
4 zusätzliche Aminosäuren am
C-Terminus, die wie oben dargestellt an HLA-A2-Moleküle binden,
wodurch eine CTL-Reaktion hervorgerufen wird. Diese Peptide können therapeutisch
verwendet werden, indem sie einem Patienten, der HLA-A2-positiv
ist und in Zusammenhang mit einer Erkrankung NY-ESO-1 exprimiert,
verabreicht werden, sowie diagnostisch, d.h. um zu ermitteln, ob
HLA-A2-positive Zellen oder relevante CTLs vorhanden sind, usw.
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Das
HLA-A2-Molekül
ist ein MHC-Klasse-I-Molekül,
und die T-Zellen, die auf Komplexe aus Peptiden und Klasse-I-Molekülen reagieren,
sind im Allgemeinen CD8+-Zellen. Eine weitere Teilmenge der T-Zellen, CD4+-Zellen, reagiert auf Komplexe aus MHC-Klasse-II-Molekülen und
Peptiden, und MHC-Klasse-II eingeschränkte CD4+-T-Zellenreaktionen
gegen rekombinante NY-ESO-1, die durch autologe kultivierte dendritische
Zellen repräsentiert
werden, wurden bei Melanom-Patienten detektiert. In hierin nicht
beschriebenen Ergebnissen wurden insbesondere CD4+-Zellen
von anderen Zellen aus PBLs oder Serumproben mittels weithin bekannter
Verfahren getrennt. Dann wurden sie mit dendritischen Zellen gemischt,
die mit NY-ESO-1-Protein gepulst worden waren. Eine Proliferation
von CD4+-Zellen wurde beobachtet, was der
hierin erläuterten
integrierten Immunreaktion eine weitere Facette verleiht. Ein weiterer
Aspekt der Erfindung sind daher diese CD4+-T-Zellen,
Peptide, die an die MHC-Klasse-11-Moleküle binden, sowie deren Verwendung
in der Therapie.
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Weitere
Merkmale und Anwendungen der Erfindung sind für Fachleute auf dem Gebiet
offensichtlich und müssen
hierin nicht erläutert
werden.
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